CN112730360A - 一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素b1检测方法 - Google Patents

一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素b1检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法，涉及食品安全检测领域。步骤如下：步骤一：制备氨基功能化上转换纳米材料；步骤二：在氨基功能化上转换纳米材料表面连接黄曲霉毒素B1适配体；步骤三：制备黑磷纳米片；步骤四：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于缓冲液中，加入步骤三得到的黑磷纳米片制成的分散液，孵育结合得特异性检测体系；步骤五：建立黄曲霉毒素B1含量检测标准曲线；步骤六：检测样本中黄曲霉毒素B1含量。本发明通过构建黄曲霉毒素B1荧光检测体系，实现食品中黄曲霉毒素B1的高特异性、灵敏性检测，具有较宽的浓度检测范围和较低的检测限，具有良好实用前景。

Description

一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素 B1检测方法
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，是一种高毒性和致癌性的霉菌毒素。黄曲霉毒素主要包括B族(B1和B2)、G族(G1和G2)及M族(M1和M2)，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，被国际癌症物质研究机构列为Ⅰ类致癌物。
AFB1可导致严重的肝损伤、肝癌、儿童生长障碍等一系列健康危害问题。不幸的是，根据联合国粮食及农业组织的报告，全球有约25％的农作物受到了霉菌毒素的侵害，而其中仅AFB1污染就占据了被霉菌毒素侵害农作物总量的四分之一。
由于黄曲霉毒素B1的严重危害，目前许多国家都规定了AFB1在各种农产品和食品中的最大残留量。例如，中国国家标准GB 2761-2017规定，坚果、小麦、大豆及其衍生物中AFB1含量不得超过5ug/kg。但是，传统的黄曲霉毒素检测方法，如高效液相色谱法、酶联免疫吸附试验等，不仅仪器设备昂贵、检测成本高、步骤繁琐，更为重要的是不能实现对AFB1的特异性检测，因此无法满足对AFB1含量的快速、高灵敏性检测要求，对于AFB1的检测精度和灵敏度处在较低水平。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法，以解决上述现有技术存在的问题，从而实现对食品中黄曲霉毒素B1的高特异性、灵敏性检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种黄曲霉毒素B1的检测方法，包括以下步骤：
步骤一，制备氨基功能化上转换纳米材料：
将上转换纳米材料进行稀土掺杂后，在避光条件下与聚乙烯亚胺搅拌后得到混合液，将混合液在200℃条件下反应12h，冷却后离心得到沉淀，洗涤沉淀并进行真空冷冻干燥，得到氨基功能化上转换纳米材料；
步骤二，在氨基功能化上转换纳米材料表面连接黄曲霉毒素B1适配体：将步骤一得到的氨基功能化上转换纳米材料分散于磷酸盐缓冲液中，加入戊二醛溶液进行表面活化；反应结束后，将表面活化后的氨基功能化上转换纳米材料重新分散于磷酸盐缓冲液中，加入黄曲霉毒素B1适配体孵育，得到表面连接适配体的上转换纳米粒子；
步骤三，采用液相剥离法制备黑磷纳米片：将黑磷晶体块于惰性气体条件下研磨粉碎，得黑磷粉末；将所得黑磷粉末加入经惰性气体鼓泡后的N-甲基吡咯烷酮溶液中，密封后超声剥离得到黑磷分散液；超声结束后离心分离得到黑磷纳米片；
步骤四，特异性检测体系的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子配制成表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液，加入步骤三得到的黑磷纳米片制备成的分散液，经孵育结合形成荧光共振能量转移供受体对后，即为特异性检测体系；
步骤五，黄曲霉毒素B1含量检测标准曲线的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于缓冲液中，然后加入步骤三得到的黑磷纳米片制备的分散液，然后分别加入不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，得到不同浓度的检测液，经过孵育后，测定检测液的荧光强度信号特征值，以黄曲霉毒素B1浓度和荧光强度信号特征值进行线性拟合，建立黄曲霉毒素B1含量检测的标准曲线；
步骤六：食品样本中黄曲霉毒素B1含量的检测：将食品经预处理，提取得到含有食品中黄曲霉毒素B1的溶液，将所得溶液按照与步骤五过程相同操作加入步骤四的特异性检测体系，将测定的荧光强度信号特征值，带入步骤五所得的标准曲线，计算出食品中黄曲霉毒素B1的含量。
进一步地，步骤二中，所述氨基功能化上转换纳米材料、磷酸盐缓冲液、戊二醛溶液的体积比为10:5:1.25，活化时间为1.5-2.5h；
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，摩尔浓度为10mM；
戊二醛溶液的浓度为质量分数25％；
所述氨基功能化上转换纳米材料与黄曲霉毒素B1适配体的比例为4mg:450nM，孵育时间为10-12h。
进一步地，步骤三中，所述N-甲基吡咯烷酮用惰性气体鼓泡的时间为15-30min，黑磷粉末与N-甲基吡咯烷酮的比例为40mg:40mL；
超声剥离的时间为12–18h，超声剥离过程中保持的低温应保持在0-25℃。
进一步地，步骤三中，离心分离黑磷纳米片的步骤为：首先将超声剥离得到的黑磷分散液于4000–5000rpm转速下离心除去未剥离的黑磷粉末，然后将上清液于10000–11000rpm转速下离心分离得到黑磷纳米片。
进一步地，步骤四中，所述表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液浓度为1mg/mL；所述黑磷纳米片分散液浓度为0.6mg/mL；所述表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液与黑磷纳米片分散液的体积比为1:1。
进一步地，步骤五中，所述黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度范围为0.2–500ng/mL；所述黄曲霉毒素B1标准溶液和特异性检测体系的体积比为1:2。
进一步地，步骤五中，所述测定检测溶液的荧光强度信号特征值的步骤为：测定980nm激发光激发下660nm处的荧光强度值，记录仅有特异性检测体系时的荧光强度值F0和加入黄曲霉毒素B1标准溶液之后特异性检测体系的荧光强度值F1；F1-F0即为检测溶液的荧光强度信号特征值。
进一步地，步骤六中，所述食品样本的预处理方法为：将食品样本加入乙腈-水溶液中，涡旋混匀，超声均质、离心后取上清液；所述乙腈-水溶液体积比为84:16。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明公开了一种黄曲霉毒素B1的检测方法，是基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器对黄曲霉毒素B1进行检测，具体是通过上转换纳米粒子作为荧光供体、黑磷纳米片作为荧光受体，两者通过核酸适配体连接构成基于荧光共振能量转移的特异性AFB1检测体系。
2.本发明构建的特异性检测体系，具体优化设计的连接核酸适配体的上转换纳米粒子-黑磷纳米片荧光共振能量转移体系，对黄曲霉毒素B1具有强的荧光响应性，可有效消除背景荧光及其他分子的干扰，对AFB1的检测具有高特异性，能够实现对AFB1含量的高灵敏度检测，克服了传统方法的不足，对保障粮食安全至关重要。
3.本发明建立的AFB1浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为0.2-500ng/mL，具有较宽的线性检测范围，检测限LOD为0.033ng/mL，可以满足食品中AFB1含量的高灵敏检测，具有很好的通用性，比传统方法的检测精度和灵敏度高。
4.本发明通过构建稳定的黄曲霉毒素B1荧光检测体系，实现食品中黄曲霉毒素B1的高特异性、灵敏性检测，具有较宽的浓度检测范围和较低的检测限，从而使得该检测方法具有良好的实用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明基于上转换和黑磷纳米片适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测原理图；
其中，A为表面连接适配体的上转换纳米粒子制备流程图；B为黑磷纳米片的制备流程图；
图2为实施例1制备的氨基功能化上转换纳米粒子的透射电镜图；
图3为实施例1制备的黑磷纳米片的透射电镜图；
图4为实施例1中不同AFB1浓度下检测溶液的荧光信号图；
图5为实施例1中AFB1含量检测标准曲线图；
图6为对比例1-6不同真菌毒素的荧光强度信号特征值。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。
图1为本发明基于上转换和黑磷纳米片适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测原理图。
实施例1花生油中黄曲霉毒素B1含量的检测
一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法，包括如下步骤：
步骤一，氨基功能化上转换纳米材料的制备：准确称取0.2366g六水氯化钇、0.0775g六水氯化镱、0.0076g六水氯化铒、0.1461g氯化钠和0.1852g氟化铵加入到15mL乙二醇溶液中，超声溶解10min，转移至100mL圆底烧瓶中磁力搅拌30min，混合均匀；在避光条件下，向混合溶液加入0.2g聚乙烯亚胺并充分搅拌10min；将混合均匀的溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于200℃下反应12h，得到反应产物；反应产物冷却后，用20mL丙酮沉淀，8500rpm离心后保留沉淀；沉淀用20mL乙醇离心清洗3次；所得沉淀经真空冷冻干燥后，得到氨基功能化上转换纳米材料(图2)。
步骤二，连接适配体：准确称量4mg步骤一得到氨基功能化上转换纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)中，超声溶解10min；继续加入1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)活化材料表面氨基，缓慢振摇2.5h，反应结束后用蒸馏水离心清洗3次；将表面活化的氨基功能化上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入450nMAFB1适配体，于37℃下缓慢振摇12h(图1A)；孵育结束后用磷酸盐缓冲液离心清洗3次，得到表面连接核酸适配体的上转换纳米粒子；
步骤二中氨基功能化上转换纳米材料与AFB1核酸适配体比例的优化过程如下：
取450nM适配体溶液分别加入到1.25mL不同浓度的氨基功能化上转换纳米材料溶液中，孵育结束后，离心搜集上清液测定紫外-可见吸收光谱；结果表明，随着上转换纳米粒子溶液浓度的升高，上清液在260nm处的吸收强度不断下降，而当上转换纳米粒子溶液浓度达到4mg/mL之后，上清液的吸收峰强度不再下降。因此，确定实施例中氨基功能化上转换纳米材料与AFB1核酸适配体比例为4mg:450nM。
步骤三，黑磷纳米片的制备：将购买的商业化黑磷晶体块于充满惰性气体的手套箱中研磨粉碎；移取40mL N-甲基吡咯烷酮溶液，用惰性气体鼓泡15min；准确称量24mg黑磷粉末加入N-甲基吡咯烷酮溶液中，密封后超声剥落12h，整个超声过程频繁更换冰袋，保持温度为25℃(图1B)；超声结束后，首先将得到的黑磷分散液于4000rpm转速下离心除去未剥离的黑磷粉末；再将上清液于10000rpm转速下离心分离得到黑磷纳米片沉淀；
图3为制备得到的黑磷纳米片沉淀的透射电镜图。
步骤三中黑磷纳米片制备的分散液浓度的优化过程如下：
取1mL不同浓度的步骤三中黑磷纳米片形成的分散液分别加入1mL1mg/mL的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶液，经30min孵育后采集荧光信号特征值；结果表明，当黑磷纳米片分散液浓度达到0.6mg/mL之后，特异性检测体系的荧光信号已经几乎被完全猝灭。因此选用黑磷纳米片分散液浓度为0.6mg/mL。
步骤四，特异性检测体系的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于磷酸盐缓冲液中，配制成1mg/mL的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶液；将步骤三得到的黑磷纳米片分散在磷酸盐缓冲液中，配制成0.6mg/mL的黑磷纳米片分散液；将上转换纳米粒子溶液和黑磷纳米片分散液按照体积比1:1混合，得到特异性检测体系。
步骤五，AFB1含量检测标准曲线的建立：分别将1mL不同浓度的AFB1标准溶液在步骤四加入黑磷纳米片分散液的过程中同时加入上转换纳米粒子溶液，得到检测液，测定检测液的荧光强度信号特征值，以AFB1浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标进行线性拟合，建立AFB1含量检测的标准曲线；具体为：配制0.2、0.5、1、5、10、25、50、100和500ng/mL等不同浓度的AFB1溶液，分别取1mL加入特异性检测体系，其中，AFB1溶液和特异性检测体系的体积比为1:2，经过在37℃孵育50min后采集荧光信号特征值；
其中，测定检测溶液的荧光强度信号特征值的步骤为：测定980nm激发光激发下660nm处的荧光强度值，记录仅有特异性检测体系时的荧光强度值F0和加入黄曲霉毒素B1标准溶液之后特异性检测体系的荧光强度值F1；F1-F0即为检测溶液的荧光强度信号特征值ΔF。
图4为不同AFB1浓度下检测溶液的荧光信号。
从图4可以看出，随AFB1浓度的增加，660nm处的荧光信号不断增强；经线性拟合得到AFB1含量检测的标准曲线ΔF＝389.5log(CAFB1)+307.43(图5)，相关系数R2＝0.993，检测限LOD为0.033ng/mL，线性范围为0.2–500ng/mL。
步骤六：花生油中AFB1含量的检测：称取5g花生油加入20mL乙腈-水溶液中，涡旋混匀，超声均质20min，6000rpm离心后取上清液；上清液经黄曲霉毒素固相萃取柱净化，保留净化液；取净化液4.0mL，在50℃下用氮气吹至近干，分别加入200uL正己烷和100uL三氟乙酸，涡旋30s，在40℃的恒温箱中衍生15min；衍生结束后，在50℃用氮气吹至近干，用磷酸盐缓冲液定容至1.0mL，涡旋30s溶解；取所得溶液1mL加入特异性检测体系，孵育50min结束后测定荧光信号特征值ΔF＝205.33，带入步骤五所得标准曲线，计算出花生油样本中的AFB1含量为0.547ng/mL。所述乙腈-水溶液的体积比为84:16。
实施例2小麦中黄曲霉毒素B1含量的检测
一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法，包括如下步骤：
步骤一，氨基功能化上转换纳米材料的制备：准确称取0.2366g六水氯化钇、0.0775g六水氯化镱、0.0076g六水氯化铒、0.1461g氯化钠和0.1852g氟化铵加入到15mL乙二醇溶液中，超声溶解15min，转移至100mL圆底烧瓶中磁力搅拌40min，混合均匀；在避光条件下，向混合溶液加入0.2g聚乙烯亚胺并充分搅拌10min；将混合均匀的溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于180℃下反应8h，得到反应产物；反应产物冷却后，用20mL丙酮沉淀，8500rpm离心后保留沉淀；沉淀用20mL乙醇离心清洗3次；所得沉淀经真空冷冻干燥后，得到氨基功能化上转换纳米材料。
步骤二，连接适配体：准确称量10mg步骤一得到的氨基功能化上转换纳米材料分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)中，超声溶解15min；继续加入1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)活化材料表面氨基，缓慢振摇1.5h，反应结束后用蒸馏水离心清洗3次；将表面活化的氨基功能化上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入450nM AFB1适配体，于37℃下缓慢振摇10h，孵育结束后用磷酸盐缓冲液离心清洗3次，得到表面连接核酸适配体的上转换纳米粒子。
步骤三，黑磷纳米片的制备：将购买的商业化黑磷晶体块于充满惰性气体的手套箱中研磨粉碎；移取40mL N-甲基吡咯烷酮溶液，用惰性气体鼓泡30min；准确称量20mg黑磷粉末加入N-甲基吡咯烷酮溶液中，密封后超声剥落15h，整个超声过程频繁更换冰袋，保持温度为10℃；超声结束后，首先将得到的黑磷分散液于5000rpm转速下离心除去未剥离的黑磷粉末；再将上清液于11000rpm转速下离心分离得到黑磷纳米片沉淀。
步骤四，特异性检测体系的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于磷酸盐缓冲液中，配制成1mg/mL的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶液；将步骤三得到的黑磷纳米片分散在磷酸盐缓冲液中，配制成0.6mg/mL的黑磷纳米片分散液；将表面连接适配体的上转换纳米粒子溶液和黑磷纳米片分散液按照体积比1:1混合，得到特异性检测体系。
步骤五，AFB1含量检测标准曲线的建立：分别将1mL不同浓度的AFB1标准溶液在步骤四加入黑磷纳米片分散液的过程中同时加入上转换纳米粒子溶液，得到检测液，测定检测液的荧光强度信号特征值，以AFB1浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标进行线性拟合，建立AFB1含量检测的标准曲线；具体为：配制0.2、0.5、1、5、10、25、50、100和500ng/mL等不同浓度的AFB1溶液，分别取1mL加入特异性检测体系，其中，AFB1溶液标准溶液和特异性检测体系的体积比为1:2，经过在37℃孵育50min后采集荧光信号特征值；
其中，测定检测溶液的荧光强度信号特征值的步骤为：测定980nm激发光激发下660nm处的荧光强度值，记录仅有特异性检测体系时的荧光强度值F0和加入黄曲霉毒素B1标准溶液之后特异性检测体系的荧光强度值F1；F1-F0即为检测溶液的荧光强度信号特征值ΔF。
随AFB1浓度的增加，660nm处的荧光信号不断增强；经线性拟合得到AFB1含量检测的标准曲线ΔF＝373.2log(CAFB1)+315.21，相关系数R2＝0.981，检测限LOD为0.045ng/mL，线性范围为0.2–500ng/mL。
步骤六：小麦中AFB1含量的检测：将小麦用粉碎机粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛；称取5g过筛后的小麦加入20mL乙腈-水溶液中，涡旋混匀，超声均质20min，6000rpm离心后取上清液；上清液经黄曲霉毒素固相萃取柱净化，保留净化液；取净化液4.0mL，在50℃下用氮气吹至近干，分别加入200uL正己烷和100uL三氟乙酸，涡旋30s，在40℃的恒温箱中衍生15min；衍生结束后，在50℃用氮气吹至近干，用磷酸盐缓冲液定容至1.0mL，涡旋30s溶解；取所得溶液1mL加入特异性检测体系，孵育50min结束后测定荧光信号特征值ΔF＝280.59，带入步骤五所得标准曲线，计算出小麦样本中的AFB1含量为0.808ng/mL。所述乙腈-水溶液的体积比为84:16。
实施例3花生中黄曲霉毒素B1含量的检测
一种基于上转换和黑磷纳米片的适配体传感器的黄曲霉毒素B1检测方法，包括如下步骤：
步骤一，氨基功能化上转换纳米材料的制备的制备：准确称取0.2366g六水氯化钇、0.0775g六水氯化镱、0.0076g六水氯化铒、0.1461g氯化钠和0.1852g氟化铵加入到15mL乙二醇溶液中，超声溶解15min，转移至100mL圆底烧瓶中磁力搅拌40min，混合均匀；在避光条件下，向混合溶液加入0.2g聚乙烯亚胺并充分搅拌10min；将混合均匀的溶液转移到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，于190℃下反应12h，得到反应产物；反应产物冷却后，用20mL丙酮沉淀，8500rpm离心后保留沉淀；沉淀用20mL乙醇离心清洗3次；所得沉淀经真空冷冻干燥后，得到氨基功能化上转换纳米材料的制备。
步骤二，上转换纳米材料与适配体连接：准确称量10mg步骤一得到的氨基功能化上转换纳米材料的制备分散于5mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4,10mM)中，超声溶解15min；继续加入1.25mL戊二醛溶液(戊二醛溶液质量分数为25％)活化材料表面氨基，缓慢振摇2h，反应结束后用蒸馏水离心清洗3次；将表面活化的上转换纳米材料重新分散于5mL磷酸盐缓冲液中，加入450nM AFB1适配体，于37℃下缓慢振摇11h，孵育结束后用磷酸盐缓冲液离心清洗3次，得到表面连接核酸适配体的上转换纳米粒子。
步骤三，黑磷纳米片的制备：将购买的商业化黑磷晶体块于充满惰性气体的手套箱中研磨粉碎；移取40mL N-甲基吡咯烷酮溶液，用惰性气体鼓泡20min；准确称量30mg黑磷粉末加入N-甲基吡咯烷酮溶液中，密封后超声剥落18h，整个超声过程频繁更换冰袋，保持温度在0℃；超声结束后，首先将得到的黑磷分散液于4500rpm转速下离心除去未剥离的黑磷粉末；再将上清液于10500rpm转速下离心分离得到黑磷纳米片沉淀。
步骤四，特异性检测体系的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于磷酸盐缓冲液中，配制成1mg/mL的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶液；将步骤三得到的黑磷纳米片分散在磷酸盐缓冲液中，配制成0.6mg/mL的黑磷纳米片分散液；将表面连接核酸适配体的上转换纳米粒子和黑磷纳米片分散液按照体积比1:1混合，得到特异性检测体系。
步骤五，AFB1含量检测标准曲线的建立：分别将1mL不同浓度的AFB1标准溶液在步骤四加入黑磷纳米片分散液的过程中同时加入上转换纳米粒子溶液，得到检测液，测定检测液的荧光强度信号特征值，以AFB1浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标进行线性拟合，建立AFB1含量检测的标准曲线；具体为：配制0.2、0.5、1、5、10、25、50、100和500ng/mL等不同浓度的AFB1溶液，分别取1mL加入特异性检测体系，其中，AFB1溶液标准溶液和特异性检测体系的体积比为1:2，经过在37℃孵育50min后采集荧光信号特征值；
其中，测定检测溶液的荧光强度信号特征值的步骤为：测定980nm激发光激发下660nm处的荧光强度值，记录仅有特异性检测体系时的荧光强度值F0和加入黄曲霉毒素B1标准溶液之后特异性检测体系的荧光强度值F1；F1-F0即为检测溶液的荧光强度信号特征值ΔF。
随AFB1浓度的增加，660nm处的荧光信号不断增强；经线性拟合得到AFB1含量检测的标准曲线ΔF＝380.7log(CAFB1)+311.57，相关系数R2＝0.987，检测限LOD为0.042ng/mL，线性范围为0.2–500ng/mL。
步骤六：花生中AFB1含量的检测：将花生用粉碎机粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛；称取5g过筛后的花生加入20mL乙腈-水溶液中，涡旋混匀，超声均质20min，6000rpm离心后取上清液；上清液经黄曲霉毒素固相萃取柱净化，保留净化液；取净化液4.0mL，在50℃下用氮气吹至近干，分别加入200uL正己烷和100uL三氟乙酸，涡旋30s，在40℃的恒温箱中衍生15min；衍生结束后，在50℃用氮气吹至近干，用磷酸盐缓冲液定容至1.0mL，涡旋30s溶解；取所得溶液1mL加入特异性检测体系，孵育50min结束后测定荧光信号特征值ΔF＝385.67，带入步骤五所得标准曲线，计算出花生样本中的AFB1含量为1.565ng/mL。所述乙腈-水溶液的体积比为84:16。
对比例1
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL黄曲霉毒素B2(AFB2)。
对比例2
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL黄曲霉毒素G1(AFG1)。
对比例3
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL黄曲霉毒素G2(AFG2)。
对比例4
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL赭曲霉毒素A(OTA)。
对比例5
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL伏马菌素B1(FB1)。
对比例6
与实施例1不同之处在于，检测对象为20ng/mL展青霉素(PAT)。
以2ng/mL的黄曲霉毒素B1(AFB1)为参照，对比例1-6的荧光信号特征值见图6。
由图6可以看出，将所构建的检测方法用于其他真菌毒素：黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A、伏马菌素B1和展青霉素的检测中时，即使以AFB1的10倍浓度也不会引起体系明显的荧光信号变化，只有在加入黄曲霉毒素B1溶液时体系的荧光强度才会有明显的改变，由此可见，本发明所构建的检测方法对黄曲霉毒素具有高特异性和高灵敏度。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备氨基功能化上转换纳米材料：
将上转换纳米材料进行稀土掺杂后，在避光条件下与聚乙烯亚胺搅拌后得到混合液，将混合液在200℃条件下反应12h，冷却后离心得到沉淀，洗涤沉淀并进行真空冷冻干燥，得到氨基功能化上转换纳米材料；
步骤二，在氨基功能化上转换纳米材料表面连接黄曲霉毒素B1适配体：将步骤一得到的氨基功能化上转换纳米材料分散于磷酸盐缓冲液中，加入戊二醛溶液进行表面活化；反应结束后，将表面活化后的氨基功能化上转换纳米材料重新分散于磷酸盐缓冲液中，加入黄曲霉毒素B1适配体孵育，得到表面连接适配体的上转换纳米粒子；
步骤三，采用液相剥离法制备黑磷纳米片：将黑磷晶体块于惰性气体条件下研磨粉碎，得黑磷粉末；将所得黑磷粉末加入经惰性气体鼓泡后的N-甲基吡咯烷酮溶液中，密封后超声剥离得到黑磷分散液；超声结束后离心分离得到黑磷纳米片；
步骤四，特异性检测体系的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子配制成表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液，加入步骤三得到的黑磷纳米片制备成的分散液，经孵育结合形成荧光共振能量转移供受体对后，即为特异性检测体系；
步骤五，黄曲霉毒素B1含量检测标准曲线的建立：将步骤二得到的表面连接适配体的上转换纳米粒子溶于缓冲液中，然后加入步骤三得到的黑磷纳米片制备的分散液，然后分别加入不同浓度的黄曲霉毒素B1标准溶液，得到不同浓度的检测液，经过孵育后，测定检测液的荧光强度信号特征值，以黄曲霉毒素B1浓度和荧光强度信号特征值进行线性拟合，建立黄曲霉毒素B1含量检测的标准曲线；
步骤六：食品样本中黄曲霉毒素B1含量的检测：将食品经预处理，提取得到含有食品中黄曲霉毒素B1的溶液，将所得溶液按照与步骤五过程相同操作加入步骤四的特异性检测体系，将测定的荧光强度信号特征值，带入步骤五所得的标准曲线，计算出食品中黄曲霉毒素B1的含量。
2.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤二中，所述氨基功能化上转换纳米材料、磷酸盐缓冲液、戊二醛溶液的体积比为10:5:1.25，活化时间为1.5-2.5h；
所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，摩尔浓度为10mM；
戊二醛溶液的浓度为质量分数25％；
所述氨基功能化上转换纳米材料与黄曲霉毒素B1适配体的比例为4mg:450nM，孵育时间为10-12h。
3.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤三中，所述N-甲基吡咯烷酮用惰性气体鼓泡的时间为15-30min，黑磷粉末与N-甲基吡咯烷酮的比例为40mg:40mL；
超声剥离的时间为12–18h，超声剥离过程中保持的低温应保持在0-25℃。
4.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤三中，离心分离黑磷纳米片的步骤为：首先将超声剥离得到的黑磷分散液于4000–5000rpm转速下离心除去未剥离的黑磷粉末，然后将上清液于10000–11000rpm转速下离心分离得到黑磷纳米片。
5.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤四中，所述表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液浓度为1mg/mL；所述黑磷纳米片分散液浓度为0.6mg/mL；所述表面连接适配体的上转换纳米粒子缓冲液与黑磷纳米片分散液的体积比为1:1。
6.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤五中，所述黄曲霉毒素B1标准溶液的浓度范围为0.2–500ng/mL；所述黄曲霉毒素B1标准溶液和特异性检测体系的体积比为1:2。
7.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤五中，所述测定检测溶液的荧光强度信号特征值的步骤为：测定980nm激发光激发下660nm处的荧光强度值，记录仅有特异性检测体系时的荧光强度值F0和加入黄曲霉毒素B1标准溶液之后特异性检测体系的荧光强度值F1；F1-F0即为检测溶液的荧光强度信号特征值。
8.根据权利要求1所述的黄曲霉毒素B1的检测方法，其特征在于，步骤六中，所述食品样本的预处理方法为：将食品样本加入乙腈-水溶液中，涡旋混匀，超声均质、离心后取上清液；所述乙腈-水溶液体积比为84:16。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113702370A (zh) * 2021-09-16 2021-11-26 盐城工学院 一种利用葡萄糖-金纳米粒子检测黄曲霉毒素b1的方法
CN114674791A (zh) * 2022-02-28 2022-06-28 江苏大学 一种染料功能化的柔性上转换发光固相传感器的制备方法及其应用
US11773322B2 (en) 2022-02-28 2023-10-03 Jiangsu University Preparation and application of dye-functionalized flexible upconversion-luminescence solid-phase sensor

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011020198A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Neoventures Biotechnology Limited Dna ligands for aflatoxin and zearalenone
CN103487418A (zh) * 2013-09-18 2014-01-01 广州阳普医疗科技股份有限公司 一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
CN104634964A (zh) * 2015-01-07 2015-05-20 中国检验检疫科学研究院 一种黄曲霉毒素b1的检测试剂盒及检测方法
CN105372213A (zh) * 2015-09-29 2016-03-02 江南大学 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
CN108333342A (zh) * 2018-05-14 2018-07-27 广东药科大学 一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
CN109668864A (zh) * 2018-12-14 2019-04-23 福建中医药大学 氮化碳纳米片耦合适配体传感的赭曲霉毒素a荧光检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011020198A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-24 Neoventures Biotechnology Limited Dna ligands for aflatoxin and zearalenone
CN103901000A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 江南大学 一种基于荧光共振能量转移检测伏马菌毒素b1的方法
CN103487418A (zh) * 2013-09-18 2014-01-01 广州阳普医疗科技股份有限公司 一种以碳纳米材料为受体的上转换荧光共振能量转移检测方法
CN104634964A (zh) * 2015-01-07 2015-05-20 中国检验检疫科学研究院 一种黄曲霉毒素b1的检测试剂盒及检测方法
CN105372213A (zh) * 2015-09-29 2016-03-02 江南大学 一种基于上转换发光纳米材料和金纳米棒之间发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法
CN108333342A (zh) * 2018-05-14 2018-07-27 广东药科大学 一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
CN109668864A (zh) * 2018-12-14 2019-04-23 福建中医药大学 氮化碳纳米片耦合适配体传感的赭曲霉毒素a荧光检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIE ZHOU等: "Black phosphorus nanosheets for rapid microRNA detection", 《NANOSCALE》 *
SHUYUE REN等: "Upconversion fluorescent aptasensor for bisphenol A and 17β-estradiol based on a nanohybrid composed of black phosphorus and gold, and making use of signal amplification via DNA tetrahedrons", 《MICROCHIMICA ACTA》 *
欧阳秀酝等: "基于荧光共振能量转移的免疫传感器检测黄曲霉毒素B1", 《食品与发酵工业》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113702370A (zh) * 2021-09-16 2021-11-26 盐城工学院 一种利用葡萄糖-金纳米粒子检测黄曲霉毒素b1的方法
CN114674791A (zh) * 2022-02-28 2022-06-28 江苏大学 一种染料功能化的柔性上转换发光固相传感器的制备方法及其应用
CN114674791B (zh) * 2022-02-28 2023-01-17 江苏大学 一种染料功能化的柔性上转换发光固相传感器的制备方法及其应用
WO2023160554A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 江苏大学 一种染料功能化的柔性上转换发光固相传感器的制备方法及其应用
US11773322B2 (en) 2022-02-28 2023-10-03 Jiangsu University Preparation and application of dye-functionalized flexible upconversion-luminescence solid-phase sensor

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