CN105063218A - 快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量pcr试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，包括四重PCR反应体系，包含针对引起小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体：流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌基因的正、反向引物和AllGlo荧光探针。本发明设计合理，可简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体的感染，实现了单管PCR同时检测四种细菌，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，并可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，对阻断传染源、减少四种细菌感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床实用性。

Description

快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术，涉及一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，尤其涉及检测流感嗜血杆菌（HaemophilusInfluenzae,HI）、肺炎链球菌（StreptococcusPneumoniae,SP）、卡他莫拉菌（MoraxellaCatarrhalis,MC）、嗜肺军团菌（LegionellaPneumophila,LP）的四重定量PCR试剂盒，具体地说，本发明涉及应用四重定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四种细菌（HI、SP、MC、LP）的试剂盒。
背景技术
根据世界卫生组织（WHO）统计，肺炎是全球儿童的“头号杀手”，也是5岁以下儿童死亡的第二位原因。在我国，儿童肺炎亦是儿童期重要的常见疾病，在儿童患病率、病死率中占据第一，用于治疗肺炎的巨大医疗费用加重了社会和患儿家庭的经济负担。近年来随着抗生素、激素及免疫抑制剂的广泛应用，呼吸道防御功能及机体免疫力降低，人体寄生菌与宿主之间的关系发生了变化，同时耐药菌的出现也进一步加重了疾病负担。
分析研究显示中国5岁以下死于肺炎的儿童中，感染肺炎链球菌和b型流感嗜血杆菌的占到54.2%。肺炎链球菌（SP）和流感嗜血杆菌（HI）常与正常菌群共生，是儿童社区获得性肺炎的重要致病菌，通常起病急骤，以高热、寒战、咳嗽、血痰及胸痛为特征，主要经呼吸道传播，好发于冬春季。卡他莫拉菌（MC）是引起儿童肺炎的第三位常见致病菌，仅次于前两者，其发病率有逐年增加趋势，且令人担忧的是已发现产β-内酰胺酶菌株占分离菌90%以上，给临床治疗带来困难。MC产生的β-内酰胺酶不仅保护着细菌产生的各种致病性的酶，而且使得其他严重呼吸道合并感染如SP、HI感染对青霉素治疗无效。嗜肺军团菌（LP）感染引起的肺炎，其临床表现多样，X线胸片改变缺乏特异性，可能合并肺外多脏器损害。军团菌肺炎在非典型肺炎中是病情最严重的一种，未经有效治疗者的病死率高达45%。以上四种细菌感染引起的肺炎，其症状、体征及X线检查结果不易鉴别和鉴定，因此快速同步对小儿细菌性肺炎四种临床难鉴定病原体（HI、SP、MC、LP）进行联合检测及鉴别诊断意义重大。
细菌性肺炎的临床表现复杂多样、不典型，容易误诊和漏诊，为了早期明确病因诊断，及早采取快速、有效的治疗，一个敏感而可靠的实验室诊断技术是必需的。HI、SP、MC、LP感染引起的肺炎临床对其病原学诊断主要依靠细菌学检查。痰细菌培养仍是常规检测项目，细菌培养阳性是诊断的金标准，具有一定的临床价值，但其生长缓慢、培养耗时长，技术要求高，从临床样本中进行分离培养较困难并且难鉴定，易混淆而造成误诊，尤其在混合感染中，可能会忽视一些潜在的病原菌，因而限制了其在临床的应用。另外，虽然血清学方法技术成熟，有商品试剂盒供应，但是敏感性和特异性有待提高，同时，需要检测急性期和恢复期双份血清才有诊断意义且容易漏诊。
定量PCR检测方法是目前众多研究的焦点，优点是快速简便、准确可靠、敏感性高、特异性强、可以定量、不受抗生素应用的影响等。由此基础上发展而来的多重定量PCR在儿童肺炎病原体联合检测及鉴别诊断中变得越来越重要。因此，迫切需要单管PCR同时定量检测以上4种临床难培养鉴定细菌的感染或混合感染的试剂盒。其不仅快速准确、节约成本，还可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低抗生素的过度使用，监测临床疗效，并最终改善患者预后。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成。其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种dNTP、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）和嗜肺军团菌（LP）等量混合的阳性质粒样品，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl。5个阳性定量标准品是由HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品，浓度分别为103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl。引物探针需要放置棕色瓶中避光。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
HI：
上游引物：GATGCTGGTGTATTTGGTGG
下游引物：CCGTTCAACTTGGGCTTTAG
探针：SAT-AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG-SAT
SP：
上游引物：CATTTGGTGATGCGGCTA
下游引物：AGGACGGCTTTCGTTGAG
探针：MAR-CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT-MAR
MC：
上游引物：ATCTATGCCAACTGGAAGCC
下游引物：CCAACACGGAAATCACGAC
探针：JUP-CTATCGCCCACACACTCAGCGTG-JUP
LP：
上游引物：TCGTCACTTAAACGGCTTC
下游引物：TACCGACCAGGATTGCTAC
探针：NEP-CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG-NEP
SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
HI标准品序列：
GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTGAACGG
SP标准品序列：
CATTTGGTGATGCGGCTAAAGGTAAAACAATTGCAGCCGCACAATACGCAGCCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGTAGCTGGTGGTACAGGTGCAGGTGTCTTTGCAGAGGCAAAATCTCTCAACGAAAGCCGTCCT
MC标准品序列：
ATCTATGCCAACTGGAAGCCTTATGGCAATGATAAGGTGAATGTAAACTTTGCGGTGAATAATGTCTTTAATAAAAACTATCGCCCACACACTCAGCGTGCTTCCATAGATACCTTACCTGGGGCAGGTCGTGATTTCCGTGTTGG
LP标准品序列：
TCGTCACTTAAACGGCTTCTTTCTAGATAACTTCAATTCCAAATTCAATGGATTTGGTCCCCGTACCGGCCTTGATATGAATTATGTATTCGGTAATGGGTTTGGTATTTATGCAAAATCAGCTGTAGCAATCCTGGTCGGTA
本发明四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒的检测方法包括如下步骤：
（1）引物设计：在GenBank中检索获得流感嗜血杆菌（HaemophilusInfluenzae,HI）、肺炎链球菌（StreptococcusPneumoniae,SP）、卡他莫拉菌（MoraxellaCatarrhalis,MC）、嗜肺军团菌（LegionellaPneumophila,LP）特异性的保守基因，通过序列比对，确定它们各自的高度保守序列区，作为四种细菌的待检靶基因特异性核酸序列分别设计特异引物；
（2）荧光探针设计：根据步骤（1）中的四种细菌的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
（3）标准品和和质控品的构建：根据步骤（1）确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HI、SP、MC、LP高度保守序列区的标准质粒分子；
（4）四重定量PCR反应体系的优化与建立：使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的探针及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分组成四重荧光PCR反应液，通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，优化四重定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
（5）标准曲线制备：使用步骤（4）中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有HI、SP、MC、LP目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到四重定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析，制备标准曲线；
（6）临床验证：用HI、SP、MC、LP临床标本细菌DNA提取液作为模板，进一步用步骤（4）和（5）的方法和条件进行四重定量PCR扩增；
所述的特异性的保守基因，指的是HI的外膜蛋白P1基因，SP的脂蛋白基因，MC的外膜蛋白B2基因和LP的外膜孔蛋白基因；
所述的特异性定量PCR引物，指的是长度为19±1Nt的寡核苷酸链，与流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补；
所述的特异性定量PCR荧光探针，指的是长度为24±1Nt的寡核苷酸链，与流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团；
所述的试剂盒包括如下成分：①DNA提取液；②质控品（阴性、强阳性、弱阳性）及阳性定量标准品；③四重荧光PCR反应液。
步骤（1）、（2）所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列同上。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种细菌所特有的一段基因序列。
所述的标准品，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等组成的混合液。
所述的四重定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.99，扩增效率在0.95-1.01之间，满足定量PCR标准曲线的要求。
本发明根据流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌特异性的保守基因，登录GenBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，四种细菌各筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针，用自制的不同浓度的标准分子（HI、SP、MC、LP靶基因质粒克隆载体）作为模板，在ABI7500定量PCR仪中进行单、四重定量PCR实验，优化四重定量PCR反应体系，确定该方法的灵敏度、特异性、重复性等，制备标准曲线，最后用该方法检测临床阴、阳性标本各5份（其中LP无临床标本故用标准菌株验证），并与临床实验室在用的细菌培养鉴定方法的检测结果相比较，分析四重定量PCR方法的可靠性。
本发明是一种对引起小儿细菌性肺炎的四种临床难培养鉴定病原体的早期、快速、简便而有效的四重定量PCR检测试剂盒，涉及的病原体包括HI、SP、MC、LP，采用AllGlo荧光素标记探针，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重定量PCR同时检测四种细菌的方法，使其检测灵敏度大大提高，达到10个拷贝的细菌分子，对于单个样本检测时间约为1.5个小时，操作简便，并且可以进行大批量的样本分析检测，较现有的细菌培养方法在检测时间、鉴定程序、检出率等方面有了极大的提高，较血清学检测在检测灵敏度、特异性、定量等方面均有很大的提高或改进，对引起小儿细菌性肺炎四种临床难培养鉴定病原体的感染或混合感染的流行监控、快速鉴定、疗效判断等方面具有很大帮助。
本发明可以简便快速地在一个反应管中同时、平行地检测四种细菌的感染，并可根据细菌感染的滴度，为小儿肺炎患者提供早期明确诊断和防治，为临床治疗方案的制定提供参考依据，从而提高临床决策水平，有效降低抗生素的过度使用，对阻断传染源、减少HI、SP、MC、LP感染或混合感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。采用本发明提供的试剂盒，解决了现有检测方法的诸多缺陷：包括检测速度慢、不能检测多重感染、不能定量、特异性较差或者成本高、操作繁琐等，实现了单管PCR同时定量检测四种细菌，且这四种细菌都是临床实验室难以培养鉴定的细菌。本试剂盒操作简单快速，灵敏度高，特异性好，重复性好，结果准确可靠，实用性强。
附图说明
图1a是流感嗜血杆菌（HI）在四重定量PCR中的标准曲线扩增图。
图1b是相应的标准曲线（斜率为-3.297，截距为37.789，R2为0.999）。
图2a是肺炎链球菌（SP）在四重定量PCR中的标准曲线扩增图。
图2b是相应的标准曲线（斜率为-3.422，截距为40.115，R2为0.993）。
图3a是卡他莫拉菌（MC）在四重定量PCR中的标准曲线扩增图。
图3b是相应的标准曲线（斜率为-3.340，截距为38.970，R2为0.996）。
图4a是嗜肺军团菌（LP）在四重定量PCR中的标准曲线扩增图。
图4b是相应的标准曲线（斜率为-3.457，截距为38.316，R2为0.999）。
注：上述模板为HI、SP、MC、LP等量混合质粒，浓度（Copies/test）为107、106、105、104、103，平行3管。
图5是流感嗜血杆菌（HI）在四重定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图6是肺炎链球菌（SP）在四重定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图7是卡他莫拉菌（MC）在四重定量PCR中的敏感性实验扩增图。
图8是嗜肺军团菌（LP）在四重定量PCR中的敏感性实验扩增图。
注：上述模板为HI、SP、MC、LP等量混合质粒，浓度（Copies/test）为108、107、106、105、104、103、102、101，平行3管。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
一种快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成。其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种dNTP、HotStartTaqDNA聚合酶等成分构成的混合液。阴性质控品为灭菌注射用水。强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）和嗜肺军团菌（LP）等量混合的阳性质粒样品，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl。5个阳性定量标准品是由HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品，浓度分别为103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl。
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
HI：
上游引物：GATGCTGGTGTATTTGGTGG
下游引物：CCGTTCAACTTGGGCTTTAG
探针：SAT-AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG-SAT
SP：
上游引物：CATTTGGTGATGCGGCTA
下游引物：AGGACGGCTTTCGTTGAG
探针：MAR-CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT-MAR
MC：
上游引物：ATCTATGCCAACTGGAAGCC
下游引物：CCAACACGGAAATCACGAC
探针：JUP-CTATCGCCCACACACTCAGCGTG-JUP
LP：
上游引物：TCGTCACTTAAACGGCTTC
下游引物：TACCGACCAGGATTGCTAC
探针：NEP-CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG-NEP
SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素。
HI标准品序列：
GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTGAACGG
SP标准品序列：
CATTTGGTGATGCGGCTAAAGGTAAAACAATTGCAGCCGCACAATACGCAGCCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGTAGCTGGTGGTACAGGTGCAGGTGTCTTTGCAGAGGCAAAATCTCTCAACGAAAGCCGTCCT
MC标准品序列：
ATCTATGCCAACTGGAAGCCTTATGGCAATGATAAGGTGAATGTAAACTTTGCGGTGAATAATGTCTTTAATAAAAACTATCGCCCACACACTCAGCGTGCTTCCATAGATACCTTACCTGGGGCAGGTCGTGATTTCCGTGTTGG
LP标准品序列：
TCGTCACTTAAACGGCTTCTTTCTAGATAACTTCAATTCCAAATTCAATGGATTTGGTCCCCGTACCGGCCTTGATATGAATTATGTATTCGGTAATGGGTTTGGTATTTATGCAAAATCAGCTGTAGCAATCCTGGTCGGTA
实施例2
四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒的检测方法包括如下步骤：
（1）引物设计：在GenBank中检索获得流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）和嗜肺军团菌（LP）特异性的保守基因，通过序列比对，确定它们各自的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列分别设计特异引物；
（2）荧光探针设计：根据步骤（1）中的四种细菌的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；
（3）标准品的构建：根据步骤（1）确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HI、SP、MC、LP高度保守序列区的标准质粒分子；
（4）四重定量PCR反应体系的优化与建立：使用步骤（1）中的引物和步骤（2）中的探针及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等成分组成四重荧光PCR反应液，通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，优化四重定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；
（5）标准曲线制备：使用步骤（4）中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有HI、SP、MC、LP目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到四重定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值和基线，进行结果分析，制备标准曲线；
（6）临床验证：用HI、SP、MC、LP临床标本细菌DNA提取液作为模板，进一步用步骤（4）和（5）的方法和条件进行四重定量PCR扩增。
所述的特异性的保守基因，指的是HI的外膜蛋白P1基因，SP的脂蛋白基因，MC的外膜蛋白B2基因和LP的外膜孔蛋白基因。
所述的特异性定量PCR引物，指的是长度为19±1Nt的寡核苷酸链，与流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。
所述的特异性定量PCR荧光探针，指的是长度为24±1Nt的寡核苷酸链，与流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、卡他莫拉菌、嗜肺军团菌待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5′端和3′端均使用AllGlo探针进行标记，AllGlo探针的每种染料既是报告基团又是粹灭基团。
所述的试剂盒包括如下成分：①DNA提取液；②质控品（阴性、强阳性、弱阳性）及阳性定量标准品；③四重荧光PCR反应液。
步骤（1）、（2）所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列同实施例1。
所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种细菌所特有的一段基因序列。
所述的标准品，指的是利用基因克隆技术构建的人工重组质粒，每种质粒只重组一种特异待检靶基因序列。
所述的四重定量PCR反应体系，指的是由四组引物、探针以及qPCR反应缓冲液（含Mg2+）、四种核苷酸单体（dNTPs）、HotStartTaqDNA聚合酶等组成的混合液。
所述的四重定量PCR反应标准曲线，指的是不同稀释度标准质粒分子用四重定量PCR反应液进行检测所得，标准曲线的r2均大于0.99，扩增效率在0.95-1.01之间，满足定量PCR标准曲线的要求。
实施例3
1.四种细菌（HI、SP、MC、LP）目的基因质粒克隆载体的构建
采用T-A载体克隆方案，将四种目的基因PCR产物经过电泳确认扩增片段分子量后，扩增片段经2%琼脂糖凝胶回收纯化，克隆至pUC57质粒中，然后将连接产物转化至感受态大肠埃希菌中，在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上筛选阳性菌落，经回收、抽提、纯化重组质粒，将经验证完全正确的目的质粒用紫外分光光度计定量后，用1×TE（pH8.0）缓冲液稀释到1010拷贝/μl作为储存液，–20℃保存备用。
2.DNA模板提取
2.1痰液：痰液中加入4倍体积的生理盐水，用1ml的枪头反复吹打后置4℃冰箱过夜，使痰液充分液化。用枪头或吸管混匀后吸取1ml至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10分钟，12000rpm离心5分钟，备用。
2.2分泌物拭子：加灭菌生理盐水1.5ml到无菌玻璃管，充分震荡混匀，挤干棉拭子，立即将液体全部转移至1.5ml离心管中，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12000rpm离心5分钟。去上清，沉淀中加入50μlDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10分钟，12000rpm离心5分钟，备用。
2.3质控品和阳性定量标准品处理：8000rpm离心数秒，备用。
注：DNA提取液——50mmol/LNaOH，10mmol/LTris-HClpH8.0，体积分数为1%TritonX-100，体积分数为1%NP-40，0.5mmol/LEDTApH8.0。
3.AllGlo探针四重定量PCR
3.1引物及探针
查阅相关的专业文献，根据文献报道获取HI、SP、MC、LP特异性保守基因，登录GenBank获取相关序列，应用Clustalw软件对所有序列比对分析，挑选最保守的基因序列用PrimerPremiers5.0软件设计引物，登录NCBI通过BLAST程序比对分析，每种细菌筛选出一对特异性最强的引物和相应的特异探针（见表1）。
HI、SP、MC、LP单管四重定量PCR引物和相应的AllGlo探针分别由LifeTechnologies公司和上海奕跃生物科技有限公司合成。为了确保四重定量PCR的特异性和灵敏度，所有的引物和探针均与GenBank里的扩增靶序列进行BLAST，所有引物和探针的Tm值基本一致。采用ABI7500定量PCR仪进行四重定量PCR实验。
SAT、MAR、JUP、NEP均为不同波长的AllGlo探针标记荧光素，分别对应于目前使用的CY3、FAM、VIC和CY5荧光。
3.2单重定量PCR条件优化
采用五个引物探针浓度比例对定量PCR进行优化：50μlPCR反应体系，包括包括自制qPCR反应液14.5μl[qPCR反应缓冲液（含20mMMg2+）7.5μl、4种dNTP混合液（2.5mM）6μl，5U/μlHotStartTaqDNA聚合酶1μl]，106Copies/test质粒模板4μl，引物（上、下游）与相应探针分别加1μl、2μl（200nM﹕400nM），0.5μl、1μl（100nM﹕200nM），1μl、1μl（200nM﹕200nM），1μl、0.5μl（200nM﹕100nM），2μl、1μl（400nM﹕200nM），用双蒸水补至50μl，所有引物探针应用浓度均为10μM.，每种引物探针浓度比例均平行做三管，用灭菌注射用水做阴性对照。于ABI7500定量PCR仪扩增，循环条件：95℃30s，95℃5s、60℃34s（40cycles）（同时在58-62℃范围内筛选最适退火/延伸温度）。荧光信号的收集定为CY3（流感嗜血杆菌）、FAM（肺炎链球菌）、VIC（卡他莫拉菌）、CY5（嗜肺军团菌）。实时分析软件计算扩增Ct值，以扩增Ct值统计实验结果。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。
3.3四重定量PCR条件优化
根据单重定量PCR条件优化实验所得结果，选择引物探针浓度比例为100nM﹕200nM、200nM﹕200nM和200nM﹕100nM三种比例进行四重PCR，PCR反应体系及扩增条件同上，将四种引物和探针加入同一管中，然后各管分别加入一种106Copies/test的质粒模板4μl，阴性对照加灭菌注射用水进行单目的基因多重PCR扩增，用双蒸水补至50μl，每个反应平行做3管。另外，加入一种106Copies/test的HI、SP、MC、LP1:1:1:1混合的质粒模板4μl，阴性对照加灭菌注射用水进行多目的基因多重PCR扩增，用双蒸水补至50μl，每个反应平行做3管。以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例作为四重PCR标准曲线制作和其他实验的最终扩增条件。
3.4四重定量PCR的特异性、敏感性试验
将已知拷贝数的含HI、SP、MC、LP目的扩增片段的重组质粒，使用时连续10倍倍比稀释至浓度在101~108Copies/test之间作为单基因四重定量PCR的标准品；同时，将HI、SP、MC、LP重组质粒1:1:1:1混合后进行10倍倍比稀释成101~108Copies/test之间，作为多基因四重定量PCR的标准品。取不同载量的标准品4μl作为四重定量PCR的模板，同时用灭菌注射用水做对照实验，对各稀释度模板按照（3.3）确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带的软件自动分析结果，从而确定该方法的最低检出限，评估快速联检四种难培养鉴定细菌多重定量PCR试剂盒的检测灵敏度。
3.5四重定量PCR标准曲线制备
将浓度在（Copies/test）103、104、105、106、107的混合质粒作为制备标准曲线的标准品，按照（3.3）确立的反应体系和扩增条件同时进行荧光PCR检测，所有检测标本至少检测三次，扩增完成后用仪器自带软件分析结果，制备标准曲线。
3.6四重定量PCR的重复性试验
将已知拷贝数的HI、SP、MC、LP重组质粒混合液（105Copies/test）平均分成10份，-20℃冷冻保存作为模板，按制备标准曲线的四重定量PCR的反应体系和扩增条件进行扩增，同时按照（3.5）制备标准曲线，每周检测一次，根据标准曲线仪器自动给出定量检测结果，连续5周，最后统计软件分析5次检测结果的重复性（CV%）。
3.7结果判定
分析条件设定：根据仪器所带分析软件自动分析结果，阈值设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增线和仪器噪音进行调整。
质控标准：阴性质控品无扩增曲线和Ct值；阳性定量标准品均为阳性，Ct值<35，且0.98≤r2≤1；阳性质控品全部阳性，Ct值应与标准曲线的相应标准品的Ct值相对应，并且出现典型的扩增曲线；以上要求需在同一次实验中同时满足，否则实验视为无效，需重新进行。
A.阴性：无扩增曲线无Ct值。
B.阳性及定量判断：出现典型的扩增曲线且Ct值≤37判定为阳性，并根据标准曲线自动获取定量值，表示样品中存在HI、SP、MC、LP细菌颗粒。
C.有效原则：Ct值>37的样品定量结果不可靠，需重做实验。无Ct值为阴性，有Ct值但仍>37需重新取标本复查。
3.8临床验证
取临床阴、阳性（HI、SP、MC、LP）标本各5份（其中LP无临床阳性标本故用标准菌株验证）。将临床分离菌株菌液混入呼吸道标本中，按照（2）的方法提取细菌DNA，使用本试剂盒的AllGlo探针四重定量PCR方法对标本进行检测，并与临床实验室在用的细菌分离培养鉴定方法的检测结果相比较，进一步验证该方法的可靠性。
3.9实施例3检测结果
3.9.1四重定量PCR条件优化结果：
①反应体系配制优选方案：
四重荧光qPCR反应液24.5μl
其中包括：
上、下游引物（HI、SP、MC、LP）各1μl
探针（HI、SP、MC、LP）各0.5μl
模板4μl
dH2Oupto50μl
*引物探针浓度比例为200nM﹕100nM
②循环条件：
3.9.2四重定量PCR的特异性、敏感性试验结果：HI、SP、MC、LP标准分子在四重定量PCR体系中进行扩增后，其特异性均为100%。HI、SP、MC、LP在四重定量PCR体系中检测灵敏度均为101Copies/test（见附图5-8）。
3.9.3四重定量PCR标准曲线制备结果：HI、SP、MC、LP标准分子的标准曲线在经过优化的四重定量PCR反应体系进行制备，它们的标准曲线的r2分别为0.999、0.993、0.996、0.999，扩增效率（Efficiency）分别为1.01、0.96、0.99、0.95（见附图1-4）。
3.9.4四重定量PCR的重复性试验结果：相同的HI、SP、MC、LP标准分子混合液（105Copies/test）在四重定量PCR体系检测5次，检测数据经对数转换后，HI、SP、MC、LP五次检测的CV均小于5%，详见表2。
3.9.5临床验证结果：采用本试剂盒（AllGlo探针四重定量PCR）对临床标本进行检测的结果与临床实验室在用的细菌分离培养鉴定结果一致。
<110>杭州市第一人民医院
<120>快速联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒
<160>16
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据流感嗜血杆菌（HI）外膜蛋白P1基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>1
GATGCTGGTGTATTTGGTGG
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据流感嗜血杆菌（HI）外膜蛋白P1基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>2
CCGTTCAACTTGGGCTTTAG
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据流感嗜血杆菌（HI）外膜蛋白P1基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>3
AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG
<210>4
<211>135
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据流感嗜血杆菌（HI）外膜蛋白P1基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>4
GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTGAACGG
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎链球菌（SP）脂蛋白基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>5
CATTTGGTGATGCGGCTA
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎链球菌（SP）脂蛋白基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>6
AGGACGGCTTTCGTTGAG
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎链球菌（SP）脂蛋白基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>7
CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT
<210>8
<211>137
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据肺炎链球菌（SP）脂蛋白基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>8
CATTTGGTGATGCGGCTAAAGGTAAAACAATTGCAGCCGCACAATACGCAGCCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGTAGCTGGTGGTACAGGTGCAGGTGTCTTTGCAGAGGCAAAATCTCTCAACGAAAGCCGTCCT
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据卡他莫拉菌（MC）外膜蛋白B2基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>9
ATCTATGCCAACTGGAAGCC
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据卡他莫拉菌（MC）外膜蛋白B2基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>10
CCAACACGGAAATCACGAC
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据卡他莫拉菌（MC）外膜蛋白B2基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>11
CTATCGCCCACACACTCAGCGTG
<210>12
<211>146
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据卡他莫拉菌（MC）外膜蛋白B2基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>12
ATCTATGCCAACTGGAAGCCTTATGGCAATGATAAGGTGAATGTAAACTTTGCGGTGAATAATGTCTTTAATAAAAACTATCGCCCACACACTCAGCGTGCTTCCATAGATACCTTACCTGGGGCAGGTCGTGATTTCCGTGTTGG
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据嗜肺军团菌（LP）外膜孔蛋白基因设计的PCR检测上游引物序列
<400>13
TCGTCACTTAAACGGCTTC
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据嗜肺军团菌（LP）外膜孔蛋白基因设计的PCR检测下游引物序列
<400>14
TACCGACCAGGATTGCTAC
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据嗜肺军团菌（LP）外膜孔蛋白基因设计的AllGlo荧光定量检测探针序列
<400>15
CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG
<210>16
<211>143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据嗜肺军团菌（LP）外膜孔蛋白基因设计的荧光定量检测标准品序列
<400>16
TCGTCACTTAAACGGCTTCTTTCTAGATAACTTCAATTCCAAATTCAATGGATTTGGTCCCCGTACCGGCCTTGATATGAATTATGTATTCGGTAATGGGTTTGGTATTTATGCAAAATCAGCTGTAGCAATCCTGGTCGGTA

Claims (4)

1.一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，其特征在于：由DNA提取液、四重荧光PCR反应液、1个阴性质控品、1个强阳性质控品、1个弱阳性质控品、5个浓度的阳性定量标准品组成，其中四重荧光PCR反应液为四组引物、探针以及含Mg2+的qPCR反应缓冲液、四种dNTP、HotStartTaqDNA聚合酶构成的混合液，强阳性质控品浓度107Copies/μl，弱阳性质控品浓度103Copies/μl；
所述的引物及其特异性定量PCR荧光探针序列、标准品序列如下：
HI：
上游引物：GATGCTGGTGTATTTGGTGG
下游引物：CCGTTCAACTTGGGCTTTAG
探针：SAT-AGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAG-SAT
SP：
上游引物：CATTTGGTGATGCGGCTA
下游引物：AGGACGGCTTTCGTTGAG
探针：MAR-CCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGT-MAR
MC：
上游引物：ATCTATGCCAACTGGAAGCC
下游引物：CCAACACGGAAATCACGAC
探针：JUP-CTATCGCCCACACACTCAGCGTG-JUP
LP：
上游引物：TCGTCACTTAAACGGCTTC
下游引物：TACCGACCAGGATTGCTAC
探针：NEP-CGTACCGGCCTTGATATGAATTATG-NEP
SAT、MAR、JUP、NEP是AllGlo探针的四种不同荧光素；
HI标准品序列：
GATGCTGGTGTATTTGGTGGAAAAACTGACTTGAGTGCTATCAACTTAAATTTAAGTGGTGCTTATCGAGTAACAGAAGGTTTGAGCCTAGGTTTAGGGGTAAATGCGGTTTATGCTAAAGCCCAAGTTGAACGG
SP标准品序列：
CATTTGGTGATGCGGCTAAAGGTAAAACAATTGCAGCCGCACAATACGCAGCCGGTGCAGATATTGTTTACCAAGTAGCTGGTGGTACAGGTGCAGGTGTCTTTGCAGAGGCAAAATCTCTCAACGAAAGCCGTCCT
MC标准品序列：
ATCTATGCCAACTGGAAGCCTTATGGCAATGATAAGGTGAATGTAAACTTTGCGGTGAATAATGTCTTTAATAAAAACTATCGCCCACACACTCAGCGTGCTTCCATAGATACCTTACCTGGGGCAGGTCGTGATTTCCGTGTTGG
LP标准品序列：
TCGTCACTTAAACGGCTTCTTTCTAGATAACTTCAATTCCAAATTCAATGGATTTGGTCCCCGTACCGGCCTTGATATGAATTATGTATTCGGTAATGGGTTTGGTATTTATGCAAAATCAGCTGTAGCAATCCTGGTCGGTA。
2.根据权利要求1所述的一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，其特征在于：强、弱阳性质控品为由流感嗜血杆菌（HI）、肺炎链球菌（SP）、卡他莫拉菌（MC）和嗜肺军团菌（LP）等量混合的阳性质粒样品，阴性质控品为灭菌注射用水。
3.根据权利要求1所述的一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，其特征在于：5个阳性定量标准品是由HI、SP、MC、LP等量混合的质粒样品，浓度分别为103Copies/μl、104Copies/μl、105Copies/μl、106Copies/μl、107Copies/μl。
4.根据权利要求1所述的一种联检四种难培养鉴定细菌的多重定量PCR试剂盒，其特征在于：引物探针需要放置棕色瓶中避光。
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