CN103509860A - 食品中大肠杆菌o157:h7活菌的定量检测方法 - Google Patents

食品中大肠杆菌o157:h7活菌的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌O157:H7的荧光定量PCR的检测方法。针对大肠杆菌O157:H7的filc ，设计一对扩增20bp片段的特异性引物。首先，采用磁珠富集的方法从实际样本中分离出大肠杆菌O157:H7，然后通过脱氧胆酸盐(SD)和叠氮溴化丙锭（PMA）处理排除食物样品中死菌的干扰，使PCR扩增活菌。本发明的检测方法具有灵敏度高、准确定量、特异性强、检测时间短，操作过程简单，并且不会被食物样品中残留的DNA或死菌的干扰。

Description

食品中大肠杆菌O157:H7活菌的定量检测方法
技术领域
本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速检测食品中大肠杆菌O157:H7的方法。
技术背景
大肠杆菌O157:H7是近30年来才被发现和识别的食源致病菌，按血清型分类属肠出血性大肠杆菌（Entero Hemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）。它以食物传播为主，主要的宿主是牛和鸡等家畜家禽。人类摄入不到10个活菌就有可能引起出血性结肠炎（Hemorrhagiccolitis HC）和溶血性尿毒综合征（Hemolytic uremie syndrom HUS)，患者病死率极高，其对人类的健康构成了严重的威胁。巴氏灭菌和冷冻存储是两种常见方法降低大肠杆菌O157:H7对食品的污染。然而由于食品基质以及大肠杆菌O157:H7自身免疫机制常常对细菌具保护功能，所以常常有大肠杆菌O157:H7污染食品。被来自1982年美国首次爆发大肠杆菌O157:H7引起的感染性腹泻以来，世界各国相继爆发了多起大肠杆菌O157:H7的流行事件。1986年在中国江苏徐州首次报道了大肠杆菌O157:H7的病例，随后在中国十几个省份也发生散发病例。其流行性已经不再是个别国家的问题，而是成为世界重要公共卫生问题之一。
目前检测大肠杆菌O157:H7的常见培养法、免疫学方法以及分子生物方法。常规培养法耗时且工作量大；免疫磁珠捕获法由于方法自身的局限性，检测的灵敏度低且造成一定程度的漏检。分子生物学方法，如PCR存在不能区分死菌或者活菌的缺陷，使检测结果具有假阴性。据报道，PMA能够通过细胞膜破损的死菌，与DNA结合，使死菌DNA在PCR时不再扩增，进而检测活菌的信号。然而PMA-PCR结合的方法也具有一定的局限性。细胞膜未破损的死菌以及受伤的菌，PMA不能有效抑制其PCR扩增。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的大肠杆菌O157:H7。
发明内容
本发明是目的是针对现有技术的不足，提供一种定量、结果准确、检测快速高效、灵敏度高的大肠杆菌O157:H7的快速检测方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：
包括如下步骤：
（1）取食物样本，加PBS磷酸缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；
(2)取制备好的菌悬液加偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，室温下在旋转混合仪上以10rpm的转速反应45min后，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清，加入到灭菌离心管中备用。最后，添加1mL洗涤液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积缓冲液重悬磁珠。
（3）向上述重悬液加入0.1%(m(g)/v(mL）)蛋白胨水溶解的脱氧胆酸盐使其终浓度为0.1%～2.5%(m(g)/v(mL）),室温孵育20～120min。
（4）加入叠氮溴化丙锭（PMA）溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，用无菌水重悬，所得沉淀用沸水浴法提取DNA。
（5）通过连续十倍稀释过夜培养的大肠杆菌O157:H7得到不同梯度浓度的菌悬液，沸水浴法提取菌悬液中大肠杆菌O157:H7的DNA，然后进行荧光定量PCR。同时平板计数每个梯度菌悬液的浓度，以平板计数得到活菌数的对数值为横坐标，以荧光定量PCR的Ct值为纵坐标绘制得到大肠杆菌O157:H7标准曲线。
（6）取DNA为模板，进行荧光定量PCR。PCR的上下游引物分别为flic上游引物：5’-TTCGCAGCATCACTGGATTC-3’
flic下游引物：5’-CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3’
荧光定量PCR反应体系为20μL：DNA模板2μL，SYBR Premix ExTaqTM10μL，ROX0.4μL，10μM的上下游引物各0.4μL，无菌水补足20μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s，紧接着95℃变性5s,62℃退火1min40个循环。
荧光定量PCR数据用SDS2.3软件分析数据，从而进行结果的分析，将将荧光定量PCR结果代入标准曲线中，即可定量得到待测食品样本中大肠杆菌O157:H7。
有益效果
与现有技术相比，本发明有如下有益效果，本发明将IMS（磁珠分离）与qPCR技术相结合，检测大肠杆菌O157:H7时间更短，可在5个小时内得到结果且提高了检测灵敏度。同时本发明克服了一般的分子生物学检测方法无法区分死菌与活菌的缺陷。大肠杆菌O157:H7作为一种主要的食源性致病菌，在公共卫生、食品安全。兽牧兽医和出入境检验检疫中必须的检测指标。随着社会经济的发展和国际贸易量的与日俱增。急需建立一种从田园到餐桌的一种快速、准确、灵敏度高的细菌检测方法。将IMS-SD-PMA与qPCR检测技术更具有重要意义。
附图说明
图1脱氧胆酸盐浓度的优化；
图2脱氧胆酸盐与大肠杆菌O157:H7孵育时间的优化；
图3大肠杆菌O157:H7标准曲线的建立；
图4、qPCR、PMA-qPCR、SD-PMA-qPCR与平板计数方法的比较，各种形状代表qPCR(■),PMA-qPCR(
Figure BDA0000365199280000041
),SD-PMA-qPCR(□)和平板计数（
Figure BDA0000365199280000042
）；
图5大肠杆菌O157:H7经过磁珠富集的检测线。a未经过SD和PMA处理大肠杆菌O157:H7检测线。b经过SD和PMA处理后大肠杆菌O157:H7检测线。
具体实施方案
下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。
实施例1脱氧胆酸盐浓度的优化以及处理时间
称取一定量的脱氧胆酸盐（SD）溶解于0.1%(m(g)/v(mL）)的蛋白胨水，配成浓度为5%(m(g)/v(mL）)的SD母液，置于4℃避光保存。
叠氮溴化丙锭（PMA）溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成0.5mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。
挑取大肠杆菌O157:H7（英国典型菌种保藏中心）的单菌落于5mLLB培养基中，37℃过夜培养后，取1mL菌液用PBS连续十倍稀释两个梯度，得到约为106CFU/mL。12000rpm离心10min，用等体积的0.1%（m(g)/v(mL)）的蛋白胨水重悬。将重悬后的菌液置于-70℃中处理10min后，9℃水浴30min，得到受伤的细菌、活菌和死菌的混合物。取上述1mL含有受伤的细菌、活菌和死菌的混合物加入1.5mL的离心管中。分别向离心管中加入不同体积的SD，使SD的最终浓度达到0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5和5%(m(g)/v(mL）)。37℃以180rpm转速孵育30min，采用传统的平板技术的方法对各离心管活菌进行计数。结果见图1，根据计数的结果，0.1%(m(g)/v(mL）)SD能够有效地降解受伤细菌的细胞膜，所以后续实验选取0.1%SD（不影响活菌生长）处理受伤细菌。
取大肠杆菌O157:H7的单菌落于5mL LB培养基中，37℃过夜培养后，取1mL菌液用PBS连续十倍稀释两个梯度，得到约为106CFU/mL。12000rpm离心10min，用等体积的0.1%的蛋白胨水重悬。将重悬后的菌液置于-70℃中处理10min后，9℃水浴30min，得到受伤的细菌、活菌和死菌的混合物。取上述1mL含有受伤的细菌、活菌和死菌的混合物加入1.5mL的离心管中，向离心管中加入20μL5%(m(g)/v(mL）)SD，37℃以180rpm转速分别孵育0、10、20、30、60和90、120min，采用传统的平板技术的方法对脱氧胆酸盐处理不同时间的细菌进行计数。结果见图2，由图2可以看出，经过脱氧胆酸盐处理受伤细菌20min处理后，受伤细菌不能在平板上生长，失去了生长能力。故后续实验脱氧胆酸盐的处理时间选择20min。实施例2、标准曲线的建立
挑取大肠杆菌O157:H7（英国典型菌种保藏中心）单菌落于5mL的LB培养基中，37℃培养过夜。取1mL菌液于1.5mL离心管中，用PBS连续十倍稀释，通过平板计数得知菌液浓度分别为4.78×108、4.78×107、4.78×106、4.78×105、4.78×104、4.78×103和4.78×102CFU/mL。分别取500μL不同浓度的菌液采用沸水浴法进行基因组DNA的提取。以平板计数得到活菌数的对数为横坐标，以荧光定量PCR的Ct值为纵坐标绘制得到大肠杆菌O157:H7标准曲线：y=-3.27x+41.803,见图3。
实施例3、食品中大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）活菌的定量检测
1）食物样本预处理
称取1g或者1mL的无目的菌的食物样本，加入9mL的PBS磷酸盐缓冲液，碾磨制成匀浆液，加入不同浓度的大肠杆菌O157:H7以保证浓度107-102CFU/mL,800rpm离心5min，去除大的食物残渣，取上清（该过程必须无菌操作）
2）磁珠富集
取980μL步骤1）菌悬液加入到灭菌离心管中，加入偶联有E.coliO157:H7抗体的免疫磁珠0.05mg，磁珠粒径为180nm，室温下在旋转混合仪上以10rpm转速反应45min后，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清，加入到灭菌离心管中备用。最后，添加1mL洗涤液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积缓冲液重悬磁珠。洗涤液为添加有0.02%（v/v）吐温的磷酸盐缓冲液。
抗体的制备参照文献：王燕琴.抗出血性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体的制备与鉴定[D].甘肃农业大学，2007。
偶联有E.coli O157:H7抗体的免疫磁珠的制备方法如下：取10mg磁珠（奥润，无锡）用无菌添加有吐温20的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MEST）（0.01mol/L，0.02%Tween-20，pH5.5）洗涤3遍，磁分离后移除上清。加入用无菌MES缓冲液现配的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)溶液（10mg/mL）各0.5mL，室温下在旋转混合仪上活化1h（15rpm）。磁分离后移除上清，用1mL无菌MES缓冲液（pH5.5）重悬。磁分离后吸出上清，向离心管中添加0.5mL BS（0.005M硼酸盐缓冲液，pH8.5）稀释的单抗，抗体量为50μg/mg磁珠。室温下在旋转混合仪上反应3h以上（15rpm）。磁分离后加入1mL含1%（m/v）氨基葡萄糖的硼酸盐缓冲液（pH8.5）封闭磁珠，室温下在旋转混合仪上反应1h（15rpm）。磁分离后移除上清，用BST(0.005M硼酸盐缓冲液，0.02%Tween-20，pH8.5)洗涤3遍。最后用0.5mL BST（含0.02%叠氮钠、0.5%BSA）重悬磁珠，置于4℃备用
3）脱氧胆酸盐（SD）处理
向步骤2）中重悬的菌液中加入20μL5%SD,使脱氧胆酸盐最终的浓度为0.1%，以转数180rpm室温孵育20min。
4）、叠氮溴化丙锭（PMA）处理
PMA溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成0.5mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。向步骤3）中离心管中加入1μL5mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL；混合均匀后，在室温条件下避光培养5min，利用500W的卤素灯曝光5min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于10000g离心5min，所得沉淀用于DNA的提取。
5）基因组DNA的提取
经步骤4获得的样品在12000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清，并小心吸走残余液体，加入30μL无菌的去离子水100℃煮沸10min，以12000rpm离心5min。取上清作为qPCR反应模板，制备的模板应立即用于检测。PCR的上下游引物分别为
flic上游引物：5’-TTCGCAGCATCACTGGATTC-3’
flic下游引物：5’-CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3’
荧光定量PCR反应体系为20μL：DNA模板2μL，SYBR Premix ExTaqTM10μL，ROX0.4μL，10μM的上下游引物各0.4μL，无菌水补足20μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性30s，紧接着95℃变性5s,62℃退火1min40个循环。荧光定量PCR数据用SDS2.3软件分析数据，将荧光定量PCR结果代入实施例2的标准曲线中，即可定量得到待测食品样本中大肠杆菌O157:H7。
实施例4引物特异性验证
为验证引物的特异性，对表1提供的菌株进行基因组DNA的提取和荧光定量PCR，操作条件见实施例3的步骤5）。菌株的编号和来源及验证结果见表1，从表1中可以看出本发明提供的引物对大肠杆菌Escherichia coli O157:H7具有较高的特异性。
表1供试菌株及检测结果
Figure BDA0000365199280000091
Figure BDA0000365199280000101
Figure BDA0000365199280000111
aNCTC,国家典型菌种保藏中心，英国；
bJX-CDC,江西省疾病预防与控制中心，中国；
cATCC,美国典型菌种保藏中心，美国；
dCMCC,中国药物菌种保藏中心，中国
实施例5本发明的检测方法与传统方法的比较
挑取大肠杆菌O157:H7（英国典型菌种保藏中心）的单菌落于5mL LB培养基中，37℃过夜培养后，取1mL菌液用PBS连续十倍稀释两个梯度，得到约为106CFU/mL。置于63℃水浴0、1、2、4和8min或者-20℃处理24h，以得到不同浓度受伤细菌、活菌和死菌。取980μL不同时间处理得到的菌液进行进行四种不同的处理。其中DNA的提取及qPCR的操作条件见实施例3的步骤5，荧光定量PCR得到的Ct值通过标准曲线（见实施例2）得到大肠杆菌O157:H7的活菌数。
第一种直接提取DNA进行qPCR；
第二种PMA-qPCR法，先加入20μL0.1%的蛋白胨水，再加入1μL5mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL；混合均匀后，在室温条件下避光培养5min，利用500W的卤素灯曝光5min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于10000g离心5min，所得沉淀用于DNA的提取后进行qPCR；
第三种SD-PMA-qPCR法即为本发明提供的检测方法，先加入20μL5%SD,使脱氧胆酸盐最终的浓度为0.1%，以转数180rpm室温孵育20min。再加入1μL5mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL；混合均匀后，在室温条件下避光培养5min，利用500W的卤素灯曝光5min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于10000g离心5min，所得沉淀用于DNA的提取后进行qPCR；
第四种直接进行传统平板计数。实验结果见图4，SD-PMA-qPCR与平板计数方法的结果最接近。验证了方法的准确性。
实施例6SD和PMA处理对检测线的影响
为探讨SD和PMA处理是否对检测线有影响，称取1g或者1mL的无目的菌的食物样本，加入9mL的PBS磷酸盐缓冲液，碾磨制成样本匀浆液，离心去除大的残渣，将过夜培养浓度为108CFU/mL的大肠杆菌O157:H7经过63℃处理2min得到细胞膜受损的细菌，用样本匀浆液连续十倍稀释经过热处理的菌液，以保证样本匀浆中活菌浓度为107-102CFU/mL，样本匀浆中细菌先后经过磁珠富集（实施3步骤2），SD处理（实施例3步骤3）和PMA处理（实施例3步骤4），沸水浴法提取DNA（实施例3步骤5），进行荧光定量PCR（操作条件见实施例3步骤6）。对照组为未经过热处理过夜培养菌液，加入到样本匀浆液中以保证活菌数为107-102CFU/mL，样本匀浆中细菌经过磁珠富集（实施例3步骤2），沸水浴法提取DNA（实施例3步骤5），进行荧光定量PCR（实施例3步骤6）。结果见图5，由图5可知，从加标样品经过磁富集后，经过SD、PMA处理和未经过处理，不会影响检测线，且线性关系良好，R2=0.9916，可以用于实际样本的检测，能定量检测到102CFU/mL的大肠杆菌O157:H7。
序列表
 
<110>  无锡中德伯尔生物技术有限公司
 
<120>  食品中大肠杆菌O157:H7活菌的定量检测方法
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
ttcgcagcat cactggattc                                                 20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
catcgcaaaa gcaactcctg                                                 20
 
 

Claims (9)

1.食品中大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）活菌的定量检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1）取待测食品样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除食物残渣，取上清得菌悬液；
2)取步骤1）的菌悬液加偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，室温下以10 rpm的转速反应45 min后，磁力架分离3min，吸出上清，加入洗涤液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积缓冲液重悬磁珠，得重悬液；
3）向步骤2）的重悬液中加入脱氧胆酸盐使其终浓度为0. 1%~2.5%(m(g)/v(mL）),室温孵育20~120 min；
4）向步骤3）菌液加叠氮溴化丙锭溶液，使叠氮溴化丙锭的终质量浓度为5 μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；
5）标准曲线的建立；
6）取步骤4）中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR，上下游引物分别为
flic上游引物：5’-TTCGCAGCATCACTGGATTC-3’  
flic下游引物：5’-CATCGCAAAAGCAACTCCTG-3’ 
荧光定量PCR数据用SDS 2.3软件分析数据，将荧光定量PCR结果代入步骤5）的标准曲线中，定量检测食品样本中大肠杆菌O157:H7。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述的洗涤液为添加有0.02%（v/v）吐温的磷酸盐缓冲液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述磁珠粒径为180 nm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）所述磁珠的加入量为每1mL的菌液里面加入0.05 mg。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）所述脱氧胆酸盐终浓度优选为0.1%(m(g)/v(mL）),室温孵育时间优选为20 min；
所述脱氧胆酸盐用0.1%(m(g)/v(mL）)的蛋白胨水溶解。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）所述叠氮溴化丙锭溶液配制方法为叠氮溴化丙锭溶解于二甲亚砜中，配制成5 mg/mL的叠氮溴化丙锭溶液。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5）所述标准曲线的建立通过连续十倍稀释过夜培养的大肠杆菌O157:H7得到梯度浓度的菌悬液，沸水浴法提取菌悬液中大肠杆菌O157:H7的DNA，然后进行荧光定量PCR，同时平板计数每个梯度菌悬液的浓度，以平板计数得到活菌数的对数值为横坐标，以荧光定量PCR的Ct值为纵坐标建立大肠杆菌O157:H7标准曲线。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）所述荧光定量PCR反应体系为：DNA模板2 μL，SYBR Premix Ex Taq TM  10 μL，ROX 0.4μL，10 μM的上下游引物各 0.4μL，无菌水补足20 μL，反应条件为：95 ℃预变性30 s，紧接着95 ℃变性5 s,62 ℃退火1 min 40个循环。
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