CN108333342A - 一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法 - Google Patents

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毕水莲
梁紫璐
罗永文
王宗源
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Abstract

本发明涉及一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，属于食品检测领域。为了克服现有技术的不足，本发明提供一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，本发明通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后与四环素类抗体利用戊二醛方法进行偶联，得到四环素类抗体‑NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料并偶联四环素类抗原，然后构建上转换纳米粒子‑金纳米的荧光能量共振转移体系，从而准确检测牛奶中四环素类药物残留量。本发明能得到粒径较小，单分散性好，荧光信号强的上转换纳米材料，可以通过上转换纳米材料的荧光变化量来定量四环素类药物的含量。

Description

一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，属于食品检测领域。
背景技术
在食品安全检测中，经常利用荧光染料与研究对象进行结合形成化合物，然后通过化合物的荧光特性反映研究对象性能的信息。但是这些结合后的化合物在紫外波段下发生激发光时，有可能会使生物组织及其肽、蛋白质、核酸等产生强烈的背景荧光。某些荧光素还会产生生物学毒性，导致抗原或抗体的灵敏度和选择性下降，影响实际检测效果或严重危害到被检测的生物体。上转换发光技术就是利用功能化的上转换发光材料与生物分子结合形成良好的低毒性、抗光漂白、方便的标记物，对有害分子的进行检测，从而解决传统化学荧光染料的局限。
食品安全检测中运用上转换发光材料技术，必须先对上转换发光材料进行氨基化、醛基化、羧基化的表面修饰，增强上转换发光材料在水溶液中的分散性和稳定性，使其易于和生物大分子相结合，便于运用在食品安全检测中。利用戊二醛方法，标记四环素类抗体，形成标记物。
上转换发光技术是把上转换发光材料NaYF4：Yb，Er作为能量供体，金纳米粒子作为能量受体，分别结合四环素类抗体和抗原，由于供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，抗原抗体也会发生免疫反应，因此可以缩短供体和受体分子之间的距离，从而实现能量淬灭。随后加入一定量的游离抗原，让游离的抗原和金纳米材料上的抗原形成免疫竞争，使得上转换发光材料和金纳米形成的荧光能量共振转移体系被破坏，荧光淬灭消失，荧光量增加，因此可以根据荧光量的变化对游离抗原进行量化。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，本发明通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后与四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料并偶联四环素类抗原，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，本发明能得到粒径较小，单分散性好，荧光信号强的上转换纳米材料，可以通过其荧光变化量来定量四环素类药物的含量。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，是通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后和四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料，偶联四环素类抗原得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，通过测定荧光强度确定四环素类抗原的浓度。
本发明所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，具体包括下述步骤：
1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备
量取YNO3溶液、YbNO3溶液和ErNO3溶液混合均匀，缓慢加入柠檬酸钠溶液后超声混匀；向其中缓慢滴加NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温后离心，将沉淀物洗涤干燥，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
将NaYF4：Yb，Er纳米粒子加入正丙醇中，超声磁力搅拌后转移至35℃的恒温水浴中，向其中滴入氨水溶液，继续磁力搅拌1h；依次向其中缓慢滴加TEOS溶液反应4h；向其中加入APTES溶液持续搅拌1h后离心取沉淀物，洗涤、干燥，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
3)四环素类抗体连接
取功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到PBS溶液中，缓缓加入戊二醛溶液和硼氢化钠，混合均匀后室温下缓慢振荡反应1h后离心，沉淀物使用PBS溶液洗涤后重新分散在PBS溶液中，加入四环素类抗体和硼氢化钠，室温下振荡反应1h后加入Tris封闭剂，继续振荡反应1h后离心，沉淀物洗涤后分散在PBS溶液中，4℃保存备用，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液；
4)合成金纳米
磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，加热回流30min，冷却至室温得冷却溶液，将PVP溶液加入到冷却溶液中室温搅拌24h，即得金纳米溶液，4℃避光保存；
5)金纳米和抗原连接
金纳米溶液用PBS溶液调到pH为8.0，冰水浴中搅拌状态下加入四环素类抗原搅拌反应1h；向其中加入BSA封闭剂后继续搅拌反应1h，4℃下离心分离，沉淀物使用PBS洗涤后，分散在PBS溶液中，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；
6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：
在试管中加入定量游离四环素类抗原，然后分别向其中加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液，反应0.5h后，接着分别加入一系列不同量的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，将体系置于摇床上缓慢振摇0.5h后，放入荧光分光光度计上进行荧光测定，通过荧光的变化量来确定体系中四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；
7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围向牛奶中分别掺入不同含量四环素类抗原，然后分别加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液混合反应0.5h，接着加入适量四环素类抗原-BSA-金纳米溶液。最后向其中加入PBS溶液，使得最终溶液为200μL后置于摇床振荡反应40min，进行荧光测定，根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，确定四环素类药物的检测范围，得到相关线性关系。
8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否能在检测范围内检测出含有四环素类抗生素的样品。
优选地，所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，具体包括下述步骤：
1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备
分别取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入过量的HNO3溶液加热反应，溶液蒸发后加入去离子水定容分别得到浓度分别为1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和的ErNO3溶液3mL混合均匀，缓慢加入1mmol的柠檬酸钠溶液后超声后混合均匀；磁力搅拌下缓慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，使用NaOH溶液将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温并将混合液离心，离心转速为10000rpm，离心时间为10min；使用无水乙醇洗涤一次，然后再用双蒸水洗涤三次；洗涤完毕后置于60℃恒温干燥12h，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
将20mg NaYF4：Yb，Er粉末加入到30mL的正丙醇溶液，超声磁力搅拌40min，向其中滴入1.25mL氨水溶液和10mL水，然后转移至35℃的恒温水浴中磁力搅拌1h；向其中缓慢滴加10μLTEOS溶液和正丙醇的混合溶液，继续反应4h；接着将0.1mL APTES和正丙醇的混合溶液滴入到上述溶液中，持续搅拌1h；搅拌完毕后10000rpm下离心10min，用无水乙醇洗涤沉淀物3次；将沉淀物置于60℃干燥12h，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
3)四环素类抗体连接
取20mg功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到5mL 0.01mol/L的PBS中，然后缓缓加入1.25mL 25％的戊二醛溶液和100mg硼氢化钠，混合均匀室温下缓慢振荡反应1h，混合溶液在10000rpm下离心10min，使用0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，将沉淀物重新分散在5mL的0.01mol/L PBS中，加入30μg的四环素类抗体和100mg的硼氢化钠，室温下继续振荡1h；然后加入100mg的Tris为封闭剂，继续振荡反应1h；所得的产物离心、用PBS溶液洗涤3次后，重新分散在1mL PBS中，4℃保存备用。
4)合成金纳米
称取0.0216g氯金酸溶于237.5mL去离子水，剧烈搅拌并加热至沸腾；称取0.125g柠檬酸钠溶于12.5mL去离子水中，在磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，继续水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，继续加热回流30min，冷却到室温得到冷却溶液，称取0.0042g PVP溶于1mL去离子水中，再将其加入到冷却溶液中，室温搅拌24h，自然冷却至室温，即得金纳米，4℃避光保存；
5)金纳米和四环素类抗原连接
取5mL金纳米，用pH为9.0的0.01mol/L PBS溶液将其pH值调为8.0，加入20μg的四环素类抗原，冰水浴中搅拌1h；然后加入25mg的BSA作为封闭剂，继续搅拌1h，4℃离心转速为10000rpm，离心时间为10min，使用0.01mol/L的PBS洗涤三次，移去上层溶液，最后用5mL0.01mol/L的pH为7.0的PBS溶液收集，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；
6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：
取1.5mL的小试管加入定量的游离的四环素类抗原，然后在每个小试管中分别加入30μg/mL的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液100μL，接着每个试管加入20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，分别为10、20、40、80、160μL，最后，加入适量的PBS溶液，使得游离的四环素类抗原的最终浓度为100ng/mL放到摇床上缓慢振摇0.5h，接着进行荧光测定；对照组试管中不添加游离的抗原溶液，加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原偶联的金纳米溶液，反应后也进行荧光测定；通过实验组和对照组的荧光恢复的变化量来确定四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；
7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围
在牛奶中掺杂一系列不同浓度的四环素类抗原，取若干个1.5mL的小试管，每个小试管做好标记，在小试管中加入含有不同含量的四环素类抗原的牛奶溶液，牛奶溶液中的四环素类含量分别为0.1，1，5，10，30，50，75，100，500，1000ng，然后加入30μg/mL的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反应0.5h后加入适量20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米溶液；然后依次向每个小试管中加入用PBS溶液使得最终溶液的体积为200μL，然后放到摇床上缓慢振荡40min，进行荧光测定；
8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类牛奶样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否检测含有四环素类抗生素的牛奶样品。如上所述的方法中所述的四环素类抗原抗体能够对多种四环素类药物，如四环素、氯四环素、土霉素或金霉素等有良好的交叉反应性，能够检测多种四环素类抗生素。
本发明与现有技术相比具体优势在于：
本发明在现有技术的基础上，通过上转换发光材料和金纳米材料分别结合四环素类抗体和抗原，构建和优化了以上转换发光材料-金纳米为基础的荧光能量共振转移体系，建立四环素类兽药残留的快速检测方法，可以实现在牛奶以及其他功能饮料中痕量四环素类抗生素的检测，具有广阔的应用前景。
具体实施例
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例本发明一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其包括下述步骤：
1、上转换发光材料NaYF4：Yb，Er的合成
分别取一定量的Y2O3，Yb2O3和Er2O3，加入过量的HNO3溶液加热蒸发定容后，得到1mol/LYNO3，0.2mol/LYbNO3和0.02mol/LErNO3的硝酸盐溶液。然后分别取YNO32.5mL，YbNO33mL和ErNO33mL混合均匀，慢慢滴加柠檬酸钠溶液超声震荡。震荡均匀后，缓慢的加入适量NaF溶液到混合溶液中磁力搅拌。用0.5mol/L的NaOH溶液将pH值调为5，磁力搅拌1h。搅拌后转移到50mL反应釜中，保持180℃反应4h。反应结束后冷却至室温进行离心和洗涤3次。在60℃下恒温干燥12h，即得上转换NaYF4：Yb，Er纳米粒子。
2、上转换发光材料NaYF4：Yb，Er修饰和偶联四环素类抗体
取制备好的NaYF4：Yb，Er粉末20mg于烧杯中，加入30mL正丙醇溶液，超声搅拌40min，滴入1.25mL氨水溶液和10mL水。然后放入35℃恒温水浴中继续搅拌1h，加入10μLTEOS溶液缓慢继续反应4h。接着将0.1mL的APTES溶液逐步滴入到溶液中，持续搅拌1h。反应结束后用无水乙醇洗涤沉淀3次。最后将沉淀物在60℃下进行干燥12h，即可以得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子。
取20mg功能化修饰的NaYF4：Yb，Er的粉末溶解到5mL 0.01mol/L的PBS中，加入1.25mL 25％戊二醛溶液和100mg硼氢化钠，混合后在室温下缓慢振荡1h。反应结束后，离心洗涤3次，移去上层溶液，得到沉淀物重新分散在5mL 0.01mol/LPBS中，加入30μg四环素类抗体和100mg硼氢化钠，室温下继续振荡1h。然后，加入100mg Tris为封闭剂，继续振摇反应1h。所得的产物离心洗涤，重新分散在1mL PBS中，4℃保存备用。
3、金纳米材料制备及偶联四环素类抗原
采用柠檬酸还原法制备得到金纳米材料。取5mL金纳米颗粒，加入20μg四环素类抗原，冰水浴中搅拌搅拌1h。加入25mg BSA为封闭剂，继续搅拌1h。4℃下离心分离，10000rpm离心10min，用0.01mol/LPBS洗涤3次，移去上层溶液，最后分散在5mL 0.01mol/LPBS，4℃保存备用。
4、确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系
取1.5mL的小试管加入一定的量游离的抗原(使得最后浓度为100ng/mL)，然后在每个小试管中分别加入30μg/mL的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液100μL，然后每个试管加入不同量的20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米溶液10、20、40、80、160μL，放到摇床上缓慢振摇0.5h。振摇后，放入荧光分光光度计上进行荧光测定。作为对照组，不添加游离的抗原溶液，在每个试管中加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er和四环素类抗原偶联的金纳米溶液。通过对照组和实验组的荧光变化量来确定四环素荧光能量共振转移体系的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系。
5、确定四环素类药物在牛奶中的检测范围在牛奶中掺夹杂不同浓度的四环素类药物，取若干小试管，在里面加入含有不同浓度的四环素类抗原的牛奶混合溶液，使得最后体系中四环素类抗原的含量分别为0.1，1，5，10，30，50，75，100，500，1000ng；然后加入制备好的四环素类抗体NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反应0.5h后加入适量制备好的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液。然后依次向每个小试管中加入PBS溶液，使得最终溶液体积为200μL。然后放到摇床上缓慢振摇40min，振摇后进行荧光测定。根据四环素类药物在牛奶中的检测范围，在牛奶中掺杂分别相同浓度的抗生素强力霉素、抗生素四环素、抗生素磺胺甲恶唑和BSA。取若干个1.5mL的小试管，每个小试管做好标记，分别在小试管中加入含有混合物的牛奶溶液适量，然后加入制备好的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反应0.5h后加入适量制备好的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液。然后依次向每个小试管中加入用PBS溶液加至体积为200μL，使得试管中的混合物(抗生素强力霉素，抗生素四环素、抗生素磺胺甲恶唑和BSA)浓度为20ng/ml。然后放到摇床上缓慢振摇40min振摇后，进行荧光测定。

Claims (4)

1.一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其是通过水热合成法制备得到上转换纳米粒子NaYF4：Yb，Er，将其功能化修饰后和四环素类抗体利用戊二醛方法偶联，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er；通过柠檬酸钠合成法得到金纳米材料，偶联四环素类抗原得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，然后构建上转换纳米粒子-金纳米的能量共振转移体系，通过测定荧光强度确定四环素类抗原的检测范围。
2.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其特征在于，其具体包括如下步骤：
1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
量取YNO3溶液、YbNO3溶液和ErNO3溶液混合均匀，缓慢加入柠檬酸钠溶液后超声混匀；向其中缓慢滴加NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温后离心，将沉淀物洗涤干燥，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
将NaYF4：Yb，Er纳米粒子加入正丙醇中，超声磁力搅拌后转移至35℃的恒温水浴中，向其中滴入氨水溶液，继续磁力搅拌1h；依次向其中缓慢滴加TEOS溶液反应4h；加入APTES溶液持续搅拌1h后离心取沉淀物，洗涤、干燥，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
3)四环素类抗体连接：
取功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到PBS溶液中，缓缓加入戊二醛溶液和硼氢化钠，混合均匀后室温下缓慢振荡反应1h后离心，沉淀物使用PBS溶液洗涤后重新分散在PBS溶液中，加入四环素类抗体和硼氢化钠，室温下振荡反应1h后加入Tris封闭剂，继续振荡反应1h后离心，将沉淀物洗涤后分散在PBS溶液中，4℃保存备用，得到四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液；
4)合成金纳米：
磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，加热回流30min，冷却至室温得冷却溶液，将PVP溶液加入到冷却溶液中室温搅拌24h，即得金纳米溶液，4℃避光保存；
5)金纳米和抗原连接：
用PBS溶液将金纳米溶液pH值调为8.0，冰水浴中搅拌状态下加入四环素类抗原搅拌反应1h；再向其中加入BSA封闭剂后继续搅拌反应1h，4℃下离心分离，沉淀物使用PBS洗涤后，分散在PBS溶液中，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；
6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：
在试管中加入定量游离四环素类抗原，然后分别向其加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液，反应0.5h后，接着分别加入一系列不同量的四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，将体系置于摇床上缓慢振摇0.5h后，放入荧光分光光度计上进行荧光测定；对照组试管中不添加游离的抗原溶液，加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原偶联的金纳米溶液，反应后也进行荧光测定；通过实验组和对照组的荧光变化量来确定体系中四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；
7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围：
在牛奶中分别掺入不同含量的四环素类抗原溶液，然后分别加入等量的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液混合反应0.5h，接着加入适量四环素类抗原-BSA-金纳米溶液；最后向其中加入PBS溶液，使得最终溶液为200μL后，置于摇床振荡40min后进行荧光测定，根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，确定四环素类药物的检测范围，得到相关线性关系；
8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否在检测范围内检测出含有四环素类抗生素的样品。
3.根据权利要求1所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其特征在于，所述的方法具体包括下述步骤：
1)NaYF4：Yb，Err纳米粒子的制备
分别取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入过量的HNO3溶液加热反应，待溶液蒸发后加入去离子水定容，得到浓度分别为1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和ErNO3溶液3mL混合均匀，缓慢加入1mmol的柠檬酸钠溶液后超声后混合均匀；磁力搅拌下缓慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混合溶液中有白色沉淀出现，使用NaOH溶液将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温并将混合液离心，离心转速为10000rpm，离心时间为10min；使用无水乙醇洗涤一次，然后再用双蒸水洗涤三次；洗涤完毕后置于60℃恒温干燥，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
将20mg的NaYF4：Yb，Er粉末加入到30mL的正丙醇溶液，超声磁力搅拌40min，向其中滴入1.25mL氨水溶液和10mL水，然后转移至35℃的恒温水浴中磁力搅拌1h；向其中缓慢滴加10μL TEOS和正丙醇的混合溶液，继续反应4h；接着将0.1mL的APTES溶液和正丙醇的混合溶液滴入到溶液中，持续搅拌1h；搅拌完毕后10000rpm下离心10min取沉淀物，用无水乙醇洗涤沉淀物3次；将沉淀物置于60℃干燥12h，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
3)四环素类抗体连接
取20mg功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到5mL 0.01mol/L的PBS溶液中，超声15min；然后缓缓加入1.25mL 25％的戊二醛溶液和100mg硼氢化钠，混合均匀后在室温下缓慢振荡反应1h，混合溶液在10000rpm下离心10min，使用0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，将沉淀物重新分散在5mL的0.01mol/L PBS中，加入30μg的四环素类抗体和100mg的硼氢化钠，室温下继续振荡1h；然后加入100mg的Tris为封闭剂，继续振荡反应1h；所得的产物离心、用PBS溶液洗涤3次后，重新分散在1mL PBS中，4℃保存备用；
4)合成金纳米
称取0.0216g氯金酸溶于237.5mL去离子水，剧烈搅拌并加热至沸腾；称取0.125g柠檬酸钠溶于12.5mL去离子水中，在磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液中，继续水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，继续加热回流30min，冷却至室温得到冷却溶液。称取0.0042g PVP溶于1mL去离子水中，再将其加入到冷却溶液中，室温搅拌24h，自然冷却至室温，即得金纳米，4℃避光保存；
5)金纳米和抗原连接
取5mL金纳米溶液，用0.01mol/L，pH为9.0的PBS溶液将其pH调为8.0，然后，在冰水浴中加入20μg的四环素类抗原，搅拌1h；接着加入25mg的BSA作为封闭剂，继续搅拌1h，4℃下离心分离，离心转速为10000rpm，离心时间为10min，使用0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，移去上层溶液，最后用5mL 0.01mol/L的pH为7.0的PBS溶液收集，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；
6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液为基础的四环素荧光能量共振转移体系：
取1.5mL的小试管加入定量的游离的四环素类抗原，然后在每个小试管中分别加入25μg/mL的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液100μL，接着每个试管加入20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，分别为10、20、40、80、160μL，最后，加入适量的PBS溶液，使得游离的四环素类抗原的最终浓度为100ng/mL放到摇床上缓慢振摇0.5h，接着放入荧光分光光度计上进行荧光测定；对照组试管中不添加游离的抗原溶液，加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原偶联的金纳米溶液，反应后也进行荧光测定；通过实验组和对照组的荧光变化量来确定四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶液的最适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；
7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围
在牛奶中掺杂一系列不同浓度的四环素类抗原，取若干个1.5mL的小试管，每个小试管做好标记，在小试管中加入含有不同含量的四环素类抗原的牛奶溶液，使得牛奶溶液中的四环素类含量最终分别为0.1，1，5，10，30，50，75，100，500，1000ng，然后加入30μg/mL的四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反应0.5h后加入适量20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米溶液；然后依次向每个小试管中加入用PBS溶液使得最终溶液的体积为200μL，然后放到摇床上缓慢振荡40min，进行荧光测定；
8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类牛奶样品的荧光强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否检测牛奶样品中的其他四环素类抗生素。
4.根据权利要求1或2所述的快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，其特征在于，所述的四环素类抗原抗体能够对多种四环素类药物，如四环素、氯四环素、土霉素或金霉素等有良好的交叉反应性，能够检测多种四环素类抗生素。
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