CN108753941B - 双重标记磁珠及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双重标记磁珠及其制备方法和应用。该双重标记磁珠在醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠表面固定有捕获抗体和固定寡核苷酸片段，在检测时，当捕获抗体捕获有目标微生物时，可以产生第一重信号。该第一重信号的有无可以反映出磁珠通过特异性的捕获抗体有无捕获到微生物。后续进一步可以通过特异性设计的第二扩增引物对对捕获的微生物的特异性核酸区域进行扩增，并借助第二荧光检测探针检测得到第二重信号，该第二重信号的有无即可反映由捕获抗体捕获的微生物是否是目的微生物。通过双重信号进行微生物检测，检测结果的准确性和可靠性显著提高，并且在检测时，首先经由捕获抗体捕获和富集目的微生物，因而检测灵敏度也显著提高。

Description

双重标记磁珠及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种双重标记磁珠及其制备方和应用。

背景技术

1947年，Dick G W等在非洲乌干达的恒河猴体内发现了一种全新的黄病毒，并将之命名为寨卡病毒(Zika virus)。五年后，同样在乌干达报道了人类首例临床病例。在随后的50多年时间里，有报道的寨卡病例仅局限在非洲和亚洲地区，且只呈散发流行。直到2007年，在雅浦群岛暴发了寨卡病毒大规模流行，总共约73％的人口受到了感染，其中18％的人口有临床症状产生。自此以后，寨卡疫情有向全球蔓延的趋势，近两年在美洲和东南亚暴发的寨卡疫情充分验证了这一点。目前为止，全球已有67个国家和地区报道了寨卡病例，一百多万人口遭受了寨卡病毒的感染。WHO宣布寨卡病毒疫情已构成国际关注的突发公共卫生事件，并且称聚集性婴儿小头病例和某些神经系统混乱疾病如格林－巴利综合症与寨卡病毒有关联。

对寨卡病毒的早期诊断有助于有效遏制疾病的传播，目前针对寨卡病毒检测主要方法包括寨卡病毒血清学检测以及RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法对病毒核酸进行检测。但无论是血清学检测还是核酸检测法，一般只能产生单个检测信号，也即都是单信号检测，由于病毒复杂的特性，如会与其他病毒产生交叉反应等，单信号检测往往会导致假阳性或假阴性的结果，影响检测结果的准确性和可靠性。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够提高病毒检测结果的准确性和可靠性的双重标记磁珠及其制备方法和应用。

一种双重标记磁珠，包括醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠以及固定在所述纳米氧化铁磁珠表面的捕获抗体和固定寡核苷酸片段，所述捕获抗体通过其端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定，所述固定寡核苷酸片段通过其5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定。

在其中一个实施例中，所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠是四氧化三铁和γ氧化亚铁的混合纳米粒子构成的，其中，Fe²⁺和Fe³⁺的浓度之和为0.03mol/L～1mol/L，优选为0.09mol/L，Fe³⁺与Fe²⁺的摩尔比为(0.25～4):1，优选为2:1，Fe²⁺和Fe³⁺的物质的量之和与醛基葡聚糖的物质的量的比例为1:(2～12)，优选为1:10。

在其中一个实施例中，所述捕获抗体是兔抗寨卡病毒特异性多克隆抗体，分子量为165kDa，具有特异性识别寨卡病毒的位点。所述捕获抗体与所述醛基包被的纳米氧化铁磁珠的质量比为(5～100):1。

在其中一个实施例中，所述固定寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示，所述固定寡核苷酸片段与固定有所述捕获抗体的纳米氧化铁磁珠的质量比为1:(6.25～50)。

在其中一个实施例中，所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠的粒径为50nm±15nm，优选为50±10nm，更优选为50nm。

一种检测试剂盒，包括上述任一实施例所述的双重标记磁珠，还包括第一扩增引物对、第一荧光检测探针以及游离寡核苷酸片段；

所述第一扩增引物对的上游引物与所述固定寡核苷酸片段的5’端或靠近5’端的部分片段的序列一致，所述第一扩增引物对的下游引物与所述游离寡核苷酸片段的5’端或靠近5’端的部分片段的序列一致，所述第一荧光检测探针与所述游离寡核苷酸片段中部的部分片段的序列一致，所述游离寡核苷酸片段的3’端的部分片段与所述固定寡核苷酸片段的3’端的部分片段互补配对。

在其中一个实施例中，所述第一扩增引物对的上游引物与所述固定寡核苷酸片段的靠近5’端的部分片段的序列一致，所述固定寡核苷酸片段的5’端具有连接片段，连接片段的5’端具有氨基修饰，所述第一扩增引物对的下游引物与所述游离寡核苷酸片段的5’端的部分片段的序列一致。

在其中一个实施例中，所述固定寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示(5'-ACCACATAGCTTTCATGTCCTGATCGGAAGGACCGTTGGCGCCCGACC CTGGGCCTCTAA-3')；

所述第一扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:2(5'-GCTTTCATGTCCTGATCG-3')和SEQ ID NO:3所示(5'-GCATCCTGAGCACGG-3')；

所述第一荧光检测探针的序列如SEQ ID NO:4所示(5'-CGCGTCCGAACCTAGCTCCA-3')；

所述游离寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:5所示(5'-GCATCCTGAGCACGGTCGCGCGTCCGAACCTAGCTCCACTTTAGAGG CCCAGGGTCGGGC-3')。

在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括第二扩增引物和第二荧光检测探针，所述第二扩增引物用于扩增所述捕获抗体捕获的微生物中的特异性核酸片段，所述第二荧光检测探针用于检测由所述第二扩增引物扩增的特异性核酸片段。

在其中一个实施例中，第一荧光检测探针和第二荧光检测探针的两端均连接有荧光基团，如5’端可以连接FAM基团，3’端可以连接四甲基罗丹明基团(TAMRA)。

在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括结合/除杂缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、结合抗体蛋白层析柱、阳性参考品、阴性参考品以及PCR反应液中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述结合/除杂缓冲液含有浓度范围为0.05～0.45mol/L的NaCl和浓度为0.02～0.2mol/L的Na₂HPO₄，溶液pH值为7.0～10.0；优选包括0.15mol/L NaCl和0.02mol/L Na₂HPO₄，pH为7.0；

洗涤缓冲液含有浓度范围为0.05～0.45mol/L的NaCl和浓度为0.02～0.2mol/L的Na₂HPO₄，溶液pH值为7.0～10.0；优选地，包括0.30mol/L NaCl和0.02mol/L Na₂HPO₄，pH为7.0；

洗脱液缓冲液为0.02～0.2mol/L的甘氨酸溶液，溶液pH值为2～5；优选地，为0.1mol/L的甘氨酸溶液，溶液pH值为3.0；

结合抗体蛋白层析柱是按照如下步骤制备得到的：将100～500μl Protein A试剂于1.0ml蛋白层析柱中，优选Protein A体积为200μl；加入16～800μg抗体，优选抗体量为160μg，室温下孵育0.5～3h，优选时间为1h，加入1.0ml250μg/ml BSA进行洗涤，5％～50％FBS(牛血清白蛋白)封闭10min～2h，优选封闭时间为0.5h，1.0ml 250μg/ml BSA进行洗涤，加入0.2ml内含0.05％的proclin防腐剂，4℃保存待用；

PCR反应液包括四种dNTP、镁离子缓冲液和DNA聚合酶等。

该检测试剂盒在捕获和富集到目的微生物后，可用于荧光定量PCR扩增，以产生第一重信号，检测捕获和富集的效果。在其中一个实施例中，反应条件为：94.0℃预变性10min；94℃变性10s，65℃延伸30s，10个循环，每个循环延伸温度下降0.5℃；72℃延伸15s；94℃变性10s，60℃荧光检测10s～30s，20～40个循环。整个PCR反应体系中，游离模板的终浓度在1×10⁶copies/μl～1×10⁸copies/μl，优选1×10⁷copies/μl，引物浓度优选为0.4μmol/L，探针浓度优选为0.2μmol/L。判定时，如样品Ct值<25可以认为捕获结果为阳性，样品25<Ct值<30可以认为捕获结果为可疑阳性，CT＞30或为“Undet/NT”判读为阴性或者低于检测试剂盒的检测低限。

一种双重标记磁珠的制备方法，包括如下步骤：

向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入捕获抗体，振荡反应，使所述捕获抗体的端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述捕获抗体固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液；

向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入固定寡核苷酸片段，所述固定寡核苷酸片段的5’端修饰有氨基，振荡反应，使所述固定寡核苷酸片段5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述固定寡核苷酸片段固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到所述双重标记磁珠。

在其中一个实施例中，所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液的制备步骤包括：

配制无氧反应溶液，所述无氧反应溶液中加入有羟基葡聚糖、Fe₃O₄和γFe₂O₃，其中，Fe²⁺和Fe³⁺的浓度之和为0.03mol/L～1mol/L，Fe³⁺与Fe²⁺的摩尔比为(0.25～4):1，Fe²⁺和Fe³⁺的物质的量之和与羟基葡聚糖的物质的量的比例为1:(2～12)；

将所述无氧反应溶液在30～70℃下以500～1200rpm/min搅拌反应，加入碱性试剂调节酸碱度至pH为9～11，将温度调节至50～100℃下，继续恒温反应，反应结束后冷却至室温，2500rpm～3500rpm下离心去除反应液中较大的颗粒，收集的反应液用酸调节酸碱度至中性，然后用0.22μm亲水性滤膜过滤以进一步除杂，滤液纯化后得到羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液；

向所述羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入高碘酸钠，所述羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠与所述高碘酸钠的质量比为(0.125～8):1，避光反应，反应结束后分离纯化除去游离的葡聚糖，得到所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液。

在其中一个实施例中，所述羟基葡聚糖的分子量为20kDa～100kDa，优选地，为20kDa、40kDa或100kDa。

在其中一个实施例中，Fe²⁺和Fe³⁺的浓度之和为0.09mol/l。

在其中一个实施例中，Fe³⁺与Fe²⁺的摩尔比为2:1。

在其中一个实施例中，Fe²⁺和Fe³⁺的物质的量之和与羟基葡聚糖的物质的量的比例为1:2、1:4、1:6、1:10或1:12；优选地，为1:10。

在其中一个实施例中，是将所述无氧反应溶液在50℃下以1000rpm/min搅拌反应10min，再加入氨水调节酸碱度至pH为10，在70℃下继续搅拌反应1h。氨水可选用浓度为5mol/L～15mol/L的浓氨水，浓氨水的加入量可按照每100ml无氧反应溶液加入8ml～50ml，如可以选择加入8ml、12ml、16ml、24ml或50ml，优选地，浓氨水的加入量可按照每100ml无氧反应溶液加入12ml的量加入。

在其中一个实施例中，所述离心的转速是3000rpm，时间是5min。

在其中一个实施例中，使用浓度为0.1M～2.0M的HCl或冰醋酸进行酸碱度调节至中性，如可使用浓度为1.0M的HCl调节酸碱度至pH为7.0。

在其中一个实施例中，所述滤液纯化是过分选柱(德国美天旎，MS分选柱)纯化，以除去其中游离的葡聚糖。

在其中一个实施例中，是取500μl、6mg/ml的所述羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液，纳米氧化铁磁珠:高碘酸钠质量比＝8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:8，加入20mg/ml高碘酸钠溶液，其优选质量比为1:1，常温避光搅拌反应30min～3h，优选为1h，反应结束后过柱分离纯化除去游离葡聚糖，用10mM～100mM，pH为7.0～9.0硼酸钠溶液洗涤1～6次，优选的洗涤条件为20mM，pH为8.5硼酸钠溶液洗涤3次。

在其中一个实施例中，在向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入捕获抗体时，按照所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠与捕获抗体的质量比为1:(5～100)的比例添加。

具体地，在其中一个实施例中，是取200μl、2mg/ml醛基葡聚糖包被的纳米氧化磁珠，加入0.02～0.5mol/L缓冲液(缓冲液可为碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液以及磷酸盐缓冲液)，缓冲液pH值为7～10，优选pH为9.5的碳酸盐缓冲液；按照纳米氧化磁珠:抗体质量比＝1:5、1:15、1:30或1:100加入5mg/ml抗体，常温反应振荡混匀1h～12h，优选反应条件为纳米氧化磁珠:抗体质量比＝15:1，反应时间为3h，反应结束后，过柱法进行分离纯化，用1.0mluP水洗涤和400μl uP水洗脱后4℃保存待用。

在其中一个实施例中，在向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入固定寡核苷酸片段时，按照所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠与固定寡核苷酸片段的质量比为(6.25～50):1的比例添加。

具体地，在一个实施例中，是取200μl、1mg/ml的固定有捕获探针的纳米氧化铁磁珠，加入0.02～0.5mol/L缓冲液(缓冲液可为碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液以及磷酸盐缓冲液)，缓冲液pH值为7～10，优选pH为9.5的碳酸盐缓冲液；按照固定有捕获探针的纳米氧化铁磁珠:核酸质量比＝6.25:1、12.5:1、25:1或50:1加入0.5μg/μl DNA，常温反应振荡混匀1h～12h，优选反应条件为磁珠与抗体比例为25:1，反应时间为3h，反应结束后，按照磁珠:NaBH₄质量比＝20:1、10:1、1:10或1:20比例加入0.25M NaBH₄，优选比例为10:1，反应30min～3h，优选反应时间为0.5h，过柱法进行分离纯化，用1.0ml uP水洗涤和400ul uP水洗脱后4℃保存待用。

上述双重标记磁珠在醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠表面固定有捕获抗体和固定寡核苷酸片段，在检测时，可通过特异性的捕获抗体捕获目的微生物或与目的微生物具有血清学交叉反应的其他微生物，以实现对微生物的筛选和富集，后续通过蛋白A层析柱等筛选方法可以得到富集有微生物的磁珠，再通过与固定寡核苷酸片段配套使用的第一扩增引物对和游离寡核苷酸片段，对固定寡核苷酸片段和游离寡核苷酸片段进行扩增反应，第一荧光检测探针可以检测出扩增产物，由此可得到第一重信号；而样品中若没有目的微生物或与目的微生物具有血清学交叉反应的其他微生物，则捕获抗体不会有捕获结果，会直接通过蛋白A层析柱，也即通过蛋白A层析柱等筛选方法不会获得有富集微生物的磁珠，因而也就不会产生第一重信号。该第一重信号的有无可以反映出磁珠通过特异性的捕获抗体有无捕获到微生物。后续进一步可以通过特异性设计的第二扩增引物对对捕获的微生物的特异性核酸区域进行扩增，并借助第二荧光检测探针检测得到第二重信号，该第二重信号的有无即可反映由捕获抗体捕获的微生物是否是目的微生物，可以排除由于抗体捕获时存在与其他微生物交叉反应的问题，进一步确定捕获的微生物是否是目的微生物。通过双重信号进行微生物检测，检测结果的准确性和可靠性显著提高，并且在检测时，首先经由捕获抗体捕获和富集目的微生物，因而检测灵敏度也显著提高。

进一步，在固定寡核苷酸片段的设计和固定时，充分考虑到核苷酸片段的长度对固定效果的影响，设计与之在3’端能够互补配对的游离寡核苷酸片段进行配合使用，保证固定在磁珠上的固定寡核苷酸片段的长度不至于过长而影响固定的稳定性，也保证不至于过短而影响后续PCR扩增的效果。固定寡核苷酸片段与游离寡核苷酸片段配合使用，第一荧光检测探针只与游离寡核苷酸片段中部的部分片段序列一致，经过PCR扩增后，在磁珠表面的固定寡核苷酸片段的3’端以游离寡核苷酸片段为模板进行延长，对扩增产物进行变性处理，延长的片段能够与第一荧光检测探针互补配对，进而产生第一重信号。

本发明的双重标记磁珠在醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁表面固定有捕获抗体和固定寡核苷酸片段，可以借由捕获抗体对目的微生物进行捕获和富集，并可借由固定寡核苷酸片段对捕获和富集的效果进行信号放大，有利于提高检测结果的准确性。

该双重标记磁珠及含有该双重标记磁珠的检测试剂盒可广泛使用在寨卡病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和黄热病毒等病毒微生物或其他细菌类微生物的检测场合，具有检测灵敏度高、检测结果准确可靠等优点。

附图说明

图1为羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠的粒径分布图；

图2为醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠上醛基含量检测；

图3为纳米氧化铁磁珠的poct实验；

图4为DNA凝胶电泳结果；

图5为荧光定量PCR扩增程序；

图6为游离寡核苷酸片段(以下也称为游离ZTN模板)以及固定寡核苷酸片段(以下也称为偶联到磁珠表面ZTN)的荧光定量PCR标准曲线；

图7为PCR扩增曲线图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1 50nm羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠的合成

首先称取8.0g羟基葡聚糖(分子量40kDa)，溶解到100ml去离子水中，通氮除氧10min后，加入1.62g FeCl₃.6H₂O和0.62g FeCl₂.4H₂O，1000rpm/min搅拌50℃水浴加热10min后，加入12ml浓度为15mol/L的浓氨水调节酸碱度至pH为10.0；温度升至70℃保温继续反应1h后，停止反应冷却至室温；3000rpm离心5min将溶液中大颗粒离心除去后，用1.0MHCl调节酸碱度至中性，再用0.22μm的亲水性滤膜过滤，将得到的滤液用德国美天旎MS分选柱除去溶液中游离的葡聚糖；取6mg/ml羟基葡聚糖纳米磁珠用超纯水稀释至1mg/ml，DLS对其粒径进行表征，三次求平均值，即可得到50nm羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠(以下检测为羟基磁珠)，4℃保存。

如图1所示，得到的羟基磁珠的平均粒径为59.50nm，且羟基磁珠呈现球状单颗粒分布，尺寸均匀。

下表1是得到的羟基磁珠的稳定性结果。

表1羟基磁珠不同时间粒径检测

	平均粒径	峰值粒径	PDI
				放置1月	59.50	72.2	0.172
放置3月	58.65	71.5	0.174
				放置6月	60.12	72.1	0.171

从表1可以看到羟基磁珠在4℃可以存储半年以上纳米粒子之间不会发生聚集而影响纳米粒子性能，为后续免疫分选应用提供了稳定性保证。

实施例2醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠表面醛基含量检测

取3.292ml 4.86mg/ml羟基磁珠加入708μl水得到浓度为4mg/ml的羟基磁珠，向三组羟基磁珠分别加入374μl(8mg)、747μl(16mg)浓度为0.1mol/L的NaIO₄和747μl(32mg)浓度为0.2mol/L的NaIO₄，分别对应磁珠与NaIO₄质量比为1:2、1:1和2:1；室温涡旋振荡反应1h，美天旎LS柱过柱，每次0.5ml，1.0ml水洗涤，1.0ml水洗脱；干燥法测得三组磁珠过柱后终浓度分别为0.86mg/ml、0.78mg/ml、0.74mg/ml；分别取0.74mg/ml、0.78mg/ml、0.86mg/ml三组磁珠5.405ml、5.127ml、4.651ml补加水595ml、872ml、1349ml，则磁珠量均为4mg，体积6.0ml；加入0.5ml 2％(10mg)盐酸羟胺室温振荡反应20min；用0.02M NaOH滴定，电导滴定仪DDS-307A检测电导变化。

结果如图2所示，AB段为碱中和释放出的盐酸引起的电导率变化，BC段为碱与剩余盐酸羟胺反应时电导率的变化，CD段为碱自身引起的电导率变化，AB与BC段滴定直线的交点B，即为碱滴定盐酸的滴定终点。表面醛基含量按下式计算：醛基(mmol/g)＝M_(碱)×V_(碱)/W_{(磁珠质量)}，其中M_(碱)、V_(碱)、W_{(磁珠质量)}分别为氢氧化钠的摩尔浓度、体积以及磁珠质量，磁珠与NaIO₄质量比为＝1:2、1:1、2:1其对应的醛基含量为5.25mmol/g、11.25mmol/g、22.5mmol/g，表明随着高碘酸钠含量上升，产生的醛基量也逐渐上升；磁珠表面过多的醛基降低磁珠的稳定性，因而在不影响抗体/核酸与磁珠偶联的前提下，后面的实验选择磁珠与高碘酸钠质量比为1:1。

实施例3醛基葡聚糖偶联抗体

取2.5ml 4mg/ml羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠于EP管中，按照高碘酸钠：羟基葡聚糖＝1:1(质量比)加入0.1mol/L高碘酸钠溶液，室温避光振荡反应1h后，采用磁分离过柱法除去纳米粒子所带的杂质，400μl uP水洗脱得到磁珠浓度为2mg/ml；加入0.2mol/LpH 9.5碳酸盐缓冲液，按照纳米粒子：抗体＝15:1(质量比)，将抗体加入到磁珠溶液中，常温涡旋振荡反应3h，LS分选柱分离没有偶联到磁珠表面的游离抗体，400μl uP水洗脱得到磁珠浓度为0.8mg/ml，4℃保存待用。

实施例4偶联有抗体的纳米氧化铁磁珠偶联DNA

取0.2mL 0.8mg/ml偶联抗体磁珠(即偶联有抗体的纳米氧化铁磁珠)于EP管中，按照磁珠：DNA＝10:1(质量比)加入16μL 0.5μg/μl DNA模板，同时加入21.6μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，常温振荡反应3h，加入40μl 0.25mol/L NaBH₄常温涡旋振荡反应30min，LS分选柱分离没有偶联到磁珠表面的游离核酸，400μl uP水洗脱得到磁珠浓度为0.2mg/ml，4℃保存待用。

实施例5BCA法检测磁珠表面抗体浓度

1体积BCA试剂B加入到50体积BCA试剂A得到工作液C。

按照下表2配置BCA标准液制备标准曲线。

表2

取100μl上述配置不同浓度的BSA标准液以及100μl用uP水稀释一倍的偶联不同抗体和DNA磁珠溶液加入到2ml工作液C中，60℃孵育30min。

以F溶液扣除背景后，紫外分光光度计在562nm处检查吸光值，以上述BSA做标准曲线计算抗体浓度；其中磁珠没有抗体只偶联DNA的作为对照。结果如表3所示，不同抗体偶联到磁珠表面的效率有差异。从图3免疫poct卡条也可以看到，没有偶联抗体的羟基磁珠滴加到poct卡条上，缺少抗原抗体的相互作用，磁珠在卡条上没有任何显色反应，而当加入不同浓度的抗原后，磁珠表面的抗体与抗原进行结合，卡条上抗原含量越高，能够捕获的磁珠量也越多，因而颜色也越深。通过抗体定量检测和poct卡条定性分析可表明抗体成功偶联到磁珠表面。

表3

注：表中抗体依次为识别寨卡病毒蛋白质的不同的N端位点(1601A和1601B和1606A)和C端位点(1605B和1607A和1607B)，分子量均为165kDa。

实施例6PCR对磁珠表面DNA扩增后进行DNA凝胶电泳

按表4配制PCR反应液。

表4

试剂	量(μl)
		游离模板ZTF(25ng/μl)	2
偶联抗体和核酸磁珠	5
		上、下游引物10μM	各1
PCR反应液	2.5
		25μM MgCl<sub>2</sub>	2.5
2.5μM dNTP	2
		Taq	0.25
dd H<sub>2</sub>O补齐至	25

PCR扩增条件：94.0℃预变性10min；94℃变性10s，65℃延伸30s，10个循环，每个循环延伸温度下降0.5℃；72℃延伸15s；94℃变性10s，60℃荧光检测10s，20个循环；72℃延伸15s；72℃延伸3min；4℃保温。

按照上述反应体系和PCR扩增条件对偶联到磁珠表面的核酸进行扩增。DNA凝胶电泳条件，2％琼脂糖凝胶，恒压120V，时间40min，上样量为10μl。如图4所示，磁珠表面同时偶联抗体和核酸，普通PCR进行扩增，平行四组实验均出现了与阳性组相一致目的条带，根据设置的mark可以算出条带分子量大小为100kb与理论计算相一致，表明核酸成功偶联到磁珠表面。

实施例7荧光定量PCR对游离ZTN模板以及偶联到磁珠表面ZTN扩增及标准曲线制备

按照游离ZTN模板、偶联到磁珠表面ZTN起始浓度为25ng/μl，对应起始拷贝数约为10¹²copies/μl；固定ZTN终浓度为10⁷copies/μl，将ZTN稀释成终浓度为10¹⁰、10⁹…10⁶、10⁵copies/μl，取4μl稀释后的ZTN加入到36μl扩增体系中得到ZTN最终浓度为10⁹、10⁸…10⁵、10⁴copies/μl；将偶联抗体和核酸磁珠依次稀释10¹、10²、10³、10⁴，取4μl磁珠原液以及稀释10¹、10²、10³、10⁴倍后的磁珠稀释液到36μl扩增体系中得到磁珠最终浓度相对于原磁珠浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。

现配试剂总体系为40μl，体系如下(μl)：Probe Mix：20；TaqMAN:0.8；Primer-F：1.6；Primer-R：1.6；ddH₂O：8；游离ZTN模板：4(10⁸copies/μl)，终浓度为10⁷copies/μl。

按照图5程序进行荧光定量PCR扩增。游离ZTN模板标准曲线线性拟合方程为y＝3.3191x+5.3545(R²＝0.9998)，线性范围为10⁴～10⁹copies/μl，相关R²为0.9998，在线性范围内有非常好的线性关系；偶联抗体和核酸磁珠标准曲线线性拟合方程为y＝3.0765x+12.48(R²＝0.9998)，线性范围为磁珠稀释10倍到10⁴倍，相关R²为0.9998，在对应的线性范围内有非常好的线性关系(见图6)。

实施例8寨卡病毒检测试剂盒建立与具体操作

1、试剂盒组成

试剂盒包括结合/除杂缓冲液A、洗涤缓冲液B、洗脱缓冲液C、偶联抗体和核酸的双重标记磁珠溶液D、结合抗体蛋白层析柱E，阳性参考品F以及阴性参考品G，PCR反应液H(包含dATP、dUTP、dCTP、dGTP、镁离子缓冲液和酶)，PCR反应液I(包含第一扩增引物对、第一荧光检测探针、游离DNA模板和水)。

2、实验步骤

本试剂盒包含2个对照管和8个样品管，最多可以检测8个样品。

1)根据待测样品数量N，计算所需要的EP管数为N+2；

2)每个样品各取10μl分别加入不同的EP管，另外，溶液F、G(对照组)各取10μl，分别加入2个EP管；

3)分别取100μl溶液D加入至步骤2中的每个EP管中，于室温静置孵育1小时；

4)根据步骤3中的EP管数，取相同数量的层析柱，用试管夹或其它工具固定保持直立状态；

5)打开层析柱上端盖子，取1mL溶液A加入到层析柱中，去掉层析柱下端封口帽，让液体流出；

6)待液面降低与层析柱填料表面平齐之时，用封口帽堵住层析柱下端开口；

7)向层析柱中缓慢加入步骤3中的溶液，去掉层析柱下端封口帽，让液体流出；

8)待液面降低与层析柱填料表面平齐之时，用封口帽堵住层析柱下端开口，室温孵育30分钟；

9)向层析柱中加入3mL溶液B，打开底部塞子使液体缓慢流下；

10)层析柱中的液体全部流出后，在层析柱底部放置一只新的2mL EP管，加入0.5mL溶液C，收集到的液体，4℃保存待用；

11)根据步骤2中的EP管数，取相同数量的PCR扩增管，分别加入20μl试剂H和10μl试剂I，然后加入10μl步骤10的收集液(使用之前请将所有试剂用移液枪缓慢地吹打混匀)。

3.结果检测

PCR扩增条件：94.0℃预变性10min；94℃变性10s，65℃延伸30s，10个循环，每个循环延伸温度下降0.5℃；72℃延伸15s；94℃变性10s，60℃荧光检测10s，20个循环。

4.结果分析

表5

样品编号	复孔1(Ct值)	复孔2(Ct值)	平均值(Ct值)
				阴性对照	27.41	27.56	27.49
阳性对照	23.32	23.14	23.23

阳性对照参考品Ct值为23.23，阴性对照参考值Ct值为27.49且无S型扩增曲线实验成立(具体见图7)，用体外表达的病毒蛋白重组蛋白和抗原多肽做测试标准品得出的结果判读：样品Ct值<25为说明抗体捕获有寨卡病毒，样品Ct值>25且无S型扩增曲线说明没有捕获到寨卡病毒。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）

<120> 双重标记磁珠及其制备方法和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accacatagc tttcatgtcc tgatcggaag gaccgttggc gcccgaccct gggcctctaa 60

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctttcatgt cctgatcg 18

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcctgag cacgg 15

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcgtccgaa cctagctcca 20

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcatcctgag cacggtcgcg cgtccgaacc tagctccact ttagaggccc agggtcgggc 60

Claims (7)

1.一种检测试剂盒，其特征在于，包括双重标记磁珠、第一扩增引物对、第一荧光检测探针以及游离寡核苷酸片段；

所述双重标记磁珠，包括醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠以及固定在所述纳米氧化铁磁珠表面的捕获抗体和固定寡核苷酸片段，所述捕获抗体通过其端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定，所述固定寡核苷酸片段通过其5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应结合而被固定；

所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠是通过将8.0g分子量为40kDa的羟基葡聚糖溶解到100mL去离子水中，通氮除氧10min后，加入1.62g FeCl₃·6H₂O和0.62g FeCl₂·4H₂O，1000rpm搅拌50℃水浴加热10min，加入浓氨水调节酸碱度至pH为10，将温度升至70℃保温继续反应1h后冷却，3000rpm离心5min将溶液中大颗粒离心去除，用盐酸调节酸碱度至中性，然后用0.22μm亲水性滤膜过滤，将滤液进一步除杂去除游离的羟基葡聚糖，形成羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠，所述羟基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠再与高碘酸钠按质量比为1:1反应后得到；

所述捕获抗体是兔抗寨卡病毒特异性多克隆抗体，分子量为165kDa，具有特异性识别寨卡病毒的位点；

所述固定寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:1所示；

所述第一扩增引物对的上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；

所述第一荧光检测探针的序列如SEQ ID NO:4所示；

所述游离寡核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:5所示。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括第二扩增引物和第二荧光检测探针，所述第二扩增引物用于扩增所述捕获抗体捕获的寨卡病毒中的特异性核酸片段，所述第二荧光检测探针用于检测由所述第二扩增引物扩增的特异性核酸片段。

3.如权利要求1~2中任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括结合或除杂缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液、结合抗体蛋白层析柱、阳性参考品、阴性参考品以及PCR反应液中的至少一种。

4.一种如权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将如权利要求1所述双重标记磁珠、所述第一扩增引物对、所述第一荧光检测探针以及所述游离寡核苷酸片段制成所述检测试剂盒。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述双重标记磁珠的制备步骤包括：

向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入捕获抗体，振荡反应，使所述捕获抗体的端部的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述捕获抗体固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液；向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入碱性缓冲液，调节酸碱度至碱性后加入固定寡核苷酸片段，所述固定寡核苷酸片段的5’端修饰有氨基，振荡反应，使所述固定寡核苷酸片段5’端修饰的氨基与所述纳米氧化铁磁珠表面包被的醛基葡聚糖上的醛基反应，将所述固定寡核苷酸片段固定在所述纳米氧化铁磁珠的表面，得到所述双重标记磁珠。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在向醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠溶液中加入捕获抗体时，按照所述醛基葡聚糖包被的纳米氧化铁磁珠与捕获抗体的质量比为15:1的比例添加。

7.如权利要求5所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于，在向所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠溶液中加入固定寡核苷酸片段时，按照所述固定有捕获抗体的纳米氧化铁磁珠与固定寡核苷酸片段的质量比为10:1的比例添加。

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