KR20230133078A

KR20230133078A - 식물에서 생산된 Factor C의 sushi domain을 포함하는 재조합 단백질을 이용한 엔도톡신 LPS 제거 방법

Info

Publication number: KR20230133078A
Application number: KR1020220030166A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 엠디 레자울 이슬람 칸
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-03-10
Publication date: 2023-09-19

Abstract

본 발명에 따른 CES3를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 LPS 제거 방법에 대한 기술이다. 구체적으로, 편자게 Carcinoscorpius rotundicauda의 Factor C 단백질의 LPS 감지 및 결합을 담당하는 cysteine-rich domain과 Sushi 1-3 motif를 갖는 도메인을 포함하는 N-terminal 부위 (cysteine-rich domain, EGF-like domain 및 세 개의 sushi motif를 갖는 domain, CES3)를 식물에서 재조합 단백질로 생산하고자 재조합 유전자를 구축하였으며, 이의 재조합 유전자를 형질전환한 식물체를 만들어, LPS가 혼합된 단백질 혼합물에서 약 80%의 내독소를 제거함을 확인하였다. 이를 통해서 식물에서 생산된 재조합 단백질인 CES:CBM3를 MCC bead에 고정시켜 단백질 샘플에서 LPS를 제거하는 시스템을 구축하였다. 본 발명을 이용하는 경우, 기존의 LPS 제거 방법보다 지속가능성, 가용성, 안정성 및 비용 효율성 측면에서 우수하다.

Description

식물에서 생산된 Factor C의 sushi domain을 포함하는 재조합 단백질을 이용한 엔도톡신 LPS 제거 방법{Method for removal of endotoxin LPS using recombinant proteins containing the sushi motifs of Factor C produced in plants}

본 발명은 투구게 Factor C 단백질의 N-terminal region (CES3; Cysteine-rich domain, EGF-like domain, Sushi 1-3 motifs를 포함하는 domain), 거미줄 단백질의 N-terminal domain (NT), SUMO domain, cellulose binding domain을 포함하며 소포체로 targeting되는 재조합 유전자들을 구축하고 이들을 N. benthamiana에 도입하여 재조합 단백질을 생산하고 이들 재조합단백질에 포함된 CES3가 LPS에 결합할 수 있는 기능을 유지함을 확인함과 동시에 이들 재조합단백질이 가진 CBM3가 microcrystalline bead (MCC)에 binding을 유도하여 분리정제함과 동시에 MCC bead의 표면에 고정할 수 있다는 것을 확인하고, 이들 domain들을 이용하여 최종적으로 BiP-NT-SUMO-CES3-CBM3로 이루어진 재조합 유전자를 구축하고 이를 애기장대에 형질전환하여 발현을 유도하여 단백질을 생산하고 이 CES3-CBM3를 포함하는 단백질을 MCC bead에 고정하여 이를 이용하여 단백질 샘플에 포함된 박테리아 엔도톡신 LPS를 제거하는 방법에 관한 것이다.

대장균(E.coli)는 빠른 성장 속도, 간단하고 사용 가능한 성장 배지, 변형을 위한 유전 도구의 가용성, 매우 다양한 단백질을 발현하는 높은 단백질 발현 속도 및 가소성을 포함한 여러 핵심 요소를 통해 오늘날 승인된 치료 단백질 30-40%의 생산을 담당하고 있다. 이러한 성공 사례에도 불구하고 대장균은 여전히 치명적이며 과학적으로 도전적인 문제인 내독소 오염의 문제가 있다. E.coli 생산 단백질에 매우 적은 양의 엔도톡신이 잔류하더라도 동물 세포 배양, 특히 면역 세포 배양과 같은 다운스트림 애플리케이션에 영향을 크게 미치게 된다. 엔도톡신은 체중 1kg당 1ng 정도로 낮은 미량으로도 발열 반응을 유발할 수 있다. 특히 나노 물질은 표면 대 부피 비율이 크고 소수성 및 양이온성 표면을 갖기 때문에 내독소에 오염되기 쉽고 그 중 3분의 1이 내독소 오염 때문에 전임상 테스트에 실패했다. 최악의 경우 이러한 오염된 단백질 또는 물질을 사람이나 동물에 투여하면 전신 염증 반응을 일으켜 패혈성 쇼크 및 치사를 초래할 수 있다. 따라서 대장균이 생산한 치료용 단백질에서 내독소를 제거하는 것이 대단히 중요하며 전체 제조 비용의 42~92%가 내독소 제거를 위한 공정에 사용된다.

내독소는 그람 음성 박테리아의 외막에 존재하며 코어 다당류, 장쇄 다당류 및 지질 A라고 하는 비극성 지질의 세 가지 다른 영역으로 구성된다. 장쇄 다당류는 다양한 올리고당이 반복된 것을 포함하며 균주 특이적 표면 항원(O-항원)이다. 이 중 지질-A는 전염증성 사이토카인 생성을 유발하여 독성을 유발한다. 지질 A는 소수성이지만 O-항원과 코어 다당류는 모두 친수성이다. 이러한 화학적 성질을 감안할 때 내독소는 다양한 생리학적 조건에서 소수성 및 친수성의 세포내의 조성물들과 상호작용할 수 있다. 또한 높은 안정성과 내열성 및 다양한 pH에 대한 저항성으로 인해 오염된 경우 제거하기가 어렵다.

몇 가지 고전적인 방법들이 개발되어 이들을 이용하여 물, 소금 및 약제 용액에 존재하는 내독소의 제거에 사용되고 있다. 단백질 샘플에서 ~100kDa과 같이 분자 크기가 큰 micelle을 형성하는 LPS(Lipopolysaccharide)의 경우에는 ultrafiltration과 microfiltration과 같은 여과법을 이용하여 제거하는 방법이 개발되었다(van Reis and Zydney, 2001). 또한 1-옥탄올과 같은 유기 용매, Triton X-114와 같은 비이온성 세제를 사용한 친수성-소수성 상 분리를 이용하는 방법으로 내독소를 제거하는 방법이 개발되었다. 이온 교환 크로마토그래피 같은 방법도 개발되었다. 그러나, 이들 방법은 대부분 고비용, 낮은 생산성, 낮은 효율, 낮은 단백질 회수율, 단백질 안정성에 영향을 미치거나 바람직하지 않은 화학물질 오염과 같은 문제점을 내포하고 있다. 이러한 문제 때문에 단백질에 해를 끼치지 않으면서 엔도톡신을 제거할 수 있는 친화성 흡수제를 개발하고자 하고 있다. 디메틸아미노에탄올, 폴리-1-리신, 폴리(에틸렌이민)(pEI), 히스타민, 히스티딘, 디아미노히스티딘, 폴리비닐 알코올, 키토산, 폴리믹신 B 등과 같은 다양한 화학적 리간드가 개발되었다. 이러한 리간드는 친화성 크로마토그래피에 사용하거나 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 나일론, 폴리비닐 아세테이트 등의 막에 고정하여 사용할 수 있다. 셀룰로오스를 제외하고는 모두 화학적으로 합성된다. 셀룰로오스조차도 리간드와 결합하기 위해 화학적 변형이 필요하다. 최근 나노입자(NP)에 폴리-ε-카프로락톤(PCL)과 같은 리간드를 고정하는 기술이 개발되었으며, 다른 방법들에 비교하여 저비용이며 효율적인 내독소 제거 방법이라는 것이 보고되었다. 그러나 이러한 모든 방법은 ligand를 붙이기 전에 화학적 합성 또는 처리가 필요 하기 때문에 지속 가능성, 가용성, 안전성 및 비용 효율성 측면에서 여전히 제한적이라 할 수 있다.

한편, 편자게(Carcinoscorpius rotundicauda)의 혈구는 세린 프로테아제의 자이모겐인 Factor C라는 단백질에 의해 시작된 일련의 경로를 통해 그람 음성 박테리아를 응고시키는 능력을 가지고 있다. 이 Factor C 단백질이 LAL 내독소 테스트의 주요 구성 요소이며, 실제로 LPS를 인식하는 역할을 담당하고 있다. Factor C라는 단백질은 1019개의 아미노산 잔기로 구성되어 있으며, N-말단 신호 펩티드(1-25), heavy chain (26-690) 및 light chain (691-1019)로 구성되어 있다.

이에 본 발명자들은 Factor C 단백질을 이용하여 기존의 LPS 제거 방법보다 지속가능성, 가용성, 안전성 및 비용 효율성 측면에서 우수한 새로운 내독소 제거 방법을 구축하기 위해 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 Carcinoscorpius rotundicauda의 Factor C 단백질의 LPS 감지 및 결합을 담당하는 cysteine-rich domain과 sushi 도메인을 포함하는 N-terminal 부위(cysteine-rich domain, EGF-like domain 및 세 개의 sushi motif를 갖는 domain, 이하 'CES3')를 포함하는 재조합 단백질을 식물에서 생산하고자 재조합 유전자를 구축하였다. 이 CES3를 포함하는 재조합 유전자를 N. benthamiana에 Agrobacterium를 매개로 하여 도입한 후 transient expression을 통해서 이 재조합 유전자가 암호화하는 재조합 단백질의 생산을 유도한 결과 CES3를 포함하는 이 재조합단백질을 soluble form으로 생산할 수 있으며, N. benthamiana에서 생산한 CES3를 포함하는 재조합단백질이 LPS를 인식할 수 있다는 것을 확인하였다. 이어서 이 CES3를 포함하는 재조합 유전자를 애기장대에 도입하여 형질전환 식물체를 구축하였다. 그리고 형질전환체로부터 분리된 단백질이 결합된 비드 복합체가 E. coli O111:B4 유래의 LPS가 혼합된 단백질 혼합물에서 약 80%의 내독소를 제거함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 (i) 거미줄 단백질의 NT(N-terminal)도메인; (ii) SUMO(a small ubiquitin-related modifier); (iii) CBM3(Cellulose binding module 3); 및 (iv) CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motifs)를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로부터 만들어진 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (i) 상기 재조합 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 재조합 벡터를 세포에 형질전환하는 단계; (iii) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (iv) 상기 배양한 형질 전환체를 식물에 침윤하는 단계; 및 (v) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계; 를 포함하는 LPS 제거용 CES3 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물에서 생산된 서열번호 14로 표시되는 재조합 단백질을 MCC 비드에 결합시켜 LPS를 제거하는 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi-3 motif)를 포함하는 서열번호 14로 표시되는 LPS 제거를 위한 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안 된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 (i) 거미줄 단백질의 NT(N-terminal)도메인; (ii) SUMO(a small ubiquitin-related modifier); (iii) CBM3(Cellulose binding module 3); 및 (iv) CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motif)를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CES3의 유전자 서열은 서열번호 14의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CES3의 유전자 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CBM3는 CES3 단백질의 C말단에 위치할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NT 도메인의 유전자 서열은 서열번호 16의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 CBM3의 유전자 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 SUMO의 유전자 서열은 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NT 도메인의 유전자 서열은 서열번호 15의 염기서열을 포함하고, 상기 CBM3의 유전자 서열은 서열번호 9의 염기서열을 포함하고, 상기 SUMO의 유전자 서열은 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 및 유지(retention)할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)하는 염기서열은 BiP 단백질을 코딩하는 염기서열이고, 상기 BiP 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 목적 단백질을 유지(retention)하는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터를 추가적으로 포함하고, 상기 프로모터는 바이러스 유래 또는 포유류 유래의 프로모터인 것 일 수 있다 .

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로부터 만들어진 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (i) 상기 재조합 벡터를 제작하는 단계; (ii) 상기 재조합 벡터를 세포에 형질전환하는 단계; (iii) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계; (iv) 상기 배양한 형질 전환체를 식물에 침윤하는 단계; 및 (v) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계; 를 포함하는 LPS 제거용 CES3 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (ii)단계의 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계의 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 단자엽 식물일 수 있다.

본 발명은 식물에서 생산된 서열번호 14로 표시되는 재조합 단백질을 MCC 비드에 결합시켜 LPS를 제거하는 시스템을 제공한다.

본 발명은 또한, CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motif)를 포함하는 서열번호 14로 표시되는 LPS 제거를 위한 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 CES3를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 LPS 제거 방법을 이용하는 경우 단백질 샘플에서 LPS를 제거가 가능하며, 대장균에서 생산하는 단백질에서 매우 적은 양의 엔도톡신의 오염을 제거할 수 있어, 지속 가능성 및 비용 효율성에 우수하다. 또한, 단백질의 안정성에 영향을 미치거나 바람직하지 않은 화합물질 오염의 문제점이 발생하지 않으므로, 단백질에 해를 끼치지 않으면서 엔도톡신을 제거할 수 있다.

도 1은 본 발명의 LPS 결합능이 있는 Factor C의 N-terminal region (CES3)를 포함하는 재조합 유전자를 구축하고 이를 식물 (N. benthamiana)에서 수용성으로 생산하는 재조합 유전자의 구축과 이의 발현 및 수용성 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 CES3를 식물을 이용하여 생산하는 과정에서 SUMO domain을 포함하는 전장의 재조합 단백질로부터 bdSENP1을 이용하여 in vivo에서 CES3 domain을 유리할 수있는지를 확인하고 이렇게 유리된 CES3를 순수 분리 정제가능성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명은 식물에서 생산한 CES3가 LPS에 결합하는지를 확인하기 위해서 대장균과 binding을 유도한 후 CES3가 대장균에 결합하는 것을 확인한 결과이다.
도 4는 식물에서 생산한 CBM3과 CES3를 포함하는 재조합 단백질을 MCC bead에 고정한 후 이 재조합 단백질의 CES3가 LPS에 결합하는지를 확인한 결과이다.
도 5는 BNS:CES3:CBM3 재조합 유전자를 애기장대에 도입하여 형질전환체를 구축하고 이들 형질전환체에서 이 유전자의 발현을 확인하고 이 재조합 단백질이 MCC bead에 결합하는지를 확인한 결과이다.
도 6은 애기장대에서 분리정제하고 MCC bead에 고정한 CES3:CBM3가 단백질 sample에 오염된 LPS를 제거하는 것을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 LPS를 결합하는 Factor C의 Cysteine-rich domain, EGF-like domain, Sushi 1-3 motif를 포함하는 도메인을 포함하는 N-말단 부위 (이하 'CES3'), cellulose bead에 고정하기 위해서 CBM3 셀룰로오스 binding 도메인 (이하 'CBM3'), 단백질의 수용성을 높이기 위해서 거미줄 단백질의 N-terminal domain (이하 'NT'), brachypodium의 SUMO domain (이하 'SUMO')과 N-terminal region에 BiP leader sequence를 포함하는 재조합 단백질 유전자를 구축하고 이 재조합 유전자 (BiP:NT:SUMO:CES3:CBM3)를 Arabidopsis에 도입하여 형질전환체 식물을 제고하고 이로부터 재조합 단백질을 미세결정 셀룰로스(microcrystalline cellulose, 이하 'MCC')에 고정하여 분리 정제하였다. 그리고 이 MCC bead에 결합된 재조합 단백질 (BiP:NT:SUMO:CES3:CBM3)을 이용하여 LPS를 제거하는 기술을 개발하였다. 본 발명에 따른 CES3를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터 및 이를 이용한 LPS 제거 방법을 이용하는 경우 단백질 샘플에서 LPS를 제거가 가능하며, 지속 가능성 및 비용 효율성에 우수하다.

따라서, 본 발명은 (i) 거미줄 단백질의 NT(N-terminal)도메인; (ii) SUMO(a small ubiquitin-related modifier); (iii) CBM3(Cellulose binding module 3); 및 (iv) CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motifs)를 포함하는 LPS 제거용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 도 1, 도 4 및 도 5에 나타난 모식도와 같이 재조합 벡터를 제조하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CES3는 투구게(Carcinoscorpius rotundicauda)의 Factor C 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 본 발명에서 용어 '투구게'는 '말굽게' 및 '펀자게'와 동일한 의미로 사용된다. 또한, 그 종으로서, 리물루스 폴리페무스 (Limulus polyphemus), 카르시노스코르피우스 로툰디카우다 (Carcinoscorpius rotundicauda), 타키플레우스 트리덴타투스 (Tachypleus tridentatus), 또는 타키플레우스 기가스 (Tachypleus gigas)로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명자들은 Factor C의 LPS를 인식하는 부위를 포함하는 재조합 단백질을 식물에서 생산하기 위해서 번역 증진용으로 인간 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C(CD45)의 N-glycan modification이 많은 domain (이하 'M 도메인'), 또는 있는 M 도메인을 사용하였지만 이 경우에는 재조합 단백질이 insoluble aggregate로 존재하였으므로 단백질의 solubility를 증진시키기 위해서 이 M domain을 Nephila clavipes의 주요 거미줄 단백질인 MaSp 1b의 NT 도메인으로 변경하고, NT domain의 단량체 간의 정전기적 상호작용 감소를 통한 이량체 형성을 방지하여 소수성 도메인을 가용화하는 능력을 유지하기 위하여 Asp59를 Lys로, Lys84를 Asp로 대체한 'NT 도메인'을 이용하였다. 셀룰로스 비드에 대한 결합능을 이용하여 단백질 분리를 위한 CBM3, 단백질의 수용성을 증진시키기 위한 brachypodium의 SUMO domain(S), 말굽게(혹은 투구게)라고 불리는 Carcinoscorpius rotundicauda의 Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motif를 갖는 domain (CES3)를 포함하는 재조합 유전자를 구축하였다. 또한, 이에 더하여 분리 정제용 6xHis tag와 ER 보유 신호인 HDEL를 갖도록 하였으며, CBM3 domain의 앞 뒤에 linker를 포함시켰고, 5' end에 번역 효율을 높여주는 5' UTR을 연결하여 재조합 유전자를 완성하였다.

상기 재조합 벡터는 이미 시판되고 있거나 공지된 일반적인 식물 발현 벡터를 기본 골격으로 하여 다양한 프로모터와 함께 유전자를 순차적으로 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터일 수 있다.

상기 재조합은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 상기 "벡터"라는 용어는 본 발명에 따른 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

또한 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 당업자라면 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 본 발명에 따른 상기 DNA 단편 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CES3의 유전자 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자 서열은 서열번호 13의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 CBM3는 CES3 단백질의 C말단에 위치할 수 있다. 본 발명에서는 목적 단백질을 보다 간편하고 빠르게 분리 및 정제하기 위해 앞서 기술한 본 발명의 재조합 벡터에 셀룰라제의 셀룰로오스-결합 도메인을 코딩하는 염기서열을 추가적으로 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제조하였다.

따라서 본 발명에서는 셀룰로오스-결합 도메인을 포함하는 재조합 벡터를 사용함에 따라 발현된 목적 단백질이 셀룰로오스 결합 도메인과 융합된 형태일 수 있으며, 따라서 셀룰로오스 담체를 컬럼으로 이용하는 크로마토그래피를 통하여 용이하게 분리 및 정제할 수 있다.

또한, 이렇게 생산된 융합된 형태의 목적 단백질은 적절한 효소 등을 이용하여 셀룰로오스 결합 도메인을 절단한 다음 추가적인 분리 정제 과정을 거쳐서 비융합된 형태의 목적 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는, CES3의 C 말단에 CBM3를 위치시켜 BNS:CES3:CBM3를 디자인하였다. 이 재조합 단백질은 CBM3 도메인에 의해 MCC 비드에 고정될 수 있다. 또한, CMB3의 위치로 인하여 CES3의 LPS의 결합 능력에 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 4D).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 NT 도메인의 유전자 서열은 서열번호 15의 염기서열을 포함하고, 상기 CBM3의 유전자 서열은 서열번호 9의 염기서열을 포함하고, 상기 SUMO의 유전자 서열은 서열번호 11의 염기서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 유전자 서열은 각각의 염기서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95%이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 및 유지(retention)할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.

일반적으로 형질전환 식물체 또는 세포내에서 목적 단백질을 과발현시키는 경우, 단백질이 분해 (proteolytic degradation)되는 현상들이 종종 발생한다. 그러나 다양한 세포내 소기관으로 외래 단백질을 타겟팅시킬 경우에는 이들 단백질을 보다 안정적으로 저장할 수 있으며, 특히, 목적 단백질을 소포체로 타겟팅 할 경우, 세포질에 존재하는 것보다 단백질의 분해를 최소화할 수 있으며, 이러한 예로 담배에서 인간 상피 성장 인자를 소포체로 타겟팅 시켰을 때 단백질의 수율이 약 10⁴ 배나 증가된다는 것이 알려져 있다. 또한, KDEL 또는 HDEL과 같은 소포체 저장 신호 펩타이드(ER retention signal peptide)를 이용하면 목적 단백질을 소포체내에 머물도록 함으로써 분자 샤페론에 의한 폴딩(folding)과 조합(assembly)이 증가되어 결과적으로 단백질의 분해를 최소화할 수 있다. 이러한 예로서, 목적 단백질을 분비 경로로 보냈을 때보다 소포체에 유지(retention) 시킨 경우, 목적 단백질의 수율이 10~100배 정도 증가된다고 알려졌다.

이때, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 할 경우에는 BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 염기서열을 사용할 수 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 사용할 수 있다. 상기 목적 단백질을 유지(retention)시키기 위한 염기서열로는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 사용할 수 있다.

상기 BiP는 루미날 결합 단백질(luminal binding protein)로서, 면역글로불린 중사슬 결합 단백질 (immunoglobulin heavy chain binding protein)과 글루코스 조절 단백질(glucose regulated protein)로 동정되었으며, 소포체에 위치해 있는 HSP70 샤페론 패밀리의 한 종류이며 소포체에서 새로이 합성된 단백질에 일시적으로 결합한다. 또한, BiP 단백질의 N-말단에는 소포체로의 타겟팅을 결정하는 신호 서열을 함유하고 있어 목적 단백질들을 소포체로 타겟팅 시키는 역할을 한다.

따라서, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)하는 염기서열은 BiP 단백질을 코딩하는 염기서열이고, 상기 BiP 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고, 상기 목적 단백질을 유지(retention)하는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다.

상기에서 프로모터로는 식물체 내에 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 상기 프로모터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터; 피크워트 모자이크 비루스(FMV)에서 유래한 전장 전사 프로모터 및 TMV의 코트 단백질 프로모터를 들수 있으며, 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 CaMV의 35S 프로모터를 사용하였다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터인 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터, Hsp 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 Hsp 터미네이터를 이용하였다.

본 발명의 벡터의 형질 전환시키는 경우에는 숙주세포로서 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium)이 될 수 있고, 바람직하게는 아그로박테리움(Agrobacterium) 투마파시엔스일 수 있으며, 더 자세하게는 아그로박테리움 LBA4404, GV3101, AGL1, EHA101 또는 EHA105일 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 이때 상기 식물체로부터 목적 단백질을 발현시키고 생산하는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (ii)단계의 재조합 벡터를 세포에 형질전환하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법인 것일 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 아그로박테리움 매개 침투를 통해 N. 벤타미아나에서 일시적으로 재조합 유전자를 발현하도록 하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (iv) 단계의 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 단자엽 식물인 것일 수 있다.

상기 (iv) 단계의 형질전환체를 식물에 침윤하는 방법은 화학 전지법, 진공 또는 주사기 침윤 방법이 있고 가장 바람직하게는 주사기 침윤 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 (iv) 단계의 형질전환체를 식물에 침윤하는 단계에 본 발명의 재조합 벡터 배양물 외 p38을 포함하는 재조합 벡터의 배양물을 동시에 침윤할 수 있다. p38은 유전자 침묵 억제인자이며, 목적하는 유전자의 발현수준을 증가시키는 데에 중요하다. p38 이외에도 유전자 침묵 억제 인자는 P19, HC-Pro, TVA 2b 등일 수 있다.

상기 (v) 단계에서 셀룰로스 비드는 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose, MCC), 카르복실 메틸 셀룰로스(carboxyl methyl cellulose, CMC), 메틸 셀룰로스(methyl cellulose, MC), 무정형 셀룰로스(amphous cellulose, AMC), 히드록시 에틸 셀룰로스(hydroxy ethyl cellulose, HEC) 및 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스(hydroxy propyl methyl cellulose, HPMC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 셀룰로스 비드를 이용할 수 있으며 가장 바람직하게는 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose, 이하 'MCC')일 수 있다.

상기 셀룰로스 비드에는 본 발명의 재조합 벡터에 도입된 CBM3 도메인이 결합할 수 있으며(도 4A), 이에 대한 기재는 전술하였으므로 생략한다.

본 발명은 식물에서 생산된 서열번호 14로 표시되는 재조합 단백질을 MCC 비드에 결합시켜 LPS를 제거하는 시스템을 제공한다. 본 발명의 구체적인 일실시예에 있어서, CES3가 MCC 비드와 결합한 경우, MCC 비드를 단독으로 사용한 경우보다 강력하게 LPS를 제거할 수 있음을 확인하였다. 또한 이 때 단백질 샘플에서 단백질의 손상 없이 LPS가 제거됨을 확인하였다(도 6A 및 6B).

본 발명은 또한, CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motifs)를 포함하는 서열번호 14로 표시되는 LPS 제거를 위한 재조합 단백질을 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[준비예]

본 발명에서 이용된 DNA 및 아미노산 서열은 다음과 같다.

	서열(5'-3')	서열번호
35S promoter 염기서열	GTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAGAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGATGGCTTCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTACCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAACATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATGGTCAACATGGTGGAGCACGACACTCTCGTCTACTCCAAGAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAGAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGATGGCTTCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTACCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAACATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGG	1
5’-UTR 염기서열	ATTATTACATCAAAACAAAAA	2
BiP 염기서열	ATGGCTCGCTCGTTTGGAGCTAACAGTACCGTTGTGTTGGCGATCATCTTCTTCGGTGAGTGATTTTCCGATCTTCTTCTCCGATTTAGATCTCCTCTACATTGTTGCTTAATCTCAGAACCTTTTTTCGTTGTTCCTGGATCTGAATGTGTTTGTTTGCAATTTCACGATCTTAAAAGGTTAGATCTCGATTGGTATTGACGATTGGAATCTTTACGATTTCAGGATGTTTATTTGCGTTGTCCTCTGCAATAGAAGAGGCTACGAAGTTA	3
BiP 아미노산 서열	MARSFGANSTVVLAIIFFGCLFALSSAIEEATKL	4
MP염기서열	ATGGCAAACATCACTGTGGATTACTTATATAACAAGGAAACTAAATTATTTACAGCAAAGCTAAATGTTAATGAGAATGTGGAATGTGGAAACAATACTTGCACAAACAATGAGGTGCATAACCTTACAGAATGTAAAAATGCGTCTGTTTCCATATCTCATAATTCATGTACTGCTCCTGAT	5
MP아미노산 서열	MANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPD	6
(G4S)2 Linker 염기 서열	GGTGGAGGAGGTTCTGGTGGTGGAGGTTCA	7
(G4S)2 Linker 아미노산 서열	GGGGSGGGGS	8
CBM3 염기 서열	GTATCAGGTAACCTTAAGGTGGAGTTTTACAACTCGAACCCTTCTGATACAACTAACTCAATAAACCCACAGTTCAAAGTTACAAACACAGGCAGCTCTGCGATCGATTTGTCTAAATTAACCCTCAGATACTATTATACGGTTGATGGACAGAAGGACCAGACTTTCTGGTGTGATCATGCAGCTATCATTGGTTCTAACGGTAGCTACAACGGAATTACATCAAACGTGAAGGGCACTTTCGTTAAGATGTCCTCTAGCACTAACAACGCAGACACATATTTGGAGATCAGTTTTACGGGGGGAACCCTTGAACCAGGTGCTCACGTCCAGATTCAAGGAAGATTCGCTAAAAACGACTGGTCGAACTATACCCAAAGTAATGATTACAGTTTTAAATCCGCCTCACAATTTGTTGAGTGGGATCAGGTCACTGCTTACCTGAACGGGGTTCTAGTGTGGGGAAAGGAACCTGGT	9
CBM3 아미노산 서열	VSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPG	10
bdSUMO 염기 서열	ATGCATATTAATTTGAAAGTGAAGGGACAGGACGGAAACGAGGTTTTCTTCCGTATCAAAAGATCAACACAACTCAAGAAACTCATGAATGCTTACTGCGATAGACAAAGCGTGGACATGACAGCTATAGCTTTCCTATTTGATGGGAGAAGGTTGAGAGCGGAACAGACTCCGGATGAGCTTGAAATGGAAGATGGAGATGAGATTGACGCAATGTTACATCAGACTGGTGCCGGCGGT	11
bdSUMO 아미노산 서열	MHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMTAIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGAGG	12
CES3 염기 서열	AAGGGAGTAGATCTAGGGTTGTGTGATGAAACGAGGTTCGAGTGCAAATGCGGCGATCCAGGCTATGTCTTCAACATCCCAGTGAAACAATGTACATACTTTTATAGATGGAGGCCGTATTGTAAGCCATGTGATGATCTGGAGGCTAAAGATATCTGTCCAAAGTATAAACGCTGTCAGGAGTGCAAGGCTGGTCTTGATTCCTGTGTTACTTGTCCTCCCAACAAATACGGCACTTGGTGCAGCGGAGAATGTCAGTGTAAGAATGGCGGTATCTGTGATCAGAGGACAGGAGCTTGCGCATGTCGTGACAGATACGAGGGGGTTCACTGTGAAATTCTCAAAGGTTGTCCTCTTCTTCCCTCGGATTCTCAAGTTCAGGAGGTCAGAAATCCACCTGATAATCCCCAAACTATTGACTACTCCTGCTCACCTGGATTCAAGCTTAAGGGAATGGCACGAATTAGCTGTTTGCCAAATGGACAGTGGAGTAACTTTCCACCGAAATGTATTAGAGAATGCGCCATGGTTTCATCTCCTGAGCATGGGAAAGTGAATGCTCTCAGTGGTGATATGATAGAAGGGGCTACTTTACGGTTTTCATGTGATTCTCCGTACTATTTGATTGGACAGGAAACATTAACCTGTCAAGGTAATGGTCAATGGAATGGACAAATACCTCAATGTAAGAATCTTGTTTTCTGTCCAGACCTGGACCCTGTAAACCATGCAGAACACAAGGTTAAAATTGGTGTTGAACAGAAGTATGGTCAATTTCCTCAGGGAACTGAGGTGACCTATACATGCTCTGGTAATTACTTTTTGATG	13
CES3 아미노산 서열	KGVDLGLCDETRFECKCGDPGYVFNIPVKQCTYFYRWRPYCKPCDDLEAKDICPKYKRCQECKAGLDSCVTCPPNKYGTWCSGECQCKNGGICDQRTGACACRDRYEGVHCEILKGCPLLPSDSQVQEVRNPPDNPQTIDYSCSPGFKLKGMARISCLPNGQWSNFPPKCIRECAMVSSPEHGKVNALSGDMIEGATLRFSCDSPYYLIGQETLTCQGNGQWNGQIPQCKNLVFCPDLDPVNHAEHKVKIGVEQKYGQFPQGTEVTYTCSGNYFLM	14
NT 염기서열	ATGACATGGACTGCTAGGCTTGCCTTGTCGATACTCGCCGTGCTTTGTACTCAGGGGTTGTTTGCTCAAGGACAAAATACCCCTTGGTCCTCTACAGAGCTAGCTGATGCATTTATCAATGCATTCCTCAACGAGGCTGGTAGAACCGGCGCATTTACTGCTGATCAACTGGATAAGATGTCTACCATCGGAGACACATTGAAAACGGCTATGGACAAAATGGCAAGAAGTAACAAGTCATCACAGAGTGATTTACAAGCTCTTAATATGGCTTTCGCTTCTTCAATGGCGGAAATTGCTGCAGTGGAACAAGGTGGTCTGTCTGTAGCAGAAAAGACAAATGCAATTGCTGATTCCCTTAATAGCGCCTTTTATCAGACAACTGGAGCAGTCAACGTTCAGTTTGTTAATGAGATTAGAAGTTTAATTAGCATGTTCGCCCAGGCGTCTGCTAATGAAGTT	15
NT 아미노산서열	MTWTARLALSILAVLCTQGLFAQGQNTPWSSTELADAFINAFLNEAGRTGAFTADQLDKMSTIGDTLKTAMDKMARSNKSSQSDLQALNMAFASSMAEIAAVEQGGLSVAEKTNAIADSLNSAFYQTTGAVNVQFVNEIRSLISMFAQASANEV	16
Hsp terminator 염기서열	CTCGAGATATGAAGATGAAGATGAAATATTTGGTGTGTCAAATAAAAAGCTTGTGTGCTTAAGTTTGTGTTTTTTTCTTGGCTTGTTGTGTTATGAATTTGTGGCTTTTTCTAATATTAAATGAATGTAAGATCTCATTATAATGAATAAACAAATGTTTCTATAATCCATTGTGAATGTTTTGTTGGATCTCTTCTGCAGCATATAACTACTGTATGTGCTATGGTATGGACTATGGAATATGATTAAAGATAAGGAATTC	17

Nicotiana benthamiana에서 Factor C의 LPS 결합 스시 도메인을 포함하는 재조합 단백질의 생산 및 western blot 분석 결과 확인

Factor C의 LPS를 인식하는 부위를 포함하는 재조합 단백질을 식물에서 생산하기 위해서 ER targeting을 위한 BiP의 리더 서열 (B), 번역 증진용으로 인간 단백질 티로신 포스파타제 수용체 유형 C(CD45)의 N-glycan modification이 많은 domain (M), cellulose bead에 대한 결합능을 이용하여 단백질 분리를 위한 Cellulobse binding domain(CBM3), 단백질의 수용성 증진 및 N-terminal region을 제거하기 위한 brachypodium의 SUMO domain(S), 말굽게라고 불리는 Carcinoscorpius rotundicauda의 Cysteine-rich-EGF 유사 도메인-Sushi 1-3 motifs를 갖는 domain (CES3), 분리 정제용 6xHis tag와 ER 보유 신호인 HDEL를 갖도록 구축하였다. 그리고 CBM3 domain의 앞 뒤에 linker를 포함시켰으며, 이 재조합 유전자 BMCS:CES3:6XHis의 5' end에 번역 효율을 높여주는 5' UTR을 연결하여 재조합 유전자를 완성하였다.

M domain은 인간 티로신 포스파타제 수용체 C(CD45)의 일부로 다수의 N-글리칸인을 갖는 domain으로 번역을 증가시킨다고 알려졌다. SUMO 도메인의 C-말단 영역은 bdSENP1을 사용한 단백질 분해 절단에 의해 전장 재조합 단백질로부터 방출될 수 있다. 6xHis 태그는 Ni²⁺-NTA 친화성 컬럼을 사용하여 분리정제에 사용할 수 있다. 이 재조합 유전자는 BMCS:CES:6xHix로 명명되었다.

그리고 이 유전자를 CaMV35S 프로모터와 Hsp 터미네이터 사이에 위치하는 발현 벡터를 구축하고 이를 아그로박테리움 매개 침투를 통해 N. 벤타미아나에서 일시적으로 재조합 유전자를 발현하도록 하였다(도 1A). 이때 유전자 침묵 억제인자, p38을 보유하는 아그로박테리움을 BMCS:CES3:6xHix를 함유하는 아그로박테리움과 1:1로 섞어서 벤타미아나에 주사기 매개 침윤에 사용하였다. p38의 동시발현은 이전에 보고된 바와 같이 발현 수준을 증가시키는 데 중요했다. 잎 조직을 Agrobacterium 침윤 후 3, 5 및 7일짜에 수확을 하고 총 단백질 추출물을 제조한 후 이를 원심분리하여 수용성 단백질을 포함하는 상등액과 비수용성 단백질을 포함하는 pellet 나누고 이들을 SDS-PAGE를 통해서 전개한 후 이를 항-CBM3 항체를 이용하여 western blotting을 통해서 분석하였다. 이때 BMCS:CES3:6XHis과 함께 gene silencing suppressor인 p38를 함께 침윤한 것과 같이 침윤하지 않은 두 종류의 sample을 확보하였다. 그 결과 p38을 함께 침윤한 sample에서 BMCS:CES3:6xHis(~77 kD 단백질)의 발현 수준은 시간이 지남에 따라 점차 증가했다(도 1B). 하지만 대부분의 단백질들은 5 및 7 dpi에서 펠렛 분획에서 검출되었으며, 이는 BMCS:CES3:6XHis 재조합 단백질이 주로 비수용성의 단백질 응집체 형태로 존재함을 알 수 있었다(도 1B).

CES3를 포함하는 단백질을 수용성으로 만들기 위해서 새로운 재조합 유전자를 구축하였다. BMCS:CES3:6XHis 유전자에 있는 M domain을 Euprosthenops australis의 MaSp 1a의 N-terminal domain (NT)로 치환하여 단백질의 수용성을 높이기로 하였다. 이전 연구에서 NT 도메인은 micelle 구조를 형성하여 거미 단백질의 소수성 부분을 격리하는 데 도움을 주고 있다는 연구 결과가 발표되었었다. 특히 이 NT 도메인의 Asp40을 Lys로, Lys65를 Asp로 치환하면 단량체 간의 정전기적 상호작용 감소를 통해 이량체 형성을 방지할 수 있으며, 이 돌연변이 NT 도메인은 광범위한 pH에서 micelle 형성을 통해 이웃한 소수성 도메인을 가용화하는 능력은 유지한다. 본 연구에서는 Nephila clavipes의 주요 거미줄 단백질인 MaSp 1b의 NT 도메인을 이용하여 같은 방법으로 Asp59를 Lys로, Lys84를 Asp로 대체하여 NT-m을 구축하였다. 그리고 BMCS:CES3:6xHis의 M 도메인을 NT-m 도메인으로 교체하여 BNCS:CES3:6xHis를 구축하였다(도 1C).

그리고 도 1B에서와 같이 BNCS:CES3:6xHis을 Agrobacterium을 이용하여 N. benthamiana의 잎에 발현되도록 하였다. 이때 p38을 동시에 발현되거나 되지 않도록 하여 p38에 의한 단백질의 발현 level을 비교하였다. 잎 조직을 3, 5 및 7 dpi에서 수확하고 이로부터 단백질 총 추출물을 만들고 가용성 및 pellet 분획으로 나누었다. 이들 분획을 SDS-PAGE로 분리하고 항-CBM3 항체에 대한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 발현 수준은 시간이 지남에 따라 증가했으며 p38이 BNCS:CES3:6xHis의 발현을 높이는데 중요하였다. 재조합 단백질 BNCS:CES3:6xHis(~78 kD)는 용해성 분획(도 1D)에서 검출되었으며, 이는 NT-m이 BNCS:CES3:6xHis의 가용화를 유도한다는 것을 나타낸다. 즉, BNCS:CES3:6XHis가 수용성 단백질로 확인되었다.

그러나, 항-CBM3 항체는 78kDa와 51kDa의 위치에서 2개의 밴드를 검출했는데, 이 중에 상단 밴드는 전장 재조합 단백질에 해당하며, 하단 밴드는 재조합 단백질의 일부가 잘려진 것으로 추정되었다.

식물에서 발현 후 생체내에서 태그 제거된 CES3:6XHis의 정제

식물에서 생산된 CES3가 LPS에 결합하는지 확인하고자 하였다. 이를 위해서 CES3:6xHis domain을 BNCS:CES3:6xHis로부터 분리하여 확보하고자 하였다.

BNCS:CES3:6xHis로부터 CES3:6xHis 도메인이 SUMO protease인 bdSENP1에 의해서 전장 재조합 단백질에서 방출될 수 있는지 테스트하기 위해서 BNCS:CES3:6XHis 재조합 단백질의 SUMO를 인식하여 자르는 bdSENP1 유전자를 BNCS:CES3:6XHis와 같이 발현하여 in vivo에서 SUMO를 잘라서 CES3:6xHis를 전장 단백질로부터 release하는지를 확인하였다. 이때 침묵 억제 인자 p38도 같이 발현하여 BNCS:CES3:6XHis의 발현을 높게 유도하였다. 유전자들을 Agrobacterium을 이용하여 N. benthamiana 잎에 도입한 후 3, 5, 7 DPI에서 수확하고 단백질을 추출한 다음 SDS-PAGE로 전개하고 이어서 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다.

그 결과, bdSENP1이 함께 발현된 경우에는 band가 35 kD 근처에 multiple form으로 나타났다(도 2A). 이를 통해서 bdSENP1이 BNCS:CES3:6XHis의 SUMO domain을 인식하여 절단하는 것을 확인할 수 있었다.

그리고 이들 sample 중 bdSENP1의 발현을 유도한 sample을 SDS-PAGE로 전개하고 항-HA 항체를 이용하여 웨스턴블랏팅을 수행하였다. 여기에 사용한 bdSNEP1은 C-terminal에 HA로 tagging된 version을 사용하였다. 그 결과 bdSENP1이 잘 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2B).

이어서, BNCS:CES3:6XHis, p38 및 pHAbdSNEP1이 동시에 발현된 잎 조직에서 총 단백질 추출물을 만들고 이로부터 CES3:6XHis을 분리 정제하고자 하였다. 가용성 단백질 혼합물 Ni²⁺-NTA-아가로스 비드 컬럼에 로딩하여 binding을 유도한 후 resin을 20mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 여러 번 세척하고 250mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 Ni²⁺-NTA-아가로스 비드에 결합된 단백질을 용리시켰다. 이 과정에 얻어진 flow-through (FT), washing solution (W1~W3), elution (E)된 샘플을 SDS-PAGE 분리 및 Comossaic blue 염색으로 검출했다.

그 결과, 용리된 sample에 35 kD에 위치하는 단백질을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 CES3:6XHis를 Ni²⁺-NTA-아가로스 비드 컬럼으로 분리 정제할 수 있음을 확인하였다(도 2C).

또한, 이 단백질이 CES3:6XHis인지를 검증하기 위해서 항-His 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였으며, 그 결과, 이 단백질들이 CES3:6XHis임을 확인하였다(도 2D).

정제된 CES3:6XHis 단백질과 LPS의 결합 확인

분리정제된 CES3:6XHis 단백질이 LPS에 결합을 하는지를 확인하고자 하였다. 그람 음성균인 대장균은 외막 표면이 LPS로 구성되어 있다. 따라서 CES3:6XHis가 LPS와 결합할 수 있다.

밤새 배양한 LB 배지에서 배양한 E.coli 균주 JMO109를 원심분리 한 후 PBS 완충액으로 여러 번 세척한 후 분리 정제된 CES:6XHis 단백질 더해서 1 시간 정도 실온에서 incubation하였다. 그리고 대장균을 혼합물로부터 원심분리하여 pelleting하고 이를 다시 5회 PBS 완충액으로 세척하여 결합되지 않은 CES3-6XHis를 제거하였다. 대장균을 pellet으로부터 확보하고 이를 SDS-PAGE sample buffer를 더해서 boiling 한 후 상등액을 SDS-PAGE로 분리하고 CBB로 염색하거나 (도 3A, lane 2) 항-His 항체로 웨스턴 블롯팅하였다(도 3B, lane 2). 이 때, E. coli (lane 1)와 분리정제한 단백질 (lane 4)이 대조군으로 사용되었다.

그 결과, ~28 kDa CES3:6XHis가 E. coli를 침전하여 얻어진 단백질 샘플에 존재함을 알 수 있었다(도 3A 및 B, lane 2). 이를 통해서 CES3:6XHis가 LPS에 결합할 수 있음을 알 수 있었다.

CES3의 C 말단에 fusion된 셀룰로오스 결합 도메인 CBM3은 CES3의 LPS 결합에 영향을 미치지 않음을 확인

위의 결과를 기반으로 CES3을 사용하여 내독소를 제거하는 기술을 발명하고자 하였다.

단백질에 오염된 LPS를 제거하는 시스템을 개발하기 위해서 먼저 CES3:CBM3를 생산하기 위한 재조합 유전자를 구축하였다. 이를 위해서 BNCS:CES3:6XHis에서 SUMO 앞에 위치한 CBM3 위치를 CES3 뒤로 옮겨서 BNS:CES3:CBM3를 디자인하였다. 이 재조합 단백질에서는 bdSENP1을 이용하여 CES3를 전장 단백질에서 방출될 수 있으며 또한 CBM3 도메인에 의해 미세결정질 셀룰로스(MCC) 비드에 고정될 수 있다(도 4A) 이 유전자를 발현 vector에 옮기고 아그로박테리움 매개를 통해서 N. benthamiana에 발현을 하였다. 침묵 억제인자 p38을 함게 발현하도록 하였다. 침윤 후 5 및 7 dpi에 수확된 잎에서 단백질을 추출하고 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

그 결과, 약 75 kD 위치에 밴드를 확인할 수 있었다(도 4B). 이를 통해서 BNS:CES3:CBM3은 두 dpi 모두에서 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. RbcL은 단백질의 loading 양을 비교하기 위해서 블로팅 멤브레인을 CBB 염색한 것으로 동일한 단백질이 loading되었다는 것을 확인하였다.

이어서, BNS:CES3:CBM3단백질이 MCC bead에 결합하는지를 확인하고자 하였다. 총 단백질 추출액을 세척된 MCC 비드와 함께 1시간 동안 인큐베이션하여 MCC bead에 BNS:CES3:CBM3의 binding을 유도하였다. 이 후 MCC bead를 원심분리하여 pelleting 하여 회수하였다. 상등액을 flow-through (FT) fraction으로 회수하였다. 비드를 3 회 세척하고 세척액은 W1~W3로 확보하였으며, MCC bead는 1X SDS-PAGE sample 완충액을 첨가하여 boiling을 통해서 MCC bead에 결합한 단백질을 용출하고 (E), 이를 SDS-PAGE를 통해서 분리하고 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅하였다.

그 결과, 총 단백질 추출액에 있던 BNS:CES3:CBM3이 다른 fraction에는 나타나지 않고 E fraction에만 나오는 것을 확인하였으며, 이를 통해서 BNS:CES3:CBM3이 MCC bead에 잘 결합함을 확인할 수 있었다(도 4C).

다음으로, MCC bead에 결합한 BNS:CES3:CBM3에 LPS가 binding 하는지 확인하기 위해서 대장균을 이용하여 확인하였다. E.coli 균주 JM109를 밤새 배양하고 PBS로 5회 세척한 후 다양한 양의 E. coli 세포 현탁액을 다양한 양의 MCC-BNS:CES3:CBM3 (60ng protein; 100μl MCC bead)와 함께 인큐베이션하였다. 배양한 MCC bead가 스스로 침강되도록 여러 번 세척한 다음 sample buffer를 넣고 boiling 한 후 상등액을 SDS-PAGE로 분리한 후 CBB 염색을 실행하여 대장균 단백질의 유무를 확인하였다. 대조군으로 25, 50 및 100 μl의 MCC와 E. coli를 함께 incubation한 것이 대조군으로 사용되었다.

그 결과, MCC-BNS:CES3:CBM3와 대장균을 incubation한 sample에서 25μl와 50μl MCC bead와 대장균을 incubation 한 sample 보다 훨씬 높은 band intensity를 주었다(도 4D). 100 μl의 MCC bead를 넣은 sample에서는 MCC-BNS:CES3:CBM3와 차이가 없었다. 겔의 CBB 염색을 통해서 E. coli 단백질이 BNS:CES3:CBM3-MCC 비드 복합체에서 얻어진 상등액에서 검출되었지만 MCC 비드 단독에서는 검출되지 않았다. 이는 MCC bead가 약하지만 LPS에 결합하는 능력이 있는 것으로 해석되었다. E. coli 단독으로는 pelleting되지 않는 조건이라는 것은 E. coli 만 incubation한 sample을 통해서 확인하였다.

이어서, 동일한 membrane을 항-CBM3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅 수행하였다. 그 결과 BNS:CES3:CBM3을 확인할 수 있었다(도 4E).

내독소 오염이 없는 NS:CES3:CBM3 생산을 위한 형질전환 애기장대 구축

BNS:CES3:CBM3을 사용하여 LPS 제거 시스템을 개발하기 위해 형질전환 식물에서 BNS:CES3:CBM3을 생산하고자 하였다. 아그로박테리움은 그람 음성 박테리아이기 때문에 아그로박테리움 매개 침투를 사용하여 N. 벤타미아나에서 일시적인 발현에 의해 생성된 단백질은 LPS 오염의 가능성이 있다. 따라서 완전히 내독소가 없는 환경에서 BNS:CES3:CBM3을 생산하기 위해 애기장대(Arabidopsis)를 사용하여 BNS:CES3:CBM3을 발현하는 형질전환 식물을 구축하였다(도 5A). BNS:CES3:CBM3을 포함하는 형질전환 식물을 생성하기 위해 꽃 침지 방법을 사용했다. 형질전환 식물의 T3 세대에서 BNS-CES3:CBM3의 발현을 조사하였다. T3 세대의 개별 식물에서 총 단백질 추출물 얻고 이를 SDS-PAGE로 분리하고 항-CBM3 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 많은 형질전환 계통 중에서 독립 계통 10 및 14의 식물에서 높은 발현을 확인하였다.

그 결과, BNS:CES3:CBM3를 형질전환한 식물에서 약한 ~77kD와 강한 ~48kD 크기의 두 단백질 밴드가 검출되었다(도 5B). 분자량이 78 kD는 전장 BNS:CES3:CBM3에 해당하고 ~48 kDa 밴드는 절단된 단백질로 CES3:CBM3에 해당하였다. 따라서 애기장대 형질전환체에서는 BNS:CES3:CBM3이 발현된 후 대부분의 단백질이 외부에서 도입된 bdSNEP1 없이도 endogenous protease에 의해서 CES3:CBM3로 만들어짐을 알 수 있었다. 이전 연구에서는 SUMO 도메인을 포함하는 특정 재조합 단백질이 생체 내에서 알려지지 않은 내인성 프로테아제에 의해 SUMO의 C-말단 영역에서 단백질 분해가 일어난다는 것이 보고되었었다. 이는 애기장대의 소포체에서 BNS:CES3:CBM3이 SUMO 부위에서 절단되는 것으로, bdSENP1을 처리하지 않아도 CES3:CBM3을 생산할 수 있는 잇점이기도 하다.

이어서, BNS:CES3:CBM3에서 발현된 재조합 단백질이 MCC에 결합하는지 확인하고자 하였다. 무균 조건의 인공 배양챔버에서 형질전환 Arabidopsis 식물을 키우고, 이들 식물체로부터 단백질 추출물을 내독소가 없는 완충액을 사용하여 만들었다. 총 가용성 단백질 추출물을 미리 세척한 MCC 비드와 혼합한 후, incubation을 하고 이어서 MCC 비드를 원심분리에 의해 침전시키고 여러번 세척하였다. 이렇게 확보된 MCC 비드를 boiling하여 방출된 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고 항-CBM3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.

그 결과, bdSNEP1에 의해 BNS:CES3:CBM3에서 방출된 CES3:CBM3의 크기에 해당하는 ~48kDa에서 단백질 밴드를 확인하였다(도 5C). 이로서, 48 kD 위치에 있는 단백질들이 MCC bead에 잘 결합함을 확인하였다.

MCC 비드에 결합된 CES3:CBM3을 이용한 단백질 샘플의 내독소 제거 확인

MCC 비드에 결합된 CBM3:CES3이 단백질 샘플에서 내독소를 제거할 수 있는지 여부를 테스트하였다.

이를 위해 1㎍의 내독소가 없는 BSA(소 혈청 알부민)와 E. coli O111:B4의 LPS를 혼합하여 내독소 농도가 0.9EU가 되도록 LPS를 포함하는 단백질 샘플을 만들었다. 내독소 함유 BSA 용액을 MCC 비드 단독 또는 CES3:CBM3과 함께 MCC 비드와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 샘플의 원심분리 후, MCC 비드 및 상등액을 별도로 수집하였다. 상등액에서 LAL 시험을 이용하여 결합하지 않은 내독소를 측정하고, 계산하여 원래 첨가된 양과 비교하였다. BSA와 LPS의 양을 조사하였다.

그 결과, MCC bead나 CES3:CBM3-MCC이 없는 경우에는 0.8 EU의 LPS가 측정되었으며 MCC bead 단독인 경우 0.38EU, CES3:CBM3-MCC 경우 0.08EU의 LPS가 확인되었다(도 6A). 즉, MCC bead 단독과 CES3:CBM3-MCC 비드 복합체로 인큐베이션 한 샘플의 상층액에 있는 LPS의 양은 각각 대조군의 80% 및 20%로 감소되었다. 이를 통해서 MCC bead 단독으로도 LPS를 제거할 수 있지만 CES3:CBM3-MCC은 훨씬 강력하게 LPS를 제거함을 알 수 있었다. 그리고 이러한 과정에서 BSA의 양에는 변화가 없음을 확인하였다(도 6B). 따라서, 단백질 손실 없이 단백질 sample에 포함된 LPS를 제거할 수 있음을 확인하였다. 데이터는 오차 막대가 ±SEM, n=4, p<0.0039인 GraphPad Prism에서 학생의 t-검정을 사용하여 분석되었다. ***: p<0.0002 및 0.0004.

이어서, E.coli에서 발현 후 정제된 단백질을 이용하여 LPS의 제거 가능성을 확인하였다. E.coli 균주 BL21에서 His-bdSNEP1의 발현을 유도하고 총 단백질 추출물로부터 Ni²⁺-NTA 친화성 크로마토그래피로 정제한 후 엔도톡신을 측정하였다. 단백질을 농축한 다음 1mL 시스템에서 1μg 단백질이 1EU 미만의 엔도톡신이 오염되도록 희석하였다. 이는 LAL 검사가 시스템에서 1EU 이상 효과적으로 내독소를 검출하는데 한계가 있기 때문이다. CES3:CBM3-MCC와 정제된 His-bdSNEP1 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 원심분리하여 상등액을 수집하였다. 대조군으로 MCC bead 단독이 사용되었다. 상층액의 내독소의 양은 미처리 시료(Control)와 비교하여 LAL-test를 사용하여 측정하였다.

그 결과, control에는 0.85 EU의 LPS가 검출되었고, MCC bead 단독으로는 0.81EU가 검출되었다. 반면에 CES3:CBM3-MCC의 경우에는 0.39EU가 검출되었다. 이를 통해서 CES3:CBM3-MCC가 단백질에 오염된 LPS를 제거할 수 있음을 확인하였다(도 6C). 그리고, 이러한 과정에 단백질의 소실 여부를 확인하기 위해서 His-bdSENP1 양을 Bradford 방법을 사용하여 측정하였으며, 단백질의 소실이 없음을 확인하였다(도 6D). 모든 데이터는 오차 막대가 ±SEM, n=3, *: p<0.0118 **: p<0.0039인 GraphPad Prism에서 Student's t-test를 사용하여 분석되었다.

종합하면, 형질전환체로부터 분리된 단백질이 결합된 비드 복합체가 E. coli O111:B4 유래의 LPS가 혼합된 단백질 혼합물에서 약 80%의 내독소를 제거함을 확인하였으며, 단백질 샘플의 소실 없이 오염된 LPS를 제거할 수 있음을 확인하였다.

SEQUENCE LISTING <110> POSTECH Research and Business Development Foundation <120> Method for removal of endotoxin LPS using recombinant proteins containing the sushi motifs of Factor C produced in plants <130> 1070768 <160> 17 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 751 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 35S promoter <400> 1 gtcaacatgg tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga tacagtctca 60 gaagaccaga gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa cctcctcgga 120 ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc gaaaggacag tagaaaagga agatggcttc 180 tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gctatcgttc aagatgcctc taccgacagt 240 ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg aacatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300 acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat ggtcaacatg gtggagcacg acactctcgt 360 ctactccaag aatatcaaag atacagtctc agaagaccag agggctattg agacttttca 420 acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat 480 cgaaaggaca gtagaaaagg aagatggctt ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa 540 ggctatcgtt caagatgcct ctaccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag 600 gaacatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga 660 tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc 720 tatataagga agttcatttc atttggagag g 751 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'-UTR <400> 2 attattacat caaaacaaaa a 21 <210> 3 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Bip <400> 3 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> BiP <400> 4 Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala Ile Glu Glu Ala Thr 20 25 30 Lys Leu <210> 5 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MP <400> 5 atggcaaaca tcactgtgga ttacttatat aacaaggaaa ctaaattatt tacagcaaag 60 ctaaatgtta atgagaatgt ggaatgtgga aacaatactt gcacaaacaa tgaggtgcat 120 aaccttacag aatgtaaaaa tgcgtctgtt tccatatctc ataattcatg tactgctcct 180 gat 183 <210> 6 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MP <400> 6 Met Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu 1 5 10 15 Phe Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn 20 25 30 Thr Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala 35 40 45 Ser Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala Pro Asp 50 55 60 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> (G4S)2 Linker <400> 7 ggtggaggag gttctggtgg tggaggttca 30 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> (G4S)2 Linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 477 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CBM3 <400> 9 gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60 ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120 accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180 gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240 ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300 gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360 tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420 tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477 <210> 10 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CBM3 <400> 10 Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp 1 5 10 15 Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile 50 55 60 Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr 65 70 75 80 Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu 85 90 95 Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile 100 105 110 Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val 130 135 140 Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly 145 150 155 <210> 11 <211> 240 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> bdSUMO <400> 11 atgcatatta atttgaaagt gaagggacag gacggaaacg aggttttctt ccgtatcaaa 60 agatcaacac aactcaagaa actcatgaat gcttactgcg atagacaaag cgtggacatg 120 acagctatag ctttcctatt tgatgggaga aggttgagag cggaacagac tccggatgag 180 cttgaaatgg aagatggaga tgagattgac gcaatgttac atcagactgg tgccggcggt 240 <210> 12 <211> 80 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> bdSUMO <400> 12 Met His Ile Asn Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe 1 5 10 15 Phe Arg Ile Lys Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr 20 25 30 Cys Asp Arg Gln Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp 35 40 45 Gly Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Ala Gly Gly 65 70 75 80 <210> 13 <211> 828 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CES3 <400> 13 aagggagtag atctagggtt gtgtgatgaa acgaggttcg agtgcaaatg cggcgatcca 60 ggctatgtct tcaacatccc agtgaaacaa tgtacatact tttatagatg gaggccgtat 120 tgtaagccat gtgatgatct ggaggctaaa gatatctgtc caaagtataa acgctgtcag 180 gagtgcaagg ctggtcttga ttcctgtgtt acttgtcctc ccaacaaata cggcacttgg 240 tgcagcggag aatgtcagtg taagaatggc ggtatctgtg atcagaggac aggagcttgc 300 gcatgtcgtg acagatacga gggggttcac tgtgaaattc tcaaaggttg tcctcttctt 360 ccctcggatt ctcaagttca ggaggtcaga aatccacctg ataatcccca aactattgac 420 tactcctgct cacctggatt caagcttaag ggaatggcac gaattagctg tttgccaaat 480 ggacagtgga gtaactttcc accgaaatgt attagagaat gcgccatggt ttcatctcct 540 gagcatggga aagtgaatgc tctcagtggt gatatgatag aaggggctac tttacggttt 600 tcatgtgatt ctccgtacta tttgattgga caggaaacat taacctgtca aggtaatggt 660 caatggaatg gacaaatacc tcaatgtaag aatcttgttt tctgtccaga cctggaccct 720 gtaaaccatg cagaacacaa ggttaaaatt ggtgttgaac agaagtatgg tcaatttcct 780 cagggaactg aggtgaccta tacatgctct ggtaattact ttttgatg 828 <210> 14 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CES3 <400> 14 Lys Gly Val Asp Leu Gly Leu Cys Asp Glu Thr Arg Phe Glu Cys Lys 1 5 10 15 Cys Gly Asp Pro Gly Tyr Val Phe Asn Ile Pro Val Lys Gln Cys Thr 20 25 30 Tyr Phe Tyr Arg Trp Arg Pro Tyr Cys Lys Pro Cys Asp Asp Leu Glu 35 40 45 Ala Lys Asp Ile Cys Pro Lys Tyr Lys Arg Cys Gln Glu Cys Lys Ala 50 55 60 Gly Leu Asp Ser Cys Val Thr Cys Pro Pro Asn Lys Tyr Gly Thr Trp 65 70 75 80 Cys Ser Gly Glu Cys Gln Cys Lys Asn Gly Gly Ile Cys Asp Gln Arg 85 90 95 Thr Gly Ala Cys Ala Cys Arg Asp Arg Tyr Glu Gly Val His Cys Glu 100 105 110 Ile Leu Lys Gly Cys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Ser Gln Val Gln Glu 115 120 125 Val Arg Asn Pro Pro Asp Asn Pro Gln Thr Ile Asp Tyr Ser Cys Ser 130 135 140 Pro Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn 145 150 155 160 Gly Gln Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met 165 170 175 Val Ser Ser Pro Glu His Gly Lys Val Asn Ala Leu Ser Gly Asp Met 180 185 190 Ile Glu Gly Ala Thr Leu Arg Phe Ser Cys Asp Ser Pro Tyr Tyr Leu 195 200 205 Ile Gly Gln Glu Thr Leu Thr Cys Gln Gly Asn Gly Gln Trp Asn Gly 210 215 220 Gln Ile Pro Gln Cys Lys Asn Leu Val Phe Cys Pro Asp Leu Asp Pro 225 230 235 240 Val Asn His Ala Glu His Lys Val Lys Ile Gly Val Glu Gln Lys Tyr 245 250 255 Gly Gln Phe Pro Gln Gly Thr Glu Val Thr Tyr Thr Cys Ser Gly Asn 260 265 270 Tyr Phe Leu Met 275 <210> 15 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> NT <400> 15 atgacatgga ctgctaggct tgccttgtcg atactcgccg tgctttgtac tcaggggttg 60 tttgctcaag gacaaaatac cccttggtcc tctacagagc tagctgatgc atttatcaat 120 gcattcctca acgaggctgg tagaaccggc gcatttactg ctgatcaact ggataagatg 180 tctaccatcg gagacacatt gaaaacggct atggacaaaa tggcaagaag taacaagtca 240 tcacagagtg atttacaagc tcttaatatg gctttcgctt cttcaatggc ggaaattgct 300 gcagtggaac aaggtggtct gtctgtagca gaaaagacaa atgcaattgc tgattccctt 360 aatagcgcct tttatcagac aactggagca gtcaacgttc agtttgttaa tgagattaga 420 agtttaatta gcatgttcgc ccaggcgtct gctaatgaag tt 462 <210> 16 <211> 154 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NT <400> 16 Met Thr Trp Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ser Ile Leu Ala Val Leu Cys 1 5 10 15 Thr Gln Gly Leu Phe Ala Gln Gly Gln Asn Thr Pro Trp Ser Ser Thr 20 25 30 Glu Leu Ala Asp Ala Phe Ile Asn Ala Phe Leu Asn Glu Ala Gly Arg 35 40 45 Thr Gly Ala Phe Thr Ala Asp Gln Leu Asp Lys Met Ser Thr Ile Gly 50 55 60 Asp Thr Leu Lys Thr Ala Met Asp Lys Met Ala Arg Ser Asn Lys Ser 65 70 75 80 Ser Gln Ser Asp Leu Gln Ala Leu Asn Met Ala Phe Ala Ser Ser Met 85 90 95 Ala Glu Ile Ala Ala Val Glu Gln Gly Gly Leu Ser Val Ala Glu Lys 100 105 110 Thr Asn Ala Ile Ala Asp Ser Leu Asn Ser Ala Phe Tyr Gln Thr Thr 115 120 125 Gly Ala Val Asn Val Gln Phe Val Asn Glu Ile Arg Ser Leu Ile Ser 130 135 140 Met Phe Ala Gln Ala Ser Ala Asn Glu Val 145 150 <210> 17 <211> 262 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Hsp terminator <400> 17 ctcgagatat gaagatgaag atgaaatatt tggtgtgtca aataaaaagc ttgtgtgctt 60 aagtttgtgt ttttttcttg gcttgttgtg ttatgaattt gtggcttttt ctaatattaa 120 atgaatgtaa gatctcatta taatgaataa acaaatgttt ctataatcca ttgtgaatgt 180 tttgttggat ctcttctgca gcatataact actgtatgtg ctatggtatg gactatggaa 240 tatgattaaa gataaggaat tc 262

Claims

(i) 거미줄 단백질의 NT(N-terminal) 도메인;
(ii) SUMO(a small ubiquitin-related modifier);
(iii) CBM3(Cellulose binding module 3); 및
(iv) CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motif)를 포함하는
LPS((Lipopolysaccharide) 제거용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 CES3의 유전자 서열은 서열번호 14의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 CES3의 유전자 서열은 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 CBM3는 CES3 단백질의 C말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 NT 도메인의 유전자 서열은 서열번호 16의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고,
상기 CBM3의 유전자 서열은 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고,
상기 SUMO의 유전자 서열은 서열번호 12의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제5항에 있어서,
상기 NT 도메인의 유전자 서열은 서열번호 15의 염기서열을 포함하고,
상기 CBM3의 유전자 서열은 서열번호 9의 염기서열을 포함하고,
상기 SUMO의 유전자 서열은 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting) 및 유지(retention)할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서,
상기 식물 세포에서 소포체(ER)로 목적 단백질을 타겟팅(targeting)하는 염기서열은 BiP 단백질을 코딩하는 염기서열이고,
상기 BiP 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하고,
상기 목적 단백질을 유지(retention)하는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 프로모터를 추가적으로 포함하고,
상기 프로모터는 바이러스 유래 또는 포유류 유래의 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제9항에 있어서,
상기 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환체.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로부터 만들어진 재조합 단백질.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량 생산하는 방법.
(i) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(ii) 상기 재조합 벡터를 세포에 형질전환하는 단계;
(iii) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계;
(iv) 상기 배양한 형질 전환체를 식물에 침윤하는 단계; 및
(v) 상기 식물을 분쇄하여 셀룰로스 비드에 결합하는 단계;
를 포함하는 LPS 제거용 CES3 단백질을 생산하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 (ii)단계의 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,
상기 (iv) 단계의 식물은 애기장대, 대두, 담배, 가지, 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근 및 샐러리로 이루어진 군 중에서 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리 및 양파로 이루어진 군 중에서 선택되는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
식물에서 생산된 서열번호 14로 표시되는 재조합 단백질을 MCC 비드에 결합시켜 LPS를 제거하는 시스템.
CES3(Cysteine-rich-EGF like domain-Sushi 1-3 motif)를 포함하는 서열번호 14로 표시되는 LPS 제거를 위한 재조합 단백질.