CN104630360A - Hps等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Hps等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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CN104630360A CN201510057974.8A CN201510057974A CN104630360A CN 104630360 A CN104630360 A CN 104630360A CN 201510057974 A CN201510057974 A CN 201510057974A CN 104630360 A CN104630360 A CN 104630360A
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Abstract

本发明公开了一种HPS等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法。该试剂盒根据靶序列上8个区域设计6条引物，2条外引物、2条内引物和2条环引物，还包括2×LAMP buffer、Bst DNA聚合酶管、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。利用本试剂盒在65℃左右的温度下经10～25min的反应后，便可以根据肉眼观察反应结果判断是否含有副猪嗜血杆菌。本发明可以在等温条件下快速、高效、特异性地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。

Description

HPS等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及细菌检测领域，具体是一种HPS等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)细菌是一种无芽孢、无鞭毛、有荚膜的革兰氏阴性菌，现归类为巴斯德氏菌科嗜血杆菌属，目前至少可分为15个血清型，其中，1、5、10、12、13和14型为强毒力血清型，2、4、15型为中等毒力血清型，3、6、7、8、9和11型为无毒力血清型，且各血清型之间交叉保护力弱，疫苗的免疫效果较差，从而加重了HPS的流行。在患病猪体内，致病性HPS分布于全身各组织器官，且以血清4、5、13型细菌较为多见。早在1910年，德国科学家Glasser首次报道了HPS；1922年，Schermer和Ehrlich从发病猪中首次分离到了HPS；1931年，Lewis和Shope将该菌命名为H.Influenzae suis，他们发现该菌是在一次猪流感的研究中，当他们分离到该细菌时认为该菌的生长同时需要X及V因子；1943年该菌又被Hjarre和Wramby命名为猪嗜血杆菌(Haemophilussuis)；1969年，该菌被重新命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)这是因为Biberstein和White发现该细菌的生长不需要X因子；1952年，Bakos等人首先报道了HPS存在的血清型；直到1992年，Kielstein P等人才对HPS进行了定型，并报道了HPS的15种血清型，其所鉴定的血清型也被称为“Kielstein-Rapp-Gabrielson(KRG)血清分型方法”。
副猪嗜血杆菌病也称猪革拉泽氏病(Glasser‘s)是由HPS引起的一种以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为典型特征的传染病。猪革拉泽氏病在全球范围内已成为影响养猪业的典型细菌性疾病之一，在世界各地的发病率极高，据相关报道该病的真实发病率可能为实际确诊数的10倍之多。HPS主要通过空气、猪与猪之间的接触及排泄物进行传播，主要传染源为病猪和带菌猪。该病通常只感染猪，有较强的宿主特异性，一年四季均可发生，但以昼夜温差相差较大的早春和深秋季节多发，特别是发生一些应激性因素如：转群、长途运输时均能促使本病的发生。处于2周龄～4月龄这一阶段的猪感染该菌的机率较大，特别是断奶前后和保育期的仔猪。副猪嗜血杆菌病还可以与病毒性疾病、免疫抑制性疾病发生混合感染，这种情况的发生增加了猪群疫病的复杂性若不及时控制会带来不可想象的损失。目前一些养猪业发达的国家如美国、日本、加拿大、德国、澳大利亚、丹麦、西班牙等对副猪嗜血杆菌病高度重视并对它的流行病学进行了调查，其结果显示此病在临床发病猪中的分离率高达20％左右。
在我国，由HPS引起猪的多发性浆膜炎、关节炎的报道屡见不鲜，目前已从我国部分省市分离出该菌，该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失，该细菌的检测在出入境和食品安全检验中起着重要的作用。随着社会的不断发展，科学的不断进步，传统的检测方法已不能满足人们的需求，建立快速、准确的检测方法才是成功防制该病的关键。
目前进行细菌分类鉴定中常用的的靶基因是16S rRNA，它是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，具有高度的保守性，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。HPS的生化反应复杂，不同毒力的菌株会有不同结果；琼脂扩散试验虽是目前最准确有效的方法，但此方法耗时较长；间接血凝试验与猪胸膜肺炎放线杆菌阳性血清存在交叉反应；PCR检测方法虽然特异性强，但是需要昂贵的PCR扩增仪。因此，发明一种可以同时鉴别检测动物HPS 15种不同血清型的检测方法对研究我国猪肉中HPS感染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告，但在兽医临床诊断方法，Haemophilus parasuis诊断方法的报导并不多且灵敏度不高。
环介导等温扩增基因技术(loop-mediated isothermal amplication,简称LAMP)(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的8个区域设计一套三对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的3对引物是针对靶基因的8个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。
中国发明专利(申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等)分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用环介导等温扩增基因技术检测HPS的试剂盒。
发明内容
为克服现有技术的不足，本发明将LAMP恒温扩增技术运用于HPS的快速检测，使检测的特异性和灵敏度比普通变温PCR方法更高。本发明的第一个目的是提供一种HPS等温扩增技术快速检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
HPS等温扩增快速检测用引物包括：DNA序列为SEQ ID NO.1的副猪嗜血杆菌内引物上游；DNA序列为SEQ ID NO.2的副猪嗜血杆菌内引物下游；DNA序列为SEQ ID NO.3的副猪嗜血杆菌外引物上游；DNA序列为SEQ ID NO.4的副猪嗜血杆菌外引物下游；DNA序列为SEQ ID NO.5的副猪嗜血杆菌环引物上游；DNA序列为SEQ ID NO.6的副猪嗜血杆菌环引物下游。
应用以上引物本发明提供了一种HPS等温扩增快速检测用试剂盒，包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的50mmol/L的HPS内引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的50mmol/L的HPS内引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的HPS外引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.4的5mmol/L的HPS外引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.5的30mmol/L的HPS环引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的HPS环引物下游1.0μL；
2×LAMP buffer 12.5μL；
5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；
灭菌去离子水3.7μL；
合计23μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为HPS阳性重组质粒DNA，体积为20μL。
所述阴性对照管，管内为无HPS感染的猪肉组织液基因组DNA，体积为20μL。
所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒进行HPS等温扩增快速检测的方法，包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板；
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，钙黄绿素(Calcein)显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL；
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于65℃恒温反应60min，80℃终止反应；
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在15min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
本发明的原理是：针对一段185bp左右的靶序列上8个区域设计6条引物(2条外引物、2条内引物和2条环引物)，利用核酸分子在65℃左右的温度下处于自然松散状态，采用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下对目的基因进行高效扩增，经15～30min的反应，模板扩增效率能达到109～1010倍。由于该反应不需要高温节链、退火等步骤，因此不需要昂贵的PCR仪。在反应的Buffer反应液里加入一种特殊的发光剂钙黄绿素显色剂，钙黄绿素显色剂本身是一种发绿光的荧光，在本反应中采用的钙黄绿素显色剂是被锰离子整合处理过的，不能发黄绿色荧光，一旦LAMP反应发生，产生的大量焦磷酸根离子可竞争性地结合锰离子，释放出钙黄绿素显色剂，导致反应呈黄绿色，通过黄绿色荧光的产生也能判定反应结果。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
LAMP是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。现有的HPS检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需1小时。
本发明的优点是(1)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性：应用8个区段，6条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间1小时左右；(4)、灵敏度高：扩增模板仅需2.0pg/mL或更少，组织液样品中DNA最低检测极限达到175.0fg/mL；标本的检出率达到99％；(5)、鉴定简便：无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物----焦磷酸镁乳白沉淀，与Calcein显色剂结合，阳性结果显示为黄绿色，阴性结果为橙色，结果明显可靠，可通过肉眼观察鉴定；(6)、用途广：可广泛用于HPS的安全快速检测。
附图说明
图1HPS的LAMP扩增特异性试验结果；
图2HPS的LAMP扩增灵敏性试验结果；
图3阴阳性对照LAMP扩增结果；
图中：A-实时扩增速率曲线，B-实时扩增浊度曲线，C-扩增柱型分析图；D-HPS阳性,E-阴性对照；
图1中：1-副猪嗜血杆菌(HPS)DNA，2-猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)DNA，3.猪瘟病毒(CSFV)cDNA，4.猪圆环病毒II型(PCV-II)DNA，5.猪肠炎沙门氏菌(SE)DNA，6.猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)cDNA，7.猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株cDNA，8.阴性对照；
图2中：从左到右，1、17.5ug/mLHPS DNA，2、17.5×10-1ug/mLHPS DNA，3、17.5×10-2ug/mLHPS DNA，4、17.5×10-3ug/mLHPS DNA，5、17.5×10-4ug/mLHPSDNA，6、17.5×10-5ug/mLHPS DNA，7、17.5×10-6ug/mLHPS DNA，8、17.5×10-7ug/mLHPS DNA，9、17.5×10-8ug/mLHPS DNA，10、17.5×10-9ug/mLHPS DNA，11、阴性对照。
具体实施方式
实施例1，HPS环介导等温扩增技术快速检测试剂盒包括LAMP扩增反应液、Calcein显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
LAMP扩增反应液管管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO.1的50mmol/L的HPS内引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.2的50mmol/L的HPS内引物下游1.0μL；序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的HPS外引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.5的5mmol/L的HPS外引物下游1.0μL；序列为SEQID NO.5的30mmol/L的HPS环引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的HPS环引物下游1.0μL；10×LAMP buffer缓冲液12.5μL；5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；灭菌去离子水3.7μL；合计23μL，为单次反应的用量。
其中10×LAMP buffer缓冲液由以下成分组成：40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐；20mmol/L氯化钾；20mmol/L硫酸胺；体积百分比浓度为1％Tritonx-100；0.8mol/L Betaine；7.5mmol/L氯化镁；1.2mmol/L dNTP。上述浓度为溶液终浓度。
阳性对照管管内为HPS阳性重组质粒，体积为20μL。
阴性对照管管内为HPS阴性的猪肉组织液基因组DNA，体积约20μL。
所述Calcein显色剂管管内体积约20μL。
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
实施例2，引物的设计及筛选
HPS等温扩增引物组，其设计是根据GenBank公布的HPS 16S rRNA基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0，设计特异性引物，分别标记为：SEQ ID NO.1……SEQID NO.6。其中引物组中内引物上游FIP:SEQ ID NO.1；内引物下游BIP:SEQ IDNO.2；外引物上游F3:SEQ ID NO.3；外引物下游B3:SEQ ID NO.4；环引物上游LF:SEQ ID NO.5；环引物下游LB:SEQ ID NO.6的浓度分别为50mmol/L，50mmol/L，5mmol/L，5mmol/L，30mmol/L，30mmol/L；体积比为1:1:1:1:1:1。同时，PCR扩增时，PCR上游引物：SEQ ID NO.3；PCR下游引物：SEQ ID NO.4；体积比为1:1。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用市售细菌核酸提取试剂盒提取HPS DNA，扩增，排除有非特异性扩增的引物。获得引物如下：
引物序列号 序列(5′～3′)
SEQ ID NO.1 TGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGAGAGGATGACCAGCCAC
SEQ ID NO.2 TATTGCACAATGGGGGGAACCCACCCGAAGGCCTTCTTCA
SEQ ID NO.3 AAGCCGACGATCTCTAGCT
SEQ ID NO.4 CCCTTCCTCATCACCGAAAG
SEQ ID NO.5 GACCGTGTCTCAGTTCCAGT
SEQ ID NO.6 CAGCCATGCCGCGTGAA
实施例3，阳性对照品的制备
用试剂盒核酸提取标准阳性HPS培养物的DNA，电泳提取的核酸，采用PCR上游引物SEQ ID NO.3和PCR下游引物SEQ ID NO.4进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和pMD-19T载体进行连接反应，16℃连接2小时，转化JM109菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。
实施例4，阴性对照品的制备
用试剂盒核酸提取无HPS感染的猪肉组织液基因组DNA，电泳提取的核酸，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。
实施例5，2×LAMP buffer的配制
40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,Ph8,25℃)，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1％TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L氯化镁和1.2mmol/L dNTP。各物质的浓度满足上述浓度要求即可构成2×LAMP buffer。
实施例6、制备待检样品的核酸模板
取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，即为核酸模板。
实施例7、扩增体系的建立和优化
以标准阳性毒株DNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增反应的温度，在优化后的温度条件下，优化反应体系中的引物浓度、10×LAMP buffer缓冲液和Bst DNA聚合酶等。优化的LAMP扩增反应液中包含：10×LAMP buffer缓冲液12.5μL，5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL，60mmol/L的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各1μL、5mmol/L的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4各1μL，30mmol/L的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6各1μL，灭菌去离子水3.7mL；在优化的等温条件下，可实现对HPS 15种血清型的鉴定。优化的LAMP扩增条件是：65℃恒温反应60min，80℃终止反应。
实施例8、特异性和灵敏度
采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性副猪嗜血杆菌(HPS)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒II型(PCV-II)、猪肠炎沙门氏菌(SE)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株、HPS阴性猪肉组织液等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条带。
用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为0.175fg/μL。
参见图2可以得到反应灵敏度结果。
实施例9、试剂的制备
LAMP扩增反应液：10×LAMP buffer缓冲液12.5μL，5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL，60mmol/L的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各1μL、5mmol/L的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4各1μL、30mmol/L的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6各1μL，灭菌去离子水3.7μL，共23μL，每个试剂盒提供足做48个反应的量共23×48＝1104μL。
实施例10、试剂盒的组装
如上所配制的阳性对照管、阴性对照管各1支，LAMP扩增反应液管1支，灭菌去离子水管2支，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
实施例11、HPS环介导等温扩增技术快速检测方法，包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板。
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，Calcein显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL。
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于65℃恒温反应60min，80℃终止反应。
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在15min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
参见图1可以明显得出1号有HPS扩增，图3可以明显得出D含有HPS出现黄绿色荧光。

Claims (5)

1.HPS等温扩增快速检测用引物，其特征在于包括：
DNA序列为SEQ ID NO.1的副猪嗜血杆菌内引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.2的副猪嗜血杆菌内引物下游；
DNA序列为SEQ ID NO.3的副猪嗜血杆菌外引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.4的副猪嗜血杆菌外引物下游；
DNA序列为SEQ ID NO.5的副猪嗜血杆菌环引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.6的副猪嗜血杆菌环引物下游。
2.HPS等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的50mmol/L的HPS内引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的50mmol/L的HPS内引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的HPS外引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.4的5mmol/L的HPS外引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.5的30mmol/L的HPS环引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的HPS环引物下游1.0μL；
2×LAMP buffer 12.5μL；
5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；
灭菌去离子水3.7μL；
合计23μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为HPS阳性重组质粒DNA，体积为20μL；
所述阴性对照管，管内为无HPS感染的猪肉组织液基因组DNA，体积为20μL；
所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
3.根据权利要求2所述HPS等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：所述2×LAMP buffer由以下成分组成：
40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1％TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L氯化镁和1.2mmol/L dNTP。
4.根据权利要求2或3所述HPS等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：所述HPS阳性重组质粒DNA由以下方式获得：
序列为SEQ ID NO.3的HPS外引物上游和序列为SEQ ID NO.4的HPS外引物下游分别作为PCR的上游引物和下游引物，模板为标准阳性HPS培养物的DNA，按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD 19T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。
5.利用权利要求2所述试剂盒进行HPS等温扩增快速检测的非疾病检测目的的检测方法，包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板；
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，钙黄绿素显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL；
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于65℃恒温反应60min，80℃终止反应；
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在15min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834432A (zh) * 2016-10-20 2017-06-13 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN107177671A (zh) * 2017-05-31 2017-09-19 北京市农林科学院 一种快速检测副猪嗜血杆菌血清13型的方法
CN108570510A (zh) * 2017-03-14 2018-09-25 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN109055585A (zh) * 2018-08-24 2018-12-21 暨南大学 基于数字lamp技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法
CN110205395A (zh) * 2019-06-17 2019-09-06 武汉科前生物股份有限公司 副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及pcr体系

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174653A (zh) * 2011-03-01 2011-09-07 广西壮族自治区兽医研究所 副猪嗜血杆菌实时荧光定量pcr检测方法
CN102776283A (zh) * 2012-07-05 2012-11-14 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174653A (zh) * 2011-03-01 2011-09-07 广西壮族自治区兽医研究所 副猪嗜血杆菌实时荧光定量pcr检测方法
CN102776283A (zh) * 2012-07-05 2012-11-14 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种检测副猪嗜血杆菌的可视化环介导等温扩增试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG JM ET AL.: "Detecton of haemophilus parasuis isolates from South china by loop-mediated isothermal amplification and isolate characterisation", 《ONDERSTEPOORT J VET RES》 *
吴诗敏等: "副猪嗜血杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立", 《畜牧与兽医》 *
朱杰仪等: "副猪嗜血杆菌环介导等温扩增检测方法的建立", 《中国畜牧兽医》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106834432A (zh) * 2016-10-20 2017-06-13 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN106834432B (zh) * 2016-10-20 2020-09-29 广东省农业科学院动物卫生研究所 检测副猪嗜血杆菌的交叉引物扩增引物组、试剂盒及应用
CN108570510A (zh) * 2017-03-14 2018-09-25 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN108570510B (zh) * 2017-03-14 2021-07-09 河南科技大学 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法
CN107177671A (zh) * 2017-05-31 2017-09-19 北京市农林科学院 一种快速检测副猪嗜血杆菌血清13型的方法
CN107177671B (zh) * 2017-05-31 2020-10-20 北京市农林科学院 一种快速检测副猪嗜血杆菌血清13型的方法
CN109055585A (zh) * 2018-08-24 2018-12-21 暨南大学 基于数字lamp技术检测副猪嗜血杆菌的引物及其试剂盒与方法
CN110205395A (zh) * 2019-06-17 2019-09-06 武汉科前生物股份有限公司 副猪嗜血杆菌的血清分型方法、引物组合以及pcr体系

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