CN111733298B - 检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents

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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及多瘤病毒的检测。本发明提供了一种用于检测多瘤病毒并分型的组合物；同时，还提供了包括该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测多瘤病毒并分型的方法。本发明的组合物能够使用一个管在一次试验中同时检测这3种病毒并分型，其成本低，通量高，耗时少，灵敏度高，特异性好。

Description

检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，具体地，涉及多瘤病毒的检测并分型。
背景技术
多瘤病毒（polyomavirus）是一种广泛分布于脊椎动物体内的病毒，该病毒可在很多不同种系的天然宿主范围内传播，具有促使多种类型细胞发生肿瘤变异的能力。因其可诱发小鼠患多发性肿瘤，因此以“多瘤”一词命名此类病毒多瘤病毒属乳多空病毒科病毒，主要包括BK病毒（BK virus，BKV）、JC病毒（JC virus，JCV）和SV40病毒（simian virus40，猿猴空泡病毒40），原发感染大多发生在儿童和青少年时期，一般无临床症状，但可持续潜伏于肾脏和B淋巴细胞中。当机体免疫功能受损或低下时（AIDS患者、移植受者），潜伏的病毒可被激活，引起活动性感染。可能发展为进行性多灶性白质脑（PML）及多瘤病毒相关性肾病（PVAN）。
BK 病毒是一种直径45nm，拥有二十面体衣壳的非包膜双链环状DNA病毒，含5300基本碱基对。BK病毒的全部基因有75%与JC病毒同源，70%与SV40 病毒同源。BK病毒出现在尿液中称为病毒尿症（viruria），出现在血液或血浆中称为病毒血症（virmia）。BK病毒肾病（BKVN）则定义为BK 病毒出现在肾实质中，其伴随证据是肾小管间质性肾炎或爬升的血清肌酐指标，与美国肾移植学组对移植物肾病的定义相一致。BK病毒的治疗不仅是特殊针对肾病的治疗，一些研究学者认为在发现BK病毒血症时便须开始进行干预治疗。所以BK病毒的检测与监控是重要的也是首要措施。
JC病毒最早是从进行性多灶性脑白质病患者的大脑组织中分离出来的，这是一种突胶质细胞中病毒裂解复制引起的脱髓鞘疾病，如进行性多灶性白质脑（PML），见于严重细胞免疫抑制病例，如获得性免疫缺陷综合征。
SV40病毒（猿猴空泡病毒40），是60年代初发现分离的猴肾细胞病毒，它是一种DNA病毒，其在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成，并且人类许多肿瘤的发生也与之有关。
同时，也有研究报道称在患脑瘤的病人的脑组织中，大多数都具有三种病毒中至少一种呈阳性的情况，所以，同时检测并区分这三种病毒是有必要的。
目前国内外应用于临床诊断的血清学检测主要是检测抗多瘤病毒的IgG与IgA，检测方法多为酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA技术简单、快速、不需要特定的仪器，但是其灵敏度不高，且存在一定的假阳性。且由于BK病毒/JC病毒/SV40病毒属于长期潜伏感染的病毒，正常人也会携带这些病毒，人抗体90%以上都为阳性，所以血清学的方法并不能有效的判断。
而常规的PCR在应用中由于各种因素影响，如操作不规范，标本质量差，严重交叉污染等，都会造成错误的结果，出现假阳性和假阴性。所以更广泛使用的是荧光定量PCR。
然而，到目前为止，还未出现同时检测BK病毒、JC病毒，和SV40病毒的荧光定量PCR的产品。现行多瘤病毒的检测主要还是以荧光PCR单通道检测，每次只能检测一个靶标，整体检测的通量与便捷性不够。因此，本领域需要同时检测BK病毒、JC病毒，和SV40病毒的产品。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测多瘤病毒并分型的组合物，所述组合物包括：
BKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQ ID NO:1）；
BKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQ ID NO:2）；
BKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQ ID NO:3）；
JCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQ ID NO:4）；
JCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQ ID NO:5）；
JCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQ ID NO:6）；
SV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:7）；
SV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQ ID NO:8）；和
SV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:9）。
使用本发明的组合物，能够使用一个管在一次试验中同时检测这3种病毒并分型，其成本低，通量高，耗时少，全程仅需75分钟。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。其灵敏度为400拷贝/ml，特异性好。
本发明的组合物还可以包括上述引物和探针中的一条或多条。
所述多瘤病毒包括：BK病毒、JC病毒，和SV40病毒。
进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：
IC-F1：5'-CAAGATCATCAGCAATGCCT-3'（SEQ ID NO:10）；
IC-R1：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'（SEQ ID NO:11）；和
IC-P1：5'-CACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3'（SEQ ID NO:12）。
进一步地，组合物中的探针（P）的荧光基团不互相干扰。
在本发明中，“不互相干扰”是指是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些荧光基团的吸光值不接近，能选择不同的检测通道，因而不会互相干扰。
在本发明中，荧光基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE，但不限于此。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的BKV探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的JCV探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的SV40探针的荧光基团为CY5。
在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:12所示的内标探针的荧光报告基团为ROX。
进一步地，所述组合物中引物（F和R）的用量为25~100nM；所述组合物中探针（P）的用量为10~75nM。
在一些实施方案中，本发明的组合物存在于同一包装中。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备用于检测多瘤病毒并分型的试剂盒中的用途。
所述多瘤病毒包括：BK病毒、JC病毒，和SV40病毒。
第三方面，本发明提供了一种检测多瘤病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、逆转录酶、DNA聚合酶、UNG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述组合物中引物（F和R）的用量为25~100nM；所述组合物中探针（P）的用量为10~75nM；所述dNTP的用量为0.2~0.3mM。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为1U/μL~5U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶；尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）0.05 U/μL ~0.2 U/μL。
本发明的试剂盒中Taq酶为高纯度耐热DNA聚合酶（Taq酶），比普通热启动酶启动更快，使检验更具特异性。体系中含有UNG酶，可以防止PCR 产物的污染，大大降低携带污染。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照和定量参考品A~D。
所述阳性对照为为临床医院收集的强阳性样本，其浓度为1.00~5.00E+05 拷贝/ml。
所述定量参考品A~D：为已标定好浓度的混合质粒（BK病毒/JC病毒/SV40病毒/内标质粒）溶液，用于进行定量标准曲线的绘制，进行样本的定量。其混合质粒浓度A~D BK病毒/JC病毒/SV40病毒浓度4.00E+07拷贝/ml~4.00E+04拷贝/ml（4个梯度，每个梯度为10倍），混合质粒浓度A~D内标浓度为4.00E+05拷贝/ml。
在一个具体的实施方案中，所述试剂盒除上述的本发明的组合物之外，还进一步包括以下组份和用量：
组份 每一个反应中的体积/浓度
Mg<sup>2+</sup>（1M） 0.2μL
dNTPs（100mM） 0.8μL
UNG酶 0.1U/μL
Taq酶 3U/μL
PCR缓冲液（5x） 10µl
所述5×PCR缓冲液包括pH7.5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液、20mmol/L氯化镁溶液、500mmol/L氯化钾溶液、0.2%（体积/体积） 曲拉通溶液和10%（体积/体积）)甲酰胺溶液。
第四方面，提供了一种用于检测多瘤病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、脑组织等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
UNG酶反应，温度为50℃，时间2~4分钟，1次循环；Taq酶活化，温度为94℃，时间1~5分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为5~25秒，退火、延升、荧光采集，温度为57℃，时间为30~40秒，45~50次循环。
在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测多瘤病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染多瘤病毒并罹患相关疾病的信息。例如，该方法可以检测单纯细胞培养物中是否有多瘤病毒。
附图说明
图1为本发明组合物的检测结果图；
图2为本发明组合物检测JC病毒的灵敏度结果；
图3为本发明组合物检测BK病毒的灵敏度结果；
图4为本发明组合物检测SV40病毒的灵敏度结果；
图5为本发明组合物FAM通道的特异性结果；
图6为本发明组合物HEX通道的特异性结果；
图7为本发明组合物CY5通道的特异性结果；
图8为本发明对比例组合物中的JC病毒的引物和探针单独检测的结果图；
图9为本发明对比例组合物中的SV40病毒的引物和探针单独检测的结果图；
图10为本发明对比例组合物的检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明组合物使用的引物和探针
本发明组合物使用的引物和探针序列如下所示：
BKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQ ID NO:1）；
BKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQ ID NO:2）；
BKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQ ID NO:3）；
JCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQ ID NO:4）；
JCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQ ID NO:5）；
JCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQ ID NO:6）；
SV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:7）；
SV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQ ID NO:8）；
SV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:9）；
IC-F1：5'-CAAGATCATCAGCAATGCCT-3'（SEQ ID NO:10）；
IC-R1：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'（SEQ ID NO:11）；和
IC-P1：5'-CACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3'（SEQ ID NO:12）。
其中，BKV探针的荧光基团为FAM；JCV探针的荧光基团为HEX；SV40探针的荧光报告基团为CY5，内标探针的荧光基团为ROX，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2猝灭基团。
实施例2、本发明组合物检测多瘤病毒并分型的方法
1、试剂准备：
1.1、取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；
1.2 、根据待测样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品A~D的数量，按比例（PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份）取相应量的PCR反应液、酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10秒，4℃避光待用。
2、样本、质控品、定量参考品处理与加样（在样本处理区进行）
2.1、样本、质控品预处理
2.1.1、待测样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品A~D处理方法：
2.1.1.1、取出核酸提取或纯化试剂盒（S1006）包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，混匀后备用；
2.1.1.2 、取适量1.5 mL离心管，根据待测样本例数，每管加入600 μL 提取溶液1；
2.1.1.3 、每管加入200μL待测样本；盖上管盖，震荡混匀10秒钟后，95℃加热10分钟，瞬时离心；
2.1.1.4 、每管加入100 μL提取溶液2和50μL 磁珠溶液，震荡混匀10秒钟，室温静置20分钟；
2.1.1.5、 瞬时离心后将离心管置于磁性分离器上，3分钟后缓慢将溶液吸出（注意不要碰到吸附于管壁内侧的棕色物）；
2.1.1.6 、每管加入600μL提取溶液3和200μL 提取溶液4，震荡混匀5秒钟, 瞬时离心后将离心管再次置于磁性分离器；
2.1.1.7 、约3分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃；
2.1.1.8、加入30~50μL洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置10分钟后将离心管再次置于磁性分离器上3 分钟，然后将洗脱下来的核酸放于新的1.5 mL 离心管中。
2.2 、 加样（阴性对照、阳性对照与待测样本同步处理）
2.2.1、每个PCR反应管中加入上述处理后的待测样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品A~D各4～10μl；
2.2.2、 室温静置10分钟，各待测样本、阴性对照、阳性对照、定量参考品的反应管中分别加入40μl上述已配制好的PCR-mix。
3 、荧光PCR反应与结果分析（在荧光定量PCR扩增仪上进行）
1）将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称及定量参考品浓度；
2） 荧光检测通道选择：选择FAM通道（Reportere:FAM, Quencher:None）检测检测百JC病毒DNA；选择HEX或VIC通道（Reporter:VIC, Quencher:None）检测BK病毒；选择ROX通道（Reporter:ROX, Quencher:None）检测内标；选择CY5通道（Reporter:CY5, Quencher:None）检测SV40病毒；
3）荧光定量PCR反应条件为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
4）结果分析
反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和定值结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct（即cycle threshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数值）。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
对于测定值在4.00E+02~4.00E+09拷贝/ml之间的样本，报告相应的测定结果。
对于测定值>4.00E+09拷贝/ml 的样本，报告注明>4.00E+09拷贝/ml。若需精确定量，可根据结果将样本稀释至4.00E+09拷贝/ml以下再复测。
每次实验应满足如下质量控制中的要求，实验结果才可靠。
质量控制：
1）阴性对照：FAM/HEX/CY5检测通道无荧光信号增长，且无明显S型扩增曲线，ROX检测通道有明显S型扩增曲线，且检测Ct值小于35；
2）阳性对照：FAM/HEX/CY5检测通道有明显S型扩增曲线，且检测Ct值小于35；
3）四个定量参考品：FAM/HEX/CY5检测通道均检测为阳性，且标准曲线相关系数R2≥0.98；
4）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
实施例3、本发明组合物检测多瘤病毒并分型
将本公司合格试剂检测为强阳性的JC病毒、BK病毒、SV40病毒的克隆质粒，经紫外分光光度计测定OD260值、标定浓度，按浓度合并成同浓度的混合样本后用TE稀释至4.00E+05拷贝/ml，使用本发明实施例1所述的组合物，按照本发明实施例2的方法在SLAN-96P仪器上进行检测，考查联检试剂对样本的检测效果，结果如图1所示，从图中可以看出检测曲线成典型的S型，实验证明本发明的组合物能够很好的对这三种病毒进行检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
选取检测限样本（400拷贝/ml），分别使用两种不同的核酸提取试剂，严格按试剂盒说明书的要求操作，使用本发明实施例1所述的组合物，按照本发明实施例2的方法在同一台SLAN-96P仪器上进行检测，重复检测20次，验证本试剂盒的最低检测限。实验结果如图2-4所示，在样本浓度为400拷贝/ml时，20次检测均能正确检测出样本。因此，实验证明本发明组合物的灵敏度为400拷贝/ml。
实施例5、本发明组合物的特异性
以种属相近的或引起症状相似或临床上常见的临床确认阳性样本（人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、单纯疱疹病毒1型、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人细小病毒B19），使用本发明实施例1所述的组合物，按照本发明实施例2的方法在同一台Slan 96仪器上检测，通过分析检测阴阳性符合性，分析组合物的特异性。实验结果如图5-7所示，本发明的组合物在三个通道均未出现非特异性扩增，证明本发明组合物的特异性较好。
实施例6、本发明组合物的对比例检测多瘤病毒
为了进一步说明本发明组合物的优势，发明人在设计过程中设计了其余的多对引物，其中，JC病毒和SV40病毒引物探针筛选分别发现有引物和探针（对比例）在单一检测时的技术效果较好，如图8-9所示，但是，发明人进一步将JC病毒和SV40的这些引物探针与本申请的BK引物探针组合在一起测试后发现，这些组合物的效果明显变差，结果如图10所示，对比例所用引物和探针的Ct值与荧光值都较图1相比变差，并且甚至有一个靶点由于体系干扰出现了信号抑制，没有信号而没有检测到。所以，实验证明，本发明的组合物在检测方面有着更高的灵敏度优势。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测多瘤病毒并分型的组合物、试剂盒、方法及其用途
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggggacctag ttgccagtgt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagcaccag caattacagc a 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcatccctt gctactgtag agggcat 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
acacccaaac cattgtctga agca 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tccttcagtg cattgcccct gt 22
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatctatcc acacaagtgg gctgcttc 28
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tcattaaagg cattccacca c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcattaaagg cattccacca c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tcattaaagg cattccacca c 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caagatcatc agcaatgcct 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agtccttcca cgataccaaa 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caccaccaac tgcttagcac ccct 24

Claims (9)

1.一种检测多瘤病毒并分型的组合物，所述组合物包括：
BKV-F1：5'-GGGGACCTAGTTGCCAGTGT-3'（SEQ ID NO:1）；
BKV-R1：5'-GGAGCACCAGCAATTACAGCA-3'（SEQ ID NO:2）；
BKV-P1：5'-TGCATCCCTTGCTACTGTAGAGGGCAT-3'（SEQ ID NO:3）；
JCV-F1：5'-ACACCCAAACCATTGTCTGAAGCA-3'（SEQ ID NO:4）；
JCV-R1：5'-TCCTTCAGTGCATTGCCCCTGT-3'（SEQ ID NO:5）；
JCV-P1：5'-CAATCTATCCACACAAGTGGGCTGCTTC-3'（SEQ ID NO:6）；
SV40-F1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:7）；
SV40-R1：5'-TGTGTTAAACTACTGATTCTAATTGTTTG-3'（SEQ ID NO:8）；和
SV40-P1：5'-TCATTAAAGGCATTCCACCAC-3'（SEQ ID NO:9）；其中，所述组合物的探针的荧光基团不互相干扰。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括：
IC-F1：5'-CAAGATCATCAGCAATGCCT-3'（SEQ ID NO:10）；
IC-R1：5'-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3'（SEQ ID NO:11）；和
IC-P1：5'-CACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3'（SEQ ID NO:12）。
3. 根据权利要求1所述的组合物，其中，如SEQ ID NO:3所示的BKV探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO:6所示的JCV探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO:9所示的SV40探针的荧光基团为CY5。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的各成分存在于同一个包装中。
5.权利要求1~4中任一项所述的组合物在制备用于检测多瘤病毒并分型的试剂盒中的用途。
6.一种用于检测多瘤病毒并分型的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1~4中任一项所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dNTP、DNA聚合酶、UNG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述组合物中引物的用量为25~100nM；所述组合物中探针的用量为10~75nM。
9.一种用于以非诊断目的检测多瘤病毒并分型的方法，所述方法包括以下步骤：
1）释放待测样本的核酸；
2）使用如权利要求1~4中任一项所述的组合物对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；
3）获得并分析结果。
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