CN111808852B

CN111808852B - 用于2019新型冠状病毒核酸提取的组合物、试剂盒、用途及其方法

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Publication number: CN111808852B
Application number: CN202010897178.6A
Authority: CN
Inventors: 吴康; 龙凤英; 缪为民; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2020-08-31
Filing date: 2020-08-31
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2040-08-31
Also published as: CN111808852A

Abstract

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于病毒核酸提取的领域。本发明请求保护一种提取2019新型冠状病毒核酸的组合物，所述组合物包括：提取溶液1：盐酸胍、硫氰酸胍、尿素、莎梵婷、氯化钾、氯化锂、十二烷基硫酸三乙醇胺、NP‑40、曲拉通X‑100，和异丙醇；提取溶液2：Tris‑HCl、氯化锂、醋酸钠、十二烷基硫酸三乙醇胺、NP‑40、SDS，和乙醇；以及提取溶液3：Tris‑HCl、氯化钠，和乙醇。使用本发明的组合物，能够特异性的提高2019新型冠状病毒的核酸提取和纯化的灵敏度，其检测限可达10拷贝/mL。

Description

用于2019新型冠状病毒核酸提取的组合物、试剂盒、用途及其方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于病毒核酸提取的领域，更具体地，属于2019新型冠状病毒核酸提取领域。

背景技术

核酸是各类生命的最基本物质之一，不仅起着储存和传递遗传信息的作用，在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中也起着决定性的作用。自1869年瑞士物理学家Friedrich Miescher首次从白细胞中分离出核酸以来，全球各国的研究者们在核酸提取和纯化方法上进行了不懈的研究探索。核酸提取的传统方法包括酚抽提法、碱裂解法、CTAB抽提法、煮沸法等。自1979年Vogelstein和Gillespie首次将玻璃纤维（主要成分SiO2）用于回收琼脂糖凝胶中的DNA片段以来，以固相载体为基础的新型核酸提取方法便被发展起来，包括苯酚-氯仿抽提法、离心柱提取法、玻璃珠吸附法及微纳米磁珠提取法。

苯酚-氯仿抽提核酸苯酚氯仿提取核酸是利用酚是蛋白质的变性剂的特性，使蛋白质变性，裂解释放核酸，而核酸易溶于水，却不溶于异丙醇等有机溶剂。根据核酸、蛋白溶于不同的试剂层，在不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得核酸。该方法的缺点是由于使用了苯酚、氯仿等有毒挥发性试剂，对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大。另外，由于操作步骤复杂，不同实验人员之间的操作重复性差。优点是使用了实验室常见的试剂且成本比较低廉。

离心柱法主要原理是将对核酸有吸附作用的官能基团固定在吸附模上，在高盐环境下，核酸可被吸附在吸附膜上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离，通过反复离心洗涤，最终洗脱核酸，达到核酸提取与纯化的目的。离心柱法核酸提取的优点是比传统酚氯法提取的纯度更高，而且可进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，逐渐取代了传统核酸提取方法，被高校科研机构等市场普遍接受。其缺点是离心柱法提取需要反复离心，不便于自动化、高通量操作，特别是在疾病检测等分子诊断领域，离心柱法提取需要大量的操作人员及仪器设备。当面对突发疫情时，更是需要有高通量、自动化的设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。

磁珠法依据与吸附膜相似的原理，在磁珠表面修饰可以吸附核酸的特定官能团，通过不同的溶液环境，达到裂解、结合、洗涤和洗脱的目的。同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。该技术能够从动植物组织、体液、环境等样本中分离获得高纯度的核酸。适用于PCR、Q-PCR、分子杂交、测序等下游应用。因其载体磁珠操作友好性高、核酸纯度高、自动化实现简单，在分子克隆、分子杂交、分子诊断等领域有广泛的应用。磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，在临床分子诊断方面有很多优势：容易实现自动化、高通量操作，可满足当前临床分子诊断高通量操作的要求；操作简单、用时短，无需反复离心等操作；不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，安全无毒，对实验操作人员的伤害少；磁珠与核酸的特异性结合使得其有非常高的核酸提取效率，更能满足临床分子诊断对于某些检测灵敏度要求非常高的项目需求。

随着研究的不断深入，基于磁珠法技术的核酸提取也变得多种多样，但是不同的磁珠修饰方式、不同的核酸吸附环境等，对于磁珠法提取核酸的效率和稳定性有较大的影响，这也是造成市面上的磁珠法核酸提取产品虽然数量非常多，但其质量却良莠不齐的原因之一。

2019新型冠状病毒（2019-nCoV）在感染者身上潜伏期长，出现了很多号称“隐形病人”的无症状感染者，不易被发现，却可能传播病毒。推测的原因可能在于无症状感染者体内的病毒载量较低，常规的核酸提取或纯化过程的灵敏度有限，市面上针对新冠的磁珠法核酸提取试剂检测灵敏度为不低于200拷贝/mL。例如样本用量少，核酸纯度低，导致其无法适应病毒载量较低的感染者的检出。磁珠法核酸提取利用磁珠与核酸的特异性结合使得其有非常高的核酸提取效率，通过大样本量的使用进一步提高了灵敏度和检出率。在进行新冠初筛时，大样本量的使用更适合于混检模式，加大筛查规模，更能满足临床分子诊断对于某些检测灵敏度要求非常高的项目需求。

核酸的提取与纯化作为2019新型冠状病毒检测基本步骤的首要环节，在大规模新型冠状病毒诊断与筛查中具有极其重要的地位，能否实现高灵敏的新冠病毒核酸提取纯化是后续给出正确诊断结果的关键。因此，本领域需求一种能够以高灵敏度提取2019新型冠状病毒的核酸的产品。

发明内容

本申请发明人对2019新型冠状病毒进行了理化性质分析，并结合该病毒的理化性质，对现有的提取试剂和方法进行改进，发现了一种能特异性提高提取2019新型冠状病毒的核酸的灵敏度的组合物。

第一方面，本发明提供一种提取2019新型冠状病毒核酸的组合物，所述组合物包括：

提取溶液1：盐酸胍、硫氰酸胍、尿素、莎梵婷（surfactin）、氯化钾、氯化锂、十二烷基硫酸三乙醇胺、NP-40、曲拉通X-100、和异丙醇；

提取溶液2：Tris-HCl、氯化锂、醋酸钠、十二烷基硫酸三乙醇胺、NP-40、SDS，和乙醇；以及

提取溶液3：Tris-HCl、氯化钠，和乙醇。

进一步地，本发明所述组合物还包括磁珠。该磁珠包括1%磁珠、10mmol/L Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L的EDTA（pH8.0），其适于提取2019新型冠状病毒的核酸。

更进一步地，本发明所述组合物还包括洗脱液。所述洗脱液包括10mmol/L的Tris-HCl（pH8.0）、1mmol/L的EDTA（pH8.0），其适于洗脱2019新型冠状病毒的核酸。

更进一步地，本发明所述组合物还包括蛋白酶K。所述蛋白酶K的浓度为20mg/mL。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中盐酸胍的浓度为1~3mol/L，更优选为2mol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中硫氰酸胍的浓度为0.5~1.5mol/L，更优选为1mol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中尿素的浓度为0.5~1.5mol/L，更优选为1mol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中莎梵婷（surfactin）的浓度为0.01~0.5mmol/L，更优选为0.2mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中氯化钾的浓度为100~200mmol/L，更优选为150mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中氯化锂的浓度为0.2~1mol/L，更优选为0.5mol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中十二烷基硫酸三乙醇胺的质量/体积比为0.1%~1%，更优选为0.5%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中NP-40的质量/体积比为0.1%~1%，更优选为0.5%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中曲拉通X-100的质量/体积比为0.01%~1%，更优选为0.5%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液1中异丙醇的体积/体积比为30%~50%，更优选为40%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中Tris-HCl的浓度为5~15mmol/L，更优选为10mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中氯化锂的浓度为50~200mmol/L，更优选为100mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中醋酸钠的浓度为50~200mmol/L，更优选为100mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中十二烷基硫酸三乙醇胺的质量/体积比为0.1%~1%，更优选为0.5%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中NP-40的质量/体积比为0.1%~1%，更优选为0.1%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中SDS的质量/体积比为1%~5%，更优选为5%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液2中乙醇的体积/体积比为10%~30%，更优选为20%。

在一些具体的实施方案中，提取溶液3中Tris-HCl的浓度为5~15mmol/L，更优选为10mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液3中氯化钠的浓度为10~30mmol/L，更优选为20mmol/L。

在一些具体的实施方案中，提取溶液3中乙醇的体积/体积比为60%~80%，更优选为70%。

在一个具体的实施方案中，所述组合物中不同的提取溶液存在于不同的包装中。

在一个具体的实施方案中，所述组合物中不同的组分存在于不同的包装中。

使用本发明的组合物，能够特异性的提高2019新型冠状病毒的核酸提取和纯化的灵敏度，其检测限可达10拷贝/mL。其次，本发明的组合物既能够适用于手工提取，又能够使用自动化核酸提取设备进行提取，第三，本发明组合物能适用于咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、唾液样本、血浆、血清、抗凝外周血、粪便、肛拭子等样本的2019-nCoV病毒核酸提取。使得不同样本的提取能够兼容，节省了大量的人力和物力，最后，本发明组合物能够进行快速提取，配合自动提取仪使得操作时间短，仪器可在15~30分钟之内完成48或96例核酸样品的提取。

第二方面，本发明提供了一种用于提取2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。

本发明提供了一种用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括用于检测2019新型冠状病毒的引物和探针。

进一步地，所述试剂盒还包括用于监控的内标引物和探针。

第三方面，本发明提供了上述组合物在制备用于提取2019新型冠状病毒核酸的试剂盒中的用途。

本发明提供了上述组合物在制备用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒中的用途。

第四方面，本发明提供了一种检测2019新型冠状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

1）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒提取并纯化待测样本的核酸；

2）使用对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、唾液样本、血浆、血清、抗凝外周血、粪便、肛拭子等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

逆转录，温度为50℃，时间25~35分钟，1次循环；预变性，温度为94℃，时间2~10分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，45~50次循环。

进一步地，提供了一种用于以非诊断目的检测2019新型冠状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

2）使用对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。

在示例性的实施方案中，本发明的检测方法可以在实验中的检测培养物中是否有上述病毒。

附图说明

图1为本发明组合物提取阴性咽拭子样本稀释标定的新型冠状病毒培养物（10拷贝/mL）中的检测结果；

图2为本发明组合物提取阴性咽拭子样本稀释标定的新型冠状病毒（10拷贝/mL）中的检测结果；

图3-4为本发明组合物提取EDTA抗凝全血模拟样品的核酸的检测结果；

图5为本发明组合物提取含不同浓度的新冠样品的检测结果；

图6-8为本发明组合物提取不同浓度丙肝样品的检测结果；

图9为本发明组合物提取甲流样品的检测结果；

图10为本发明组合物提取乙流样品的检测结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明组合物提取2019新型冠状病毒核酸的方法

1.准备工作

根据待测样本、阴阳性样品数量，将蛋白酶K（20μL/人份）和2019-nCoV 磁珠溶液（30μL/人份）按照比例混合成蛋白酶K-磁珠混合液，震荡混匀，低速瞬时离心。

2.核酸提取操作过程

2.1 根据待测样本数量取2mL离心管若干，每管加入750 μL样品；

2.2 加入750 μL 2019-nCoV提取溶液1（2mol/L的盐酸胍、1mol/L的硫氰酸胍、1mol/L的尿素、0.2mmol/L的莎梵婷（surfactin）、150mmol/L的氯化钾、0.5mol/L的氯化锂、质量/体积比为0.5%的十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.5%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为0.5%的曲拉通X-100、体积/体积比为40%的异丙醇）和50 μL蛋白酶K-磁珠混合液；盖上管盖，震荡混匀30s，60℃加热5~10min；

2.3低速瞬时离心，将离心管置于磁性分离器上，1~5min后缓慢吸弃废液（*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）；

2.4加入750 μL 2019-nCoV提取溶液2（10mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L的氯化锂、100mmol/L的醋酸钠（pH8.0）、质量/体积比为0.5%的十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为5%的SDS、体积/体积比为20%的乙醇），震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸1min，将液体完全吸出丢弃（*注意不要碰到吸附于管壁内侧的磁珠）；

2.5加入750 μL 2019-nCoV提取溶液3（10mmol/L的Tris-HCl（pH8.0）、20mmol/L的NaCl，质量/体积比为70%的乙醇），震荡混匀30s，低速瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器。磁吸1min，将液体完全吸出丢弃，继续于磁性分离器上静置2min，将液体完全吸尽（*注意不要吸到管壁内侧的磁珠；若此时洗涤液并非无色透明，需重复该步骤）；

2.6 室温开盖静置5min（*注意：乙醇残留会对后续实验造成不良影响，需保证乙醇充分挥发；同时不要干燥太长时间，以免磁珠挂壁难以洗脱）；

2.7加入30~100μL （推荐50μL洗脱）洗脱液，震荡混匀30s，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置2min；低速瞬时离心，将离心管再次置于磁性分离器上磁吸2 min，然后将洗脱下来的核酸转移到干净的1.5 mL离心管中。

3. 核酸检测

取20μL提取后的核酸，用新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸检测试剂盒（多重荧光PCR法）进行检测。

实施例2、本发明组合物提取咽拭子模拟样本检测

按照如实施例1所述的提取方法提取阴性咽拭子样本稀释标定的新型冠状病毒培养物（10拷贝/mL）和假病毒（10拷贝/mL），将提取的核酸进行荧光PCR检测，其核酸检测结果如图1-2所示（深色为ORF1ab基因检测，浅色为N基因检测，重复24次），从图中可以看出，本发明的组合物能够很好的提取10拷贝/mL的新冠病毒样本和假病毒，并均能够检测到相应病毒。

实施例3、本发明组合物提取EDTA抗凝全血模拟样品的核酸纯度以及检测

按照如实施例1所述的提取方法提取EDTA抗凝全血模拟样品的核酸（新冠病毒为20拷贝/mL），其浓度和纯度如下表1所示。

从表中可以看出，使用本发明组合物提取的纯度均符合本领域的要求。

使用提取的核酸进行检测，检测结果如图3-4所示。图3是内标扩增曲线，图4为新冠病毒扩增曲线。从图中可以看出，使用本发明组合物提取低病毒浓度的核酸，均能检测到相应的靶标。

实施例4、本发明组合物提取梯度稀释的含新冠病毒样本的检测

按照如实施例1所述的提取方法提取以下几个浓度的含新冠病毒的样本：高浓度（20000拷贝/mL）、中浓度（200拷贝/mL）、低浓度（20拷贝/mL）。将提取的核酸进行荧光PCR检测，其核酸检测结果如图5所示（深色为ORF1ab基因检测，浅色为N基因检测），从图中可以看出，本发明的组合物能够很好的提取各浓度梯度的新冠病毒样本，并均能够检测到相应病毒。

实施例5、本发明组合物精密度检测

安装如实施例1所述的提取方法提取以下几个浓度的含新冠病毒的样本：高浓度（20000拷贝/mL）、中浓度（200拷贝/mL）、低浓度（20拷贝/mL），并重复8次进行紧密度检测，结果如表2所示。实验结果表明本发明组合物精密度良好。

实施例6、本发明组合物提取丙肝、甲流和乙流核酸的检测

为了进一步说明本发明组合物提取新冠的特异性，发明人同时使用本发明的组合物提取了丙肝（50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL）、甲流和乙流（2.0TCID50/mL）的核酸。其中，10拷贝/mL新冠的浓度与12.5IU/mL丙肝和2.0TCID50/mL甲流和乙流是其对应PCR检测试剂盒的常规检测灵敏度下限。对提取的核酸进行了荧光PCR检测，其核酸检测结果如图6-10所示。图6-8分别为50IU/mL、25IU/mL、12.5IU/mL浓度丙肝的一个样本的重复检测结果，另外还测量了多个样本，其统计结果如表3所示。

从图中可以看出，本发明组合物提取丙肝病毒的测试结果不能满足试剂盒本身检出限要求。效果比提取新冠病毒的效果差。

图9-10分别为检测甲流和乙流的结果，从图中可以看出，本发明组合物提取甲流、乙流病毒的测试结果不能满足试剂盒本身检出限要求。甲流、乙流进行呼吸道病原体核酸测试结果没有新冠项目测试结果好。

对比例1、本发明组合物与市售的提取试剂盒的灵敏度对比

使用本发明的组合物和市售的新冠提取试剂盒分别对200拷贝/mL、100拷贝/mL和50拷贝/mL的20份样品按照实施例1所述的方法进行检测，表4为市售的新冠提取试剂盒的检测结果，表5为本发明组合物的检测结果。

从表中可以看出，市售的新冠提取试剂盒在100拷贝/mL的浓度时，其阳性检测率已经大为下降，而本发明的组合物在50拷贝/mL的浓度时，其阳性检测率仍然为100%。另一方面，本发明的组合物提取之后所检测的Ct值也比对比例的Ct值大为靠前，表明本发明的组合物提取的灵敏度更高。

Claims

1.一种提取2019新型冠状病毒核酸的组合物，所述组合物包括：

提取溶液1：盐酸胍、硫氰酸胍、尿素、莎梵婷、氯化钾、氯化锂、十二烷基硫酸三乙醇胺、NP-40、曲拉通X-100，和异丙醇；

提取溶液3：Tris-HCl、氯化钠，和乙醇；

其中，所述提取溶液1盐酸胍的浓度为1~3mol/L；硫氰酸胍的浓度为0.5~1.5mol/L；尿素的浓度为0.5~1.5mol/L；莎梵婷的浓度为0.01~0.5mmol/L；氯化钾的浓度为100~200mmol/L；氯化锂的浓度为0.2~1mol/L；十二烷基硫酸三乙醇胺的质量/体积比为0.1%~1%；NP-40的质量/体积比为0.1%~1%；曲拉通X-100的质量/体积比为0.01%~1%；异丙醇的体积/体积比为30%~50%；

其中，所述提取溶液2中Tris-HCl的浓度为5~15mmol/L；氯化锂的浓度为50~200mmol/；醋酸钠的浓度为50~200mmol/L；十二烷基硫酸三乙醇胺的质量/体积比为0.1%~1%；NP-40的质量/体积比为0.1%~1%；SDS的质量/体积比为1%~5%；乙醇的体积/体积比为10%~30%；

其中，所述提取溶液3中Tris-HCl的浓度为5~15mmol/L；氯化钠的浓度为10~30mmol/L；乙醇的体积/体积比为60%~80%。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包括磁珠、洗脱液和蛋白酶K中的至少一种或多种。

3.一种用于提取2019新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。

4.一种用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其中，所述试剂盒还包括用于检测2019新型冠状病毒的引物和探针。

6.权利要求1或2所述的组合物在制备用于检测2019新型冠状病毒的试剂盒中的用途。

7.一种以非诊断目的检测2019新型冠状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

1）使用如权利要求1或2中任一项所述的组合物提取并纯化待测样本的核酸；

2）使用对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。