CN103468797A

CN103468797A - 一种快速准确检测大肠杆菌o157:h7活菌试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103468797A
Application number: CN2013103525632A
Authority: CN
Inventors: 李林; 杨晓慧; 许恒毅; 徐波
Original assignee: WUXI ZODOLABS BIOTECH CO Ltd
Current assignee: WUXI ZODOLABS BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌O157:H7的PCR的检测方法。本发明针对大肠杆菌O157:H7的rfbE基因，设计一对扩增634bp的特异性PCR引物，同时为防止PCR检测时PCR抑制剂存在引起的假阳性结果，在PCR体系中添加了一对扩增16SrRNA保守区域引物。主要采用磁珠富集的方法从实际样本中分离出目的菌。通过叠氮溴化丙锭（PMA）处理分离的大肠杆菌O157:H7以去除死菌的干扰。最后通过PCR扩增和电泳检测确定实际样本中是否受到大肠杆菌O157:H7的污染。本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，操作过程简单，并且不会被食物样品中残留的DNA或死菌的干扰，同时也排除了实际样本中PCR抑制剂而引起的假阳性结果，使得检测结果准确可靠。

Description

一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌的方法。

技术背景

大肠杆菌O157:H7是近30年来才被发现和识别的食源致病菌，按血清型分类属肠出血性大肠杆菌（Entero Hemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）。它以食物传播为主，主要的宿主是牛和鸡等家畜家禽。人类摄入不到10个活菌就有可能引起出血性结肠炎（Hemorrhagiccolitis HC）和溶血性尿毒综合征（Hemolytic uremie syndrom HUS)，患者病死率极高，其对人类的健康构成了严重的威胁。自1982年美国首次爆发大肠杆菌O157:H7引起的感染性腹泻以来，世界各国相继爆发了多起大肠杆菌O157:H7的流行事件。1986年在中国江苏徐州首次报道了大肠杆菌O157:H7的病例，随后在中国十几个省份也发生散发病例。其流行性已经不再是个别国家的问题，而是成为世界重要公共卫生问题之一。

目前检测大肠杆菌O157:H7方法有常规培养法和免疫法等，常规培养法耗时且工作量大；免疫磁珠捕获法由于方法自身的局限性，检测的灵敏度低且造成一定程度的漏检。因此，为了确保食品安全，急需快速、简单、准确的方法来检测食品中的大肠杆菌O157:H7活菌。

rfbE基因是编码大肠杆菌O157:H7的O157抗原基因，本试剂盒针对rfbE基因设计引物特异性强。设计扩增的rfbE基因的片段见SeqNO.1。

发明内容

本发明是目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、检测结果准确可靠、检测快速高效、灵敏度高的大肠杆菌O157:H7试剂盒及快速检测方法。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒，其特征在于其含有rfbE上游引物（5’→3’）：TCCATTTATACGGACATCCAT，见Seq NO.2;

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA见SeqNO.3;

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT见SeqNO.4;

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC见SeqNO.5。

上述试剂盒还含有偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，PBS磷酸盐缓冲液，添加有0.02%吐温的磷酸盐缓冲液，PMA溶液，Taq mix。

一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法包括如下步骤：

（1）取食物样本，加PBS磷酸缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；

（2）取1mL上述菌悬液加入到灭菌离心管中，加入制备好的免疫磁珠0.05mg，室温下以10rpm转速于旋转混合仪上反应45min后，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清，加入到灭菌离心管中备用。最后，添加1mL加有0.02%吐温的磷酸缓冲液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积磷酸缓液重悬磁珠。

（3）向步骤2的重悬液加PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA；PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

（4）PCR反应，PCR反应所用的引物为：

rfbE上游引物（5’→3’）：TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC

体系为20μL，其中DNA模板2μL，2×Taq mix5μL，上下游引各为0.25nmol，无菌水补足20μL。PCR反应条件为：95℃预变性10min,紧接着94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30个循环，最后72℃延伸10min。

（5）PCR反应结束后，取5μLPCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。琼脂糖凝胶用GoldView核酸染色，用GelDoc XR凝胶成像系统成像。如果有475bp的条带，说明PCR反应体系正常，可以进行后续判定；如果没有475bp的条带，说明PCR体系出现错误，需要优化体系重新PCR；在475bp条带存在的条件下，如果有634bp条带，说明食品样本中有大肠杆菌O157:H7，如果没有634bp条带，说明食品样本中没有大肠杆菌O157:H7。

有益效果：

本发明针对大肠杆菌O157:H7的rfbE基因，设计一对扩增634bp的特异性PCR引物，同时为防止PCR检测时PCR抑制剂存在引起的假阳性结果，在PCR体系中添加了一对扩增16S rRNA保守区域引物。主要采用磁珠富集的方法从实际样本中分离出目的菌。通过叠氮溴化丙锭（PMA）处理分离的大肠杆菌O157:H7以去除死菌的干扰。最后通过PCR扩增和电泳检测确定实际样本中是否受到大肠杆菌O157:H7的污染。本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短，操作过程简单，并且不会被食物样品中残留的DNA或死菌的干扰，同时也排除了实际样本中PCR抑制剂而引起的假阳性结果，使得检测结果准确可靠。

具体如下：

1、采用本发明将磁珠富集与PCR技术结合检测大肠杆菌O157:H7时间短，可在4.5个小时内得到结果，灵敏度高。同时本发明克服了一般的分子生物学检测方法无法区分死菌与活菌的缺陷以及PCR抑制剂存在引起假阳性结果，使检测结果真实可靠。

2、通过电泳识别634bp条带和475bp条带实现快速鉴定，方法简单易行。

大肠杆菌O157:H7作为一种主要的食源性致病菌，在公共卫生、食品安全。兽牧兽医和出入境检验检疫中必须的检测指标。随着社会经济的发展和国际贸易量的与日俱增。急需建立一种从田园到餐桌的一种快速、准确、简便的细菌检测方法。本发明将IMS、PMA处理的PCR检测技术更具有重要意义。

附图说明

图1未经过磁珠富集PCR检测线，a在不添加16S rRNA时的检测线，b是添加16S rRNA时的检测线

图2不同浓度的菌液磁珠富集的捕获效率；

图3PMA区分死菌活菌的效率，PMA处理结果；

图4IMS-PMA-PCR在纯培养中的检测线。泳道M DL2000,泳道1-7：2.0×10⁷to2.0×10¹cfu mL^-1，泳道8阴性对照；

图5IMS-PMA-PCR在实际样本中的检测线。泳道M DL2000，泳道1-6：5.0×10⁶to5.0×10¹cfu mL^-1,泳道7阴性对照。

具体实施方案

下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，或按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。

实施例1

一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒，其特征在于

其含有rfbE上游引物（5’→3’）：TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC。

上述试剂盒还含有偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，PBS磷酸盐缓冲液，添加有0.02%吐温的磷酸盐缓冲液，PMA溶液，Taq mix。具体检测方法如下：

1.食物样本预处理

称取1g的食物样本，加入9mL的PBS磷酸盐缓冲液，碾磨制成匀浆液，800prm离心10min，去除大的食物残渣，得上清液（该过程必须无菌操作）。

2．取1mL上述上清液加入到灭菌离心管中，加入制备好的免疫磁珠0.05mg。室温下在转速10rpm于旋转混合仪上反应45min后，将离心管插入磁力架分离3min，用移液器吸出上清液，加入到灭菌离心管中备用。最后，添加1mL加有0.02%吐温的磷酸缓冲液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，加入到灭菌离心管中备用，最后用等体积磷酸缓液重悬磁珠。对照组为不添加磁珠。将上清液、洗涤液和对照组作合适梯度稀释，从各梯度稀释液取100μL凃板于SMAC培养基，三个平行。37℃培养16h后，选择菌落数在10～100范围内的进行计数，计算其捕获效率。捕获率计算公式：捕获率（%）=（对照组中菌落总数－上清液中菌落总数－洗涤液中菌落总数）/对照组中菌落总数×100。结果见图2。

3、PMA处理

PMA溶解于二甲亚砜（DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。向1mL上述重悬液加入1μL5mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为5μg/mL；PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5min，利用500W的卤素灯曝光5min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20cm处，交联后的悬浮液于10000g离心5min，用PBS磷酸盐洗涤两次。PMA处理结果见图3，其中死菌与活菌的混合比例见表1。

表1PMA区分死菌活菌的效率（死菌与活菌的混合比例）

4、基因组DNA的提取

经步骤3获得的样品在10000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清，并小心吸走残余液体，加入30μL无菌的去离子水100℃煮沸10min，以12000g离心10min，取上清作为PCR反应模板，制备的模板应立即用于检测。

4、PCR反应体系以及反应条件

rfbE上游引物（5’→3’）:TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物（5’→3’）：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物（5’→3’）：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物（5’→3’）：CGTTTACGGCGTGGACTAC

体系为20μL,其中DNA模板2μL,2×Taq mix（日本TaKaRa公司）5μL上下游引物为0.25nmol，用无菌水补足20μL.PCR反应条件为：95℃预变性10min,紧接着94℃变性30s,56℃退火30s，72℃延伸1min30个循环，最后72℃延伸10min。

5、PCR反应结束后，取5μLPCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。琼脂糖凝胶用GoldView核酸染色，用GelDoc XR凝胶成像系统成像。其中IMS-PMA-PCR在纯培养中的检测线，见图4。IMS-PMA-PCR在实际样本中的检测线，见图5。

如果有475bp的条带，说明PCR反应体系正常，可以进行后续判定；如果没有475bp的条带，说明PCR体系出现错误，需要优化体系重新PCR；在475bp条带存在的条件下，如果有634bp条带，说明食品样本中有大肠杆菌O157:H7，如果没有634bp条带，说明食品样本中没有大肠杆菌O157:H7。详细检测结果如表2，表1提供的菌株进行引物特异性验证，菌株的编号和来源见表2。

表2供试引物特异性的菌株以及PCR结果

^aJX-CDC,江西省疾病预防与控制中心，中国；

^bNCTC,国家典型菌种保藏中心，英国；

C用于建立方法的菌株

^dCMCC,中国药物菌种保藏中心，中国；

^eATCC,美国典型菌种保藏中心，美国

通过上述检测发现在多种菌株存在下，能特异性检出E.coli O157:H7为阳性，而其他菌株为阴性，证明本发明特异性好。

SEQUENCE LISTING

<110> 无锡中德伯尔生物技术有限公司

<120> 一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒及其检测方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 634

<212> DNA

<213> rfbE基因

<400> 1

tccatttata cggacatcca tgtgatatgg aacaaattgt agaactggcc aaaagtagaa 60

atttgtttgt aattgaagat tgcgctgaag cctttggttc taaatataaa ggtaaatatg 120

tgggaacatt tggagatatt tctactttta gcttttttgg aaataaaact attactacag 180

gtgaaggtgg aatggttgtc acgaatgaca aaacacttta tgaccgttgt ttacatttta 240

aaggccaagg attagctgta cataggcaat attggcatga cgttataggc tacaattata 300

ggatgacaaa tatctgcgct gctataggat tagcccagtt agaacaagct gatgatttta 360

tatcacgaaa acgtgaaatt gctgatattt ataaaaaaaa tatcaacagt cttgtacaag 420

tccacaagga aagtaaagat gtttttcaca cttattggat ggtctcaatt ctaactagga 480

ccgcagagga aagagaggaa ttaaggaatc accttgcaga taaactcatc gaaacaaggc 540

cagtttttta ccctgtccac acgatgccaa tgtactcgga aaaatatcaa aagcacccta 600

tagctgagga tcttggttgg cgtggaatta attt 634

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> rfbE上游引物

<400> 2

tccatttata cggacatcca t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> rfbE下游引物

<400> 3

aaattaattc cacgccaacc a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 16S r RNA上游引物

<400> 4

cctacgggag gcagcagt 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 16S r RNA下游引物

<400> 5

cgtttacggc gtggactac 19

Claims

1.一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒，其特征在于其含有rfbE上游引物：TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物：CGTTTACGGCGTGGACTAC 。

2.根据权利要求1一种快速准确检测大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒，其特征在于还含有偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，PBS磷酸盐缓冲液，添加有0.02% 吐温的磷酸盐缓冲液，PMA溶液，Taq mix。

3.根据权利要求1所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除食物残渣，取上清液于无菌离心管中得到菌悬液；

（2）取制备好的菌悬液加偶联有大肠杆菌O157:H7抗体的磁珠，室温下以10 rpm的转速反应45 min后，吸出上清备用；添加1 mL洗涤液洗涤1遍，磁分离后吸出洗涤液，最后用等体积缓冲液重悬磁珠；

（3）向重悬液加PMA溶液，使PMA的终浓度为5 μg/mL，混匀后室温避光培养，卤素灯曝光，光照交联时样品置于冰上，交联后的悬浮液离心，用缓冲液洗涤两次去除未结合的PMA,最后用30 μL的无菌水重悬，用沸水浴法提取DNA；

（4）取DNA模板，进行PCR反应，PCR反应所用的引物为：

rfbE上游引物：TCCATTTATACGGACATCCAT

rfbE下游引物：AAATTAATTCCACGCCAACCA

16S rRNA上游引物：CCTACGGGAGGCAGCAGT

16S rRNA下游引物：CGTTTACGGCGTGGACTAC

（5）PCR反应结束后，取PCR扩增产物检测是否有大肠杆菌O157:H7存在。

4.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（1）或（2）中所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。

5.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的洗涤液为添加有0.02% 吐温的磷酸盐缓冲液。

6.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述磁珠粒径为180 nm。

7.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述加入磁珠0.05 mg。

8.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（3）所述PMA溶液配制方法为PMA溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成0.5 mg/mL的PMA溶液，-20℃避光保存。

9.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（4）所述PCR反应体系为20 μL；

其中DNA模板2 μL, 2×Taq mix 5 μL，上下游引物 0.25 nmol，无菌水补足20 μL；

PCR反应条件为：95 ℃预变性10 min,紧接着94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30个循环，最后72 ℃延伸10 min。

10.如权利要求3所述的一种快速准确检测食品中大肠杆菌O157:H7活菌试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤（5）取5 μL PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，显色；如果有475 bp的条带，说明PCR反应体系正常，可以进行后续判定；如果没有475 bp的条带，说明PCR体系出现错误，需要优化体系重新PCR；在475 bp条带存在的条件下，如果有634 bp条带，说明食品样本中有大肠杆菌O157:H7，如果没有634 bp条带，说明食品样本中没有大肠杆菌O157:H7。