CN106011281A - 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法 - Google Patents

肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106011281A
CN106011281A CN201610579365.3A CN201610579365A CN106011281A CN 106011281 A CN106011281 A CN 106011281A CN 201610579365 A CN201610579365 A CN 201610579365A CN 106011281 A CN106011281 A CN 106011281A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sfb
flagellin
intestinal
flic3
mflic3
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610579365.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106011281B (zh
Inventor
陈华海
尹业师
王欣
项春生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN201610579365.3A priority Critical patent/CN106011281B/zh
Publication of CN106011281A publication Critical patent/CN106011281A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106011281B publication Critical patent/CN106011281B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一套检测小鼠肠道分节丝状菌SFB鞭毛蛋白的方法与应用，包括PCR方法、蛋白质变性电泳与免疫印迹方法(SDS‑PAGE‑Western blotting)、细菌原位杂交结合免疫组化方法(FISH+IHC)。所述PCR方法为，设计合成了一对能特异性扩增SFB鞭毛蛋白Flic3基因的引物，使用该引物对样品DNA进行PCR扩增后，可以在凝胶电泳后检测到与Flic3基因片段大小一致的DNA条带。所述蛋白质变性电泳与免疫印迹方法为，成功制备了兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白的多克隆抗体，并可以使用该蛋白对样品中是否存在SFB Flic3鞭毛蛋白进行检测。所述细菌原位杂交结合免疫组化方法为使用SFB16S rRNA基因特异常性探针和兔抗SFB Flic3鞭毛蛋白多克隆抗体检测SFB鞭毛蛋白的表达情况、SFB细菌的形态及SFB与肠上皮的相互作用情况。本发明所涉及的检测方法具有快速、直观和表象的优点。

Description

肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法
(一)技术领域
本发明涉及一种鞭毛蛋白的检测，特别设计一种PCR方法检测肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的方法。
(二)背景技术
肠道分节丝状菌(SFB)是一种革兰氏阳性菌，广泛定殖于包括人体在内的脊椎和非脊椎动物肠道中。SFB定殖对宿主的免疫系统意义非常重大。通过小鼠动物实验得知，SFB能刺激宿主sIgA的释放，调节T细胞的分化与平衡，促进免疫系统的成熟等。同时，SFB与宿主自身免疫疾病的发生发展相关。但到目前为止，对SFB如何与宿主细胞相互作用还知之甚少。
细菌鞭毛基因是影响细菌定殖和宿主免疫调控反应的重要功能基因。很多肠道细菌，如沙门氏菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌均具有表达分泌鞭毛蛋白的能力。当鞭毛蛋白粘附到肠上皮基底部后可以启动天然免疫反应和鞭毛蛋白介导的促炎反应。同时，也有研究表明肠道细菌编码的鞭毛蛋白具有调节宿主体内CD4T细胞分化的功能。鉴于细菌鞭毛蛋白的重要生理功能，推测SFB鞭毛蛋白可能与其特异性定殖和免疫调控功能相关。SFB全基因组测序分析也发现，SFB基因组编码46个鞭毛和趋化相关蛋白，具有一套完整的生物合成鞭毛蛋白的基因。比较基因组学分析表明，虽然与SFB分类相近的大部分梭菌也编码鞭毛蛋白，但只有SFB鞭毛蛋白具有被宿主TLR5受体识别的位点。体外实验也表明，SFB鞭毛蛋白Flic2、Flic3和Flic4确实能与TLR5受体相互作用。因此有必要对SFB鞭毛蛋白与宿主的相互作用及其生理功能进行进一步的研究。但到目前为止，电镜观察并没有发现到SFB鞭毛蛋白的存在，所以建立SFB鞭毛蛋白的检测方法将为进一步SFB的定殖及SFB对宿主免疫调控机制的研究奠定基础。
(三)发明内容
到目前为止，电镜观察并没有发现SFB细菌外膜有鞭毛存在。本发明目的是使用Western blotting、质谱鉴定和细菌原位杂交结合荧光免疫组化的方法检测小鼠肠道内SFB鞭毛蛋白的表达情况。
本发明采用的技术方案是：
第一，本发明提供一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，所述方法为：提取待测肠道内容物DNA为模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物长度与mflic3基因长度相同(1100-1300bp，优选1200bp)，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述mflic3基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
SFB FliC3-F:5′-ATG ATA ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3′，
SFB FliC3-R:5′-TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-3′。
进一步，所述PCR扩增体系为25μL：2.5μL 2.5mmol dNTP，2.5μL 10×EX Taqbuffer，10μmol上、下游引物各1μL，0.3μL 5U/μL EX Taq polymerase和100ng模板，补水至25μL。
进一步，所述PCR扩增程序为：94℃45s 1个循环；94℃30s，50℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min，1个循环。
第二，本发明还提供一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，所述方法将待测肠道内容物中肠道菌群蛋白以兔抗mflic3基因编码蛋白多克隆抗体为二抗进行SDS-PAGE和Western blotting检测，若肠道菌群蛋白大小与mflic3基因编码蛋白大小(约50kD)一致，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述兔抗mflic3基因编码蛋白多克隆抗体以mflic3基因编码蛋白为抗原免疫兔制备获得，所述mflic3基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述SDS-PAGE获得的胶内蛋白经过胰酶酶切法提取肽段进行质谱鉴定，若含有SFB鞭毛蛋白Flic3特异性肽段，则待测肠道含有SFB鞭毛蛋白且表达；所述SFB鞭毛蛋白Flic3特异性肽段氨基酸序列为下列之一：
(1)ELGLGGVNVATTDDAK；(2)TDLENVNTLGEGTFK；
(3)LEHTIASTDnTAENLQAAESR；(4)ITNDTEFNGSKVLNGDKSGEK；
(5)TDLENVNTLGEGTFK；(6)ELGLGGVNISTAEDAK；
(7)LEHTIASTDNTAENLQAAESR；(8)ELGLGGVSVSTAEDSK；
(9)QINFTIENTAQQK。
本发明提供一对扩增SFB鞭毛蛋白编码基因flic3的PCR引物，并通过克隆文库测序和DNA序列同源性比较分析验证了该引物的特异性。所述PCR引物设计方法如下：从NCBI数据库中下载已发表的SFB鞭毛蛋白Flic3基因全长序列，利用oligo 6软件设计扩增Flic3基因全长的PCR引物，然后将设计好的引物序列发送给上海生物工程有限公司进行引物合成。合成好的引物用无菌水稀释到终浓度10pmol/L。使用QIAGEN公司的粪便细菌基因组DNA提取试剂盒抽提小鼠回肠和肓肠内容物细菌基因组DNA。使用美国Applied Biosystems公司的PCR仪进行PCR扩增。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。将PCR产物凝胶电泳后与预期目的片段大小一致的DNA条带，使用OMEGA胶回收试剂盒进行胶回收。使用TaKaRa公司的PMD18-T载体试剂盒，将胶回收后的PCR产物连接到PMD18-T载体上，转化到TaKaRa公司的DH5α化学转化感受态细胞。将转化后的产物涂布到含有羟苄青霉素(终浓度50μg/ml)和X-gal(终浓度10μg/ml)的LB平板上。平板倒置放入37度培养箱中培养18小时后，用高压灭菌过的牙签将白色单菌落挑选接种到含有5ml LB液体培养基和终浓度50μg/ml羟苄青霉素的LB液体培养基试管中。试管放入37度细菌培养摇床上，200转每分钟振荡培养过液后，将菌液送上海生物工程有限公司进行双向测序。
LB平板培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，琼脂12g/L，溶剂为水，pH值自然。
LB液体培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH值自然。
将测序所获得的基因序列与NCBI已发表的flic3基因序列进行同源性比对。同时在NCBI数据中使用BLAST对所得序列进行初步鉴定，测序所得序列为mflic3基因。
将测序获得的mflic3基因序列从pMD18-T载体亚克隆到原核表达载体PET-28a上。然后将PET-28a-mflic3质粒转化到TaKaRa公司的BL21(DE3)大肠杆菌中。使用IPTG诱导SFB鞭毛蛋白在大肠杆菌中的大量表达。然后使用HIS*BINDPURIFICATION KIT(millipore,70239)纯化SFB鞭毛蛋白(即mflic3基因编码蛋白)。使用纯化的SFB鞭毛蛋白免疫兔子，获得兔抗SFB鞭毛蛋白的多克隆抗体。使用兔抗SFB鞭毛蛋白的多克隆抗体为二抗对肠道菌群蛋白中SFB鞭毛蛋白的表达情况进行检测，进一步验证PCR检测结果。同时对SFB鞭毛蛋白在SDS-PAGE胶上相应区域进行切胶后酶消化与蛋白质谱鉴定，从分子水平上进一步鉴定PCR扩增产物是否为SFB鞭毛蛋白。
第三，本发明使用细菌原位杂交和荧光免疫组化的方法观察小鼠回肠和肓肠样品中SFB鞭毛蛋白的表达。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明方法可以通过特异引物PCR扩增的方法快速检测样品中是否存在编码SFB鞭毛蛋白Flic3的基因；可以通过werstern blotting检测SFB鞭毛蛋白Flic3在肠腔中是否有表达；通过细菌原位杂交和荧光免疫组化可以清楚的看到SFB鞭毛蛋白的表达情况、SFB细菌的形态及SFB与肠上皮的相互作用情况。
(四)附图说明
图1是SFB16S rRNA基因特异引物PCR扩增后检测小鼠回肠内容物中SFB存在情况的电泳图。泳道1为DNA marker，泳道2-7分别为6只小鼠肠道样品的PCR扩增结果，泳道8为PCR阴性对照。
图2是SFB鞭毛蛋白基因flic3特异引物PCR扩增后检测小鼠回肠内容物中SFB存在情况的电泳图。泳道1为DNA marker，泳道2-7分别为6只小鼠肠道样品的PCR扩增结果，泳道8为PCR阴性对照。
图3是纯化的SFB鞭毛蛋白的SDS-PAGE和Wester blotting检测图。A为SDS-PAGE图，泳道1为蛋白marker，泳道2-3分别为纯化的Flic3鞭毛蛋白。B为Wester blotting图，泳道1为蛋白marker，泳道2为纯化的Flic3鞭毛蛋白。
图4是蛋白印迹检测SFB鞭毛蛋白存在情况图。泳道1为蛋白marker，泳道2为纯化的Flic3鞭毛蛋白样品，泳道3为肓肠内容物提取的蛋白样品，泳道5为回肠粘膜刮取物提取的蛋白样品。
图5是细菌原位杂交结合免疫组化检测小鼠回肠SFB鞭毛蛋白的表达情况。A-D为普通荧光显微镜下观察到的结果，E-H为扫描电镜下观察到的结果。A和E为DAPI染色的结果；B和F为SFB特异性控针杂交后的结果；C和G为SFB鞭毛蛋白Flic3抗体杂交后的结果；D为B图和C图叠加后的结果；H为F图和G图叠加后的结果。
图6是细菌原位杂交结合免疫组化检测小鼠肓肠SFB鞭毛蛋白的表达情况。A-D为普通荧光显微镜下观察到的结果。A为DAPI染色的结果；B为SFB特异性控针杂交后的结果；C为SFB鞭毛蛋白Flic3抗体杂交后的结果；D为B图和C图叠加后的结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：小鼠SFB鞭毛蛋白Flic3PCR扩增引物的设计与检测。
1、小鼠肠道样品细菌基因组DNA提取与PCR检测
(1)肠道样品细菌基因组DNA提取：6只8周龄雄性ICR小鼠购自上海史莱克动物公司，并喂养在浙江大学实验动物中心。小鼠断颈处死后进行腹部解剖，分别收集回肠末端(约6-10cm长)内容物和盲肠内容物。称取0.2克肠道内容物样品，使用PBS缓冲液(使用无菌水将生工购买的20×PBS稀释成1×PBS缓冲液)进行重悬，5000转每分钟离心5分钟，弃掉上清。然后将得到的细菌沉淀使用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit，QIAGEN，51504)提取肠道样品中的细菌基因组DNA。
(2)SFB 16s rRNA基因和flic3鞭毛基因的PCR扩增：所用PCR引物均由上海生物工程有限公司合成，然后用无菌水稀释到终浓度10μmol/L。
通过文献报道的扩增SFB 16s rRNA基因的PCR特异引物(779F：5′-TGT GGGTTG TGA ATA ACA AT-3′和1008R：5′-GCG GGC TTC CCT CAT TAC AAG G-3′)扩增SFB特异片段，以检测出小鼠肠道样品中SFB阳性的实验样品。以阳性小鼠肠道内容物细菌基因组DNA为模板，以779F和1008R为引物进行PCR扩增，反应产物通过2％琼脂糖(SunShineBio,A0009-100)凝胶电泳，结果见图1。
在NCBI数据库中获得编码鞭毛蛋白Flic3基因全长序列(SEQ ID NO.3所示SFB-mouse-Japan_Flic3)，利用oligo 6软件设计特异性扩增Flic3的PCR引物。PCR上游引物为SFB FliC3-F:5′-ATG ATA ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3′，下游引物为SFB FliC3-R:5′-TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-3′。以小鼠细菌基因组DNA为模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R为引物进行PCR扩增，反应产物通过1％琼脂糖(SunShineBio,A0009-100)凝胶电泳，结果见图2。
PCR检测为25μL反应体系，具体组成为2.5μL dNTP(2.5mmol)、2.5μL 10×EXTaq buffer、上下游引物(10μmol)各1μL、0.3μL EX Taq polymerase(TaKaRa，5U/μL)和100ng DNA模版，补水至25μL。
PCR反应程序为94℃45s 1个循环；94℃30s，50℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min，1个循环。PCR仪为美国Applied Biosystems产品。
从图1可以看到SFB 16s rRNA基因PCR检测结果表明，所购买的6只小鼠肠道样品中均存在SFB菌。图2结果表明，从这6只小鼠中均能检测到SFB鞭毛蛋白flic3基因。
2、小鼠SFB鞭毛蛋白Flic3PCR扩增引物的特异性检测
(1)小鼠SFB鞭毛蛋白Flic3PCR产物胶回收：同步骤1，选取3只小鼠的回肠和肓肠内容物样品，提取DNA模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R为引物，按以上PCR体系和程序对每个样品进行PCR扩增，然后将电泳结果中与目的片段大小(约1200bp，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)一致的条带使用OMEGA胶回收试剂盒进行PCR产物切胶纯化回收。
(2)PCR扩增产物连接和转化：通过pMDTM 18-T Vector Cloning Kit(Takara,6011)将步骤(1)纯化后的PCR产物与克隆载体PMD18-T连接，然后转化到TaKaRa公司购买的DH5α化学转化感受态细胞。将构建的克隆文库涂布到添加氨苄青霉素(终浓度50μg/ml)和X-Gal(终浓度10μg/ml)的LB平板上。37度培养箱培养18小时后，从平板上随机挑选10个以上的白色菌落到含5ml添加终浓度50μg/ml羟苄青霉素的LB液体培养基的试管中，37度进行扩大培养，然后将菌液送上海生物工程有限公司使用M13F和M13R引物进行双向测序，获得66条SFB鞭毛蛋白flic3基因序列。
LB平板培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，琼脂12g/L，溶剂为水，pH值自然。
LB液体培养基终浓度组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，溶剂为水，pH值自然。
(3)SFB鞭毛蛋白flic3基因同源性比对分析：将上海生物工程有限公司测得的SFB鞭毛蛋白flic3基因使用DNAStar软件包中的MegAlign进行同源性比对和分析。结果如表1所示，测序所得的66条SFB鞭毛蛋白flic3基因与NCBI数据库中已发表的SFB-mouse-Japan Flic3基因均具有较高的同源性。将flic3基因编码的氨基酸序列进行同源性比对，然后将序列相似性达到100％的氨基酸序列只保留一条，共获得具有同源性差异的氨基酸序列36条，其中重复性最高的SFB鞭毛蛋白mFlic3(氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示)，以该蛋白作为肠道内容物中SFB鞭毛蛋白检测的判定依据。
表1 SFB鞭毛蛋白flic3基因同源性比对分析
实施例2：蛋白质变性电泳和免疫印迹检测小鼠SFB鞭毛蛋白
(1)小鼠SFB鞭毛蛋白的体外表达与纯化：从实施例1测序获得的66条序列中，选择重复性最高的SFB鞭毛蛋白mFlic3(氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)，通过PCR扩增的方法给目的基因5’端和3’端分别加上BamH I和Not I酶切位点；然后利用双酶切后连接的方法使用Epcentre的快速连接试剂盒将SFB鞭毛蛋白编码基因连接到表达载体PET-28a相应的蛋白编码框内。然后将构建好的质粒PET28a-mflic3转化到BL21(CD3)感受态细胞中。1L的LB培养基中加入终浓度50μg/ml的卡那霉素(购自上海生物工程有限公司)，37度摇床中，200rpm振荡培养，当细菌OD600达到0.6左右时添加1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)，16度摇床中，200rpm振荡培养过夜。8000转每分钟离心5分钟，收集细菌沉淀利用Master Mix(Millipore,71456)提取蛋白，然后使用HIS*BINDPURIFICATION KIT(millipore,70239)纯化重组的mFlic3蛋白，获得mFlic3蛋白(氨基酸序列SEQ ID NO.1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2)。
(2)兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗体的制备：
a)免疫前采血约5ml
第1天第一次免疫：每只兔子免疫200μg纯化获得的mFlic3蛋白，使用完全弗氏佐剂；
第15天第二次免疫：免疫剂量和免疫方法同第1次免疫；
第29天第三次免疫：每只兔子免疫100μg纯化的mFlic3蛋白，使用不完全弗氏佐剂；
第35天第1次采血15-30ml，ELISA检测；
第42天第2次采血15-30ml，ELISA检测；
第43天第四次免疫：免疫剂量和免疫方法同第3次免疫；
第49天第3次采血15-30ml，ELISA检测；
第51天ELISA转阳后收集30-50ml阳性血，即兔抗mFlic3血清，安排纯化。
b)血清ELISA检测
1)将纯化的mFlic3蛋白分别按10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.312μg/ml浓度溶解于包被液中。包被液：50mM Na2CO3(pH9.6)，20mM Tris-HCl(pH8.5)；
2)在96孔板中分别加入步骤1)mFlic3蛋白和PBS缓冲液各100μL，4℃过夜；
3)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；洗涤液为PBST或纯水；
4)每孔加200μL封闭液，37℃孵育1小时；封闭液：一般封闭用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶等；
5)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
6)每孔加100μL步骤a)制作的兔抗mFlic3血清，37℃孵育1小时；
7)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗3次；
8)每孔加100μL羊抗兔免疫球蛋白G二抗，37℃孵育1小时；
9)倒空液体并拍干残留液体，洗涤液冲洗5次；
10)拍干孔中残留液体，每孔加100μL化学发光显色液，37℃避光显色10min；
11)每孔加50μL 2M H2SO4终止显色，并立即读取450nm OD值。
血清ELISA检测均转阳(1:4000，OD值>1.0)，安排Protein A亲和纯化并进行抗体ELISA鉴定得到兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗体(即mSFB-FliC3抗体)。
(3)SDS-PAGE联合Western-blotting检测纯化蛋白的质量
SDS-PAGE：将30μL步骤(1)制备好的蛋白样品与10μL LDS样品缓冲液(NP0007，InvitrogenTM)充分混合，70度水浴10分钟。之后12000转每分钟离心15分钟，取上清30μL加入10％Bis-Tris凝胶(NP0315BOX，InvitrogenTM)的泳道中，电泳液为MES(NP0002，InvitrogenTM)，在电泳系统(NW2000，Life technologies)中电泳，电泳电压为200伏，时间为35分钟。待蛋白电泳结束，将凝胶小心取出放在去离子水中漂洗一下，再将凝胶在新的去离子水中煮开1分钟，之后在60转每分钟的摇床上振荡5分钟；再将凝胶置于快速考马斯亮蓝染色液(P50116，海利克思)中煮开，之后在摇床上以60转每分钟的速度染色5分钟；倒掉染色液将凝胶在去离子水中煮开1分钟，并在摇床上漂洗，10分钟左右可见凝胶上清晰的蛋白条带(如图3中A所示)。
Western-Blotting：待SDS-PAGE凝胶电泳结束后，将其小心取出进行电转膜，所使用的电转膜为孔径0.45μm的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，电转时恒定电流200毫安，电转时间50分钟。电转结束后将转印了蛋白膜用WesternTM Standard kit(Rabbit)试剂盒进行抗体标记，简要步骤如下：
1)在20μL的WB-1溶液中加入2μg的mSFB-FliC3抗体并充分混匀，室温放置40分钟以上备用；
2)电转膜上加入10ml ONE-HOUR预处理液并在摇床上孵育5分钟；
3)倒掉预处理液，用1×ONE-HOUR洗液快速对转印膜漂洗两次；
4)将步骤1)中已经孵育好的一抗加入到10ml含兔二抗的WB-2溶液中混匀，与转印膜在摇床上共孵育40分钟；
5)将抗体孵育好的转印膜用PBS洗液漂洗三遍，每次10分钟；
6)使用化学发光试剂盒Immun-StarTM HRP(1705060，Bio-Rad)进行化学发光，并使用发光成像仪(6200，Tanon)检测，结果见图3中B所示。
(4)肠道菌群的富集和蛋白提取
将8-10周ICR雄性小鼠断颈处死，解剖腹部，分别收集回肠末端(约6-10cm长)内容物，同时刮取黏膜。50ml 1×PBS重悬，冰上静置5分钟，收集上清。在4℃环境下，8000转每分钟离心10分钟。收集沉淀，加入细菌裂解液MasterMix(Millipore,71456)和含EDTA的蛋白酶抑制剂(Merck，C500027-0001)，冰上裂解，并超声300w，10s/10s，5分钟。4℃，12000转每分钟离心15分钟，收集上清，获得肠道菌群蛋白。
(5)SDS-PAGE和Western blotting检测肠道Flic3蛋白的表达
按照以上SDS-PAGE和western blotting的操作方法对肠道菌群蛋白使用步骤(2)制备的兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗体做为二抗进行检测。结果如图4所示，从回肠样品和肓肠样品中均检测到了与SFB鞭毛蛋白mFlic3大小一致的蛋白。
(6)蛋白胶内酶切和质谱鉴定
步骤(5)SDS-PAGE胶内蛋白经过胰酶酶切法提取肽段，通过Mass Spectrometer(LTQ Orbitrap Elite，Thermo Fisher)进行肽段识别。SEQUEST HT搜索引擎对LC/MS/MS所得的原始文件进行搜库比对，参考数据库为uniprot-proteome-mouse数据库。通过蛋白条带切胶与酶消化后质谱分析，鉴定到了SFB鞭毛蛋白特异性的肽段。
表2 肠道样品中鉴定到的SFB Flic3特异的蛋白肽段
实施例3：细菌原位杂交结合免疫组化检测SFB鞭毛蛋白
收集小鼠回肠末端和盲肠内容物，向其中加30ml 1×PBS进行重悬，600转每分钟离心5分钟，收集上清，再将收集的上清，8000转每分钟离心5分钟，弃上清，收集沉淀(菌体)。涡旋将沉淀离散，后加入2ml 4％多聚甲醛水溶液，室温(25℃)固定1h，4℃冰箱固定16-24h。菌液用水稀释500倍后，取500μL稀释液滴在防脱片载玻片上，37℃烘干；用PBS洗3遍，每遍3min。
1)制作湿盒：用5×SSC(35ml)+甲酰胺(35ml)置于湿盒内。
2)30％H2O2 1份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。DEPC水洗3次，每次1min；
3)载玻片置于湿盒内，用0.2mol/L盐酸水溶液滴于组织上，常温15min，用DEPC水洗2次，每次1min(盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景)；
4)蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。
5)用0.2％或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min(现用现配)，终止蛋白酶K。
6)PBS洗两次，每次一分钟。
7)用4％PFA多聚甲醛固定组织10min。
8)PBS洗三次，每次1min。
9)用乙酸酐溶液pH＝8.0(乙酰化作用，降低背景)室温洗5min，2次(乙酸酐溶液配制：每50ml三乙醇胺溶液中加入126μL乙酸酐，现用现配，按比例配制，用多少配多少)。
10)用PBS洗5次，每次1min。
11)用5×SSC PH 7.5洗两次，每次1min。
12)切片放置湿盒内，用预杂交液覆盖组织，65℃预杂交1h。
13)500ng/ml Cy3-labeled pube探针覆盖切片，在杂交仪内65℃黑暗反应48h。
14)用2×SSC PH＝7.5，室温洗1次，1min。
15)用甲酰胺加4×SSC PH＝4.5 1:1混合液在65℃洗三次，每次20min。
16)用PBS洗5次，每次1min，室温。
17)将切片置于湿盒内，用封闭液覆盖切片，室温反应至少30min。
18)滴加兔来源的一抗抗体(1:200)，37℃60min反应，PBS洗3遍，每遍5min。
19)滴加FITC goat anti-rabbit IgG(H+L)(1:500)，避光37℃30min反应，PBS洗3遍，每遍5min。
20)DAPI染核5min，PBS洗3遍，每遍5min。
21)滴加防淬灭剂，盖盖玻片。指甲油封片，荧光显微镜观察。
如图5和图6所示，我们在回肠和肓肠内容物样品中观察到了SFB鞭毛蛋白Flic3的存在。
总之，本发明根据NCBI数据库中已发表的小鼠SFB鞭毛蛋白Flic3基因序列，设计合成了扩增SFB鞭毛蛋白Flic3基因的PCR引物，PCR检测结果发现其检测准确率与文献报道的SFB 16S rRNA基因特异引物一致。克隆文库测序发现，获得的66条序列均为SFB鞭毛蛋白Flic3基因同源序列，与已发表的SFB-mouse-Japan Flic3同源性在84.4％-97.5％。使用兔抗SFB鞭毛蛋白多克隆抗体，Western blotting检测到了与鞭毛蛋白大小一致的蛋白条带，同时通过蛋白条带切胶与酶消化后质谱分析，鉴定到了SFB鞭毛蛋白特异性的肽段。结合细菌原位杂交和免疫组化的方法从小肠和肓肠样品中检测到了SFB鞭毛蛋白的存在。

Claims (5)

1.一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述方法为：提取待测肠道内容物DNA为模板，以SFB FliC3-F和SFB FliC3-R为引物进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增产物长度与mflic3基因长度相同，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述mflic3基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
SFB FliC3-F:5′-ATG ATA ATT AAY CAC AAT ATG AAT G-3′，
SFB FliC3-R:5′-TCT YAA KAT WGA AAG WAC TTG TTG T-3′。
2.如权利要求1所述肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述PCR扩增体系为25μL：2.5μL 2.5mmol dNTP，2.5μL 10×EX Taq buffer，10μmol上、下游引物各1μL，0.3μL 5U/μL EX Taq polymerase和100ng模版，补水至25μL。
3.如权利要求1所述肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述PCR扩增程序为94℃45s 1个循环；94℃30s，50℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min，1个循环。
4.一种肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法，其特征在于所述方法是将待测肠道内容物中肠道菌群蛋白以兔抗mflic3基因编码蛋白多克隆抗体为二抗进行SDS-PAGE和Western blotting检测，若肠道菌群蛋白大小与mflic3基因编码蛋白大小相同，则待测肠道含有肠道分节丝状菌鞭毛蛋白；所述兔抗mflic3基因编码蛋白多克隆抗体以mflic3基因编码蛋白为抗原免疫兔制备获得，所述mflic3基因编码蛋白的氨基酸酸序列为SEQ IDNO.1所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于SDS-PAGE获得的胶内蛋白经过胰酶酶切法提取肽段进行质谱鉴定，若含有SFB鞭毛蛋白Flic3特异性肽段，则待测肠道含有SFB鞭毛蛋白且表达；所述SFB鞭毛蛋白Flic3特异性肽段氨基酸序列为下列之一：
(1)ELGLGGVNVATTDDAK；(2)TDLENVNTLGEGTFK；
(3)LEHTIASTDnTAENLQAAESR；(4)ITNDTEFNGSKVLNGDKSGEK；
(5)TDLENVNTLGEGTFK；(6)ELGLGGVNISTAEDAK；
(7)LEHTIASTDNTAENLQAAESR；(8)ELGLGGVSVSTAEDSK；
(9)QINFTIENTAQQK。
CN201610579365.3A 2016-07-19 2016-07-19 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法 Expired - Fee Related CN106011281B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610579365.3A CN106011281B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610579365.3A CN106011281B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106011281A true CN106011281A (zh) 2016-10-12
CN106011281B CN106011281B (zh) 2019-04-23

Family

ID=57117121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610579365.3A Expired - Fee Related CN106011281B (zh) 2016-07-19 2016-07-19 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011281B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109134649A (zh) * 2018-07-11 2019-01-04 中国医学科学院医学生物学研究所 疏螺旋体鞭毛蛋白FlaB抗体的获取方式及应用
CN112867785A (zh) * 2018-08-03 2021-05-28 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 通过抗体介导的特定肠道细菌的中和作用治疗免疫性疾病

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154488A (zh) * 2011-03-01 2011-08-17 广西壮族自治区兽医研究所 大肠杆菌o157:h7双重pcr快速检测方法及试剂盒
CN102260743A (zh) * 2011-07-13 2011-11-30 浙江省疾病预防控制中心 肠出血性大肠杆菌o104:h4多重荧光pcr检测试剂盒及方法
WO2015075688A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to chemotherapy, and use of microbial modulators (pre-, pro- or synbiotics) for improving the efficacy of a cancer treatment
CN105483266A (zh) * 2016-01-15 2016-04-13 南开大学 检测大肠杆菌h血清型中3种血清型的基因液相芯片及检测方法
WO2016103217A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Institut Pasteur Method of culturing segmented filamentous bacteria in vitro

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154488A (zh) * 2011-03-01 2011-08-17 广西壮族自治区兽医研究所 大肠杆菌o157:h7双重pcr快速检测方法及试剂盒
CN102260743A (zh) * 2011-07-13 2011-11-30 浙江省疾病预防控制中心 肠出血性大肠杆菌o104:h4多重荧光pcr检测试剂盒及方法
WO2015075688A1 (en) * 2013-11-21 2015-05-28 Institut Gustave Roussy Microbiota composition, as a marker of responsiveness to chemotherapy, and use of microbial modulators (pre-, pro- or synbiotics) for improving the efficacy of a cancer treatment
WO2016103217A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Institut Pasteur Method of culturing segmented filamentous bacteria in vitro
CN105483266A (zh) * 2016-01-15 2016-04-13 南开大学 检测大肠杆菌h血清型中3种血清型的基因液相芯片及检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUWAHARA, T.等: "Candidatus Arthromitus sp. SFB­mouse­Japan DNA, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
SUNJE J. PAMP等: "Single-cell sequencing provides clues about the host interactions of segmented filamentous bacteria (SFB)", 《GENOME RESEARCH》 *
TULIKA PRAKASH等: "Complete Genome Sequences of Rat and Mouse Segmented Filamentous Bacteria, a Potent Inducer of Th17 Cell Differentiation", 《CELL HOST & MICROBE》 *
廖宁波: "肠道内分节丝状菌的生物学特性及其与宿主黏膜免疫系统的关系", 《中国微生态学杂志》 *
王宇 等: "肠道分节丝状菌（SFB）与宿主间相互作用关系研究进展", 《微生物学免疫学进展》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109134649A (zh) * 2018-07-11 2019-01-04 中国医学科学院医学生物学研究所 疏螺旋体鞭毛蛋白FlaB抗体的获取方式及应用
CN112867785A (zh) * 2018-08-03 2021-05-28 弗劳恩霍夫应用研究促进协会 通过抗体介导的特定肠道细菌的中和作用治疗免疫性疾病

Also Published As

Publication number Publication date
CN106011281B (zh) 2019-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Viprey et al. Symbiotic implications of type III protein secretion machinery in Rhizobium
CN112424366B (zh) 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途
CN104918953B (zh) 抗霉浆菌的亚单位疫苗
CN107266538A (zh) 鸡传染性鼻炎亚单位疫苗及其制备方法
CN110628776A (zh) 一种拟穴青蟹致敏蛋白的编码基因及其应用
CN110218250A (zh) 一种草鱼补体成分5多克隆抗体的制备方法
CN106011281A (zh) 肠道分节丝状菌鞭毛蛋白的检测方法
CN107236039A (zh) 重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法
Jeong et al. An HrpB‐dependent but type III‐independent extracellular aspartic protease is a virulence factor of Ralstonia solanacearum
CN104861050B (zh) 鲍曼不动杆菌锌依赖寡肽a1s_1610蛋白及其制备方法和应用
CN106117365B (zh) 抗猪链球菌病且具有自身免疫活性的融合蛋白及其制备和应用
CN110746496B (zh) 一种鲍曼不动杆菌的pal重组蛋白及其编码基因和它们的应用
CN103059117A (zh) 日本血吸虫重要抗原的高通量筛选及其在血吸虫病诊断中的应用
Yu et al. Prokaryotic Expression of α‐13 Giardin Gene and Its Intracellular Localization in Giardia lamblia
CN101818134B (zh) ppGalNAc-T20抗原及其多克隆抗体的制备方法
CN108794613A (zh) 一种具有抑菌活性的香港牡蛎LysM蛋白及其编码基因和应用
WO2021258637A1 (zh) 一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、编码的蛋白质和应用
CN109897092B (zh) 一种蓝舌病病毒非结构蛋白ns3的可溶制备方法
WO2015172706A1 (zh) 曼氏血吸虫诊断抗原的筛选与应用
Zhao et al. Subpopulations of chloroplast ribosomes change during photoregulated development of Zea mays leaves: ribosomal proteins L2, L21, and L29
CN108588096B (zh) 东方巴贝斯虫球状体蛋白基因4及其编码的蛋白
CN110526980A (zh) 一种特异性识别蛋白usp42的多克隆抗体制备方法及其应用
CN102993283B (zh) 一种结核分枝杆菌的抗原蛋白及应用
CN106554968A (zh) 日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用
CN106148298A (zh) 水稻抗病相关基因OsDR11及其在水稻抗病中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20190423

Termination date: 20210719