KR101567765B1

KR101567765B1 - 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 소파보바이러스의 정량 검출방법

Info

Publication number: KR101567765B1
Application number: KR1020130155415A
Authority: KR
Inventors: 김인섭; 이재일; 윤진철
Original assignee: 한남대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-11-18
Also published as: KR20150069230A

Abstract

본 발명을 통해 BPV 안전성을 확보하기 위해, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 BPV를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 BPV 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 BPV 검출 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응 시험법을 확립하였다. 또한 BPV에 특이적인 프라이머와 프로브를 선별하여 BPV 정량검출 시험법을 최적화하였다. 세포배양법에 의한 감염역가와 비교한 결과 실시간 중합효소 연쇄반응 시험법은 특이성과 재현성이 우수함을 확인하였다.

Description

실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 소파보바이러스의 정량 검출방법{Real-time PCR assays for quantitative detection of bovine parvovirus}

본 발명은 소파보바이러스(bovine parvovirus, BPV)의 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)에 관한 것으로, 상세하게는 BPV 유전자와 상보적으로 결합가능한 프라이머와 프로브를 포함하는 프라이머 세트, 상기 프라이머와 프로브를 포함하는 키트 및 BPV 검출방법에 관한 것이다.

생물의약품과 조직공학의약품, 세포치료제 제조 시 사용되는 원료물질의 기원과 특성에 따라 오염 바이러스의 검색 대상이 매우 다양하나, 소유래 원료물질을 함유한 제제에 있어서 공통적인 검색대상이 되는 대표적인 오염 바이러스 중의 하나는 소파보바이러스(bovine parvovirus, BPV)이다. 소파보바이러스는 소의 유산 및 설사와 호흡기 증상을 유발시킨다. 이 바이러스는 Parvoviridae 과에 속하며, 5,517 개의 염기를 갖는 단일나선 RNA 유전체(single positive-stranded RNA genome)로 구성되어 있고, 3개의 ORF(open reading frame)을 갖고 있는 외피를 보유하지 않은 바이러스(non-enveloped virus)이다. 소에서 BPV 항체의 혈청학적 조사 결과에 의하면 평균 70% 이상이 양성을 나타내고 있어 소파보바이러스는 소에게 만연한 바이러스임을 알 수 있다. 소 태아에도 소파보바이러스가 감염된 사례가 보고되고 있어, 세포배양의 원료물질로 사용되는 FBS(fetal bovine serum)에 오염될 가능성이 있다. 따라서 소파보바이러스는 생물의약품과 조직공학제제, 세포치료제의 원료로 사용되는 유래 혈액, 세포, 조직 및 기관 등에 오염될 수 있는 대표적인 바이러스이기 때문에, 인체에 직접적인 감염 여부는 알려져 있지 않지만, 잠재적인 위해요소 중의 하나이다.

주로 질병의 진단을 위하여 소파보바이러스 검출시험법이 개발되어 왔다. 소파보바이러스 검출 시험법으로는 혈청에 존재하는 항체를 이용하여 검출하는 혈청중화시험법과 혈구응집반응 시험(haemagglutination assay)가 있다. 상기 시험법은 시간과 비용이 많이 들고, 민감도와 특이도가 떨어지는 단점이 있어, 생물의약품 생산 공정에서 소파보바이러스 검출 시험법으로 적용하는데 어려움이 있다. 최근 생물의약품과 조직공학제제 및 세포치료제에서 내인성 또는 외래성 위해 바이러스의 검출을 위한 시험법으로 민감도와 특이도가 우수한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 활용한 유전자 증폭기술이 널리 활용되고 있다. 또한 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 바이러스의 정량검출과 바이러스 제거 검증 실험을 위한 시험법의 확립 연구가 시도되고 있다.

본 발명에서는 유래 물질을 원료로 하는 생물의약품, 조직공학제제 및 세포치료제 등에서 소파보바이러스의 안전성을 확보하기 위해 원료물질, 제조공정 및 완제품에서 소파보바이러스를 정량적으로 검출하고, 제조공정에서 소파보바이러스 제거 검증을 위한 시험법으로 활용이 가능한 실시간 중합효소 연쇄반응 시험법을 확립하였다. 또한 상기 확립한 시험법을 활용하여, 인위적으로 소파보바이러스를 감염시킨 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주에서 소파보바이러스를 정량적으로 검출하여 바이러스 안전성 검증 시험법으로 활용하고자 하였다.

본 발명은 소파보바이러스(BPV)의

ORF 유전자 검출을 위한, 정방향 프라이머로서 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 역방향 프라이머로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 및 프로브로서 서열번호 7로 표시되는 염기서열;

VP2 유전자 검출을 위한, 정방향 프라이머로서 서열번호 3으로 표시되는 염기서열, 역방향 프라이머로서 서열번호 4로 표시되는 염기서열, 및 프로브로서 서열번호 7로 표시되는 염기서열;

및

VP2 유전자 검출을 위한, 정방향 프라이머로서 서열번호 5으로 표시되는 염기서열, 역방향 프라이머로서 서열번호 6로 표시되는 염기서열, 및 프로브로서 서열번호 7로 표시되는 염기서열;

로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용하는 소파보바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"란 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 서열번호 1과 2, 서열번호 3과 4 및 서열번호 5와 6의 염기서열을 가지는 프라이머로 PCR을 수행한 경우 각각의 소파보바이러스 유전형을 높은 특이도 및 민감도로 검출할 수 있다. 상기에서 '민감도(sensitivity)'는 병이 있는 사람을 병이 있다고 판단하는 비율을 의미하며, '특이도(specificity)'는 정상인 사람을 정상이라고 판단하는 비율을 의미한다.

본 발명에서, 상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 5' 말단의 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ 1, 2 및 3 (black hole quencher 1, 2, 3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브(probe)"란 올리고뉴클레오타이드를 말하는 것으로, 자연적으로 발생하거나 합성적으로, 재조합적으로, 또는 PCR 증폭에 의해 생산되는 것으로 목적하는 다른 올리고뉴클레오타이드에 대해 최소 부분에 결합할 수 있다. 프로브는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 프로브는 특정 서열의 검출, 정의 및 분리에 유용하다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 사용된 프로브는 형광성, 방사성 및 발광성 시스템을 포함할 수 있고, 다른 검출 시스템에서 검출할 수 있도록 "리포트 분자"로 표지될 수 있다. 본 발명은 특별한 검출 시스템 또는 라벨에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 프로브는 서열번호 5로 제시되는 프로브이다.

본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 소파보바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.

상기 키트의 구성으로는 제한되지는 않지만 본 발명의 서열을 갖는 프라이머와 프로브 및 내부 대조군으로서의 프라이머와 프로브를 포함하는 키트로 제조될 수 있으며, 소파보바이러스의 검출 및 정량을 위하여 완충용액, 염화칼륨, 염화마그네슘 또는 dNTP 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 사용하여, 분리된 생물학적 시료의 소파보바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 소파보바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 소파보바이러스로 감염되거나, 감염을 의심받는 개체 또는 소파보바이러스 백신으로 백신화된 개체의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소파보바이러스 의심 개체의 혈액으로부터 수득되는 시료임이 바람직하다.

본 발명에 따른 실시간 중합효소 연쇄반응법을 이용하면 소파보바이러스 감염에 대한 검출 및 정량을 기존 방법과 비교하여 동등 이상의 민감도와 특이도로 수행할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 서로 다른 프라이머 세트를 이용하여 소파보바이러스를 검출하는 것에 관한 것으로 (A) 어닐링 온도 56 ℃, (B) 어닐링 온도 58 ℃, (C) 어닐링 온도 60 ℃. M: 100 bp DNA ladder, 1: BPV-18F, BPV-18R 프라이머 세트, 2: BPV-20F, BPV-20R 프라이머 세트, 3: BPV-22F, BPV-22R 프라이머 세트, NC: 음성대조군이다.
도 2는 DNA BLAST 검색을 이용하여 BPV 서열(M14363.1)과 BPV PCR 산물의 서열을 비교한 것이다.
도 3은 BPV 검출을 위한 SYBR Green 실시간 중합효소 연쇄반응의 민감도이다.
도 4는 BPV 검출을 위해 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응시 최적 어닐링 온도로부터 증폭 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는 BPV 검출을 위해 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응시 최적 프라이머와 프로브 농도로부터 증폭 그래프를 나타낸 것이다.
도 6는 BPV 검출을 위해 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응시 최적 염화마그네슘 농도로부터 증폭 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은 잠재적인 cross-reactive 바이러스들에 대한 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응의 민감도를 나타낸 것이다.
□: BPV, 다른 부호: BHV, BVDV, BPIV-3, HAV, MVM, PEDV, PPV, PRoV, PRV, REO-3.
도 8은 BPV의 정량적인 검출을 위한 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응의 재생성과 선형성을 나타낸 것이다.
도 9는 인위적으로 감염된 CHO-K1 세포주에서 BPV의 정량적인 검출을 나타낸 것으로 (A)는 BPV에 감염되지 않은 CHO-K1 세포주 (B)는 BPV에 감염된 CHO-K1 세포주의 형태를 나타내며 (C)는 BPV의 정량적인 검출을 위한 TaqMan 프로브 실시간 중합효소 연쇄반응의 증폭 그래프를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1) 소파보바이러스(BPV)의 배양

BPV(ATCC VR-767)의 배양과 정량을 위해 EBTr세포(ATCC CCL-44)를 사용하였다. EBTr세포를 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Hyclone, USA)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Minimum Eagle's Medium, Hyclone, USA) 배지에 1x Antibiotic Antimycotic Sol.(Hyclone, USA)을 첨가하여 배양하였다. T-150 플라스크에 배양된 단층 세포에 BPV를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 세포병변효과가 명백하게 관찰될 때 배양액과 세포 찌꺼기(debris)를 수거한 다음, 동결과 해빙 과정을 3회 반복하여 파쇄한 후 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상층액을 얻은 후 0.45 μm 필터로 여과한 다음 소분하여 -70 ℃ 이하에 보관하였다.

(실시예 2) 소파보바이러스(BPV)의 정량

BPV의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 타이터(titer)를 50% TCID₅₀(tissue culture infectious dose)로 나타내었다. BPV를 2% FBS를 첨가한 DMEM 배지로 7배수로 희석하여 24-well plate에 배양된 세포에 0.25 mL 씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양배지를 0.25 mL 씩 접종하였다. 그 후 35 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하면서 주기적으로 현미경으로 CPE를 관찰하며 배양 14일 후에 타이터를 측정하였다.

(실시예 3) 게놈(genomic) RNA 추출

BPV 게놈 DNA는 GeneALL^® Exgene^TM Blood SV mini Kit(GeneALL, Korea)를 이용하여 Blood and body fluid using microcentrifuge protocol에 따라 수행하였다. BPV 200 μL을 20 μL의 Protease K(20 mg/mL)에 섞은 후 BL 버퍼 200 μL를 첨가한 뒤 교반하였다. 상기 혼합물을 56 ℃에서 5분간 처리한 후, 99% 에탄올 200 μL를 첨가하여 컬럼으로 옮겨 6,000 x g에서 1 분간 원심분리하였다. 컬럼에 BW 버퍼 600 μL를 넣고 6,000 x g에서 1 분간 원심분리하고 다시 TW 버퍼 700 μL를 넣고 6,000 x g에서 1 분간 원심분리하였다. 마지막으로 11,000 x g에서 1 분간 원심분리한 뒤 컬럼에 AE 버퍼 200 μL를 넣고 1 분간 방치하였다. 11,000 x g에서 1 분간 원심분리하여 컬럼에서 게놈 DNA를 분리하였고 -20 ℃에 보관하였다.

(실시예 4) 프라이머(primer)의 디자인 및 선별

BPV 유전자를 증폭하기 위해 사용한 올리고핵산 프라이머 염기서열은 미국 NCBI 데이터베이스에 보고된 BPV 게놈(GenBank Accession Number: M14363.1)을 기초로 Primer3 Input 4.0 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 표 1과 같이 세 쌍의 프라이머를 디자인하였다.

[표 1]

* Genbank no.: M14363.1

앞서 제작한 세 쌍의 프라이머 중 최적의 프라이머를 선별하기 위해 어닐링(annealing) 온도를 다르게 하여 MyGenie96 Thermal Block(Bioneer, Korea)을 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. BPV DNA를 4.52 x 10⁵ TCID₅₀/mL로 준비하였다. PCR 반응을 위해 2x GoTaq^® Green Master Mix(Promega, USA) 10 μL, 10 pmol 정방향 프라이머 1 μL, 10 pmol 역방향 프라이머 1 μL, BPV 게놈 DNA 2 μL 혼합액에 멸균한 3차 증류수 6 μL를 첨가하여 최종부피를 20 μL로 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 95 ℃에서 5 분, denaturation은 95 ℃에서 30초, 어닐링은 30초(어닐링 온도 최적화를 위해 56 ℃에서 58 ℃에서 60 ℃에서 PCR 수행), extension은 72 ℃에서 1분으로 하여 45 사이클을 수행하였다. 이후 72 ℃에서 5분간 반응시킨 후 1.5% 아가로스 젤을 이용하여 100 V 전압으로 30분 정도 전기영동한 후 EtBr(ethidium bromide)로 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다. 또한 증폭된 DNA가 목적하는 산물인지를 확인하기 위해 DNA 서열확인을 실시하였다.

선별된 프라이머를 이용하여 민감도를 측정하였다. BPV DNA는 4.52 x 10⁵ TCID₅₀/mL, 4.52 x 10⁴ TCID₅₀/mL, 4.52 x 10³ TCID₅₀/mL, 4.52 x 10² TCID₅₀/mL, 4.52 x 10¹ TCID₅₀/mL, 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL로 10배씩 순차적으로 희석하여 준비하였다. 이와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 반응이 끝난 후 1.5% 아가로스 젤을 사용하여 100 V 전압으로 30분 전기영동한 후 EtBr로 염색하여 PCR 반응산물을 확인하였다.

최적의 프라이머 쌍을 선별한 결과 최적온도 56 ℃에서 BPV-18F, BPV-18R만 반응을 나타내었다(도 1). PCR 산물의 서열을 확보한 후 BLAST 정렬을 수행한 결과 목적 유전자 무분에서 디자인한 산물의 크기가 100% 일치하였으며 BPV 서열과 상동성이 100%인 것을 확인하였다(도 2). 선별된 프라이머 쌍의 민감도를 타이터가 4.52 x 10⁵ TCID₅₀/mL에서 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL까지 희석한 BPV 시료로 PCR을 수행한 결과를 4.52 x 10¹ TCID₅₀/mL까지 나타내었다(도 3).

(실시예 5) BPV 프로브(probe) 디자인

TaqMan probe 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위해 프로브의 5' 말단에는 FAM (5-carboxy fluorescein)을, 3' 말단에는 TAMRA (carboxytetramethyl-rhodamine)이 오도록 표 2와 같이 디자인하였다.

[표 2]

*Genbank no.: M14363.1

(실시예 6) TaqMan probe 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 BPV DNA 검출시험

BPV 정량을 위해 PCR을 통해 확립된 PCR 조건을 기초로 Premix Ex Taq^TM(TaKaRa, Japan)을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응 조건을 확립하였고 Eco^TM(Illumina,USA)를 사용하여 정량하였다. 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 PCR 반응액은 Premix Ex Taq^TM 10 μL, 10 pmol 정방향 프라이머 1 μL, 10 pmol 역방향 프라이머 1 μL, 10 pmol 프로브 1 μL, BPV 게놈 DNA 2 μL에 멸균된 3차 증류수 6 μL를 넣어 총 20 μL가 되게 하였다. 핵산증폭은 pre-incubation은 95 ℃에서 2분, denaturation은 95 ℃에서 5초, 어닐링은 30초(어닐링 온도 최적화를 위해 54 ℃, 56 ℃, 58 ℃, 60 ℃에서 실시간 중합효소 연쇄반응 수행)로 하여 45 사이클을 수행하였다. 최적의 프라이머 및 프로브의 농도를 결정하기 위해 프라이머 0.5 μL에 프로브 0.5 μL, 1 μL 혼합액과 프라이머 1 μL에 프로브 0.5 μL, 1 μL 혼합액이 되도록 준비하여 동일한 조건에서 최적화된 어닐링 온도 56 ℃로 하여 수행하였다. 최적 MgCl₂ 농도를 결정하기 위해 최적화된 어닐링 온도 56 ℃에서 MgCl₂를 1 mM에서 3 mM까지 변화시켜 첨가해준 BPV DNA 농도에 따른 cycle threshold 값을 비교하였다. 타이터(titer)가 4.52 x 10⁵ TCID₅₀/mL인 BPV를 10배씩 순차적으로 4.52 x 10¹ TCID₅₀/mL까지 희석한 후 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

상기 결과 56 ℃에서 crossing point가 가장 낮게 나타나 최적 온도임을 확인하였다(표 3, 도 4).

[표 3]

^aValues indicate Cycle threshold(Ct) value

^bN/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected

상기 최적 온도에서 프라이머 및 프로브의 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화 시킨 결과 프라이머 0.5 μL와 프로브 1 μL 혼합액이 최적의 프라이머 및 프로브 농도임을 확인하였다(표 4, 도 5).

[표 4]

Values indicate Cycle threshold(Ct) value

*N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected

상기 최적 온도와 프라이머 및 프로브 농도에서 염화마그네슘 농도를 변화시켜 PCR 조건을 최적화한 결과, 염화마그네슘을 추가하지 않은 농도에서 cycle threshold가 가장 낮게 나타나 최적임을 확인하였다(표 5, 도 6).

[표 5]

Values indicate Cycle threshold(Ct) value

*N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected

(실시예 7) 실시간 중합효소 연쇄반응의 신뢰성 검증

확립된 BPV 실시간 중합효소 연쇄반응 검출시험법의 신뢰성(reliability)을 보증하기 위해 확립된 실험법의 특이성(specificity), 검출한계(detection limit), 재현성(reproducibility), 완건성(robustness)을 검증하였다. 특이성 검증을 위해 Bovine herpesvirus type 1 (BHV, ATCC VR-188), Bovine viral diarrhea virus (BVDV, ATCC VR-534), Bovine parainfluenza 3 virus (BPIV-3, ATCC VR-281), Hepatitis A virus (HAV, ATCC VR-1402), Mimute virus of mice (MVM, ATCC VR-1346), Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV, KVCC-VR0000188), Porcine parvovirus (PPV, ATCC VR-742), Porcine rotavirus (PRoV, KVCC-VR0000176), Pseudorabies virus (PRV, ATCC VR-00129), Reovirus 3 (Reo-3, ATCC VR-824)에 대한 cross-reactivity를 측정하였다. 시험에 사용한 BHV 타이터(titer)는 7.76 x 10⁸ TCID₅₀/mL, PEDV titer는 8.08 x 10⁸ TCID₅₀/mL, BVDV titer는 7.44 x 10⁸ TCID₅₀/mL, MVM titer는 7.34 x 10⁸ TCID₅₀/mL, BPIV-3 titer는 6.07 x 10⁷ TCID₅₀/mL, Reo-3 titer는 6.60 x 10⁷ TCID₅₀/mL, HAV titer는 7.44 x 10⁸ TCID₅₀/mL, PRV titer는 5.33 x 10⁶ TCID₅₀/mL, PRoV titer는 1.33 x 10⁹ TCID₅₀/mL, PPV titer는 8.08 x 10⁸ TCID₅₀/mL이었다. 바이러스 게놈 DNA 및 RNA는모두 10⁴ TCID₅₀/mL 준비한 후 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

상기 반응 결과 BPV에서만 fluorescence 값의 증가를 관찰할 수 있었고, 다른 바이러스에서는 음성대조군과 같이 상기 값의 증가를 관찰할 수 없었다(도 7).

검출시험법의 재현성과 직선성 검증은 Titer가 4.52 x 10⁴ TCID₅₀/mL인 BPV를 10배씩 순차적으로 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL까지 희석하여 준비하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 한번 수행시 triple로 준비하여, 총 3일에 걸쳐 실험을 수행하여 총 9회 반복 시험을 수행하였다. 검출한계 검증을 위해 타이터가 4.52 x 10⁴ TCID₅₀/mL인 BPV를 10배씩 순차적으로 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL까지 희석하여 준비하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 한번 수행시 triple로 준비하여, 총 8일에 걸쳐 실험을 수행하여 총 24회 반복 시험을 수행하였다. PCR 후에는 정량을 위한 표준곡선을 작성하였다. 반복된 실험의 통계 자료를 이용하여 재현성, 직선성, 검출한계를 분석하였다.

BPV log titer (Log₁₀ TCID₅₀/mL; x)에 대한 cycle threshold 값(y) 간의 표준 회귀식은 첫째 날의 경우 y=-3.558x+37.567 (결정계수 R²=0.999), 둘째 날의 경우 y=-3.387x+36.413 (결정계수 R²=0.997), 셋째 날의 경우 y=-3.648x+37.483 (결정계수 R²=0.993)로 BPV log titer와 cycle threshold 값 간의 회귀성이 매우 높았다(도 8). 검출한계 검증은 8일에 걸쳐 triple로 총 24회 반복 시험을 수행하였다. 실시한 시험의 95%이상 검출된 BPV의 검출한계는 4.52 x 10¹ TCID₅₀/mL임을 확인하였다. R²은 평균 0.997으로 나타났다(표 6).

[표 6]

검출시험법의 완건성 검증을 위해 두 가지 실험으로 프라이머 제조사별 비교 실험과 MgCl₂ 농도별 비교 실험을 수행하였다. 프라이머의 완건성을 검증하기 위해 BPV 18 프라이머와 동일한 서열로 다른 세 회사에서 제작하였다. MgCl₂ 농도에 따른 반응성을 확인하기 MgCl₂를 0 mM, 1 mM, 2 mM 농도씩 추가하여 수행하였다. 모든 완건성 실험은 Titer가 4.52 x 10⁴ TCID₅₀/mL인 BPV를 10배씩 순차적으로 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL까지 희석하여 준비하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 triple로 준비하여, 동시에 수행하였다. 각각의 완건성 검증결과는 첨가해준 BPV DNA 농도에 따른 cycle threshold 값을 비교하였다.

상기 반응 결과 세 회사 간의 cycle threshold 값이 비슷하고 CV(%) 값이 3% 미만으로 프라이머 제작 회사간의 완건성은 우수한 것을 확인하였다(표 7). 또한 염화마그네슘의 농도에 대한 완건성을 확인한 결과 모든 샘플의 cycle threshold 값이 비슷하고 CV(%) 값이 3% 미만으로 염화마그네슘에 대한 완건성이 우수한 것을 확인하였다(표 8).

[표 7]

Values indicate Cycle threshold (Ct) value.

CV(%): Coefficient of variance % = (SD of Ct/Mean of Ct)ⅹ100

*N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected.

Vendor: Bioneer, NeoProbe, Macrogen

[표 8]

Values indicate Cycle threshold (Ct) value.

CV(%): Coefficient of variance % = (SD of Ct/Mean of Ct)ⅹ100

*N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected.

(실시예 8) CHO 세포주에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용한 BPV 검출

확립된 실시간 중합효소 연쇄반응을 생물의약품 제조공정 검증에 적용할 수 있는지 확인하기 위하여 인위적으로 BPV를 오염시킨 CHO 세포주에서 BPV 검출 시험을 실시하였다. CHO-K1 세포를 10% 우혈청을 첨가한 Roswell Park Memorial Institutr medium (RPMI-1640; Gibco BRL, USA) 배지에 1X Antibiotic Antimycotic Sol. (Hyclone, USA)를 첨가하여 배양하였다. T-25 플라스크에 배양된 CHO-K1에 10⁴ TCID₅₀/mL인 BPV를 감염시킨 후 2일 동안 배양하였다. 세포 배양액을 제거한 후 세포 배양액에 남아있을 수 있는 BPV를 완벽히 제거하기 위해 phosphate buffered saline으로 2번 세척한 다음 CHO-K1를 2회 계대 배양하였다. 각 배양시 마다 2일 동안 배양한 후 현미경으로 CHO-K1의 모양을 관찰한 후 세포가 포함된 세포 배양액를 수거하였다. 확립된 실시간 중합효소 연쇄반응 방법을 이용하여 세포 배양액에 BPV가 존재하는지 여부를 확인하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응 양성 대조군으로는 타이터가 4.52 x 10⁴ TCID₅₀/mL인 BPV를 10배씩 순차적으로 4.52 x 10⁰ TCID₅₀/mL까지 희석하여 준비 사용하였으며, 음성 대조군으로는 비 감염된 CHO 세포주 배양배지를 사용하였다.

BPV를 정량 검출한 결과는 도 9에 도시하였다. 1차 배양된 세포 배양액에서는 3.58 x 10¹ TCID₅₀/mL, 2차 배양된 세포배양액에서는 3.35 x 10¹ TCID₅₀/mL, 3차 배양된 세포 배양액에서는 9.07 x 10⁰ TCID₅₀/mL의 BPV가 검출되었다(표 9).

[표 9]

*N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected

<110> Hannam University Institute for Industry-Academy Cooperation <120> Real-time PCR assays for quantitative detection of bovine parvovirus <130> P13090711232 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-1 8 forward primer <400> 1 aacatgaatc cgggagca 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-1 8 reverse primer <400> 2 tggccttagc gagattgg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-2 0 forward primer <400> 3 accaaacaag caacgattcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-2 0 reverse primer <400> 4 tatcctactc gcacggctct 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-2 2 forward primer <400> 5 aacgcagcaa gacacacttt ta 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV-2 2 reverse primer <400> 6 gttgactctc ggtaccttga cc 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPV probe <400> 7 ttggcaagtg gggcactggt tag 23

Claims

소파보바이러스(BPV)의
ORF 유전자 검출을 위한, 정방향 프라이머로서 서열번호 1로 표시되는 염기서열, 역방향 프라이머로서 서열번호 2로 표시되는 염기서열, 및 프로브로서 서열번호 7로 표시되는 염기서열;
을 사용하는 소파보바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR) 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,
상기 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질을 포함하는 소파보바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
제 2항에 있어서,
상기 5' 말단의 형광물질은 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인 (hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (tetrachloro-6-carboxyfluorescein), FAM (5-carboxy fluorescein), HEX (2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein) 및 Cy5 (cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 소파보바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
제 2항에 있어서,
상기 3' 말단의 형광물질은 6-카르복시테트라메틸-로다민 (6-carboxytetramethyl-rhodamine), TAMRA (5-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ 1, 2 및 3 (black hole quencher 1, 2, 3)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 형광물질인 소파보바이러스를 검출하기 위한 실시간 중합효소 연쇄반응 프라이머 세트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 포함하는 소파보바이러스 검출용 키트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 사용하여, 분리된 생물학적 시료의 소파보바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 소파보바이러스를 검출하는 방법.