CN112424366B

CN112424366B - 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途

Info

Publication number: CN112424366B
Application number: CN202080001357.5A
Authority: CN
Inventors: 孙恩珠; 李尚珉; 姜享注
Original assignee: Bioapplications Inc
Current assignee: Bioapplications Inc
Priority date: 2019-06-17
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2040-06-16
Also published as: CN112424366A; JP7164894B2; EP3835425A4; KR20200144067A; JP2021531727A; US20230287440A1; KR102444024B1; EP3835425A1

Abstract

本发明涉及一种重组载体、用所述重组载体转化的转基因生物、用于诊断非洲猪瘟的组合物和试剂盒等，所述重组载体包括编码非洲猪瘟病毒P32蛋白的多核苷酸，所述组合物和试剂盒包含从所述转基因生物分离的非洲猪瘟病毒P32抗原蛋白。

Description

用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途

技术领域

本发明涉及用于生产作为诊断非洲猪瘟(ASF)的抗原的P32蛋白的重组载体、用该重组载体转化的转基因生物、包括从该转基因生物中分离出的ASF病毒的P32蛋白的用于诊断非洲猪瘟的组合物和试剂盒等。

本申请要求于2019年6月17日提交的韩国专利申请第10-2019-0071861号和于2020年6月15日提交的韩国专利申请第10-2020-0072204号的优先权和权益，其公开内容通过引用全部合并于本文。

背景技术

非洲猪瘟(ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的猪传染病，该病毒属于非洲猪瘟病毒科(family Asfarviridae)，该病毒最初于1921年在肯尼亚报道，此后有撒哈拉以南地区爆发的报告，自2007年以来，疫情已开始扩展到非洲以外的其他地区，例如黑海沿岸的格鲁吉亚，亚美尼亚和阿塞拜疆。特别是近年来，疫情已在与韩国有很多贸易往来的俄罗斯由东部向西部蔓延。诊断非洲猪瘟非常重要，因为它是一种高风险的传染病，当发生猪感染时，其死亡率为100％，并且由于没有针对这种疾病开发的疫苗因而需要在疫情爆发后立即进行处理。

在非洲猪瘟病毒具有特异性的蛋白质中，已知P15、P35、P72、P54、P30等具有高抗原性，因此被认为是诊断的候选。迄今为止，从未生产出使用抗非洲猪瘟病毒的抗体的诊断试剂盒，并且在国外，使用P30重组蛋白的抗体诊断试剂盒(由SVANOVIR制造)已经商业化并正在使用。

同时，由于分子生物学和基因工程技术的显著进步，这些技术也已应用于植物领域，因此继续努力从植物生产有用的生物活性物质。从植物中生产有用物质可以显著降低生产成本，并且其优势在于不仅可以从根本上排除常规流行方法(从动物细胞或微生物中合成蛋白质，并分离和纯化)中可能出现的各种污染物(病毒、癌基因和肠毒素)，而且与动物细胞或微生物不同，还可以在商业化阶段使用种子管理种子储备。

因此，正如本发明的发明人已致力于开发用于诊断非洲猪瘟的快速抗原测试以保持国家没有非洲猪瘟并有备于疾病的涌入，本发明的发明人开发了一种能够在植物中高效表达(对非洲猪瘟病毒具有特异性的蛋白质中的)P32重组蛋白质的系统，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

非洲猪瘟病毒是一种巨大的双链DNA病毒，可复制受感染细胞的细胞质。该病毒在猪中引起出血热，死亡率很高，并且还持续感染其自然宿主，猪，疣猪，鬃薮猪(bushpigs)和钝缘蜱属的软蜱虫(soft ticks of the genus Ornithodoros)，它们很可能是携带者，没有疾病迹象。由于该病毒会引起猪胎儿出血热，因此尽早诊断该病毒非常重要。

已得到本发明以满足快速诊断疑似感染非洲猪瘟的个体并解决相关领域的问题的需要，并且本发明的目的是提供一种重组非洲猪瘟病毒抗原，其不仅可以使用植物高效地生产，而且诊断灵敏度和特异性高，并且提供包括重组非洲猪瘟病毒抗原的用于诊断非洲猪瘟的组合物或试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种包括编码非洲猪瘟病毒抗原的基因的重组载体，用该重组载体转化的转基因生物等。

本发明的另一个目的是提供诊断非洲猪瘟的方法，生产用于诊断非洲猪瘟的重组抗原的方法，制备包含该重组蛋白的用于诊断非洲猪瘟的组合物的方法等。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，并且根据以下的描述，其他未提及的技术问题对于本领域普通技术人员将变得显而易见。

技术方案

根据本发明的一方面，提供了一种用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体，该重组载体包括编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的非洲猪瘟病毒P32蛋白的多核苷酸，并在植物中表达。

在本发明的一实施方案中，重组载体可进一步包括SEQ ID NO：3的编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸。

在本发明的另一实施方案中，编码BiP的多核苷酸可以位于编码P32蛋白的多核苷酸的5'末端的上游，但是本发明不限于此。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以进一步包括SEQ ID NO：4的编码多聚组氨酸的多核苷酸。

在本发明的另一实施方案中，编码多聚组氨酸的多核苷酸可以位于编码P32蛋白的多核苷酸的3'末端的下游，但是本发明不限于此。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以进一步包括SEQ ID NO：6的编码HDEL的多核苷酸。

在本发明的另一实施方案中，编码HDEL的多核苷酸可以位于编码P32蛋白的多核苷酸的3'末端的下游，但是本发明不限于此。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以进一步包括：SEQ ID NO：3的编码BiP的多核苷酸；SEQ ID NO：4的编码多聚组氨酸的多核苷酸；和SEQ ID NO：6的编码HDEL的多核苷酸，但是本发明不限于此。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以具有顺序地彼此连接的编码BiP的多核苷酸、编码P32蛋白的多核苷酸、编码多聚组氨酸的多核苷酸和编码HDEL的多核苷酸，但是本发明是不限于此。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以包括SEQ ID NO：8的核苷酸序列，但是本发明不限于此。

本发明还提供了用重组载体转化的转基因生物。

在本发明的一实施方案中，转基因生物可以是植物。

本发明还提供了使用重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

本发明还提供了使用重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白用于诊断非洲猪瘟的用途。

本发明还提供了使用该重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白，其用于生产用于诊断非洲猪瘟的试剂。

在本发明的一实施方案中，该蛋白可以是水溶性的。

本发明还提供了用于诊断非洲猪瘟的组合物，其包括作为活性成分的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

本发明还提供了用于诊断非洲猪瘟的试剂盒，其包括作为活性成分的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

本发明还提供了诊断非洲猪瘟的方法或确定非洲猪瘟的方法，所述方法包括通过使用由该重组载体生产的重组猪瘟病毒P32蛋白作为抗原，在来源于非人动物的生物样品中的抗原-抗体反应来检测抗非洲猪瘟病毒的抗体。

本发明还提供了生产用于诊断非洲猪瘟的重组抗原的方法，该方法包括：(a)用根据本发明的重组载体转化植物；和(b)从该植物中分离并纯化重组抗原。

本发明还提供了制备用于诊断非洲猪瘟的组合物或制造用于诊断非洲猪瘟的试剂盒的方法，包括：(a)用根据本发明的重组载体转化植物；(b)从该植物中分离并纯化重组抗原；以及(c)使用分离和纯化的所述重组抗原制备诊断组合物或制造诊断试剂盒。

发明的有益效果

用于诊断和预防包括非洲猪瘟在内的病毒性疾病的蛋白，尤其是抗原，由于诸如蛋白质折叠和糖基化等问题而无法利用细菌，并且主要使用动物细胞生产。然而，使用动物细胞生产疫苗的方法导致扩大大规模生产设备的巨额成本，因此制造并不容易，并且在大多数情况下，抗原是昂贵的。另外，使用动物细胞生产的抗原的缺点在于不容易储存，并且很可能被可感染动物的病毒污染。但是，本发明通过使用植物来弥补这些缺点。换句话说，与动物细胞不同，植物细胞极不可能被可感染动物的病毒污染，并且仅通过确保耕种面积就可以在任何时间大规模生产，并且可以通过植物长期保存，因此可以生产稳定且廉价的抗原。

本发明的重组非洲猪瘟病毒抗原不仅在植物中有效表达，而且具有高水溶性，因此便于其分离和纯化，并且对非洲猪瘟病毒表现出高敏感性和特异性，因此是有望广泛应用于各个领域。

另外，可以通过使用根据本发明的重组非洲猪瘟病毒抗原蛋白来生产用于诊断非洲猪瘟的组合物或试剂盒，因此可以早期诊断被非洲猪瘟感染的个体，因此可以有效地用于防止疾病传播。

附图简要说明

图1是显示根据本发明的一实施方案的用于在植物中非洲猪瘟病毒P32抗原表达的基因排列的分裂图(NB，新的伴侣结合蛋白；6xHis，多聚组氨酸标签；HDEL，ER保留信号)。

图2示出了在植物中表达然后分离和纯化后的P32抗原的蛋白免疫印迹结果(T，总提取物；S，上清液级分；P，沉淀级分)。

图3示出了根据本发明的一实施方案的在植物中表达后非洲猪瘟病毒P32抗原的纯度的确认结果。

图4示出了通过使用由西班牙参考实验室提供的用于非洲猪瘟的血清来测试包括本发明的组合物的用于非洲猪瘟的抗体血清诊断试剂盒的反应性和敏感性的结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。通常，本文使用的术语是本领域公知的且通常使用的。

本发明提供了用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体，该重组载体包括编码非洲猪瘟病毒P32蛋白的多核苷酸，并在植物中表达。

已知非洲猪瘟病毒P32蛋白在感染周期的早期与病毒的内化有关。

另外，P32蛋白可以由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码，或者可以由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成，但是本发明不限于此。更具体地，编码本发明的非洲猪瘟病毒P32蛋白的核苷酸序列可以由SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列组成，但是本发明不限于此，并且该核苷酸序列的变体落入本发明的范围内。由本发明的SEQ ID NO：1表示的核苷酸序列的核酸分子是构成其的核酸分子的功能等同物，例如，包括其中核酸分子的一些核苷酸序列通过缺失、替代或插入而被修饰，但是可以在功能上执行与核酸分子相同的作用的变体的概念。特别地，该基因可以包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有至少70％同源性，更优选至少80％同源性，进一步更优选至少90％同源性，最优选至少95％同源性的核苷酸序列。例如，该基因包含序列同源性为70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％和100％的多核苷酸。可以通过使用比较区域比较两个优化的序列来确认“序列同源性的％”，并且在比较区域中的一些多核苷酸序列可以包括与参考序列(排除添加或缺失)相比的添加或缺失(即缺口)，用于两个序列的最佳比对。

本文所用的术语“多核苷酸”是指包含通常通过磷酸酯键连接的两个或更多个核苷酸或核苷酸衍生物的低聚物或聚合物，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸还包括例如核苷酸类似物，或DNA和RNA衍生物，其包括除磷酸二酯键以外的“骨架”键，例如磷酸三酯键，氨基磷酸酯键，硫代磷酸酯键，硫酯键或肽键(肽核酸)。多核苷酸包括单链和/或双链多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，以及RNA或DNA的类似物。

在本发明的一实施方案中，重组载体可以进一步包括编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸，编码六个连续组氨酸(多聚组氨酸)的多核苷酸，编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的多核苷酸等。

在本发明的另一实施方案中，编码BiP的多核苷酸可以位于编码P32蛋白的多核苷酸的5'末端的上游，并且编码多聚组氨酸的多核苷酸和编码HDEL肽的多核苷酸可以位于编码P32蛋白的多核苷酸的3'末端的下游。

如本文所用，术语“重组载体”是指能够表达由插入载体中的异源核酸编码的肽或蛋白的载体，并且优选地是指构建为表达靶抗原(在本发明中，非洲猪瘟抗原P32)的载体。如本文所用，术语“载体”是指用于在体外、离体或体内将核苷酸引入和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物，并且可以意指可以与另一个DNA片段连接以实现该连接的片段的复制的复制子。术语“复制子”是指任何遗传单位(例如，质粒，噬菌体，粘粒，染色体和病毒)，其在体内作为DNA复制的自主单位，即能够通过自我调节来复制。

本发明的重组载体可以优选包括：启动子，其是RNA聚合酶结合的转录起始因子；用于调节转录的任意操纵子序列；编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列；调节转录和翻译的终止的序列，终止子等；可更优选地进一步包括BiP基因，His标签(由至少六个组氨酸残基组成的氨基酸部分)，内质网信号肽(与内质网靶向序列的含义相同)基因，克隆位点等；并且可以更优选地进一步包括用于筛选的标记基因，例如用于筛选转基因生物的抗生素抗性基因。

“基因(在图1中图示为NB)”优选为包括SEQ ID NO：3的核苷酸序列的基因，最优选为由SEQ ID NO：3表示的基因，但是可以包括与SEQ ID NO：3的核苷酸序列具有80％同源性，更优选至少90％同源性，甚至更优选至少95％同源性的核苷酸序列。BiP基因可能仅具有在表达重组蛋白时通过切割一部分序列而保留的一些氨基酸。

“克隆位点”统指插入以连接/划分载体中各个基因的那些位点。

“内质网信号肽(ER信号序列)”的类型和氨基酸序列不受限制，只要它是本领域普通技术人员已知的植物内质网信号肽即可，例如，参见诸如US 2013/0295065和WO 2009/158716的文件。在本发明中，“内质网信号肽”可以优选是His-Asp-Glu-Leu(HDEL，由SEQ IDNO：7表示的多肽)，并且可以由通过SEQ ID NO：6表示的核苷酸序列编码。另外，作为本发明的内质网信号肽，SEQ ID NO：6的变体落入本发明的范围内。特别地，该基因可以包括与SEQID NO：6的核苷酸序列具有至少90％同源性，更优选至少95％同源性，最优选至少98％同源性的核苷酸序列。内质网信号肽的结合位点位于蛋白质的C末端，目的是通过添加(或连接)在植物细胞中表达或合成。

在本发明中，用于除了多聚组氨酸标签以外的标签的合适基因可以包括例如Avi标签，钙调蛋白标签，多聚谷氨酸标签，E标签，FLAG标签，HA标签，His标签，Myc标签，S标签，SBP标签，IgG-Fc标签，CTB标签，Softag 1标签，Softag 3标签，链球菌标签，TC标签，V5标签，VSV标签，Xpress标签等，以及IgG-Fc标签可来源于人、小鼠、兔或猪。

用于筛选的标记基因可以包括例如抗除草剂(例如草甘膦和草丁膦)的基因、抗生素抗性基因(例如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素和氯霉素)、aadA基因等，启动子可以包括例如pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、来源于花椰菜花叶病毒的35S启动子、来源于花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子和延伸因子-1α(EF-1α)启动子，并且终止子可包括例如胭脂碱合酶(NOS)终止子、水稻淀粉酶RAmyl A终止子、菜豆球蛋白终止子，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱基因(Octopine gene)终止子和大肠杆菌rrnB1/B2终止子，但本发明不限于上面列出的例子。

在本发明的另一实施方案中，重组载体可以具有以此顺序连接的：启动子基因，编码新的伴侣结合蛋白(BiP；NB)信号肽的多核苷酸，编码P32蛋白的多核苷酸，编码多聚组氨酸的多核苷酸和编码HDEL的多核苷酸。

在多核苷酸以上述顺序连接的情况下，即，在包括图1的分裂图中所示的表达盒的情况下，根据本发明的重组载体可以包括SEQ ID NO：8的核苷酸序列，并且最优选地由SEQID NO：8的核苷酸序列组成，但是可以包括与SEQ ID NO：8的核苷酸序列具有至少80％同源性，更优选至少90％同源性，甚至更优选至少95％同源性的核苷酸序列。

本发明的另一实施方案提供了用重组载体转化的转基因生物。

在本发明的一实施方案中，转基因生物可以是微生物，例如大肠杆菌，芽孢杆菌(Bacillus)，沙门氏菌(Salmonella)或酵母菌(yeast)；昆虫细胞；包括人细胞的动物细胞，动物例如小鼠，大鼠，狗，猴子，猪，马或牛；根癌农杆菌；植物等，且更优选地，转基因生物的例子包括粮食作物，包括水稻，小麦，大麦，玉米，豆类，土豆，红豆，燕麦和高粱；蔬菜作物包括拟南芥，大白菜，白萝卜，辣椒，草莓，西红柿，西瓜，黄瓜，卷心菜，薄皮甜瓜(orientalmelons)，南瓜，葱，洋葱和胡萝卜；特殊用途的作物，包括人参，烟草，棉花，芝麻，甘蔗，甜菜，紫苏，花生和油菜；水果作物，包括苹果树，梨树，枣树，桃子，葡萄，橘子，柿子，李子，杏子和香蕉；和花，包括玫瑰，康乃馨，菊花，百合和郁金香，但是转基因生物不受限制，只要它是能够用本发明的载体转化的任何活体即可。

如本文所用，术语“转化”统指通过注射的DNA改变生物体的遗传特性，术语“转基因生物”是指通过使用分子遗传方法注射外部基因而生产的活生物体，优选是指通过本发明的重组载体转化的活生物。活生物没有特别限制，只要它是活生物体，例如微生物，真核细胞，昆虫，动物，植物等，其实例包括但不限于大肠杆菌，沙门氏菌，芽孢杆菌，酵母菌，动物细胞，小鼠，大鼠，狗，猴子，猪，马，牛，根癌农杆菌和植物。

如本文所用，“植物”可以是能够大量生产包括本发明的抗原的蛋白的任何植物，并且更特别地，可以选自烟草，拟南芥，玉米，大豆，卡诺拉(Canola)，紫花苜蓿，向日葵，高粱，小麦，棉花，花生，西红柿，土豆，生菜和胡椒，优选是烟草。在本发明中，烟草是属于烟草属的植物，对烟草的类型没有特别的限制，只要它能够过表达蛋白质即可，并且本发明可以通过根据转化方法和大量生产蛋白质的目的选择合适的物种来实施。例如，可以使用诸如本氏烟草(Nicotiana benthamiana L.)或珊西烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)之类的物种。

可以使用诸如转化，转染，农杆菌介导的转化方法，粒子枪轰击(particle gunbombardment)，超声处理，电穿孔和聚乙二醇(PEG)-介导的转化方法之类的方法生产转基因生物，但是该方法不限于此，只要它是一种能够注射本发明的载体的方法即可。

本发明的另一实施方案提供了使用根据本发明的重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白(抗原)。

在本发明的一实施方案中，重组P32蛋白(抗原)可以是水溶性的。更具体地，在植物中表达的重组P32蛋白可以以95％，96％，97％，98％，99％或100％溶解在水溶性级分(water-soluble fraction)中。

另外，在本发明的另一实施方案中，重组P32蛋白(抗原)可以分离和纯化，具有90％或更高的纯度。更具体地，在使用常规分离和纯化方法时，在植物中表达的重组P32蛋白可以获得作为具有90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的纯度的重组P32蛋白。

本发明的另一实施方案提供了用于诊断非洲猪瘟的组合物或试剂盒，其包括作为活性成分的使用根据本发明的重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白(抗原)。

如本文所用，术语“诊断”是指确定病理状况的存在或其发作的可能性。其中，本发明尤其对非洲猪瘟的诊断有效。当使用由本发明的重组载体生产的P32抗原时，可以检测在被非洲猪瘟感染的个体体内产生的特异性抗体。即，P32抗原可以用作对非洲猪瘟的诊断有用的指示剂(诊断标记物)。

如本文所用，术语“抗原”统指在体内诱导免疫反应的任何物质，并且抗原优选是病毒，化合物，细菌，花粉，癌细胞，或其一部分的肽或蛋白质，但是没有特别限制，只要它是能够在体内诱导免疫反应的物质即可。

本发明的另一实施方案提供了一种诊断非洲猪瘟的方法，其包括通过使用由根据本发明的重组载体生产的重组猪瘟病毒P32蛋白作为抗原，在来源于非人动物的生物样品中的抗原-抗体反应来检测抗非洲猪瘟病毒的抗体。

本发明的另一实施方案提供了一种生产用于诊断非洲猪瘟的重组抗原的方法，其包括：(a)用根据本发明的重组载体转化植物；以及(b)从所述植物中分离和纯化重组抗原。

本发明的另一实施方案提供了制备用于诊断非洲猪瘟的组合物或制造用于诊断非洲猪瘟的试剂盒的方法，其包括：(a)用根据本发明的重组载体转化植物；(b)从所述植物中分离和纯化重组抗原；和(c)使用分离和纯化的所述重组抗原制备诊断组合物或制造诊断试剂盒。

在下文中，将描述示例性实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例仅是为了便于对本发明的理解，而无意于限制本发明的范围。

[实施例]

实施例1：表达非洲猪瘟病毒P32抗原的重组载体的构建

如图1的分裂图所示，构建了重组植物表达载体，以便在植物中表达非洲猪瘟病毒抗原P32蛋白(已知在感染周期的早期与病毒的内化有关)。更具体地，获得了非洲猪瘟病毒P32蛋白的遗传信息，并合成了编码P32蛋白的基因(SEQ ID NO：1)，该基因具有为在植物中表达而优化的序列。

具体而言，将编码在CaMV 35S启动子基因与pCAMBIA1300载体的NOS终止子之间的伴侣结合蛋白(BiP)信号肽的多核苷酸(SEQ ID NO：3)、编码非洲猪瘟病毒的重组P32抗原蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：1)、编码由六个连续组氨酸组成的His-标签的多核苷酸(SEQID NO：4)和编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的多核苷酸(SEQ ID NO：6)顺序地连接，从而完成了非洲猪瘟病毒P32蛋白的植物表达载体的构建。

实施例2：P32抗原的表达和鉴定

2.1.在植物中表达的非洲猪瘟病毒P32抗原载体的瞬时表达

使用电穿孔法将实施例1中制备的植物表达载体转化到农杆菌LBA4404菌株(Agrobacterium LBA4404 strain)中。将转化的农杆菌在5mLYEP液体培养基(酵母提取物10g，蛋白胨10g，NaCl 5g，卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L)中于28℃振荡培养16小时，然后将1mL的原代培养液接种到50mL的新鲜YEP培养基中，并在28℃振荡培养6小时。通过离心(7,000rpm，4℃，5分钟)收集培养的农杆菌，然后将其悬浮在渗透缓冲液[10mM MES(pH5.7)，10mM MgCl₂，200μM乙酰丁香酮]中，以便在波长为600nm的吸光度变为1.0。通过使用无针注射器将农杆菌悬浮液注射到本氏烟草叶片的背面来进行农杆菌浸润。

2.2.非洲猪瘟病毒P32抗原表达的确认

从实施例2.1中制备的植物叶片中提取蛋白质并离心，然后将水溶性上清液(S)中的蛋白、沉淀物(P)级分中的蛋白和包括水溶性上清液和沉淀物的总(T)级分(fraction)分离，然后进行蛋白质免疫印迹以确认重组P32抗原蛋白的表达。更具体地，将30μL的每种级分与SDS样品缓冲液混合，然后加热。然后，将每种级分在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，以鉴定根据大小分离的蛋白条带，将分离出的蛋白转移到PVDF膜上，然后用5％脱脂乳封闭，然后使蛋白结合与多聚组氨酸反应的抗体，并使用制造商提供的方法用ECL溶液处理，以鉴定重组P32抗原蛋白的表达。

结果，如图2所示，确认了重组P32抗原蛋白的高效表达，并且确认了95％以上的表达的重组P32抗原蛋白是在水溶性上清液中。

另外，图3的SDS-PAGE结果表明，如在标记为P32的泳道中所确认的，除P32以外没有其他蛋白条带出现，并且，通过使用牛血清白蛋白(BSA)使用标准曲线对重组蛋白进行定量的结果，确认了以高纯度分离了P32抗原蛋白。

如上所述，与原始蛋白相比，本发明的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白得到了很好的纯化，没有任何明显的变化或修饰。这些结果证实了，当在植物中表达该蛋白时，未发现诸如糖结构突变和生产效率降低之类的问题，并且根据本发明的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白在植物中良好地生产。

实施例3：确认P32抗原对ASF参考血清的反应性

使用实施例2.2中制备的P32抗原蛋白制造抗体血清诊断试剂盒原型，并用西班牙ASF参考实验室提供的血清进行反应性和敏感性测试。

结果，如下面的图4和表1所示，使用重组P32抗原蛋白制造的本发明的ASF诊断试剂盒显示与提供的样品结果相符的100％相同的阳性和阴性结果，并且还确认了设定为最低阳性限度的血清(图4，limi；表1，最低限度阳性参考血清)被确定为阳性，显示出优异的特异性和灵敏度。

[表格1]

提供本发明的上述描述仅出于说明目的，并且本发明所属领域的普通技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，上述实施方案应被解释为仅出于说明的目的而提供，而不是出于限制的目的。

工业实用性

本发明的重组非洲猪瘟病毒抗原不仅可以使用植物有效地生产，而且由于其高水溶性而易于分离和纯化。另外，由于该抗原具有高的诊断敏感性和特异性，因此使用该抗原制造的用于诊断非洲猪瘟的组合物和试剂盒可以早期诊断出非洲猪瘟感染的个体，因此有望在工业上高度适用。

<110> 巴伊沃爱普有限公司

<120> 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途

<130> MPO20-066CN

<150> KR 10-2019-0071861

<151> 2019-06-17

<150> KR 10-2020-0072204

<151> 2020-06-15

<160> 8

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> P32抗原的DNA序列

<400> 1

atgaagatgg aagtcatctt taagacagat cttaggtcat cttcacaagt agtattccat 60

gcaggcagcc tttataattg gttctccgtt gaaatcatta actctggacg tatagtgacc 120

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aatgagacaa atgagtgtac ctcgagtttt gagactttgt tcgaacagga gccttctagc 360

gaggtgccaa aggactccaa gttgtacatg ctggcccaga agaccgttca gcacatcgag 420

cagtacggga aggctcctga ttttaataag gtgattaggg ctcacaactt catacaaact 480

atttatggaa ctcctcttaa ggaggaagag aaggaggttg ttagattgat ggtcataaag 540

ctattaaaga agaag 555

<210> 2

<211> 185

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P32抗原的氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln

1 5 10 15

Val Val Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile

20 25 30

Ile Asn Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser

35 40 45

Thr Val Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln

50 55 60

Gly Tyr Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His

65 70 75 80

Val Leu Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His

85 90 95

Glu Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr

100 105 110

Leu Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu

115 120 125

Tyr Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys

130 135 140

Ala Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr

145 150 155 160

Ile Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu

165 170 175

Met Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys

180 185

<210> 3

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> BiP的DNA序列

<400> 3

atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60

tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120

ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180

ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240

tgtcctctgc a 251

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 6X His的DNA序列

<400> 4

caccaccatc accaccac 18

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 6X His的氨基酸序列

<400> 5

His His His His His His

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HDEL的DNA序列

<400> 6

catgatgagc tc 12

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HDEL的氨基酸序列

<400> 7

His Asp Glu Leu

1

<210> 8

<211> 884

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 全长P32构建物的DNA序列

<400> 8

tctagaatta ttacatcaaa acaaaaaatg gctcgctcgt ttggagctaa cagtaccgtt 60

gtgttggcga tcatcttctt cggtgagtga ttttccgatc ttcttctccg atttagatct 120

cctctacatt gttgcttaat ctcagaacct tttttcgttg ttcctggatc tgaatgtgtt 180

tgtttgcaat ttcacgatct taaaaggtta gatctcgatt ggtattgacg attggaatct 240

ttacgatttc aggatgttta tttgcgttgt cctctgcagg atccatgaag atggaagtca 300

tctttaagac agatcttagg tcatcttcac aagtagtatt ccatgcaggc agcctttata 360

attggttctc cgttgaaatc attaactctg gacgtatagt gaccacggca attaagacac 420

ttctgtcaac tgttaagtat gacattgtta agagtgctag aatctacgca ggtcagggtt 480

atacagaaca tcaagcccaa gaggaatgga atatgattct ccatgtgctc tttgaggagg 540

agactgagtc tgctagttct gagaacattc acgagaagaa cgataatgag acaaatgagt 600

gtacctcgag ttttgagact ttgttcgaac aggagccttc tagcgaggtg ccaaaggact 660

ccaagttgta catgctggcc cagaagaccg ttcagcacat cgagcagtac gggaaggctc 720

ctgattttaa taaggtgatt agggctcaca acttcataca aactatttat ggaactcctc 780

ttaaggagga agagaaggag gttgttagat tgatggtcat aaagctatta aagaagaagt 840

cccggggtca ccaccatcac caccatgatg agctctagct cgag 884

Claims

1.一种用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体，其中所述重组载体包含编码由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的非洲猪瘟病毒P32蛋白的由SEQ ID NO：1的核酸序列组成的多核苷酸，并在植物中表达，并且其中所述重组载体进一步包含SEQ ID NO：3的编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸，SEQ ID NO：4的编码多聚组氨酸的多核苷酸，以及SEQ ID NO：6的编码HDEL的多核苷酸。

2.如权利要求1所述的重组载体，其中编码BiP的所述多核苷酸位于编码所述P32蛋白的所述多核苷酸的5'末端的上游。

3.如权利要求1所述的重组载体，其中编码多聚组氨酸的所述多核苷酸位于编码所述P32蛋白的所述多核苷酸的3'末端的下游。

4.如权利要求1所述的重组载体，其中编码HDEL的所述多核苷酸位于编码所述P32蛋白的所述多核苷酸的3'末端的下游。

5.如权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体具有顺序地彼此连接的编码BiP的多核苷酸、编码所述P32蛋白的多核苷酸、编码多聚组氨酸的多核苷酸和编码HDEL的多核苷酸。

6.如权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体包含SEQ ID NO：8的核苷酸序列。

7.用如权利要求1至6中任一项所述的重组载体转化的转基因生物以产生重组非洲猪瘟病毒P32蛋白的用途，其中所述转基因生物是植物。

8.使用如权利要求1至6中任一项所述的重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

9.如权利要求8所述的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白，其中所述蛋白是水溶性的。

10.一种用于诊断非洲猪瘟的组合物，所述组合物包含作为活性成分的如权利要求8所述的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

11.一种用于诊断非洲猪瘟的试剂盒，所述试剂盒包含作为活性成分的如权利要求8所述的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白。

12.一种生产用于诊断非洲猪瘟的重组抗原的方法，所述方法包括：

(a)用如权利要求1至6中任一项所述的重组载体转化植物；和

(b)从所述植物中分离并纯化重组抗原。

13.使用如权利要求1至6中任一项所述的重组载体生产的重组非洲猪瘟病毒P32蛋白用于制备用于诊断非洲猪瘟的试剂的用途。