CN102154488A - 大肠杆菌o157:h7双重pcr快速检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒，选取大肠杆菌O157特异性抗原基因rfbE和编码H7鞭毛基因Flic作为扩增靶基因，同时考虑了不同血清型核苷酸同源性，设计了两对特异性引物，用于PCR反应快速检测大肠杆菌O157:H7。本方法操作简便省时、特异性高、灵敏性好，仅能检测大肠杆菌O157:H7而不受大肠杆菌非H7血清型和其他相关菌影响。基于上述双重PCR快速检测方法研制的试剂盒，适合各种样品的大批量检测，为快速检测大肠杆菌O157:H7提供了新的技术手段。

Description

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O157:H7的检测技术，尤其涉及大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒。

背景技术

大肠杆菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种人畜共患的食源性致病菌，具有广泛流行性和对人类的高致病性，其感染力强(100～200个细菌即可引起感染，而其他致病性大肠杆菌需要百万个细菌以上才能引起发病)，可通过牛、猪、鸡等多种家畜禽宿主动物感染人类并在人类中流行，感染人可引起腹泻、出血性结肠炎，溶血性尿毒综合症及血栓性血小板减少等，严重者可导致死亡。因此，快速准确的检测大肠杆菌O157:H7是控制由其引起的食物中毒或感染暴发与流行的关键。

目前大肠杆菌O157:H7的实验室诊断方法多为选择性培养基-山梨醇麦康凯培养基分离法和抗血清鉴定法，但两者都存在耗时长和假阳性的问题。研究表明，大肠杆菌O157:H7与非H7血清型在山梨醇麦康凯培养基上均为白色半透明菌落，生化特性相似，用选择性培养基无法区分；另外，对大肠杆菌O157:H7与非H7血清型细菌的鞭毛基因(Flic)的序列比对表明，其核苷酸同源性在70％左右，存在抗原交叉，应用H7单因子血清凝集反应不易区分。李丽等人对大肠杆菌O157:H7多重PCR检测进行了研究(李丽.大肠杆菌O157:H7多重PCR检测和溶血素蛋白的表达及其免疫原性分析[D].南京农业大学2009：21-32)，并建立了以O157抗原基因rfbE和H7标志性基因Flic为靶基因的二重PCR检测方法，然而，由于需要提取细菌DNA及扩增片段过长(812bp和609bp)，处理和检测时间较长操作费时；而且，该研究未涵盖大肠杆菌O157非H7血清型，不能排除前述核苷酸同源性导致假阳性的可能，即此方法的特异性存在疑问。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、准确的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒。

为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，通过双重PCR反应后，经电泳、染色、漂洗、紫外鉴定，该方法能同时检出O157和H7基因，其引物序列和扩增序列分别为：

引物rfbE-F序列 5’-TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG-3’

引物rfbE-R序列 5’-CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC-3’

rfbE扩增序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。

引物Flic-F序列 5’-GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC-3’

引物Flic-R序列 5’-ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT-3’

Flic扩增序列为序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。

上述方法包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法；

<2>双重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；

PCR反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL、待检样本3μL及去离子水9.5μL。

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和上下游引物；

B液：含大肠杆菌O157:H7细菌DNA，作为阳性对照，；

C液：去离子水，作为阴性对照。

PCR反应液为每管25μL PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs 1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL，去离子水9.5μL。

该试剂盒含有PCR反应管。

本发明根据大肠杆菌O157:H7全基因组序列，设计了2对可扩增大肠杆菌O157特异性抗原基因rfbE和编码H7鞭毛基因Flic片段的特异性引物，建立了大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法。由于无需对细菌DNA进行提取以及扩增的DNA片段较短(291bp和180bp)，大大地缩短了检测时间，在2h内即可完成大肠杆菌O157:H7的鉴定。此外，以Flic基因为靶目标，对大肠杆菌O157:H7与O157:H30、O157:H9、O157:H25、O157:H19等非H7血清型细菌的Flic基因序列进行同源性比较后，针对Flic(H7)基因的特异性区域设计引物，结果表明非H7血清型大肠杆菌只能扩增出rfbE基因的目的片段，而不能扩增出Flic基因的目的片段，大肠杆菌DH_5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段，只有大肠杆菌O157:H7同时扩增出rfbE和Flic基因2个目的片段，证实了本发明双重PCR检测方法具有较好的特异性，避免了非H7血清型大肠杆菌和其他相关菌产生假阳性的现象。本发明还具有高度的敏感性，最低检测极限是50pg的细菌DNA。基于上述双重PCR快速检测方法研制的试剂盒，适合各种样品的大批量检测，为快速检测大肠杆菌O157:H7提供了新的技术手段。

附图说明

图1是大肠杆菌O157:H7rfbE和Flic基因的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1是大肠杆菌O157:H7。

图2是退火温度优化的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1-5分别对应退火温度54℃、56℃、58℃、60℃和62℃。

图3是双重PCR的特异性试验的PCR电泳图，图中：M是Marker 1，1是大肠杆菌O157:H7，2是大肠杆菌O157:H9，3是大肠杆菌O157:H19，4是大肠杆菌O157:H25，5是大肠杆菌O157:H30，6是大肠杆菌DH_5α，7是猪链球菌2型，8是副猪嗜血杆菌，9是阴性对照。

图4是双重PCR的敏感性试验的PCR电泳图，图中：M是Marker1，1是500ng DNA，2是50ng DNA，3是5ng DNA，4是500pg DNA，5是50pg DNA，6是5pg DNA，7是500fg DNA。

具体实施方式

大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法及试剂盒的研制

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.1.1菌株

大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌O157:H9、大肠杆菌O157:H30、大肠杆菌O157:H25、大肠杆菌O157:H19、大肠杆菌DH_5α、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型由本实验室保存。

1.1.1.2主要仪器和试剂

日本TaKaRa公司PCR仪，美国Alpha Inotech公司凝胶成像系统，美国Thermo公司微量紫外分光光度计。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR试剂、DNA Marker 1购自广东东盛生物科技有限公司；麦康凯培养基购自北京陆桥技术责任有限公司。

1.1.1.3引物设计

根据GenBank收录的大肠杆菌O157:H7全基因组序列(AE005174)，应用引物设计软件DNA STAR和Oligo 6.0选择rfbE(O157)和Flic(H7)基因的保守区作为引物设计区域，设计2对特异性引物分别扩增rfbE(O157)基因和Flic(H7)基因，引物序列为rfbE-F：5’-TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG R-3’(见序列表SEQ.ID.No.1)；rfbE-R：5’-CCTATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC-3’(见序列表SEQ.ID.No.2)和Flic-F：5’-GCG AAGTTA AAC ACC ACG AC-3’(见序列表SEQ.ID.No.4)；Flic-R：5’-ACC CGT ACC AGC AGTAGA TT-3’(见序列表SEQ.ID.No.5)，扩增片段长度分别为291bp(见序列表SEQ.ID.No.3)和180bp(见序列表SEQ.ID.No.6)。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.1.2方法

1.1.2.1细菌DNA模板的制备

1.1.2.1.1直接加入法

挑取麦康凯培养基上的粉红色菌落于加有10μL灭菌水的EP管内，反复吹吸后吸取3μL直接作为模板进行PCR反应。

1.1.2.1.2试剂盒提取法

挑取单个菌落于麦康凯培养基37℃培养24h，生理盐水洗脱细菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒抽提细菌DNA，提取方法按说明书进行。

1.1.2.2基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对抽提的细菌基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物于2％的琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。PCR产物分别与pMD-18T载体过夜连接后转化大肠杆菌DH_5α。用小量质粒提取试剂盒提取转化长出的菌落质粒，阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.1.2.3双重PCR条件和反应体系的优化

对不同退火温度(56～64℃)和PCR反应液各成分在PCR仪上进行PCR扩增，摸索双重PCR的最佳反应条件和反应体系。

1.1.2.4双重PCR方法的特异性和敏感性试验

用优化的双重PCR方法对大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌O157:H9、大肠杆菌O157:H30、大肠杆菌O157:H25、大肠杆菌O157:H19、大肠杆菌DH_5α、副猪嗜血杆菌、猪链球菌2型进行检测，评价双重PCR方法的特异性。

将500ng的细菌DNA进行10倍梯度稀释至500fg，用优化的双重PCR方法分别对其进行检测，评价双重PCR方法的敏感性。

具体操作包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法；

<2>双重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Fl ic-R各1μL、待检样本3μL及去离子水9.5μL。

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

PCR反应结束后，取10μL PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色10min，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

1.1.2.5双重PCR试剂盒的组装

A液：PCR反应液，每管25μL PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs 1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Fl ic-F和Flic-R各1μL，去离子水9.5μL。

B液：含大肠杆菌O157:H7细菌DNA，作为阳性对照；

C液：去离子水，作为阴性对照；

PCR反应管。

1.1.2.6检测试剂盒保存期试验

将检测试剂盒共3批次保存-20℃冰箱中。分别于保存后1、3和6个月，用保存的试剂盒分别对10份大肠杆菌O157:H7阳性样品和阴性样品检测，每批检测试剂盒的保存期都重复检测3次，观察检测结果，同时每批检测试剂盒的每个保存期都进行保存后的敏感性测定。

试剂盒的使用方法如下：

<1>样品的处理和模板的制备：在无菌条件下将样品接种在麦康凯培养基上，37℃培养18h后取麦康凯培养基上的粉红色菌落于加有10μL灭菌水的离心管内，反复吹吸后吸取3μL直接作为模板进行PCR反应；

<2>PCR反应：在加有22μL试剂A液的反应管中，分别加入3μL样品模板、B液和C液，混匀后在PCR仪中进行以下反应：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

PCR反应结束后，经电泳、染色、漂洗，最后在紫外透射仪下观察结果。

2.结果

2.1细菌DNA模板制备的比较

直接加入法和试剂盒提取法均能达到预期的扩增效果。在DNA模板制备过程中试剂盒提取法提取细菌DNA需要0.5～1h，而直接加入法无需DNA提取，直接进行PCR即可，缩短了检测时间。

2.2目的基因的扩增、克隆和测序

采用设计的特异性引物对抽提的大肠杆菌基因组DNA进行PCR扩增，如图1所示，PCR产物电泳后出现与预期扩增长度相同的片段。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和回收后，与pMD-18T载体过夜连接并转化大肠杆菌DH_5α。获得的阳性质粒经PCR和双酶切鉴定后送上海英骏生物技术有限公司测序，测序结果与参考序列完全一致，证实引物可特异性扩增出大肠杆菌O157:H7的rfbE(O157)基因和Flic(H7)基因。

2.3双重PCR条件和反应体系的优化

如图2所示，对PCR退火温度和PCR反应液各成分进行优化，获得了大肠杆菌O157:H7双重PCR最佳反应体系和反应条件。反应条件为：95℃预变性5min；随后进行35个95℃20s，60℃20s，72℃20s的循环；最后72℃延伸3min。

2.4双重PCR方法的特异性和敏感性试验

用建立的双重PCR方法检测大肠杆菌O157:H7、大肠杆菌O157:H9、大肠杆菌O157:H30、大肠杆菌O157:H25、大肠杆菌O157:H19、大肠杆菌DH_5α、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌，如图3所示，结果只有大肠杆菌O157:H7扩增出rfbE和Flic基因的目的片段；O157:H30、大肠杆菌O157:H25、大肠杆菌O157:H19只能扩增出rfbE基因的目的片段，不能扩增出Flic基因的目的片段；大肠杆菌DH_5α、猪链球菌2型和副猪嗜血杆菌没有扩增出任何目的片段，表明建立的方法特异性强，只能扩增大肠杆菌O157:H7。

用优化的双重PCR方法分别对500ng～500fg的细菌DNA进行检测，如图4所示，电泳结果表明方法最低检测极限是50pg的细菌DNA。

2.5检测试剂盒保存期试验

配制好的5批检测试剂盒在-20℃条件下保存，每3个月取出对样品重复进行3次检测，结果5批检测试剂盒在保存1、3、6、9和12个月后，其敏感性都没有发生改变，均能检测到50pg的大肠杆菌O157:H7DNA模板，对10份阳性样品的检测均为阳性，对10份阴性样品的检测均为阴性，这表明试剂盒在-20℃条件下保存12个月仍具有良好的稳定性和重复性。

本研究利用PCR可以在基因水平上直接进行检测的优点，以rfbE基因和Flic基因为靶目标，针对基因特异性区域设计引物进行大肠杆菌O157:H7的PCR鉴定。结果表明，本检测方法及试剂盒仅对大肠杆菌O157:H7呈阳性，不能检出大肠杆菌非H7血清型和其他相关菌，具有较高的特异性；同时，操作省时简便，敏感性很好，最低可检测出50pg的细菌DNA。

Claims (6)

1.一种大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，通过双重PCR反应后，经电泳、染色、漂洗、紫外鉴定，其特征在于该方法能同时检出O157和H7基因，其引物序列和扩增序列分别为：

引物rfbE-F序列 5’-TGT CCA TTT ATA CGG ACA TCC ATG-3’

引物rfbE-R序列 5’-CCT ATA ACG TCA TGC CAA ATT GCC-3’

rfbE扩增序列为序列表SEQ.ID.No.3的碱基序列。

引物Flic-F序列 5’-GCG AAG TTA AAC ACC ACG AC-3’

引物Flic-R序列 5’-ACC CGT ACC AGC AGT AGA TT-3’

Flic扩增序列为序列表SEQ.ID.No.6的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

<1>制备DNA样本：采用直接加入法；

<2>双重PCR反应：取步骤<1>所得DNA样本作为模板进行PCR扩增，并同时分别以标准品DNA和去离子水为阳性对照样本和阴性对照样本进行PCR扩增；

PCR反应结束后，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，然后EB染色，漂洗，在紫外透射仪下观察结果。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法，其特征在于所述PCR反应的反应体系和扩增程序分别为：

反应体系：PCR混合液25μL，其中10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL、待检样本3μL及去离子水9.5μL。

扩增程序：95℃5min；随后进行35个循环，每个循环包括95℃20s，60℃20s，72℃20s；最后72℃3min，于4℃停止反应。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：

A液：PCR反应液，含10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和上下游引物；

B液：含大肠杆菌O157:H7细菌DNA，作为阳性对照，；

C液：去离子水，作为阴性对照。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于所述PCR反应液为每管25μL PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2.5μL、25mM MgCl₂4μL、dNTPs 1μL、引物rfbE-F和rfbE-R各1.5μL、引物Flic-F和Flic-R各1μL，去离子水9.5μL。

6.根据权利要求4或5所述的大肠杆菌O157:H7双重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有PCR反应管。

Images