CN104630361A - App等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种APP等温扩增快速检测用引物、试剂盒和检测方法。该试剂盒包括根据靶序列上8个区域设计的6条引物，2条外引物、2条内引物和2条环引物，还包括2×LAMP buffer、Bst DNA聚合酶管、阳性对照、阴性对照和灭菌去离子水。利用本试剂盒在64℃左右的温度下经15～30min的反应后，便可以根据肉眼观察反应结果判断是否含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。本发明可以在等温条件下快速、高效、特异性地扩增靶序列，且操作简便，不需要昂贵的仪器和试剂，可以凭肉眼判断结果，对操作人员没有技术上的要求，检测成本低，检测时间短。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种APP等温扩增技术快速检测用引物、试剂及其检测方法。
背景技术
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)细菌是一种无芽孢、有鞭毛和荚膜的革兰氏阴性小球杆菌，现归类为放线菌属(Actinomyces)，包括2个生物型15个血清型，不同血清型之间及同一血清型的不同菌株的毒力均存在差异，致病性也有强弱之分，从而导致该病的诊断和治疗非常困难。Pattison在1957年首次报道了猪传染性胸膜肺炎(porcinecontagious pleuropneumonia,PCP)的爆发，此后，Mtthews和Pattison在1961年，olander于1963年相继报道了该病。1964年shope报道了一起爆发于阿根廷猪场的类似感染，而本病的病原菌曾由Shope和White等人在1964年根据其培养特性而命名为胸膜肺炎嗜血杆菌(Haemophilus pleuropneumoniae)。后来又经Kihan等人于1978年确定。1983年，Pohi等人通过DNA杂交试验，胸膜肺炎嗜血杆菌和猪流感嗜血杆菌间没有明显的同源性,而与李氏放线杆菌(Actinobacillus lignieresi)之间有较高同源性。据此将该菌划归于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)，放线杆菌属(Actinobacillus)，并命名为胸膜肺炎放线杆菌，也就是目前仍在使用的名称。
APP是PCP的病原菌，引起猪的呼吸道疾病，对猪有高特异性,是国际上公认的危害现代养猪业的五大疾病之一，给养猪业带来了严重的经济损失。有报道从羔羊体内分离到该菌，人工感染小鼠后也可以重新分离到该菌。该病菌主要通过呼吸传播，传染性强。猪感染该病后可表现为急性发病死亡到慢性感染及亚临床症状等经过。因此，APP在动物群中传播对人类的生活和健康存在一定的潜在威胁。同时猪肉等肉制食品在人们的日常食用中非常普遍，携带该细菌的肉制品对人的健康存在威胁，因而该细菌的检测在出入境和食品安全检验中起着重要的作用。
我国在20世纪80年代初期，由于养猪方式大部分以分散饲养为主，本病发生较少。20世纪90年代开始,随着集约化养猪业的迅速发展，加上国家及地区间引种工作的日益频繁，本病的发病率及死亡率大大高于从前。国内大多数省(区、市)经病原学、血清学诊断和检疫,有此病发生的报道。说明PCP在我国已广泛流行，并有扩大蔓延之势。目前该病已经成为我国猪呼吸系统的主要疾病。
国外较多使用PCR方法对APP进行快速诊断，所选的目的基因多种多样，如APX、olmA、Tbps、dsbE-like等。APP引起猪致病有几个毒力因素，溶血素(RTX)、荚膜多糖(CP)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(olmA)、转铁蛋白(Tbps)等。RTX存在于大部分致病性革兰氏阴性细菌中，同时也是APP的主要毒力因子之一。APP的15个血清型中共发现了4种不同的溶血毒素，即Apx I、ApxⅡ、Apx III、Apx lV。近年发现，没有一种血清型的APP能同时分泌4种毒素，但APP所有血清型在感染动物体内都能分泌Apx lV毒素蛋白，因此ApxlV毒素蛋白在建立检测方法等方面具有潜在的理论价值和应用前景，可用于区别诊断APP的感染与非感染。血清PCR检测虽为主要检测手段，但其扩增受实验条件、费用高、假阳性率高等因素的限制，不宜广泛推广；而血清学试验仅能反应是否感染，并不能检测细菌含量和分型检测。因此，发明一种可以同时鉴别检测APP15种不同血清型的检测方法对研究我国猪肉中APP感染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法，利用LAMP方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告，但在兽医临床诊断方法，APP诊断方法的报导并不多且灵敏度不高。
环介导等温扩增基因技术(loop-mediated isothermal amplication,简称LAMP)(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的8个区域设计一套3对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在64℃左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的3对引物是针对靶基因的8个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需要PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。
中国发明专利(申请号为：200710030435.0、200710030437.X、200710132320.2、200710026389.7、200810052321.0、200810015001.8、200810093986.6、200910041358.8、200910251055.9、200910090037.7、201010555073.9、201110339104.X等)分别公开了采用等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法。但是，目前尚无利用等温扩增基因技术检测APP的试剂盒。
发明内容
为克服现有技术的不足，将LAMP扩增技术运用于APP的快速检测，本发明的第一个目的是提供一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌等温扩增技术快速检测用引物，第二个目的是提供使用该引物的试剂盒，第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒的使用方法。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：
APP等温扩增快速检测用引物包括：
DNA序列为SEQ ID NO.1的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌内引物上游FIP；
DNA序列为SEQ ID NO.2的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌内引物下游BIP；
DNA序列为SEQ ID NO.3的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外引物上游F3；
DNA序列为SEQ ID NO.4的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外引物下游B3；
DNA序列为SEQ ID NO.5的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌环引物上游LF；
DNA序列为SEQ ID NO.6的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌环引物下游LB。
一种APP等温扩增快速检测用试剂盒，包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的60mmol/L的APP内引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的60mmol/L的APP内引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的APP外引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.4的5mmol/L的APP外引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.5的30mmol/L的APP环引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的APP环引物下游1.0μL；
2×LAMP buffer 12.5μL；
5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；
灭菌去离子水3.7μL；
合计23μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为APP阳性重组质粒DNA，体积为20μL。
所述阴性对照管，管内为无APP感染猪肉组织基因组DNA，体积为20μL。
所述钙黄绿素显色剂(Calcein显色剂)管，管内体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒的APP等温扩增快速检测方法：包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板；
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，Calcein显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL；
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于64℃恒温反应60min，80℃终止反应；
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在20min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
本发明的原理是：针对一段232bp左右的靶序列上8个区域设计6条引物(2条外引物、2条内引物和2条环引物)，利用核酸分子在64℃左右的温度下处于自然松散状态，采用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下对目的基因进行高效扩增，经15～30min的反应，模板扩增效率能达到109～1010倍。由于该反应不需要高温节链、退火等步骤，因此不需要昂贵的PCR仪。在反应的Buffer反应液里加入一种特殊的发光剂钙黄绿素显色剂，钙黄绿素显色剂本身是一种发绿光的荧光，在本反应中采用的钙黄绿素显色剂是被锰离子整合处理过的，不能发黄绿色荧光，一旦LAMP反应发生，产生的大量焦磷酸根离子可竞争性地结合锰离子，释放出钙黄绿素显色剂，导致反应呈黄绿色，通过黄绿色荧光的产生也能判定反应结果。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本等缺点、此外，该检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简单，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。
LAMP是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增方法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖于任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。现有的APP检测周期较长，约1～2天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需1小时。
本发明的优点是(1)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性：应用8个区段，6条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间1小时左右；(4)、灵敏度高：扩增模板仅需3.0pg/mL或更少，猪肉组织样品中DNA最低检测极限达到307.0fg/mL；标本的检出率达到99％；(5)、鉴定简便：无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物----焦磷酸镁乳白沉淀，与Calcein显色剂结合，阳性结果显示为黄绿色，阴性结果为橙色，结果明显可靠，可通过肉眼观察鉴定；(6)、用途广：可广泛用于APP的安全快速检测。
附图说明
图1为APP的LAMP扩增特异性试验结果；
图2为APP的LAMP扩增灵敏性试验结果；
图3为阴阳性对照LAMP扩增结果；
图中：A-实时扩增速率曲线，B-实时扩增浊度曲线，C-扩增柱型分析图；D-APP阳性,E-阴性对照；
图1中：1.猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)DNA，2.副猪嗜血杆菌(HPS)DNA，3.猪瘟病毒(CSFV)cDNA，4.猪圆环病毒II型(PCV-II)DNA，5.猪肠炎沙门氏菌(SE)DNA，6.猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)cDNA，7.猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株cDNA，8.阴性对照；
图2中：从左到右的浓度如下，1、3.07ug/mLAPP DNA，2、3.07×10-1ug/mLAPP DNA，3、3.07×10-2ug/mL APP DNA，4、3.07×10-3ug/mL APP DNA，5、3.07×10-4ug/mL APP DNA，6、3.07×10-5ug/mL APP DNA，7、3.07×10-6ug/mL APP DNA，8、3.07×10-7ug/mL APP DNA。
具体实施方式
实施例1，APP环介导等温扩增技术快速检测试剂盒包括LAMP扩增反应液、Calcein显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
LAMP扩增反应液管管内由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO.1的60mmol/L的APP内引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.2的60mmol/L的APP内引物下游1.0μL；序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的APP外引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.5的5mmol/L的APP外引物下游1.0μL；序列为SEQID NO.5的30mmol/L的APP环引物上游1.0μL；序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的APP环引物下游1.0μL；10×LAMP buffer缓冲液12.5μL；5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；灭菌去离子水3.7μL；合计23μL，为单次反应的用量。
其中10×LAMP buffer缓冲液由以下成分组成：40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐；20mmol/L氯化钾；20mmol/L硫酸胺；体积百分比浓度为1％Tritonx-100；0.8mol/L Betaine；7.5mmol/L氯化镁；1.2mmol/L dNTP。上述浓度为溶液终浓度。
阳性对照管管内为APP阳性重组质粒，积为20μL。
阴性对照管管内为无APP感染猪肉组织基因组DNA，体积约20μL。
Calcein显色剂管管内体积约20μL。
灭菌去离子水管1mL～2mL。
实施例2，引物的设计及筛选
APP等温扩增引物组，其设计是根据GenBank公布的APP的Apx lVA基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4.0，设计特异性引物，分别标记为：SEQ ID NO.1……SEQ IDNO.6。其中引物组中内引物上游FIP:SEQ ID NO.1；内引物下游BIP:SEQ ID NO.2；外引物上游F3:SEQ ID NO.3；外引物下游B3:SEQ ID NO.4；环引物上游LF:SEQID NO.5；环引物下游LB:SEQ ID NO.6的浓度分别为60mmol/L，60mmol/L，5mmol/L，5mmol/L，30mmol/L，30mmol/L；体积比为1:1:1:1:1:1。同时，PCR上游引物：SEQ ID NO.3；PCR下游引物：SEQ ID NO.4；体积比为1:1。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用市售细菌核酸提取试剂盒提取APP的DNA，扩增，排除有非特异性扩增的引物。获得引物如下：
| 引物序列号 | 序列(5′～3′) |
| SEQ ID NO.1 | TTCACGCAAATCCCGAACCCGAAGCGTTAAATTTAACCGAGC |
| SEQ ID NO.2 | TTCTGAGGAGTTGGCTGCTTTGGCAGGCAATAATTCTCG |
| SEQ ID NO.3 | ACCCGTTTTATAGCCGATT |
| SEQ ID NO.4 | TGTTGATACTGTAAATCCGTTG |
| SEQ ID NO.5 | GGTTAGATTAATTGTGCGACGTTGT |
| SEQ ID NO.6 | ACAACAGTACACTAAGGCCTCC |
实施例3，阳性对照品的制备
用试剂盒核酸提取标准阳性APP培养物的DNA，电泳提取的核酸，采用PCR上游引物SEQ ID NO.3和PCR下游引物SEQ ID NO.4进行扩增，并使用胶回收试剂盒回收扩增的条带。按照1：10的比例和pMD-19T载体进行连接反应，16℃连接2小时，转化JM109菌，经抗性选择和PCR鉴定阳性后，再测序验证，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。
实施例4，阴性对照品的制备
用试剂盒核酸提取无APP感染的猪肉组织基因组DNA，电泳提取的核酸，利用分光光度计测定核酸的浓度，使其浓度控制在80～100ng/μL，分装为50μL每管。
实施例5，2×LAMP buffer的配制
40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl,Ph8,25℃)，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1％TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L氯化镁和1.2mmol/L dNTP。各物质的浓度满足上述浓度要求即可构成2×LAMP buffer。
实施例6、制备待检样品的核酸模板
取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，即为核酸模板。
实施例7、扩增体系的建立和优化
以标准阳性毒株DNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增反应的温度，在优化后的温度条件下，优化反应体系中的引物浓度、10×LAMP buffer缓冲液和Bst DNA聚合酶等。优化的LAMP扩增反应液中包含：10×LAMP buffer缓冲液12.5μL，5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL，60mmol/L的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各1μL、5mmol/L的引物SEQ ID NO3.、SEQ ID NO.4各1μL，30mmol/L的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6各1μL，灭菌去离子水3.7mL；在优化的等温条件下，可实现对APP 15种血清型的鉴定。优化的LAMP扩增条件是：64℃恒温反应60min，80℃终止反应。
实施例8、特异性和灵敏度
采用上述优化的体系和扩增条件，对标准阳性猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)、副猪嗜血杆菌(HPS)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒II型(PCV-II)、猪肠炎沙门氏菌(SE)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株、APP阴性猪肉组织等核酸提取物进行扩增，均无非特异性扩增条带。
用灭菌去离子水梯度稀释阳性质粒DNA，用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为0.307fg/μL。
参见图2可以得到反应灵敏度结果。
实施例9、试剂的制备
LAMP扩增反应液：10×LAMP buffer缓冲液12.5μL，5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL，60mmol/L的引物SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2各1μL、5mmol/L的引物SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4各1μL、30mmol/L的引物SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6各1μL，灭菌去离子水3.7μL，共23μL，每个试剂盒提供足做48个反应的量共23×48＝1104μL。
实施例10、试剂盒的组装
如上所配制的阳性对照管、阴性对照管各1支，LAMP扩增反应液管1支，灭菌去离子水管2支，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
实施例11、APP环介导等温扩增技术快速检测方法，包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板。
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，Calcein显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL。
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于64℃恒温反应60min，80℃终止反应。
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在20min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
参见图1可以明显得出1号有APP扩增，图3可以明显得出D含有APP出现黄绿色荧光。
Claims (5)
1.APP等温扩增快速检测用引物，其特征在于，包括：
DNA序列为SEQ ID NO.1的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌内引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.2的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌内引物下游；
DNA序列为SEQ ID NO.3的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.4的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外引物下游；
DNA序列为SEQ ID NO.5的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌环引物上游；
DNA序列为SEQ ID NO.6的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌环引物下游。
2.APP等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、钙黄绿素显色剂管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中：
所述扩增反应液管管内由以下反应液组成：
DNA序列为SEQ ID NO.1的60mmol/L的APP内引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.2的60mmol/L的APP内引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.3的5mmol/L的APP外引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.4的5mmol/L的APP外引物下游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.5的30mmol/L的APP环引物上游1.0μL；
DNA序列为SEQ ID NO.6的30mmol/L的APP环引物下游1.0μL；
2×LAMP buffer 12.5μL；
5U/μL Bst DNA聚合酶0.8μL；
灭菌去离子水3.7μL；
合计23μL，为单次反应的用量；
所述阳性对照管，管内为APP阳性重组质粒DNA，体积为20μL；
所述阴性对照管，管内为无APP感染猪肉组织基因组DNA，体积为20μL；
所述钙黄绿素显色剂管，管内体积为20μL；
所述灭菌去离子水管1mL～2mL。
3.根据权利要求2所述APP等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：所述所述2×LAMP buffer由以下成分组成：
40mmol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐，20mmol/L氯化钾，20mmol/L硫酸胺，体积百分比浓度为1％TritonX-100，0.8mol/L Betaine，7.5mmol/L氯化镁和1.2mmol/L dNTP。
4.根据权利要求2所述APP等温扩增快速检测用试剂盒，其特征在于：所述APP阳性重组质粒DNA由以下方式获得：
序列为SEQ ID NO.3的APP外引物上游和序列为SEQ ID NO.4的APP外引物下游分别作为PCR的上游引物和下游引物，模板为标准阳性APP培养物的DNA，按常规进行PCR扩增，将PCR产物与pMD 19T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。
5.利用权利要求2所述试剂盒进行APP等温扩增快速检测的非疾病检测目的的检测方法，包括如下步骤：
(1)样品中核酸模板的提取：取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取细菌核酸的方法提取样品中的DNA，即为核酸模板；
(2)LAMP反应体系：取1μL核酸模板或阳性对照或阴性对照，分别加入LAMP扩增反应液23μL，钙黄绿素显色剂1μL，反应体系的总体积为25μL；
(3)LAMP扩增条件：将步骤(2)配制好的反应体系的PCR管于64℃恒温反应60min，80℃终止反应；
(4)结果判定：通过LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪进行实时观察：阳性扩增在20min内可见明显的实时扩增曲线和浊度扩增曲线，阴性无任何扩增；或者，反应产物显现黄绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
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| CN108570510A (zh) * | 2017-03-14 | 2018-09-25 | 河南科技大学 | 用于检测副猪嗜血杆菌的lamp引物、试剂盒及检测方法 |
| NL2032806A (en) * | 2021-09-03 | 2023-03-10 | Univ Anhui Agricultural | Loop-mediated isothermal amplification (lamp) primer set, kit and lamp microfluidic chip for detecting actinobacillus pleuropneumoniae |
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2015
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