CN104749365A - 双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于采用二氧化硅同时包埋量子点和磁性纳米颗粒，构建了同时具有光学性质和超顺磁性的复合纳米球。分别将相应的量子点和纳米球与可以特异性识别食源性致病菌的单克隆抗体连接，得到能够与菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫量子点探针和免疫复合纳米球探针。这种复合结构的纳米球既可以作为免疫识别分离致病菌的载体，又可以作为免疫量子点探针的信号增强子，实现检测信号的二次放大，通过光学检测的方法得知待测样本中的目标微生物。所述的方法能够大大缩短检测时间（≤2小时），提高灵敏度（10²cfu/mL），适合于食品、环境样品的现场快速检测及基层普及应用。

Description

双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法

技术领域

本发明涉及一种基于双功能免疫复合纳米球快速检测食源性致病菌的方法，更确切地说本发明涉及双功能复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法，属于微生物检测领域，可以用于医学诊断、食品安全、环境监测等方面。

背景技术

细菌性病原体严重危害人类的健康。食源性致病微生物种类繁多，缺乏灵敏、便捷、特异的快速检测技术，是食品安全无法得到有效保障的主要原因之一。因此开发针对致病菌的快速、灵敏、可靠的检测方法和现场、便携的检测仪器，是食品安全和国家安全保障的迫切需要。

用传统的微生物选择培养方式来检测致病菌的存在，结果虽然可靠，被视为微生物检测的金标准。但是，传统的微生物培养法耗时长、步骤繁琐、需要多种培养基和试剂，无法满足当今社会一些突发事件对微生物现场快速检测的迫切需求。因此基于分子生物学的各种检测方法应运而生。这些方法概括起来主要有三类：（1）基于链式聚合反应（PCR）的检测。PCR方法敏感、准确、快速,可替代病原学检测；（2）基于免疫反应的检测。这类方法经济实用，重现性好，快速，目前大多数食品微生物快速检测的商业化产品的反应原理是基于三明治免疫分析，即免疫复合物包含固定抗体、靶细菌和二抗标记物。（3）生物传感器。它是与生物、生物衍生物相关的分析器件、联合或者集成的物理化学传感器或者转换微系统。与传统的检测方法相比,生物传感器具有体积小、成本低、灵敏度高、选择性及抗干扰能力强和响应快等优点，在食品安全检测中具有广泛的应用价值，是食品安全检测的一个重要发展趋势。

多功能纳米材料在医学诊断、食品安全、环境监测等领域具有巨大的潜能。多功能纳米粒子拥有磁、热、表面等离子体共振和荧光性质已报道。合理设计多功能纳米结构是生物传感器检测和诊断的关键，如晶体结构和粒径的控制，表面性质的设计，结合特异性的生物分子（抗体、DNA、酶等）。这些是关键参数决定检测灵敏度、准确性和特异性。

复合纳米结构包含两种或两种以上的功能纳米材料，代表一类重要的多功能纳米系统。量子点又称半导体纳米微晶体，是一种由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素组成的能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，其颗粒直径一般约为1-100nm。由于其具有独特的量子尺寸效应和表面效应，表现出优良的光谱特征和光化学稳定性。利用量子点进行荧光标记，相比传统的有机染料分子具有许多优点，如广泛的吸收光谱、狭窄的发射光谱、高荧光量子产率、抗光漂白性等。磁性颗粒具有粒径小，比表面积大，表面有许多悬空键，可以通过共聚、表面改性赋予其表面多种反应性功能基（如羧基、氨基、巯基、生物素、单克隆抗体等）等优点；同时生物相容性良好，有利于生物分子（如：酶、核酸、抗体等）的固定；易于在磁场作用下迅速聚集，所以广泛应用于生物分析领域。将这两种纳米材料组合成复合纳米结构不仅可以阻止超顺磁纳米颗粒聚集，还能够减轻量子点的生物毒性，同时兼具量子点和磁性纳米颗粒的优良性能。硅纳米粒内部不仅可包埋大量的且可调控荧光物质和磁性氧化铁，具有较强的荧光强度和超顺磁性；由于硅壳的保护，使得荧光染料不易外泄而具有光稳定性，借助MRI、激光共聚焦扫描显微镜及透射电镜可实现对细胞进行原位标记、追踪和造影，加之硅壳表面富含羟基，易被其他的生物分子、靶向剂等官能团进行表面修饰，从而改善纳米粒的物理化学性能，且可作为携带药物和基因载体。

近年来，很多研究者基于免疫学原理在开发致病菌检测新方法和新器件方面做了很多有益的探索。2005年Hahn等用链酶亲和素修饰的量子点荧光抗体探针检测O157∶H7，其检测灵敏度比使用普通有机荧光染料探针要高出两个数量级，且荧光发光时间达到数小时，远优于普通染料的数秒发光；同时由于链亲和素-生物素体系的放大作用，进一步提高了检测灵敏度，实现了单细胞的检测。Tan课题组使用抗体连接的硅基荧光纳米材料发展了一种快速、超灵敏的原位免疫分析方法，这种方法不需要扩增和富集就能达到检测单种菌。2009年Pividori课题组利用由石墨-环氧复合物构建了一种磁传感器，可以通过免疫的方法在富集捕获致病菌的同时，通过电化学检测或者双标记PCR检测Salmonella，具有灵敏，快速的优点。基于抗原抗体结合原理，尽管在致病菌检测方面已经出现了很多新方法，但是在如何提高检测灵敏度和缩短检测时间方面，仍然是亟待解决的问题。因此引入功能性的新型纳米材料有望可以为致病菌灵敏快速检测带来新的契机。这也成为本发明的构思。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双功能免疫复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法。本方法所述的双功能复合纳米球采用二氧化硅同时包埋磁性氧化铁纳米颗粒和量子点，构建了同时具有光学性质和超顺磁的双功能纳米球。然后将双功能复合纳米球分别将量子点和纳米球与可以特异性识别食源性致病菌的单克隆抗体连接，得到能够与菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫量子点探针和免疫复合纳米球探针。这种复合结构的纳米球既可以作为免疫识别分离致病菌的载体，又可以作为前面“标签”的信号增强子，实现检测信号的二次放大，通过光学检测可以知道待测样本中是否存在目标微生物。这样通过磁性纳米颗粒免疫分离和量子点“双重标签”的信号扩增效应，能够大大缩短检测时间，提高灵敏度。适合于食品、环境样品的现场快速检测及基层普及应用。

技术方案

本发明涉及一种双功能免疫复合纳米球及快速检测食源性致病菌的方法。具体是所述的双功能免疫fuhe纳米球是硅基复合纳米球，由二氧化硅同时包埋磁性纳米颗粒和量子点形成，然后分别将纳米球和相应量子点与可以特异性识别目标食源性致病菌的单克隆抗体连接，得到能够与菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫纳米球探针和免疫量子点探针；然后用以上两种探针通过免疫的方法捕获、标记和分离菌悬液或者样品中的致病菌；最后通过光学检测特征吸收峰的强度，从而实现待测菌的检测。通过这种双功能纳米球一方面可以实现待测菌的免疫磁分离，另一方面实现光学信号的二次放大，显著提高致病菌检测的灵敏度（10²cfu/mL）和缩短检测时间（≤2小时）。

所述的双功能复合纳米球的制备方法，其包括以下步骤：

（1）水、乙醇、氨水按照一定比例混合，上限体积比例为33：16：1，下限体积比例为20：16：15；

（2）加入磁性纳米颗粒和量子点；

（3）加入正硅酸乙脂和乙醇的混合液（上限体积比例为4：21；下限体积比例为1：24），搅拌反应，生成纳米球；

（4）磁分离和乙醇清洗，真空干燥。

利用双功能复合纳米球快速检测食源性致病菌的方法，包括以下步骤：

（1）制备双功能复合纳米球，同时具有磁性和光学性能；

（2）构建免疫双功能纳米球探针，即特异性识别目标食源性致病菌的单克隆抗体与复合功能纳米球连接；

（3）构建免疫量子点探针，即特异性识别目标食源性致病菌的单克隆抗体与量子点连接；

（4）采用三明治夹心免疫分析法对目标食源性致病菌进行检测。具体步骤包括：

步骤a）：样品的预处理

按照不同样品的性质进行相应的预处理，制备成合适的样品溶液。

步骤b）：目标致病菌的富集

将免疫双功能纳米球探针加入到样品溶液中，共孵育，充分反应后，磁分离除去上清液，缓冲液洗涤两次，以达到去除杂菌的目的，从而得到包含目标致病菌和纳米球探针的缓冲溶液。

步骤c）：免疫量子点探针标记

在步骤b）所述样品中加入一定量的免疫量子点探针，共孵育，充分反应后，磁分离除去上清液，缓冲液洗涤两次，可以去除多余的量子点探针，得到形成类似三明治结构（量子点探针-目标致病菌-纳米球探针）的缓冲溶液。

步骤d）：荧光测定

将步骤c）所述溶液置荧光光谱仪中测定其特征吸收峰的强度，从而判定目标微生物的数量。

附图说明

图1包埋超顺磁性纳米颗粒和量子点的双功能纳米球的示意图；

图2基于双功能纳米球快速检测致病菌的流程示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例的介绍，进一步阐述本发明的实质性特点和显著的进步，但本发明决非仅局限于实施例。

实施例1:双功能纳米球的制备

本发明中双功能纳米球通过改进的法制备获得。具体是在一定浓度的氨水催化下，正硅酸乙酯在乙醇溶液中水解得到的。通过调节氨水、正硅酸乙酯、乙醇、水、磁性纳米颗粒和量子点的相对浓度，可以改变双功能纳米球的性质和尺寸。一个典型的合成过程如下：

24.75mL水，16.25mL乙醇和9.0mL氨水充分混合，然后加入20μL磁性氧化铁纳米颗粒和20μL碲化镉量子点，再迅速加入4.5mL正硅酸乙酯和45.5mL乙醇的混合液，搅拌反应2小时，即生成纳米球。通过磁分离和乙醇清洗三次，真空干燥过夜，得到单分散性良好，尺寸均一的双功能复合纳米球。

实施例2:免疫双功能硅基纳米球探针的构建

首先对实施例1制备的双功能复合纳米球进行表面改性，具体是将0.5g纳米球溶于50mL吡啶中，加入0.2g琥珀酸酐和0.02g4-二甲氨基吡啶，常温搅拌过夜，磁分离，用甲醇和水分别清洗两次。

然后将肠出血性大肠杆菌（E.coli O157:H7）抗体与双功能纳米球共价连接，其操作步骤如下：

取500μg纳米球于1.5mL离心管中，加入1mL清洗缓冲液，混合均匀充分洗涤，磁分离洗涤两遍后，重悬在250μL2-(N-吗啉基）乙磺酸中，再分别加入500μg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基琥珀酰亚胺，37℃活化15分钟，然后用MES清洗两次，重悬后加入50μg的抗体，室温反应2h，将抗体偶联于纳米球表面，得到免疫纳米球。用PBS洗涤偶联后磁珠2遍，加入50μL含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，保存于4℃冰箱待用。

实施例3:免疫量子点探针的构建

取500μL量子点于1.5mL离心管中，加入1mL清洗缓冲液，混合均匀充分洗涤，离心分离洗涤两遍后，重悬在250μL2-(N-吗啉基）乙磺酸中，再分别加入500μg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基琥珀酰亚胺，37℃活化15分钟，然后用MES清洗两次，重悬后加入50μg的抗体，室温反应2h，将抗体偶联于纳米球表面，得到免疫纳米球。用PBS洗涤偶联后磁珠2遍，加入50μL含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）中，保存于4℃冰箱待用。

实施例4：基于双功能免疫纳米球快速检测食品中的肠出血性大肠杆菌

a)牛奶样品的预处理

将牛奶离心（3000转，5分钟），去除上清液，加入1-10mL的磷酸盐缓冲液（pH=7.4）。

b)目标致病菌的富集

在室温中将一定量免疫双功能纳米球加入到样品溶液中，在涡旋混合器混匀1分钟，磁分离，小心的除去上清液，然后用PBS缓冲液（pH=7.4）洗涤两次，得到包含免疫纳米球-目标致病菌混合物的溶液。

c)免疫量子点探针标记

在上述混合物中加入一定量的免疫量子点探针，在涡旋混合器混匀1分钟，磁分离，小心的除去上清液，PBS缓冲液（pH=7.4）洗涤两次，去除多余的量子点探针，得到形成类似三明治结构（量子点探针-目标致病菌-纳米球探针）的混合物溶液。

d)荧光测定

将上述溶液置荧光光谱仪中测定其特征吸收峰。根据其特征吸收峰的强度判定目标微生物的数量。

应说明的是本发明所述的食源性致病菌、目标微生物、目标致病菌均是同等含义，只是为了更适合实际表述用法，采用了不同的称呼。

Claims (10)

1.一种双功能复合纳米球，其特征在于它是一种硅基复合纳米球，由二氧化硅同时包埋量子点和磁性纳米颗粒而形成；

其中，a）所包埋的磁性纳米颗粒是经过表面修饰的Fe₃O₄纳米颗粒或者γ-Fe₂O₃纳米颗粒；

b）包埋的量子点是经过表面修饰的碲化镉量子点或硒化镉量子点。

2.制备由权利要求1所述的双功能复合纳米球的方法，其特征在于通过改进的方法制备,是通过调节氨水、正硅酸乙酯、乙醇、水、磁性纳米颗粒和量子点的相对浓度，改变双功能纳米球的性质和尺寸；包括以下步骤：

（1）水、乙醇、氨水按照比例混合，上限体积比为33:16:1，下限体积比为20:16:15；

（2）加入磁性纳米颗粒和量子点；

（3）加入正硅酸乙脂和乙醇的混合液，搅拌反应，生成纳米球；正硅酸乙脂和乙醇的上限体积比为4:21，下限体积比为1:24；

（4）磁分离和乙醇清洗，真空干燥。

3.按权利要求2所述的方法，其特征在于先将24.75mL水，16.25mL乙醇和9.0mL氨水充分混合，然后加入20μL磁性氧化铁纳米颗粒和20μL碲化镉量子点，再迅速加入4.5mL正硅酸乙酯和45.5mL乙醇的混合液，搅拌反应2小时，即生成纳米球；通过磁分离和乙醇清洗三次，真空干燥过夜，得到单分散性良好，尺寸均一的双功能纳米球。

4.使用如权利要求1所述的双功能复合纳米球快速检测食源性致病菌的方法，其特征在于将所述的双功能复合纳米球分别将量子点和复合纳米球与需检测的特异性识别食源性致病菌的单克隆抗体连接，得到与菌表面抗原进行抗原-抗体反应的免疫量子点探针和免疫复合纳米球探针；复合结构的纳米球作为免疫识别分离致病菌的载体，最后通过光学检测的方法就得知待测样本中的目标致病菌。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于所述的免疫量子点探针的构建方法是取500μL量子点于1.5mL离心管中，加入1mL清洗缓冲液，混合均匀充分洗涤，离心分离洗涤两遍后，重悬在250μL2-(N-吗啉基）乙磺酸中，再分别加入500μg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基琥珀酰亚胺，37℃活化15分钟，然后用MES清洗两次，重悬后加入50μg的抗体，室温反应2h，将抗体偶联于纳米球表面，得到免疫纳米球，用PBS洗涤偶联后磁珠2遍，加入50μL含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，保存于4℃冰箱待用，所述的缓冲液pH=7.4。

6.按权利要求4所述的方法，其特征在于所述的免疫复合纳米球的构建方法是将经表面改性的免疫复合纳米球与肠出血性大肠杆菌E.coli O157:H7抗体共价连接，操作步骤为：

取500μg纳米球于1.5mL离心管中，加入1mL清洗缓冲液，混合均匀充分洗涤，磁分离洗涤两遍后，重悬在250μL2-(N-吗啉基）乙磺酸中，再分别加入500μg1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和750μg N-羟基琥珀酰亚胺，37℃活化15分钟，然后用MES清洗两次，重悬后加入50μg的抗体，室温反应2h，将抗体偶联于纳米球表面，得到免疫纳米球，再用PBS洗涤偶联后磁珠2遍，加入50μL含有1%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，保存于4℃冰箱待用，缓冲液的pH=7.4。

7.按权利要求6所述的方法，其特征在于所述的双功能纳米球的表面改性是将0.5g纳米球溶于50mL吡啶中，加入0.2g琥珀酸酐和0.02g4-二甲氨基吡啶，常温搅拌过夜，磁分离，用甲醇和水分别清洗两次。

8.按权利要求4所述的方法，其特征在于光学检测目标食用性致病菌的步骤包括：

步骤a：样品的预处理

按照不同样品的性质进行相应的预处理，制备成合适的样品溶液；

步骤b：目标致病菌的富集

将免疫双功能纳米球探针加入到样品溶液中，共孵育，充分反应后，磁分离除去上清液，缓冲液洗涤两次，以达到去除杂菌的目的，从而得到包含目标致病菌和纳米球探针的缓冲溶液；

步骤c：免疫量子点探针标记

在步骤b所述样品中加入一定量的免疫量子点探针，共孵育，充分反应后，磁分离除去上清液，缓冲液洗涤两次，可以去除多余的量子点探针，得到形成量子点探针-目标致病菌-纳米球探针的三明治结构的缓冲溶液；

步骤d：荧光测定

将步骤c所述溶液置荧光光谱仪中测定其特征吸收峰的强度，从而判定目标微生物的数量。

9.按权利要求8所述的方法，其特征在于目标检测食用性致病菌为肠出血性大肠杆菌的方法是：

a)牛奶样品的预处理

将牛奶经3000转/个，5分钟离心后，去除上清液，加入1-10mL的pH=7.4的磷酸盐缓冲液；

b)目标致病菌的富集

在室温中将免疫双功能纳米球加入到样品溶液中，在涡旋混合器混匀1分钟，磁分离，小心的除去上清液，然后用pH=7.4的PBS缓冲液洗涤两次，得到包含免疫纳米球-目标致病菌混合物的溶液；

c)免疫量子点探针标记

在上述混合物中加入免疫量子点探针，在涡旋混合器混匀1分钟，磁分离，小心的除去上清液，pH=7.4的PBS缓冲液洗涤两次，去除多余的量子点探针，得到形成类似量子点探针-目标致病菌-纳米球探针的三明治结构混合物溶液；

d)荧光测定

将上述溶液置荧光光谱仪中测定其特征吸收峰。根据其特征吸收峰的强度判定目标微生物的数量。

10.按权利要求4-9中任一项所述的方法，其特征在于检测的灵敏度达10²cfu/mL，检测时间缩短为≤2小时。