CN102590506A - 一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物食源性致病菌检测领域，公开了快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，以生物功能化超顺磁性纳米粒子和免疫化的荧光量子点免疫识别目标微生物，实现特异性检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌。本方法不仅能够从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，且富集分离后的细菌经快速的荧光标记，既能通过荧光显微镜定性鉴定，又能被荧光分光光度计定量的检测；操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

Description

一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法

技术领域

本发明涉及微生物食源性致病菌检测领域，公开了一种以生物功能化超顺磁性纳米粒子和免疫化的荧光量子点免疫识别目标微生物，实现特异性检测食源性致病菌金黄色葡萄球菌的方法。

背景技术

随着生活水平的提高，人们越来越重视食品安全的问题。2003～2004年的统计结果显示，我国食物中毒致病因素依次为微生物性、化学性、有毒动植物性病原。微生物性病原是导致食物中毒的主要因素，中毒人数最多。因此，快速而准确地检测与鉴定食品中的病原菌是及时有效控制和预防病原细菌传播、预防食物中毒的重要前提。

金黄色葡萄球菌是一群常堆积成葡萄串状，革兰氏阳性球菌，无芽孢、无鞭毛，不能运动，大多数无荚膜。本菌广泛分布于自然界，如空气、土壤、水及其它环境中，是公共场所的一种主要病原菌。金黄色葡萄球菌是污染食品和引起食物中毒的主要病原菌，也是引起化脓性炎性反应、败血症及脓毒血症的病原菌，同时也是检测医院消毒效果和医源性感染的一个重要指标。在历年食物中毒调查中.该菌占整个细菌性食物中毒的第一位或第二位。

目前，国内检测食品中金黄色葡萄球菌仍采用传统的方法，传统的细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，操作繁琐复杂、耗时费力，而且无法对人工难以培养的病原菌进行检测。近年来，随着生物学技术的迅速发展，出现了很多适合于食源性细菌检测和分析的分子生物学方法和免疫学方法。这些方法具有操作简便、快速、灵敏度高和特异性强等特点，通常只需要24～48h就可以获得检测结果。常用的免疫学方法主要包括ELISA、免疫胶体金技术等；分子生物学方法则主要有依赖PCR的DNA指纹图谱技术、多重PCR、基因芯片、定量PCR和实时荧光定量PCR等技术。这些方法虽然提高了检测的灵敏度，大大缩短了检测时间，但是都存在一定的缺陷。例如ELISA对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分；对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应；分析分子量很小的化合物或很不稳定的化合物有一定的困难。在致病菌的分子生物学检测方法方面，由于检样中存在死的致病菌、特异性DNA或RNA片段存在同源性和检样中存在不可培养微生物的情况等问题，常常造成PCR检测结果与常规方法相比，阳性率变高的现象，除存在不可培养微生物的情况外，均属于假阳性范畴。

免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病菌发生特异性的结合，载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病菌不断得到分离、浓缩。免疫磁性分离技术代替了常规的选择性增菌培养过程，可特异有效地将目的微生物从样品中快速的分离出来。金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)是致病性金黄色葡萄球菌细胞表面一种特有的蛋白质，它具有与人IgG的Fc片段特异性结合的能力，每个SPA分子可以同时结合2个人IgG分子，因此，可用来建立一种致病性金黄色葡萄球菌快速分离检验的体系。

为了食品安全，为了寻求更简便、快速、灵敏的食源性致病菌金黄色葡萄球菌的检测方法，研发了一种特异性磁性分离荧光标记定性定量检测金黄色葡萄球菌的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法。

这种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：

(1)免疫化的超顺磁纳米粒子加入到待测样品，30～40℃混合反应20～60min，使免疫化的超顺磁纳米粒子与金黄色葡萄球菌发生特异性结合；

(2)在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，用磷酸缓冲液洗涤后加入免疫化的荧光量子点，30～40℃混合反应20～60min，使量子点和吸附在免疫化超顺磁纳米粒子的致病微生物金黄色葡萄球菌发生特异性结合；

(3)利用外加磁场收集免疫化超顺磁纳米粒子，用磷酸缓冲液洗涤后定性或定量荧光检测；

所述的免疫化超顺磁纳米粒子为表面偶联人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化荧光量子点为与人免疫球蛋白IgG连接的量子点。

所述免疫化超顺磁纳米粒子为以四氧化三铁纳米粒子为核心，醛基化修饰，表面偶联人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化荧光量子点为与人免疫球蛋白IgG连接的量子点。

步骤(2)和(3)所述的外加磁场为2000～6500Gs。

所述的免疫化超顺磁性纳米磁珠制备方法包括如下步骤：

(1)醛基化磁珠的制备：将以四氧化三铁为核心的纳米磁珠与聚乙二醇混合，加入介质乙醇/双蒸水，再依次加入丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和过氧化苯甲酰，搅拌20～60min；温度升至60～70度，反应8～12h，洗涤，用磁场分离，获得了醛基功能化的磁珠；

其中四氧化三铁为核心的纳米磁珠与聚乙二醇、丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和过氧化苯甲酰的重量比为1∶80～150∶10～20∶200～300∶80～120。

(2)连接抗体：人类免疫球蛋白IgG溶在磷酸缓冲溶液中，加到步骤(1)中制得的醛基化磁珠中，4℃轻摇2.5小时。(IgG与醛基化磁珠的质量比为1∶8～20，优选为1∶8～10)。多余的抗体用磁性分离器分离，用PBS清洗2～5次；悬浮在相同的缓冲液中，4℃保存。

所述免疫化荧光量子点的制备方法包括如下步骤：

(A)将pH 7.25～7.5、含有交联剂的磷酸缓冲液与表面修饰有羧基的量子点混合，反应5～20min以活化羧基；交联剂优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，反应时交联剂的浓度为10～50mg/mL；

(B)加入保护剂反应20～60min；保护剂优选为N-羟基硫代琥珀酰亚胺，浓度为5mg/mL至20mg/mL；

(C)加入人类免疫球蛋白IgG混合，反应0.5～4hr，除去未反应的人类免疫球蛋白IgG，收集免疫化荧光量子点；

所述人类免疫球蛋白IgG与量子点的用量比为20～40g/mol。

半导体量子点，简称为量子点(quantum dots)，通常由周期表II-VI或III-V族元素合成的半导体材料，正是由于量子点的超微尺寸，半径从10～100nm，这个物理尺寸决定了它们的量子效应，使其具有独特的性质。相对于有机荧光基团，QDs具有独特的光学和电子性能，量子点的激发光谱宽而且呈连续连续分布，同时荧光发射光谱的半宽峰高(FWHM)窄且对称分布，典型的半宽峰高为30nm，此外，量子点与荧光染料相比，激发和发射光谱之间的斯托克斯位移大，有利于荧光信号的检测。同时量子点的荧光发射波长可充分利用其量子效应通过控制其合成时的直径大小和材料组分来进行连续调谐，因此合成不同直径大小的量子点就能获得多种可以辨别的不同颜色荧光，使其荧光发射范围从可见光至红外波长，此外，量子点还具有非常好的量子产额、好的耐光漂白的稳定性以及长的荧光寿命的优点。这些性质为荧光成像、荧光检测以及超灵敏生物鉴定和诊断提供了新的可能性。

致病性金黄色葡萄球菌细胞表面一种特有的蛋白质金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)能够与人IgG的Fc片段特异性结合，每个SPA分子可以同时结合2个人IgG分子，与IgG偶联的纳米磁珠能与样品中被检微生物食源性致病菌金黄色葡萄球菌发生特异性结合。

连有食源性致病菌金黄色葡萄球菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，利用外加磁场(2000～6500Gs)吸附收集上述磁性粒子，弃去检样混合液；在此基础上，将偶联有人IgG的荧光量子点加入到浓集后的反应体系中，使之与连有磁性颗粒的食源性致病菌金黄色葡萄球菌发生特异性结合。提供外加磁场，被载于磁性颗粒并且偶联有荧光量子点的目标微生物金黄色葡萄球菌向磁极方向聚集，弃去检样混合液，利用外加磁场(2000～6500Gs)吸附磁性粒子收集磁性粒子，可进行荧光定性定量检测。若样品中含有金黄色葡萄球菌，通过上述方法，可将免疫化的荧光量子点(间接)连接到免疫化超顺磁纳米粒子，经过磁性收集，进行荧光检测(复合物结构：免疫量子点-金黄色葡萄球菌-免疫磁珠)。

本发明方法不仅能够从各种样本中迅速分离目标菌，同时加以高效富集，且富集分离后的细菌经快速的荧光标记，既能通过荧光显微镜定性鉴定，又能被荧光分光光度计定量的检测。整个检测过程仅需2个小时，操作方便、简单，可靠性好，对配套设备要求低。

附图说明

图1为醛基化磁珠与IgG的连接示意图。

图2为免疫量子点-金黄色葡萄球菌-免疫磁珠复合物在可见光(A)和紫外光激发(B)下的照片。

图3为金黄色葡萄球菌浓度(x)与荧光吸收(y)的线性关系

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明：

实施例1 免疫化超顺磁性纳米磁珠的制备

1、醛基化超顺磁性纳米磁珠的制备

将以四氧化三铁为磁核的磁珠0.06g和6.0g聚乙二醇混合，加到6mL的双蒸水中，分散30分钟。混合液室温下移到摇瓶中，连续搅拌。115mL的分散介质乙醇/双蒸水(V∶V＝3∶2)加到瓶中。8mL(0.68g)丙烯醛，15mL(13.5g)苯乙烯，0.3mL(0.28g)二乙烯苯，6.0g过氧化苯甲酰依次加入，搅拌30min。温度升至65℃，反应持续10h，可以获得浅棕色乳液。用0.1M的盐酸和双蒸水洗几次，磁场分离。获得了醛基功能化的磁珠。

2、醛基化磁珠和人免疫球蛋白IgG的连接

1mg人类IgG(溶在PH7.2，0.01mol/l的磷酸缓冲溶液中)加到2mL醛基化磁珠中(5mg/mL)，4℃轻摇2.5小时。多余的抗体用磁性分离器分离，用PBS(PH6.0，0.01mol/l，含0.1％BSA)清洗3次。收集到的产物悬浮在相同的缓冲液中，4℃保存。

实施例2  荧光量子点与人免疫球蛋白IgG的连接

将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)作为交联剂，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)作为保护剂，将表面修饰有羧基的量子点(QDs-COOH)与抗体(Ab)上的末端氨基交联反应生成酰胺键，得到免疫化的量子点。抗体与量子点的摩尔比为1∶10至1∶30。

具体做法为：60ul(7.8*10^-6mol)QDs(发红光)原液加入到磷酸缓冲溶液PBS(0.01mol/L，pH 7.2)和6mg EDC·HCL(最终浓度为20mg/mL)的混合液中，混合液室温下涡旋5min，再反应15-20min以便让QDs上的自由羧基完全活化；同样的，1.5mg NHS(最终浓度为5mg/mL)加入到上面的混合液中，室温涡旋15min，反应60min，在这步中，QDs上的自由羧基和NHS上的羟基酯化反应生成半稳定的具有胺活性的NHS(羟基丁二酰胺)-酯。接下来120ul抗体(2mg/ml)加到体系中，涡旋至少2h，没反应的抗体分子最后通过超滤浓缩离心管去除掉，QDs和抗体通过强烈的共价键结合在一起，最后收集产品，0～4℃保存。

实施例3 样品的检测

检测的原理如图1所示。将实施例1制得的免疫化的超顺磁性纳米磁珠分散在磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.2)中(浓度为mg/ml，分别取用50μL的免疫磁珠滴入3mL不同浓度(10⁵cfu/mL，10⁴cfu/mL，10³cfu/mL，10²cfu/mL，10cfu/mL)的金黄色葡萄球菌菌液样品液中。室温摇床振荡充分反应0.5h，在外加磁场的作用下，用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.2)洗涤2～3次，定容至0.2mL体系，得到“磁珠-沙门氏菌”复合物。

然后向洗涤后的体系中分别滴加50uL实施例2中制备的的免疫化的量子点，在室温摇床下振荡0.5h，使金黄色葡萄球菌表面上的抗原与量子点上连接的IgG抗体充分免疫结合，在外加磁场的作用下，用磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 7.2)洗涤3～4次，目的是去除未结合的免疫量子点，最终分别用600ul的PBS悬浮。采用配有数码CCD相机(Olympus，DP70)的荧光显微镜(Olympus，BX51)对上述各100μL的体系进行暗场(荧光)与明场(日光)观察。具体步骤如下，将上述600μL的体系，先涡流2min混合均匀，取15μL滴于载玻片上，盖上盖玻片，观察体系中结合物。荧光光度计测定其FIs。

图2为免疫量子点-金黄色葡萄球菌-免疫磁珠复合物在可见光(A)和紫外光激发(B)下的照片。

结果判定与报告：

结果判定结合发荧光菌体的形态、荧光亮度与菌量综合判定。

阳性及可疑阳性结果：菌体红色荧光亮度为+，菌体形态特征符合金黄色葡萄球菌，且多数视野中均能检出数个菌体。

阴性结果：无红色荧光，或菌形模糊，为阴性。

报告方法：

量子点荧光镜检结果为阴性：报告为“未检出金黄色葡萄球菌”。

量子点荧光镜检结果为阳性或可疑阳性结果：结果记录中出现阳性或可疑阳性结果，均应按依照国家标准对阳性结果及可疑阳性结果进行培养法检查，并根据培养法检查结果做报告。

图3为金黄色葡萄球菌浓度(x)与荧光吸收(y)的线性关系。

从图中可以看出，被免疫磁珠分离出的金黄色葡萄球菌可被免疫量子点特异性结合。经荧光分光光度计检测，OD值与菌浓度成正比。现阶段检测限大约在10²cfu/ml左右。

Claims (7)

1.一种快速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)免疫化的超顺磁纳米粒子加入到待测样品，30～40℃混合反应20～60min，使免疫化的超顺磁纳米粒子与金黄色葡萄球菌发生特异性结合；

(2)外加磁场，在外加磁场吸引作用下，收集免疫化的超顺磁纳米粒子，洗涤后加入免疫化的荧光量子点，30～40℃混合反应20～60min，使量子点和吸附在免疫化超顺磁纳米粒子表面的金黄色葡萄球菌发生特异性结合；

(3)利用外加磁场收集免疫化超顺磁纳米粒子，洗涤后定性或定量荧光检测；

所述的免疫化超顺磁纳米粒子为表面偶联人免疫球蛋白IgG的磁性粒子；所述的免疫化荧光量子点为与人免疫球蛋白IgG连接的量子点。

2.权利要求1所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的免疫化超顺磁纳米粒子的制备方法包括以下步骤：

(1)醛基化磁珠的制备：将以四氧化三铁为核心的纳米磁珠与聚乙二醇混合，加入体积浓度为60％～70％的乙醇水溶液，再依次加入丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和过氧化苯甲酰，搅拌30min；60～70度下反应9～12h，洗涤，用磁场分离，收集固体，获得醛基化磁珠；

(2)、连接抗体：步骤(1)中制得的醛基化磁珠中加入含有人免疫球蛋白IgG的磷酸缓冲溶液，2～6℃振荡2～4小时；IgG与醛基化磁珠的质量比为1∶8～20；取固体洗涤。

3.权利要求2所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，四氧化三铁为核心的纳米磁珠与聚乙二醇、丙烯醛、苯乙烯、二乙烯苯和过氧化苯甲酰的重量比为1∶80～150∶10～20∶200～300∶80～120；IgG与醛基化磁珠的质量比为1∶8～10。

4.权利要求1所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述的免疫化荧光量子点的制备方法包括以下步骤：

(A)将pH 7.25～7.5、含有交联剂的磷酸缓冲液与表面修饰有羧基的量子点混合，反应5～20min以活化羧基；反应时交联剂的浓度为10～50mg/mL；

(B)加入保护剂反应20～60min；保护剂浓度为5mg/mL至20mg/mL；

(C)加入人类免疫球蛋白IgG混合，反应0.5～4hr，除去未反应的人类免疫球蛋白IgG，收集免疫化荧光量子点。

5.权利要求4所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述人类免疫球蛋白IgG与量子点的用量比为20～40g/mol。

6.权利要求4所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，保护剂为N-羟基硫代琥珀酰亚胺。

7.权利要求4所述速检测筛选金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于，步骤(2)和(3)所述的外加磁场为2000～6500Gs。

Images