CN117683946B - 鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光pcr引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于体外诊断试剂领域，提供一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物、探针、试剂盒及方法，引物和探针组合如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.9所示。本发明以麻疹病毒全基因组中核蛋白基因（N基因）为靶基因，根据麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段、差异片段、人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段分别设计引物探针，结合扩增受阻突变系统（ARMS），从而实现在一管检测液中定性检测样品中是否含有麻疹病毒，同时对检测出的阳性麻疹样品为野毒株或疫苗株进行准确区分。本发明检测灵敏度高、特异性高，可检测出1000copies/ml的麻疹通用基因浓度。
Description
技术领域
本发明为体外诊断试剂领域，涉及鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物、探针、试剂盒及方法，具体利用荧光PCR定性检测样品中是否含有麻疹病毒，同时对检测出的阳性麻疹样品为野毒株或疫苗株进行准确区分。
背景技术
麻疹病毒为麻疹的病原体，于20世纪50年代由学者从麻疹患者的血液中分离获得。研究表明：麻疹病毒为有包膜的单链RNA病毒，属副黏液病毒科的麻疹病毒属。麻疹的临床表现为发热、上呼吸道炎症、眼结膜炎及皮肤出现红色斑丘疹和颊黏膜柯式斑，疹退后遗留色素沉着伴糠麸样脱屑。同时可能会产生呼吸道疾病（如中耳炎、喉气管炎、肺炎等）、麻疹脑炎、亚急性硬化性全脑炎等严重并发症。麻疹患者是麻疹的唯一传染源，主要通过呼吸道飞沫传播，人群普遍易感。自1965年开始大规模使用麻疹减毒活疫苗后，麻疹发病率持续下降，但也有研究证明麻疹减毒活疫苗接种后，有少部分受种者会出现暂时性皮疹的不良反应，与麻疹野病毒引起的不典型麻疹病例相类似，临床上难以鉴别，且麻疹病毒只有一个血清型，血清学检测很难区分疫苗株与野毒株。
依据【WS 296-2017 麻疹诊断】，对于麻疹的诊断方法主要有血清学和病原学。血清学方法利用ELISA定性或定量的方式检测人血清或血浆中抗麻疹病毒的IgM抗体或者IgG抗体,但由于麻疹只有一种血清型，所以血清学方法很难区分麻疹病毒的野毒株与疫苗株。病原学方法通过采集咽拭子和尿液标本对病毒进行分离,采用RT-PCR的方法进行麻疹病毒的鉴定，结合测序的方式对毒株进行分型鉴别。
综上所述，开发一种简单快捷准确的用于鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的试剂对于区分疫苗株和野毒株引起的疑似麻疹病例具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物、探针、试剂盒及方法。本发明基于荧光PCR技术结合扩增受阻突变系统（ARMS），在PCR快速、稳定、特异性强和灵敏度高等优势的基础上，实现在1管反应液中做出对麻疹病毒的检测，从而实现在一管检测液中定性检测样品中是否含有麻疹病毒，同时对检测出的阳性麻疹样品为野毒株或疫苗株进行准确区分。
本发明以麻疹病毒全基因组中核蛋白基因（N基因）为靶基因，根据麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段、保守片段分别设计引物探针，再根据人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段设计引物探针，最后将所有引物探针按QC1:QC2:QC3:QC4:QC5:QC6:QC7:QC8:QC9=800nM:800nM:400nM:800nM:800nM:400nM:400nM:400Nm:200nM的终浓度配置成引物探针混合液，再和上海硕颖生产的one step buffer（3.33×）和one step enzyme（5×）配置成25-50µL的麻疹病毒ARMS检测液，取5-10µL待检样本的核酸与之震荡混匀后在荧光PCR仪上按预设的反应程序运行。
本发明技术原理为：当反应体系中不存在目的基因片段时，不发生扩增过程，不会产生扩增曲线；当反应体系中存在目的基因片段时，引物探针与目的基因结合，会发生扩增过程，产生相应的扩增曲线，若检测区段发生基因位点突变时，扩增Ct值会滞后。
本发明的目的可以通过以下方案来实现：
第一方面，本发明提供一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物，包括如下序列的引物：
（1）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段的引物序列QC1和QC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；
（2）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段的引物序列QC4和QC5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：5所示；
（3）扩增人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段的引物序列QC7和QC8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：8所示。
本发明中，引物的序列如下：
QC1：5’-GTTCAGTGCAGGATCATACCCTC-3’（SEQ ID NO：1）；
QC2: 5’-ACCATCTCTTGCCCTAATCTAAA-3’（SEQ ID NO：2）；
QC4: 5’-GGCTTGTTTCAGAGATTGCAATGCATA-3’（SEQ ID NO：4）；
QC5：5’-ACTTTGATCACCGTGTAGAAATGAC-3’（SEQ ID NO：5）；
QC7：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’（SEQ ID NO：7）；
QC8：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’（SEQ ID NO：8）。
作为本发明的一个实施方案，QC1、QC2所扩增的特异性片段为麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段、QC4、QC5所扩增的特异性片段为麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段、QC7、QC8所扩增的特异性片段为人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段。
本发明中，QC1、QC2、QC3为用于检测麻疹病毒的特异性引物和探针，QC4、QC5、QC6为用于检测麻疹病毒野毒株和疫苗株的特异性引物和探针，QC7、QC8、QC9为用于检测人源性核糖核苷酸酶P的特异性引物和探针。
第二方面，本发明提供一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR探针，包括如下序列的探针：
（1）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段的探针序列QC3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
（2）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段的探针序列QC6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
（3）扩增人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段的探针序列QC9，其核苷酸序列如SEQID NO：9所示。
本发明中，所述探针的序列如下：
QC3: 5’-AACCTCCCATGGAGTTTTCAAGTTCCACTCC-3’（SEQ ID NO：3）；
QC6：5’-CAGGATCAGTAGAGCGGTCGG-3’（SEQ ID NO：6）；
QC9：5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’（SEQ ID NO：9）。
作为本发明的一个实施方案，所述QC3的5’和 3’分别标记VIC荧光素和BHQ1荧光淬灭基团，QC6的5’和 3’分别标记FAM荧光素和BHQ1荧光淬灭基团，QC9的 5’和 3’分别标记CY5荧光素和BHQ3荧光淬灭基团。
第三方面，本发明提供一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物和探针组合，所述引物和探针组合包括如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。
第四方面，本发明提供一种如所述引物和探针组合在制备鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的试剂盒中的应用，所述试剂盒包括如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：9所示的引物和探针组合。
作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒还包括3.33×one step buffer、5×onestep enzyme、TE缓冲液。
第五方面，本发明提供一种利用所述引物的非诊断目的的鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、检测液配制：按照终浓度比例配置成引物探针混合液，将引物探针混合液、3.33×one step buffer、5×one step enzyme按体积比配置成麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液；
S2、模板RNA提取：提取待检样本中的核酸；
S3、核酸加样：将步骤S2中提取好的核酸和阳性质控品及空白质控品加入麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液，放入试管后封盖、震荡离心；
S4、程序运行：将步骤S3中的反应管置于实时荧光PCR仪，设置下列程序运行：
步骤1：50℃×10 min，1cycle；
步骤2：95℃×5 min，1cycle；
步骤3：95℃×10 s、58℃×30s，45cycles；
步骤4：循环结束后，采集荧光并校正；
S5、结果分析及判读。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述终浓度（摩尔浓度）比例为QC1:QC2:QC3:QC4:QC5:QC6:QC7:QC8:QC9 =800nM:800nM:400nM:800nM:800nM:400nM:400nM:400nM:200nM。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述引物探针混合液的体积为终体积的5-30%，所述3.33×one step buffer的体积为终体积的3/10，5×one step enzyme的体积为终体积的1/5，其余为TE缓冲液。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述检测液的份数至少为n份；其中，n=检测人份+3，即n=检测人份+2人份阳性质控品+1人份空白对照（空白质控品）。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2中，核酸的提取采用硕世生物公司的全血提取试剂盒（货号：SDK60110），具体提取方法按照说明书操作。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2。
作为本发明的一个实施方案，所述阳性质控品1的制备方法包括：按照麻疹病毒野毒株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制；要求终浓度均保持在106copies/ml至107copies/ml之间；所述麻疹病毒野毒株质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，RNase P质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
作为本发明的一个实施方案，所述阳性质控品2的制备方法包括：按照麻疹病毒疫苗株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制；要求终浓度均保持在106copies/ml至107copies/ml之间；所述麻疹病毒疫苗株质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，所述空白质控品为灭菌去RNA酶的水。
在一些实施例中，步骤S3的核酸加样是将提取好的核酸和阳性质控品及空白质控品按5 µL的体积加入麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液的8连管，封盖后震荡离心。
作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述荧光PCR仪包括ABI7500、QuantStudio™ 5、Bio-Rad CFX96™、上海宏石SLAN-96P/S、Roche LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪中的至少一种。
作为本发明的一个实施方案，步骤S4的步骤4中，设置FAM、VIC、CY5采集荧光。
作为本发明的一个实施方案，步骤S5中，所述结果分析及判读的方法包括：不同的荧光PCR仪需参考对应荧光PCR仪器的操作说明书进行操作分析。当FAM荧光通道和VIC荧光通道不产生扩增曲线且CY5荧光通道产生扩增曲线时，可对该样本判读为阴性样本；当VIC荧光通道产生扩增曲线时，可对该样本判读为麻疹病毒阳性样本，此时通过FAM荧光通道和VIC荧光通道的Ct差值范围可区分阳性麻疹样品是否为野毒株或疫苗株。
进一步的，阳性判断值：本发明通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数（Youden index）确定阳性判断值。其中VIC荧光通道和CY5荧光通道检测结果Ct≤38时判读为阳性；检测结果 Ct＞38或者未检出时判读为阴性。
本发明中，FAM通道检测麻疹病毒野毒株和疫苗株突变区段（即差异片段）；VIC通道检测麻疹病毒野毒株和疫苗株保守区段；当某样本的ΔCt<3（ΔCt（X）=Ct（VIC）-Ct（FAM））时，结果判读为该样本为麻疹病毒野毒株；当某样本的ΔCt≥3（ΔCt（X）=Ct（VIC）-Ct（FAM）），结果判读为该样本为麻疹病毒疫苗株。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明采用荧光定量PCR结合扩增受阻突变系统实现了对麻疹病毒进行高特异性，简单快捷的毒株鉴别。
（2）麻疹的诊断方法主要有血清学和病原学，但由于麻疹只有一个血清型，所以利用血清学方法不能对麻疹病毒的两种毒株进行分型。相对于同时传统的分型方法RT-PCR-RFLP，需要进行多步实验进行对麻疹病毒的分型检测，本发明操作简单、快捷且容易培训。
（3）本发明检测了与麻疹症状相似或感染部位相同的其他病原微生物（风疹病毒、腮腺炎病毒、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、小反刍兽疫病毒、海豹瘟热病毒）以及人类白细胞的总核酸无交叉反应。
（4）本发明检测灵敏度高，可检测出1000copies/ml的麻疹通用基因浓度。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为检测原理图；
图2为检测麻疹病毒野毒株质控品1结果图；
图3为检测麻疹病毒疫苗株质控品2结果图；
图4为实施例4中检测出麻疹病毒野毒株的扩增曲线；
图5为实施例4中检测出麻疹病毒疫苗株的扩增曲线；
图6为实施例4中野毒株样品检测图；
图7为实施例4中疫苗株样品检测图；
图8为实施例5中特异性分析实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供了一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物、探针、试剂盒及方法，其检测原理如图1所示。
实施例1：引物探针设计
通过NCBI查找下载麻疹病毒的核蛋白基因和人源性RNase P基因，根据上述技术原理，采用Primer Express 3.0.1设计引物和探针，设计多组野毒株检测引物和麻疹病毒通用引物，然后检测不同组合FAM和VIC通道的ΔCt，然后以ΔCt尽可能大的基本原则，筛选出合适的野毒株检测引物和麻疹病毒通用引物，最后用 NCBI-BLAST确认引物探针特异性，得到用于本发明的引物探针（QC1、QC2、QC3、QC4、QC5、QC6、QC7、QC8、QC9）。
实施例2：引物探针混合液及检测液的配制
经过多次优化，本发明引物探针及酶体系配方如下表所示（本次实施例反应终体积以25µL为例）：
按照上述引物探针及酶体系配方制得的检测液，并将检测液按20µL的体积放入反应管中，得到若干反应管待用。
实施例3：核酸提取
采用硕世生物全血提取试剂（货号：SDK60110），按照说明书对样本进行提取。麻疹野毒株样本来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，麻疹病毒疫苗株样本购自中国生物技术集团公司，上海生物制品研究所，麻疹减活疫苗S20063007（2009-5）。
实施例4：上机运行并分析
将提取好的核酸和阳性质控品1和2及空白质控品分别按5 µL的体积加入装有麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液的反应管，封盖后震荡离心；
其中，阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2；阳性质控品1的制备方法包括：按照麻疹病毒野毒株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制；终浓度为106copies/ml。
阳性质控品2的制备方法包括：按照麻疹病毒疫苗株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制；终浓度为106copies/ml。
空白质控品为灭菌去RNA酶的水。
反应管置于实时荧光PCR仪，在实时荧光PCR仪上，按照下列内容设置程序，并运行，本发明经测试研究，可兼容的PCR仪包括：ABI7500、QuantStudio™ 5、Bio-Rad CFX96™、上海宏石SLAN-96P/S、Roche LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪。
步骤①：50℃×10 min（1cycle）
步骤②：95℃×5 min（1cycle）
步骤③：95℃×10 s；58℃×30s（45 cycles）
在步骤③循环结束的58℃×30 s时，设置FAM、VIC、CY5采集荧光。
结果分析及判读：不同的荧光PCR仪需参考对应荧光PCR仪器的操作说明书进行操作分析。当FAM荧光通道和VIC荧光通道不产生扩增曲线且CY5荧光通道产生扩增曲线时，可对该样本判读为阴性样本，当VIC荧光通道产生扩增曲线时，可对该样本判读为麻疹病毒阳性样本，此时通过FAM荧光通道和VIC荧光通道的Ct差值范围可区分阳性麻疹样品是否为野毒株或疫苗株。图2、3显示出阳性质控品1和阳性质控品2的结果正常；麻疹病毒野毒株的扩增曲线和检测图分别如图4、6所示，麻疹病毒疫苗株的扩增曲线和检测图分别如图5、7所示。
实施例5：性能研究
特异性分析：检测了与麻疹症状相似或感染部位相同的其他病原微生物以及人类白细胞的总核酸，检测方法参照实施例1-4，将实施例3中的所有样本依次替换为其他病原微生物，检测结果均为阴性，特异性分析实验结果如图8所示。
上述与麻疹症状相似或感染部位相同的其他病原微生物为风疹病毒、腮腺炎病毒，其中风疹病毒来自于邦德盛生产的风疹病毒核糖核酸（RV RNA)液体室内质控品，腮腺炎病毒来自于中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。
最低检测限确认：将麻疹病毒野毒株和疫苗株样本采用数字PCR仪进行定量，然后将已知浓度的核酸分别稀释至5000 copies/ml、1000 copies/ml、800 copies/ml进行检测，检测结果显示当浓度在1000 copies/ml浓度时，麻疹病毒通用基因的检出率为100%（20/20），因此本发明最低检测限规定为1000 copies/ml。
本发明采用荧光PCR技术结合扩增受阻突变系统原理，在PCR高灵敏度、高特异性检测的基础上实现了对麻疹病毒两种毒株的快速检测，整个过程设计巧妙，操作简单，为临床提供一种更加便捷的检测方法。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (8)
1.一种鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的荧光PCR引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括如下序列：
（1）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段的引物序列QC1和QC2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：2所示；
（2）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段的引物序列QC4和QC5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：5所示；
（3）扩增人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段的引物序列QC7和QC8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7-SEQ ID NO：8所示；
所述探针包括如下序列：
（1）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的保守片段的探针序列QC3，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示；
（2）扩增麻疹病毒野毒株与疫苗株的差异片段的探针序列QC6，其核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；
（3）扩增人源性核糖核苷酸酶P基因保守片段的探针序列QC9，其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述QC3的5’和 3’分别标记VIC荧光素和BHQ1荧光淬灭基团，QC6的5’和 3’分别标记FAM荧光素和BHQ1荧光淬灭基团，QC9的 5’和 3’分别标记CY5荧光素和BHQ3荧光淬灭基团。
3.一种如权利要求1所述引物和探针组合在制备鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：9所示的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括3.33×one stepbuffer、5×one step enzyme、TE缓冲液。
5.一种利用如权利要求1所述引物和探针组合的非诊断目的的鉴别麻疹病毒野毒株和疫苗株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、检测液配制：按照终浓度比例配置成引物探针混合液，再将引物探针混合液、3.33×one step buffer、5×one step enzyme按体积配置成麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液；
S2、模板RNA提取：提取待检样本中的核酸；
S3、核酸加样：将步骤S2中提取好的核酸和阳性质控品及空白质控品加入麻疹病毒野毒株和疫苗株检测液，放入试管后封盖、震荡离心；
S4、程序运行：将步骤S3中的反应管置于实时荧光PCR仪，设置下列程序运行：
步骤1：50℃×10 min，1cycle；
步骤2：95℃×5 min，1cycle；
步骤3：95℃×10 s、58℃×30s，45cycles；
步骤4：循环结束后，采集荧光并校正；
S5、结果分析及判读。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述终浓度比例为QC1:QC2:QC3:QC4:QC5:QC6:QC7:QC8:QC9=800nM:800nM:400nM:800nM:800nM:400nM:400nM:400nM:200nM。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述引物探针混合液的体积为终体积的5-30%，所述3.33×one step buffer的体积为终体积的3/10，5×one stepenzyme的体积为终体积的1/5，其余为TE缓冲液。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2；所述阳性质控品1按照麻疹病毒野毒株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制而成；所述阳性质控品2按照麻疹病毒疫苗株质粒: RNase P质粒的拷贝浓度比为1:1配制而成。
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