CN102304585A - 金黄色葡萄球菌免疫捕捉pcr的检测试剂盒和试剂盒使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种金黄色葡萄球菌的基因检测试剂盒，属于食源性致病菌的检测领域，专一针对金黄色葡萄球菌（staphylococcus.aureus.SA）的检测。一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有：10×PCRbuffer5uL，dNTPs2.5mmol/L2uL，TaqDNA聚合酶5U/L0.25uL，正向引物10pmol/L2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物10pmol/L2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）；阳性对照1管；阴性对照1管。本发明的优点是能快速、简便、准确的检测病原菌。
Description
技术领域
本发明是一种金黄色葡萄球菌的基因检测试剂盒，属于食源性致病菌的检测领域，专一针对金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus,SA）的检测。适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。
背景技术
金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus，SA) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，可引起多种严重感染。有“嗜肉菌"的别称。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH 7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。
食源性致病菌是影响食品安全的主要原因之一,检测食源性致病菌是食源性疾病预防与控制的关键环节。传统的检测方法如分离培养、 生化鉴定等5-7d的时间，而且存在特异性不高、 灵敏度低、 操作烦琐耗时, 不能实现及时有效的监测。因此,发展新的快速检测与鉴定食源性致病菌的方法为及时有效地控制和预防致病菌传播所必需。近年来,随着PCR 技术的广泛应用,国内外已经将这一技术引入食源性致病菌检测领域。发展一种将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，是金黄色葡萄球菌检测急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足提供一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒。以克服现有的食源性致病菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足，将病原富集和基因水平检测有效结合的方法，用免疫学方法先将样品中的病原富集，然后进行PCR扩增，可以极大的提高检测灵敏度，同时大大提高了检测的效率。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，其主要特点是包括有：10× PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）；阳性对照1管；阴性对照1管。
一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是，所述使用方法的步骤为：
（1）加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌病菌；
（2）PCR扩增，其扩增条件是： 99 oC高温裂解细菌10min，释放DNA 作为扩增模板；再加入10× PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）；PCR扩增条件：94oC 2m in ; 94 oC 1min , 61 oC 30 s ,72 oC 1min30s , 35 个循环; 72 oC 3 m i n30s ,最后4℃保持。
（3）1-1.5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；
（4）对条带进行分析得出结论；若有279bp扩增条带，则判断为金黄色葡萄球菌。
所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，所述的包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管的具体步骤为：
（a） 用包被缓冲液按照1：1000-1500稀释金黄色葡萄球菌多克隆抗体，抗体浓度为1.0-1.3ug/ml，将稀释好的抗体按照每管50μL加入PCR管室温4小时或4℃过夜包被抗体；
（b） 包被缓冲液配方为：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93 g，叠氮化钠0.2 g，溶于1000ml PBST缓冲液中，调pH值到9.6；配制PBST：氯化钠8.0 g，无水磷酸氢二钠1.15 g，无水磷酸二氢钾0.2 g，氯化钾0.2 g，吐温-20 0.5 毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7.4。
所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，所述的加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌的具体步骤为：
a) 样品制备方法为：按国标GB/T4789.10-2008《食品卫生微生物学检验——金黄色葡萄球菌检验法》取25g样品加入225ml磷酸盐缓冲液，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度的金黄色葡萄球菌，人工污染的匀浆液中金黄色葡萄球菌的浓度依次为107-100cfu/ml；
b)磷酸盐缓冲液配方为： 磷酸二氢钾34g, 蒸馏水500ml，PH 7.2，作为贮存液存于40C，每次用时取1.25ml蒸馏水稀释至1000ml,1210C高压灭菌15min。
一种金黄色葡萄球菌快速免疫捕捉PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其主要特征步骤为：
取检测样品50ul置于已经包被好金黄色葡萄球菌特异性抗体的PCR管中，370C放置3h或40C过夜，370C孵育3h,用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2Min，扣干残液，加入33.75ul双蒸水，将处理液于PCR仪上以99℃裂解10min，然后迅速转移到冰上冷却5min,再经5000r/min离心2min后,其上清液即为可用于PCR扩增的DNA。
使用该试剂盒对参试细菌进行免疫PCR扩增，金黄色葡萄球菌产生分子量为279bp的特异性扩增产物。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus.aureus，SA）免疫捕捉PCR检测试剂盒，属于食源性致病菌检测领域。使用本发明试剂盒对10个参试菌株进行检测，金黄色葡萄球菌得到279bp特异性目标条带，其余菌株无产物；该试剂盒集病原浓缩、特异性抗体识别、PCR扩增为一体，是一种灵敏度极高、检测速度快、结果准确、使用方便的试剂盒，尤其适用于质捡部门和进出口检疫部门，对食品样品进行快速金黄色葡萄球菌的鉴定。
本发明的有益效果是：本发明金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，涉及一种检测危险性食物病原菌的分子技术，尤其是能快速、简便、准确的检测病原菌在数小时内就可以完成检测。
本发明提供了一种依赖PCR的分子检测试剂盒，克服现有的食源性致病菌检测方法灵敏性低、特异性差、费时不稳定的不足。该试剂盒能快速、灵敏、准确的检测到病原菌，并直接可从食品中检测病原菌。大大简化了检测程序，提高了我国口岸的检疫水平，同时为食品致病菌大量快速检测提供了依据。
通过对金黄色葡萄的特异性检测，引物nuc1和nuc2和优化的PCR条件对目标菌株扩增得到了一段长279bp的PCR产物，可以特异的检测目标菌。但是对于6种类非目标菌，均无扩增产物。
通过灵敏度的检测，对金黄色葡萄纯菌液模拟带菌样品匀浆的直接PCR和免疫捕捉PCR检测比较，发现直接进行PCR扩增的最低检出限为3.25×104cfu /ml，而免疫捕捉PCR的最低检出量是3.25×102cfu /ml。对于纯菌液，免疫捕捉PCR灵敏度是直接PCR的100倍。
附图说明
图1 金黄色葡萄球菌快速免疫捕捉检测试剂盒原理图；
图2试剂盒使用流程图；
图3 试剂盒特异性验证结果；
其中：M：100bp DNA ladder； 1-11号泳道金黄色葡萄球菌ATCC 27660，金黄色葡萄球菌ATCC 29213，单核细胞增生性李斯特菌ATCC 43251，单核细胞增生性李斯特菌ATCC 7644，坂崎肠杆菌ATCC 29004，坂崎肠杆菌ATCC 29554，肠炎沙门氏菌ATCC 13076，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715，副溶血性弧菌ATCC 17802，蜡样芽胞杆菌ATCC 11778，阴性对照
图4梯度稀释纯菌液直接PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×108-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图5 梯度稀释纯菌液免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×108-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图6梯度稀释模拟带菌雪糕样品PCR结果；
A1模拟带菌雪糕样品直接PCR结果；
A2. 模拟带菌雪糕样品免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×107-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图7梯度稀释模拟带菌酸奶样品免疫捕捉PCR结果；
B1. 模拟带菌酸奶样品直接PCR结果；
B2.模拟带菌酸奶样品免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×107-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图8梯度稀释模拟带菌果汁样品免疫捕捉PCR结果；
C1.模拟带菌果汁样品直接PCR结果；
C2. 模拟带菌果汁样品免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×107-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图9梯度稀释模拟带菌牛奶样品免疫捕捉PCR结果；
D1. 模拟带菌牛奶样品直接PCR结果；
D2.模拟带菌牛奶样品免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×107-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
图10梯度稀释模拟带菌香肠样品免疫捕捉PCR结果；
E1. 模拟带菌香肠样品直接PCR结果；
E2.模拟带菌香肠样品免疫捕捉PCR结果；
其中：1-7号泳道细菌浓度为2.35×107-2.35×101CFU/ml,N为阴性对照，P为阳性对照，M为100bp DNAladder。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，包括有：
10× PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管3个；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管（灭活的金黄色葡萄球菌菌液）管3个；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管（灭菌的PBS）管3个；阳性对照1管；阴性对照1管。
实施例2一种金黄色葡萄球菌直接PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为：
待标准菌培养18h后，取此菌液1ml依次10倍稀释到无菌PBS中，并分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、，然后取10-5、10-6、10-7梯度纯菌液各100ul于培养皿中进行平板菌落计数。浓度为：2.35×108-2.35×101CFU/ml。
取梯度菌液匀浆5ul于PCR管中，加入37.25ul去离子水，在PCR仪上990C裂解10min,然后迅速置于冰上冷却5Min，离心后加入10×PCR buffer 5ul、2.5uMdNTPs 4 ul、5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul、2ul 上游引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇ 8-10 pmol/μL；2ul引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇ 8-10 pmol/μL；然后再进行PCR扩增。
实施结果如图4所示，图中1-5号泳道均可见特异性目标条带，片段大小约为279bp，且亮度依次减弱；6-8号泳道未见特异性目标条带。试验结果表明，在纯菌液中直接PCR的检测灵敏度为104cfu/ml。
实施例3：免疫捕捉PCR特异性的检测， 见图5，
供试菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 27660，金黄色葡萄球菌ATCC 29213，单核细胞增生性李斯特菌ATCC 43251，单核细胞增生性李斯特菌ATCC 7644，坂崎肠杆菌ATCC 29004，坂崎肠杆菌ATCC 29554，肠炎沙门氏菌ATCC 13076，小肠结肠炎耶尔森氏菌ATCC 23715，副溶血性弧菌ATCC 17802，蜡样芽胞杆菌ATCC 11778，阴性对照。
检测结果表明，以上十株供试菌，只有金黄色葡萄球菌检出目标条带，其它均未检出目标条带，说明试剂盒有比较好的专一性。
实施例4一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其主要特点是步骤为：
（1）病原富集：取检测样品50ul置于已经包被好金黄色葡萄球菌特异性抗体的PCR管中，（370C放置3h或40C过夜）370C孵育3h,用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2Min，扣干残液，加入33.75ul双蒸水，将处理液于PCR仪上以99·℃裂解10min然后迅速转移到冰上冷却5min,再经5000r/min离心2min后,其上清液即为为可用于PCR扩增的DNA。
其扩增条件是：94oC 2m in ; 94 oC 1min , 61 oC 30 s ,72 oC 1min30s , 35 个循环; 72 oC 3 m i n30s ,最后4℃保持。
结果分析：灌制1.5%琼脂糖凝胶，取10ul PCR产物进行电泳分离，在凝胶成像系统下进行拍照并分析。
实施结果如图6 至图10中A1-B1-C1-D1-E1所示，图中1-7号泳道均可见特异性目标条带，片段大小约为279bp，且亮度依次减弱；8-9号泳道未见特异性目标条带。试验结果表明，在纯菌液中直接PCR的检测灵敏度为102cfu/ml。
实施例5：梯度稀释模拟带菌食品样品直接PCR结果；
按国标GB/T4789.10-2008《食品卫生微生物学检验——金黄色葡萄球菌检验法》取25g样品加入225ml磷酸盐缓冲液，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染2.35×108-2.35×101CFU/ml的梯度金黄色葡萄球菌纯菌液，使人工污染的匀浆液中金黄色葡萄球菌的浓度依次为2.35×107-2.35×100cfu/ml。
取模拟带菌好的梯度食品匀浆5ul于PCR管中，加入37.25ul去离子水，在PCR仪上990C裂解10min,然后迅速置于冰上冷却5Min，离心后加入10×PCR buffer 5ul、2.5uMdNTPs 4 ul、5U/ulTaqDNA聚合酶0.25ul、2ul 上游引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇ 8-10 pmol/μL；2ul引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇ 8-10 pmol/μL；然后再进行PCR扩增。
实施结果如图6至图10中 A1-B1-C1-D1-E1所示，食品模拟带菌的直接PCR检测灵敏度可达105—106cfu/ml
实施例6：梯度稀释模拟带菌食品样品免疫捕捉PCR结果；按国标GB/T4789.10-2008《食品卫生微生物学检验——金黄色葡萄球菌检验法》取25g样品加入225ml磷酸盐缓冲液，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度的金黄色葡萄球菌，人工污染的匀浆液中金黄色葡萄球菌的浓度依次为107-100cfu/ml。
取检测样品50ul置于已经包被好金黄色葡萄球菌特异性抗体的PCR管中，（370C放置3h或40C过夜）370C孵育3h,用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2Min，扣干残液，加入33.75ul双蒸水，将处理液于PCR仪上以99·℃裂解10min然后迅速转移到冰上冷却5min,再经5000r/min离心2min后,其上清液即为为可用于PCR扩增的DNA。 94oC 2m in ; 94 oC 1min , 61 oC 30 s ,72 oC 1min30s , 35 个循环; 72 oC 3 m i n30s ,最后4℃保持。
实施结果如图6至图10中A2-B2-C2-D2-E2所示，食品模拟带菌的免疫捕捉PCR检测灵敏度可达104—103cfu/ml
本试剂盒不需提取样本DNA，减少了提取DNA的繁琐操作，方法敏感，可靠和快速，在本实验中人工污染样品没有进行增菌便进行检测，样品灵敏度达104cfu/ml,有的样品甚至达到进行103cfu/ml其灵敏度是直接PCR的10-100倍。同时试验表明，本试剂盒在实际的食品样本检测中具有较高的实用价值，能直接对食品样品进行检测，具有较大的推广应用基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒，其特征是包括有：10× PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管为灭活的金黄色葡萄球菌菌液1管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管为灭菌的PBS阳性对照1管；阴性对照1管。
2.一种金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述使用方法的步骤为：
（1）加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌病菌；
（2）PCR扩增，其扩增条件是： 99 oC高温裂解细菌10min，释放DNA 作为扩增模板；再加入10× PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo l/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物 10p mo l/L 2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；双蒸水99%～100%；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阳性对照PCR管为灭活的金黄色葡萄球菌菌液；包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的阴性对照PCR管为灭菌的PBS；PCR扩增条件：94oC 2m in ; 94 oC 1min , 61 oC 30 s ,72 oC 1min30s , 35 个循环; 72 oC 3 m i n30s ,最后4℃保持；
（3）1-1.5%琼脂糖电泳检测目标条带并成像分析；
（4）对条带进行分析得出结论；若有279bp扩增条带，则判断为金黄色葡萄球菌。
3.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的包被了金黄色葡萄球菌多克隆抗体的检测PCR管的具体步骤为：
用包被缓冲液按照1：1000-1500稀释金黄色葡萄球菌多克隆抗体，抗体浓度为1.0-1.3ug/ml，将稀释好的抗体按照每管50μL加入PCR管室温4小时或4℃过夜包被抗体；
包被缓冲液配方为：碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93 g，叠氮化钠0.2 g，溶于1000ml PBST缓冲液中，调pH值到9.6；配制PBST：氯化钠8.0 g，无水磷酸氢二钠1.15 g，无水磷酸二氢钾0.2 g，氯化钾0.2 g，吐温-20 0.5 毫升，加双蒸水到1000ml，调pH值到7.4。
4.如权利要求2所述的金黄色葡萄球菌免疫捕捉PCR检测试剂盒的使用方法，其特征是，所述的加样品孵育3小时，抗体会特异性捕捉和富集样品中的金黄色葡萄球菌的具体步骤为：
a) 样品制备方法为：按国标GB/T4789.10-2008《食品卫生微生物学检验——金黄色葡萄球菌检验法》取25g样品加入225ml磷酸盐缓冲液，作为食品匀浆，然后对匀浆液人工污染不同浓度的金黄色葡萄球菌，人工污染的匀浆液中金黄色葡萄球菌的浓度依次为107-100cfu/ml；
b)磷酸盐缓冲液配方为： 磷酸二氢钾34g, 蒸馏水500ml，PH 7.2，作为贮存液存于40C，每次用时取1.25ml蒸馏水稀释至1000ml,1210C高压灭菌15min。
5. 一种金黄色葡萄球菌快速免疫捕捉PCR检测试剂盒模板DNA快速获取方法，其特征步骤为：
取检测样品50ul置于已经包被好金黄色葡萄球菌特异性抗体的PCR管中，370C放置3h或40C过夜，370C孵育3h,用移液器小心吸去检测样品，然后再用PBST洗涤离心管3次，每次2Min，扣干残液，加入33.75ul双蒸水，将处理液于PCR仪上以99℃裂解10min，然后迅速转移到冰上冷却5min,再经5000r/min离心2min后,其上清液即为可用于PCR扩增的DNA。
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