KR20230135411A

KR20230135411A - 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 강한 재조합 프로모터 및/또는 종결자를 포함하는 고발현 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR20230135411A
Application number: KR1020220032842A
Authority: KR
Inventors: 황인환; 강주현; 윤아름
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-09-25
Also published as: WO2023177114A1

Abstract

본 발명은 식물에서 목적 단백질을 대량생산하기 위한 강한 재조합 프로모터 및 종결자를 포함하는 고발현 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물 바이러스 유래 강한 프로모터 부위들을 재조합하여 제작된 슈퍼 프로모터 및/또는 두 종류의 종결자를 반복적으로 연결하여 제작된 강력한 종결자를 이용하여 목적단백질의 전사적 수준(transcription level)의 증진을 통해, 최종적으로 목적 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물체에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

Description

식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 강한 재조합 프로모터 및/또는 종결자를 포함하는 고발현 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량 생산 방법 {High expression vector containing recombinated strong promoter and/or terminator for high amount of target protein in plants and method for mass producing target protein using the same}

본 발명은 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 강한 재조합 프로모터 및 종결자를 포함하는 고발현 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 식물 바이러스 유래 강한 프로모터 부위들을 재조합하여 제작된 슈퍼 프로모터 및/또는 두 종류의 종결자를 반복적으로 연결하여 제작된 강력한 종결자를 이용하여 목적단백질의 전사적 수준(transcription level)의 증진을 통해, 최종적으로 목적 유전자의 발현을 증가시킴으로써 식물체에서 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다.

다양한 생명체에서 재조합 단백질을 만드는 기술들이 개발되었다. 최근에 식물을 이용하여 유용 재조합 단백질을 대량으로 생산하여 상용화 하고자 하는 시도들이 있었다. 식물을 이용하여 재조합 단백질을 대량 생산하는 경우 여러 이점들이 있는 것으로 제안 되었다. 우선, 대량 생산에 있어서 동물세포와 대장균 및 미생물보다 낮은 비용으로 훨씬 많은 양의 단백질을 생산할 수 있을 것으로 제안되었다. 또한, 대장균, 미생물 등에 존재하는 내독소와 같은 독소가 식물에서는 거의 없으며, 인체에 감염할 수 있는 병원체 또한 식물에는 없다. 하지만 아직 식물에서 재조합 단백질을 생산하여 상용화한 경우는 많지 않다. 가장 중요한 요인은 식물세포에서 유전자의 발현 수준이 아직은 높지 않아서 식물을 이용하여 단백질을 생산할 경우에 다른 시스템에 비해서 경쟁력이 떨어진다. 따라서, 식물에서 원하는 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 유전자 고발현 시스템에 대한 기술의 개발이 절실히 필요하다.

종결자는 전사의 종결과 mRNA 3' 말단의 프로세싱(processing)을 조율하는 형태로 전사 정도를 조절한다. 이에 강력한 종결자는 외래 유전자의 발현을 작게는 수 배 크게는 수십 배 향상시키는 것이 가능하다[Ingelbrecht et al., (1989) Different 3' end regions strongly influence the level of gene expression in plant cells, Plant C. 1:671-680; Nagaya et al., (2010) The HSP Terminator of Arabidopsis thaliana Increases Gene Expression in Plant Cells. Plant Cell Physiol. 51:328-332].

식물체에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 기술로서, 대한민국 공개특허 제10-2021-0117808호에는 Mac 프로모터의 3' 말단에 단일 염기 변형을 도입하여 원래의 Mac 프로모터보다 전사 수준이 높은 MacT 프로모터, 단백질의 발현을 높이는 M 도메인, ER의 높은 축적을 유도하는 BiP, ER에 높은 축적률을 유도하는 HDEL, RD29B의 종결 부위, 유전자 침묵 억제 인자인 p38 및 번역 증폭 서열인 5'-UTR를 순차적으로 연결하여 제조한 재조합 벡터를 이용하여 목적 단백질을 대량 생산하는 방법이 제시된 바 있다. 그러나, 식물 바이러스 유래의 강한 프로모터 부위들을 재조합하여 슈퍼 프로모터를 만들고, 두 종류의 종결자를 반복적으로 연결하여 강력한 종결자를 제조함으로써 최종적으로 목적 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 대한 기술은 알려진 바 없다.

본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 목적 단백질의 고발현을 위해, 식물 바이러스 유래 강한 프로모터 부위들을 재조합하여 제작된 슈퍼 프로모터 및/또는 두 종류의 종결자를 반복적으로 연결하여 제작된 강력한 종결자를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공하는데 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 전술한 유전자 컨스트럭트를 포함하는 목적 단백질의 대량 생산을 위한 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체가 도입된 식물 세포 및 식물체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 목적 단백질을 대량 생산 하기 위한 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 이용하여 식물체에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 다음의 (i) 및 (ii)가 순차적으로 연결된 FMM-UD 프로모터를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다:

(i) 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터; 및

(ii) 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, 효모의 GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 피그워트 하위유전체 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 상기 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 상기 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 FMM-UD 프로모터 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 FMM-UD 프로모터의 3' 말단에는 TATA 박스 서열이 포함되고, 상기 FMM-UD 프로모터의 5' 말단에는 5' UTR 유전자가 연결될 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 5' UTR 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 유전자, 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator, 3PRt)를 포함하는, 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 종결자 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함하고, 상기 감자 단백질 분해효소 억제제 II 유전자의 3' 영역은 서열번호 7의 염기서열을 포함하며, 상기 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 3PR 종결자는 서열번호 9의 염기서열을 포함할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 다음의 (i) 및 (ii)를 포함하는, 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다:

(i) 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터, 및 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, 효모의 GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열을 포함하는 FMM-UD 프로모터; 및

(ii) 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 및 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator).

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 유전자 컨스트럭트는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 인간 유래 인터루킨 6(human interleukin 6), 전사인자(transcription factor), 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 이동 단백질(movement protein), 효소, 효소 저해제, 수송 단백질, 구조 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 익스플로이티드 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질, 항원, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 유전자 컨스트럭트의 (i) 및 (ii) 사이에 BiP(Chaperone binding protein) 유전자, MP(Mannosylated peptide region) 유전자, CBM3(Cellulose-binding module 3) 유전자, SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 BiP의 아미노산 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 MP의 아미노산 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 CBM3의 아미노산 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 SUMO의 아미노산 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 BiP 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 포함하고, 상기 MP 유전자는 서열번호 12의 염기서열을 포함하며, 상기 CBM3 유전자는 서열번호 16의 염기서열을 포함하고, 상기 SUMO 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 전술한 다양한 형태의 유전자 컨스트럭트; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 전술한 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 형질전환체는 아그로박테리움일 수 있다.

나아가, 본 발명은 전술한 형질전환체가 도입된 식물 세포 및 식물체를 제공한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

추가로, 본 발명은 다음의 (a) 단계 내지 (d) 단계를 포함하는, 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 식물체의 제조방법을 제공한다:

(a) 전술한 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 단계.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기(b) 단계에서 형질전환체의 제조 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

추가로, 본 발명은 다음의 (a) 단계 내지(e) 단계를 포함하는, 식물체에서 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다:

(a) 전술한 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계;

(d) 상기 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 단계; 및

(e) 상기 (d) 단계의 식물체를 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (d) 단계에서 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 방법은 상기 형질전환체의 배양물을 식물의 잎에 주사(syringe infiltration) 하거나 또는 진공주입법(vaccum infiltration)으로 도입하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 프로모터와 종결자는 생산하고자 하는 목적 단백질을 코딩하는 유전자에 연결되어 목적 단백질의 유전자 발현 수준을 증가시킬 수 있는 효과가 있다. 세부적으로는, 식물 바이러스 유래 강한 프로모터 부위들을 재조합하여 제작된 슈퍼 프로모터인 FMM-UD 프로모터 및/또는 두 종류의 종결자를 반복적으로 연결하여 제작된 강력한 3PR 종결자는 목적 단백질의 유전자의 발현을 향상시킴으로써, 식물체에서 목적 단백질의 생산을 향상시킨다.

도 1은 목적 단백질 수준에서 FMM-UD 프로모터의 효율을 CaMV 35S 프로모터와 비교 분석한 결과로,(A)는 실험에 사용된 컨스트럭트의 개념 지도이다. IL6의 재조합 단백질 유전자는 이전 연구에서 발표한 것을 이용하여 컨스트럭트를 구축하였다 [Islam MR et al., (2019) Cost-effective production of tag-less recombinant protein in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnol J. 17:1094-1105].(B)의 왼쪽 결과는 상기(A)의 플라스미드 컨스트럭트를 아그로박테리움에 형질전환 시킨 후, 상기 아그로박테리움을 일시적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 침윤 및 발현시켜, 단백질을 추출한 다음 동량의 상기 단백질과 항-hIL6 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이며,(B)의 오른쪽 결과는 웨스턴 블롯 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이다(M, 표준 단백질 크기; NT, 비형질전환 식물).
도 2는 RNA 수준에서 FMM-UD 프로모터의 효율을 CaMV 35S 프로모터와 비교 분석한 결과로,(A)는 실험에 사용된 컨스트럭의 개념 지도이고,(B)는 상기(A)의 플라스미드 컨스트럭트를 아그로박테리움에 형질전환 시킨 후, 상기 아그로박테리움을 일시적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 침윤 및 발현시켜 총 RNA를 추출하여, 정량 역전사 유전자 증폭 기법(qRT-PCR) 분석을 수행한 결과이다.
도 3은 두 종류의 프로모터(CaMV 35S 또는 FMM-UD)에 대해 종결자 효과를 단백질 수준에서 비교 분석한 결과로서,(A)는 실험에 사용된 컨스트럭트의 개념 지도이고,(B)는(A)의 컨스트럭트에 사용된 공통된 벡터이다.(C)의 오른쪽 결과는 상기(B)의 플라스미드 컨스트럭트를 아그로박테리움에 형질전환 시킨 다음, 상기 아그로박테리움을 일시적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 침윤 및 발현시킨 3일 후 단백질을 추출하고, 항-hIL6 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이며,(C)의 왼쪽 결과는(C)의 오른쪽 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이다.(D)의 오른쪽 결과는 상기(C)에서 형질전환된 식물에서 5일 후 단백질을 추출하여, 항-hIL6 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이며,(D)의 왼쪽 결과는(D)의 오른쪽 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이다(NT, 비형질전환 대조군; M, 표준 단백질 크기; RbcL, Rubisco large subunit; p38, 유전자 침묵 억제자).
도 4는 두 종류의 프로모터(CaMV 35S 또는 FMM-UD)와 두 종류의 종결자(RD29BT 또는 3PRt)를 모두 조합하여 이들 조합에 대한 효과를 단백질 수준에서 비교 분석한 결과로서,(A)는 실험에 사용된 컨스트럭트 개념 지도이고,(B)는 상기(A)의 컨스트럭트들에 사용된 벡터의 전체 지도이다.(C)의 오른쪽 결과는 상기(B)의 플라스미드 컨스트럭트를 아그로박테리움에 형질전환 시킨 다음, 상기 아그로박테리움을 일시적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에 침윤 및 발현시켜 도입한 3 일후 단백질을 추출하여 동량의 상기 단백질과 항-hIL6 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이며,(C)의 왼쪽 결과는(C)의 오른쪽 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이다.(D)의 오른쪽 결과는 상기(C)에서 형질전환된 식물로부터 5 일 후 단백질을 추출하여 동량의 상기 단백질과 항-hIL6 항체를 반응시켜 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이며,(D)의 왼쪽 결과는(C)의 오른쪽 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색한 결과이다(NT, 비형질전환 대조군; M, 표준 단백질 크기, RbcL, Rubisco large subunit; p38, 유전자 침묵 억제자).
도 5는 본 발명에서 사용된 바이너리 벡터의 기본 구조를 나타낸 벡터 지도이다.

상술한 바와 같이, 식물체에서 단백질을 생산하는 것은 미생물이나 동물세포에서 생산하는 것과 달리 내독소, 인체 및 동물 감염 바이러스로부터 비교적 안전하며, 저비용으로 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 장점이 있다. 이에 따라, 본 발명에서는 식물체에서 목적 단백질의 유전자 발현 수준을 증가시키고자 재조합 프로모터와 재조합 종결자를 제작하고, 이를 각각 또는 모두 목적 단백질의 유전자와 연결하여 목적 단백질의 고발현을 위한 재조합 발현 벡터를 구축하였다. 본 발명에서 구축된 재조합 발현 벡터를 아그로박테리움과 같은 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 이를 니코티아나 벤타미아나(N.benthamiana)와 같은 식물체에 침윤시킨 결과, 형질전환체가 도입된 식물체에서 목적 단백질의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 목적 단백질의 고발현을 위해 제작된 재조합 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 재조합 프로모터는 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터; 및 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, 효모의 GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열을 포함하는 FMM-UD 프로모터(FMM-UD promoter) 유전자를 포함할 수 있다.

이때, 각 바이러스 프로모터 유전자 사이에는 두 바이러스 프로모터 유전자를 연결하기 위한 연결 부위의 염기서열을 선택적으로, 즉 연결 부위의 염기서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 FMM-UD 프로모터의 3' 말단에는 TATA 박스 서열이 포함될 수 있고, 상기 FMM-UD 프로모터의 5' 말단에는 번역 증폭 서열로 5' UTR 유전자가 연결될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 기존의 강한 프로모터인 CaMV 35S 프로모터보다 더욱 강한 프로모터를 개발하기 위해, 식물 바이러스 유래 프로모터인 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터(전사 시작 위치로부터 -270 내지 -63 위치의 염기서열, 서열번호 1), 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabiliis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터(전사 시작 위치로부터 -306 내지 -125 위치의 염기서열 서열, 서열번호 2) 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabillis mosaic virus full-length transcript) 프로모터(전사 시작 위치로부터 -193 내지 +63 위치의 염기서열, 서열번호 3)를 순차적으로 융합하고, 상기 융합된 프로모터에 GAL4-결합 유전자 서열을 더 추가하여 최종적으로 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 FMM-UD 프로모터를 제작하였다. 본 발명에서 제작된 FMM-UD 프로모터 및 종래의 공지된 CaMV35S 프로모터를 각각 사용하여, 목적 단백질인 hIL6를 생산하기 위해서 제조된 재조합 단백질의 유전자 서열(서열번호 20)을 발현시킨 결과, 도 1에서 확인되는 바와 같이 FMM-UD 프로모터가 CaMV35S 프로모터보다 약 4배 이상 단백질 발현이 높았다.

본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 프로모터에 의한 목적 단백질의 전사적 수준 증가를 설명하기 위하여, 정량 역전사 유전자 증폭 기법(qRT-PCR)을 이용하였다. 상기 FMM-UD 프로모터 및 CaMV 35S 프로모터를 각각 사용하여, 목적 단백질인 hIL6의 유전자 서열(서열번호 20)을 발현시킨 후 전사적 수준을 비교한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 FMM-UD 프로모터에서 약 5배 높은 전사적 수준이 나타남을 확인하였다.

다른 측면에서, 본 발명은 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 유전자, 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator)를 포함하는, 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 기존의 RD29Bt 종결자보다 강력한 종결자를 개발하기 위해, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 유전자(서열번호 6), 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역(서열번호 7) 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자(서열번호 8)가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator)를 제작하였다. 종결자의 종류에 따른 목적 단백질의 발현 수준을 확인하기 위해, 도 3(A)와 같이 종래의 공지된 RD29Bt 종결자와 본 발명에서 제조된 3PR 종결자를 각각 CaMV 35S 프로모터와 FMM-UD 프로모터에 도입하여, 이를 아그로박테리움에 침투시킨 후, 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물에 침윤시켜 3일 및 5일 후 목적 단백질인 hIL6의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3(C)에 나타난 바와 같이, 동일한 프로모터에 대해 3PR 종결자가 포함된 경우, 3일 후 목적 단백질의 발현이 약 2배 높았으며, 도 3(D)에 나타난 바와 같이 5일 후에는 약 3배 이상 발현이 높아짐을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명은 다음의 (i) 및 (ii)를 포함하는, 목적 단백질의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트를 제공한다:

(i) 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터, 및 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열을 포함하는 FMM-UD 프로모터; 및

(iii) 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 및 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator).

상기 "목적 단백질"은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 재조합 단백질로 발현 가능한 모든 종류의 단백질일 수 있다. 상기 유전자 컨스트럭트에는 발현하고자 하는 세포 내 및 외래 단백질을 코딩하는 유전자로서 포함된다. 예를 들어, 목적 단백질은 인터루킨(interleukin), 전사인자(transcription factor), 막 단백질(membrane protein), 인슐린, 사이토키닌(cytokinin), 성장 인자(growth factor), 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 이동 단백질(movement protein), 라이소자임(lysozyme), 백신, 효소, 효소 저해제, 수송 단백질, 구조 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 익스플로이티드 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질, 항원, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 이러한 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열인 "클로닝 부위" 를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 인터루킨은 인간 유래 인터루킨 6(human interleukin 6)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 인간 유래 인터루킨 6 유전자는 서열번호 20의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 인간 유래 인터루킨 6 단백질은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

이때, 상기 SUMO 유전자는 브라키포디움 디스타키온 (Brachypodium distachyon) 유래일 수 있고, 상기 CBM3 유전자는 클로스트리디움 써모셀룸 (Clostridium thermocellum) 유래 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 MP(Mannosylated peptide region) 유전자와 CBM3(Cellulose-binding module 3) 유전자 사이 및 CBM3(Cellulose-binding module 3) 유전자와 SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 유전자 사이에는 적절한 링커, 예를 들어, 1-50 아미노산 길이, 1-30 아미노산 길이, 1-20 아미노산 길이, 2-50 아미노산 길이, 2-30 아미노산 길이 또는 2-20 아미노산 길이의 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 글리신-세린((glycine-serine)이 반복되는 서열일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 링커의 유전자 서열은 서열번호 14의 염기서열을 포함하고, 상기 링커의 단백질 서열은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 본 발명자들은 도 1 내지 3의 결과를 토대로 FMM-UD 프로모터와 3PR 종결자가 독립적으로 목적 단백질의 단백질 수준을 향상시킬 수 있음을 확인하였는바, 이들 사이에 BiP-MP-CBM3-bdSUMO-hIL6-HDEL(서열 번호 20)를 삽입하여 발현 카세트를 제조하여[Islam MR et al., (2019) Cost-effective production of tag-less recombinant protein in Nicotiana benthamiana. Plant Biotechnol J. 17:1094-1105], FMM-UD 프로모터와 3PR 종결자의 조합에 따른 목적 단백질의 발현 수준을 추가로 확인하고자 하였다. BiP(Chaperone binding protein)는 목적 단백질 hIL6를 포함하는 재조합 단백질을 소포체로 타겟팅하기 위한 것이고, MP(Mannosylated peptide region)는 PTPRC (protein tyrosine phosphatase, receptor type, C)의 231 위치의 알라닌부터 290 위치의 아스파르트산까지의 60개 아미노산 잔기로 이루어진 단편으로, 단백질 발현의 수준을 높이기 위한 것이다. CBM3는 이후 단백질 정제를 위한 미정질(microcrystalline, MCC) 비드에 결합할 수 있는 부분이며, bdSUMO 유전자는 단백질의 용해성을 증가시키는 것이고, hIL6는 인간 인터루킨으로서 본 발명에서 목적 단백질에 해당하며, HDEL은 단백질을 소포체에 머무르게 하기 위한 것이다. 참고 컨스트럭트(reference construct)로 도 4(A)와 같이, 35S::RD29B-t를 제작하였고, 여기에 BiP-MP-CBM3-bdSUMO-hIL6-HDEL을 리포터(reporter) 유전자로 하여 발현 컨스트럭(expression construct)를 완성하였다. 참고 컨스트럭트와 FMM-UD::3PRt를 비교하기 위해서 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)에서 hIL6의 재조합 유전자를 발현시킨 후 단백질 수준을 확인한 결과, 도 4(C) 및 도 4(D)에 나타난 바와 같이 FMM-UD::3PRt이 가장 높은 단백질 수준을 보이는 것을 확인하였다. 이로써, 식물체에서 목적 단백질의 고발현을 위한 새로운 프로모터와 종결자의 조합으로 FMM-UD 및 3PRt의 조합을 확립하였다. 재조합 단백질의 유전자의 N-말단에 BiP 신호 서열을 연결시키고, C-말단에 HDEL 신호 서열을 연결시킴으로써, 목적 단백질을 ER(소포체)에 고농도로 축적시키는 효과를 가질 수 있다.

그러나, 소포체로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은, BiP로 제한되는 것은 아니며, 이외에도 소포체로의 타겟팅에 관여하는 다양한 신호 펩타이드를 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 소포체로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열로는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 [His/Lys/Arg][Asp/Glu]Glu-Leu의 조합에서 선택될 수 있는 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 사용할 수 있다. BiP 단백질의 N-말단에는 소포체로의 타겟팅을 결정하는 신호 펩타이드를 함유하고 있어 목적 단백질들을 소포체로 타겟팅 시키는 역할을 할 수 있다. 소포체로의 타겟팅을 위해 삽입되는 신호 펩타이드는 BiP 단백질의 N-말단의 신호 펩타이드에 국한되는 것은 아니며, 소포체로의 타겟팅에 관여하는 다양한 신호 펩타이드를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 상기 BiP의 아미노산 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 MP의 아미노산 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 CBM3의 아미노산 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 bdSUMO의 아미노산 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 BiP 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 포함하고, 상기 MP 유전자는 서열번호 12의 염기서열을 포함하며, 상기 CBM3 유전자는 서열번호 16의 염기서열을 포함하고, 상기 bdSUMO 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 아미노산 서열 및 핵산 서열은 제공된 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 서열까지 확장되어 해석될 수 있다.

상기 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 비교 영역에서의 염기서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트와 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 작동가능하게 연결된다.

본 발명에서 상기 "재조합 발현 벡터"는 전술한 다양한 형태의 유전자 컨스트럭트가 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 다양한 형태의 유전자 컨스트럭트는 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트는 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때, 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

상기 "재조합 발현 벡터"는 유전자 서열 또는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 모든 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 및 기타 매개체들로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 식물세포 또는 식물체 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 전술한 다양한 형태의 유전자 컨스트럭트를 도입하기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 공지된 벡터의 예는 pBI121, pHellsgate8, pROKII, pBI76, pET21, pSK(+), pLSAGPT, pUC, 및 pGEM을 포함한다. 또한, CMV35s 프로모터를 포함하는, 식물체에서 발현되는 벡터는 예를 들어 pCAMBIA 시리즈 (pCAMBIA1200, 1201, 1281, 1291, 1300, 1301, 1302, 1303, 1304, 1380, 1381, 2200, 2201, 2300, 2301, 3200, 3201, 3300), pMDC32, 및 pC-TAPapYL436와 같은 것이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 당업자라면 본 발명의 유전자 컨스트럭트를 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 전술한 다양한 형태의 유전자 컨스트럭트를 식물 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 도 5의 벡터에서 제한효소 PstI 및 EcoRI 위치를 이용하여 FMM-UD 프로모터-목적 단백질-3PR 종결자를 삽입하여 재조합 벡터를 제조하였다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 레몬 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 해바라기, 코스모스 및 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것일 수 있다.

(a) 전술한 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 단계.

본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (b) 단계에서 형질전환체의 제조 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

추가로, 본 발명은 다음의(a) 단계 내지 (e) 단계를 포함하는, 식물체에서 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다:

(a) 전술한 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계;

본 발명에 따른 목적 단백질의 대량 생산 방법에 있어서, 상기 (d) 단계에서 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 방법은 상기 형질전환체의 배양물을 식물의 잎에 주사(syringe infiltration) 하거나 또는 진공주입법(vaccum infiltration)으로 도입하는 것일 수 있다. 이와 같이 주입된 아그로박테리움은 아세토시린곤(acetosyringone) 물질에 의해 신호를 받아 상기 벡터의 프로모터-목적단백질-종결자 컨스트럭을 식물 세포내로 전달하게 된다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 대량 생산 방법에 있어서, 상기 (e) 단계에서 목적 단백질을 추출하는 것은 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위하여 상기 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 또는 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 목적 단백질을 정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 단, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발 명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

목적 단백질 수준에서 CaMV 35S보다 높은 발현 수준을 보여주는 프로모터의 효과 확인

도 1(A)에 나타낸 것과 같이, 발현 벡터를 구성하였고, 프로모터는 FMM-UD 또는 CaMV 35S을 사용하였다. 상기 두 종류의 각각 프로모터에 수용성 단백질인 hIL6(Human interleukin6)를 RD29B 종결자와 연결하여 발현용 바이너리 벡터(binary vector)를 완성하였다. 상기 바이너리 벡터의 기본구조(backbone)로는 도 5의 벡터를 이용하였다. 각각의 프로모터-hIL6-RD29Bt 컨스트럭트는 pstI 과 EcorI 제한효소 위치를 이용하여 바이너리 벡터에 도입되었다. 상기 바이너리 벡터는 아그로박테리움에 전기적충격법으로 형질전환(transformation)되었고, 상기 형질전환된 아그로박테리움은 항생제인 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L 및 100 mg/L)을 포함하는 LB 배지에 28 ℃에서 40시간 동안 빛이 없는 환경에서 배양되었다. 하나의 콜로니를 선택한 후 5 mL의 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L 및 100 mg/L)을 포함하는 LB 배지에서 15시간 어두운 상태에서 교반(shaking)하면서 배양하였다. 15 시간 후, 상기 아그로박테리움을 침윤 용액(infiltration buffer; 10 mM MES, 10 mM MgSO₄) 및 식물 신호 물질인 아세토시린곤(acetosyringone) 200 μM과 상온에서 교반 없이 1시간 30분 배양하였다.

상기 아그로박테리움을 발아 후 5주가 된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물에 1 ml 주사기를 이용하여 주입하였다. 상기 식물로부터 3일 후 잎을 수확하여 질소 고정하고 분쇄하여 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출 용액 [50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X100, 및 1% 프로테아제 억제제(protease inhibitor cocktail)]을 이용하여 추출되었으며, 해당 추출물의 상층액에 6Х 샘플 용액 [500 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 30% 글리세롤(v/v), 및 100 mM DTT]을 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 상기 과정을 통하여 추출된 샘플을 5 분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE를 통해서 분리한 후, 이후 항-hIL6 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(western blot analysis)을 수행하였다. 이를 통해서 CaMV 35S와 FMM-UD의 각 프로모터의 발현 수준을 비교 분석하였다. 그 결과, 도 1(B)에 나타난 바와 같이 FMM-UD 프로모터가 CaMV 35S 보다는 월등히 높으며, 최소한 CaMV 35S 프로모터보다 4배 이상 더 강도 높은 프로모터임을 확인하였다.

목적 RNA 수준에서 CaMV 35S보다 높은 발현 수준을 보여주는 프로모터의 효과 확인

실시예 1과 동일하게 CaMV 35S와 FMM-UD 프로모터를 각각 RD29B 종결자 및 목적 단백질인 hIL6와 연결하고 바이너리 벡터에 도입하여 도 2(A)와 같이 발현 벡터를 구성하였다. 상기 바이너리 벡터를 아그로박테리움에 형질전환하고, 실시예 1에 기술한 방법으로 아그로박테리움을 배양한 후 식물에 침윤(infiltration) 시켰다. 상기 침윤시킨 식물의 잎을 3일 후 수확하고, RNeasy 키트(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 추출한 후, 추출한 RNA와 hIL6 프라이머를 넣고 PCR을 진행하여 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA로 qRT-PCR 키트(Invitrogen)를 사용하여 정량 역전사 유전자 증폭(qRT-PCR)을 수행하여 CaMV 35S 프로모터와 FMM-UD프로모터의 활성도를 RNA 수준에서 확인하였다. 상대적 정량을 위한 참고 유전자(reference gene)로는 액틴(actin)이 사용되었다. 그 결과, 도 2(B)에 나타난 바와 같이 FMM-UD프로모터가 CaMV 35S 프로모터보다 전사적 수준(transcription level)에서 약 5배 강한 프로모터임을 확인하였다.

최적의 발현 수준을 보이는 종결 부위의 확인

도 3(A)에 나타낸 바와 같이 발현 컨스트럭트들을 제작하였다. 프로모터는 CaMV 35S 또는 FMM-UD프로모터를 사용하고 종결 부위로는 효율이 높다고 알려진 RD29B 종결자를 대조군(control group)으로 사용하고 3PR 종결자를 실험군으로 사용하였다. 그 사이에 단백질을 소포체에 머무를 수 있게 해주는 BiP, 이후 단백질 정제에 필요한 CBM3, 단백질 용해성을 증가시키는 bdSUMO, 목적 단백질인 hIL6(Human interleukin 6) 및 소포체로 이동시켜주는 신호인 HDEL을 포함하는 BiP-CBM3-bdSUMO-hIL6-HDEL 유전자를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다.

상기와 같이 디자인된 발현 카세트를 도 3(B)에 나타낸 바와 같이 바이너리 벡터(binary vector)로 제한효소를 통하여 도입하였다. 상기 사용된 제한효소 자리는 PstI과 EcoRI이다. 이들 각각의 컨스트럭트를 전기충격법(electric shock)으로 아그로박테리움에 형질전환 시킨 후, 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L 및 100 mg/L)을 포함하는 LB 배지에 28 ℃에서 40 시간 동안 빛이 없는 환경에서 배양하였다. 단일 콜로니를 카나마이신과 리팜피신을 포함하는 5 mL의 LB 배지에서 15시간 동안 어두운 환경에서 교반(shaking) 시키며 배양하였다. 15 시간 후, 상기 아그로박테리움을 침윤 용액(infiltration buffer; 10 mM MES, 10 mM MgSO₄) 및 식물 신호 물질인 아세토시린곤(acetosyringone) 200 μM과 상온에서 교반 없이 1시간 30분 처리하였다.

상기 아그로박테리움 용액을 발아 후 5주가 된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물 잎 전체에 1ml 주사기를 이용하여 주입하였다. 상기 아그로박테리움이 주입된 식물로부터 3일 및 5일 후 잎을 수확하여 단백질을 추출하였다. 단백질 추출물은 추출 용액(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X100, 및 1% 프로테아제 억제제 칵테일)을 이용하여 추출하였고, 여기에 6Х 샘플 용액 [500 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 30% 글리세롤(v/v), 및 100 mM DTT]을 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 상기 과정을 통하여 추출된 샘플을 5 분 동안 끓이고, 10% SDS-PAGE를 통해서 분리한 후, 이후 항-hIL6 항체를 이용하여 웨스턴 블롯(western blot analysis)을 수행하였다. 이후 상기 멤브레인을 쿠마시 블루로 20 분 동안 염색하였다. 그 결과, 도 3(C) 및 도 3(D)에 나타난 바와 같이 CaMV35s 프로모터와 FMM-UD 프로모터 모두에서 3PR 종결자가 RD29B 종결자보다 발현 수준이 높은 것을 확인하였다.

최고의 발현을 보여주는 최적의 프로모터 및 종결자의 조합 확인

도 4(A)에 나타낸 바와 같이 다양한 조합의 프로모터 및 종결 부위를 이용하여 4 가지 종류의 발현 컨스트럭트, 35S::RD29Bt, FMM-UD::RD29Bt, 35S::3PRt 및 FMM-UD::3PRt를 제작하였다. 그 사이에 BiP-CBM3-bdSUMO-hIL6-HDEL 유전자를 삽입하여 발현 카세트를 제작하였다. 상기와 같이 디자인된 발현 카세트를 제한효소를 통하여 도 3(B)에 나타낸 바와 같이 바이너리 벡터(binary vector)로 도입하였다. 상기 사용된 제한효소는 PstI과 EcoRI이다. 이들 각각의 컨스트럭트를 전기충격법(electric shock)으로 아그로박테리움에 형질전환시킨 후, 카나마이신과 리팜피신(각각 50 mg/L 및 100 mg/L)를 포함하는 LB 배지에 28 ℃에서 40 시간 동안 빛이 없는 환경에서 배양하였다. 단일 콜로니를 카나마이신과 리팜피신를 포함하는 5 mL의 LB 배지에서 15시간동안 교반(shaking)시키며 어둠이 없는 환경에서 배양하였다. 15 시간 후, 상기 아그로박테리움을 침윤 용액(infiltration buffer; 10 mM MES, 10 mM MgSO₄) 및 식물 신호 물질인 아세토시린곤(acetosyringone) 200 μM과 상온에서 교반 없이 1시간 30분 처리하였다.

상기 아그로박테리움 용액을 발아 후 5주가 된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 식물 잎 전체에 1ml 주사기를 이용하여 주입하였다. 상기 아그로박테리움이 주입된 식물로부터 3 일 및 5 일 후 잎을 수확하여 단백질을 추출하였다. 수확된 잎은 즉시 질소 고정되었고, 상기 질소 고정된 잎은 분쇄시켜 추출 용액(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% Triton X100, 및 1% 프로테아제 억제제 칵테일)을 이용하여 단백질을 추출하였다. 여기에 6Х 샘플 용액 [500 mM Tris-HCl(pH 6.8), 10% SDS, 0.5% 브로모페놀 블루, 30% 글리세롤(v/v), 및 100 mM DTT]을 최종 1Х 농도로 첨가하여 전기영동 단백질 샘플(sample)을 만들었다. 상기 과정을 통하여 추출된 샘플을 5 분 동안 끓이고, 10% SDS-PAGE를 통해서 분리한 후, 항-hIL6 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이후 상기 멤브레인을 쿠마시 블루로 염색하였다. 그 결과, 도 4(C) 및 4(D)에 나타난 바와 같이, FMM-UD 프로모터와 3PR 종결자를 조합하여 hIL6을 발현시켰을 때 가장 발현 수준이 높다는 것을 확인하였다.

본 발명의 실시예에서 사용된 유전자 서열 및 이의 아미노산 서열 정보는 하기 표 1과 같다.

명칭	염기서열/아미노산 서열	서열번호
피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 (전사 시작 위치로부터 -270 내지 -63 위치)	tttacagtaagaactgataacaaaaattttacttatttccttagaattaatcttaaaggtgatagtaaacaaggacgattagtccgttggcaaaattggttcagcaagtatcaatttgatgtcgaacatcttgaaggtgtaaaaaacgttttagcagattgcctcacgagagattttaatgcttaaaaacgtaagcgctgacgtatga	1
미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 (전사 시작 위치로부터 -306 내지 -125 위치)	gttttacagtcaggacagataatgtaaatcttttaaaaggatttatgaataaaaagattactggtgacagtaaacagggaaggctaataagatggcaaatgtggttttcacattacacctttaaggtggaccacctaaaaggagaacaaaatgtgctggctgattatctcaccagagaatt	2
미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 (전사 시작 위치로부터 -193 내지 + 63 위치)	aaaagatgatgcccgacagccacttgtgtgaagcatgtgaagccggtccctccactaagaaaattagtgaagcatcttccagtggtccctccactcacagctcaatcagtgagcaacaggacgaaggaaatgacgtaagccatgacgtctaatcccacaagaatttccttatataaggaacacaaatcagaaggaagagatcaatcgaaatcaaaatcggaatcgaaatcaaaatcggaatcgaaatctctcatct	3
FMM-UD 프로모터	atccacgggtgacagccctccgacgggtgacagccctccgacgggtgacagccctccgacgggtgacagccctccggattttacagtaagaactgataacaaaaattttacttatttccttagaattaatcttaaaggtgatagtaaacaaggacgattagtccgttggcaaaattggttcagcaagtatcaatttgatgtcgaacatcttgaaggtgtaaaaaacgttttagcagattgcctcacgagagattttaatgcttaaaaacgtaagcgctgacgtatgagttttacagtcaggacagataatgtaaatcttttaaaaggatttatgaataaaaagattactggtgacagtaaacagggaaggctaataagatggcaaatgtggttttcacattacacctttaaggtggaccacctaaaaggagaacaaaatgtgctggctgattatctcaccagagaattagcgtgggcggcgtgggcgtagatctagcgtgggcggcgtgggcgtaaaagatgatgcccgacagccacttgtgtgaagcatgtgaagccggtccctccactaagaaaattagtgaagcatcttccagtggtccctccactcacagctcaatcagtgagcaacaggacgaaggaaatgacgtaagccatgacgtctaatcccacaagaatttccttatataaggaacacaaatcagaaggaagagatcaatcgaaatcaaaatcggaatcgaaatcaaaatcggaatcgaaatctctcatct	4
5' UTR	attattacatcaaaacaaaaa	5
CaMV 35S 종결자	gtccgcaaaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctatttttctccagaataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcttatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgac	6
PI-II 종결자	ctagagtcaccctgcaatgtgaccctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactaattatctgaataagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcattttattaaccaattccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgctaattattgggggatagtgcaaaaagaaatctacgttctcaataattcagatagaaaacttaataaagtgagataatttacatagattgcttttatcctttgatatatgtgaaaccatgcatgatataaggaaaatagatagagaaataattttttacatcgttgaatatgtaaacaatttaattcaagaagctaggaatataaatattgaggagtttatgatt	7
RB7	accaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagt	8
3PR 종결자	gtccgcaaaaatcaccagtctctctctacaaatctatctctctctatttttctccagaataatgtgtgagtagttcccagataagggaattagggttcttatagggtttcgctcatgtgttgagcatataagaaacccttagtatgtatttgtatttgtaaaatacttctatcaataaaatttctaattcctaaaaccaaaatccagtgacgagctcctagagtcaccctgcaatgtgaccctagacttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactaattatctgaataagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcattttattaaccaattccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgctaattattgggggatagtgcaaaaagaaatctacgttctcaataattcagatagaaaacttaataaagtgagataatttacatagattgcttttatcctttgatatatgtgaaaccatgcatgatataaggaaaatagatagagaaataattttttacatcgttgaatatgtaaacaatttaattcaagaagctaggaatataaatattgaggagtttatgattgagctcaccaactcggtccatttgcacccctaatcataatagctttaatatttcaagatattattaagttaacgttgtcaatatcctggaaattttgcaaaatgaatcaagcctatatggctgtaatatgaatttaaaagcagctcgatgtggtggtaatatgtaatttacttgattctaaaaaaatatcccaagtattaataatttctgctaggaagaaggttagctacgatttacagcaaagccagaatacaaagaaccataaagtgattgaagctcgaaatatacgaaggaacaaatatttttaaaaaaatacgcaatgacttggaacaaaagaaagtgatatattttttgttcttaaacaagcatcccctctaaagaatggcagttttcctttgcatgtaactattatgctcccttcgttacaaaaattttggactactattgggaacttcttctgaaaatagtg	9
BiP	atggctcgctcgtttggagctaacagtaccgttgtgttggcgatcatcttcttcggtgagtgattttccgatcttcttctccgatttagatctcctctacattgttgcttaatctcagaaccttttttcgttgttcctggatctgaatgtgtttgtttgcaatttcacgatcttaaaaggttagatctcgattggtattgacgattggaatctttacgatttcaggatgtttatttgcgttgtcctctgcaatagaagaggctacgaagtta	10
BiP	MARSFGANSTVVLAIIFFGCLFALSSAIEEATKL	11
MP	gcaaacatcactgtggattacttatataacaaggaaactaaattatttacagcaaagctaaatgttaatgagaatgtggaatgtggaaacaatacttgcacaaacaatgaggtgcataaccttacagaatgtaaaaatgcgtctgtttccatatctcataattcatgtactgctcctgat	12
MP	ANITVDYLYNKETKLFTAKLNVNENVECGNNTCTNNEVHNLTECKNASVSISHNSCTAPD	13
링커	ggtggaggtgggtctggtggtggatca	14
링커	GGGGSGGGS	15
CBM3	gtatcaggtaaccttaaggtggagttttacaactcgaacccttctgatacaactaactcaataaacccacagttcaaagttacaaacacaggcagctctgcgatcgatttgtctaaattaaccctcagatactattatacggttgatggacagaaggaccagactttctggtgtgatcatgcagctatcattggttctaacggtagctacaacggaattacatcaaacgtgaagggcactttcgttaagatgtcctctagcactaacaacgcagacacatatttggagatcagttttacggggggaacccttgaaccaggtgctcacgtccagattcaaggaagattcgctaaaaacgactggtcgaactatacccaaagtaatgattacagttttaaatccgcctcacaatttgttgagtgggatcaggtcactgcttacctgaacggggttctagtgtggggaaaggaacctggtccc	16
CBM3	VSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWCDHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAKNDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPGP	17
bdSUMO	atgcatattaatttgaaagtgaagggacaggacggaaacgaggttttcttccgtatcaaaagatcaacacaactcaagaaactcatgaatgcttactgcgatagacaaagcgtggacatgacagctatagctttcctatttgatgggagaaggttgagagcggaacagactccggatgagcttgaaatggaagatggagatgagattgacgcaatgttacatcagactggtggt	18
bdSUMO	MHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMTAIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG	19
hIL6	atggttcctccaggagaggattctaaggatgtggctgcacctcatagacagccattgacctcttcagaaagaatcgataagcaaattaggtacattctcgatggtatatctgctttaaggaaggagacatgtaataagtcaaacatgtgcgaaagttctaaggaggctctcgcagaaaataaccttaatttgcctaagatggctgaaaaagatggatgttttcagtctggtttcaacgaagagacttgccttgttaaaattatcacaggacttttggaatttgaggtgtatcttgaatacttacaaaacagattcgaatcaagtgaagagcaggctagggcagttcaaatgagtactaaggtgcttatacagttcttgcaaaagaaagctaagaaccttgatgcaatcactacacctgatccaaccactaatgcttcactcttaacaaagcttcaagcacagaaccaatggttgcaggatatgacaacccaccttattctcaggtcattcaaggagtttttacagtcaagtcttagggctcttaggcagatg	20
hIL6	MVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM	21
HDEL	cacgatgagctc	22
HDEL	HDEL	23

* 서열번호 10의 염기서열에서 밑줄로 표시된 부분은 인트론(intron)을 나타냄.

SEQUENCE LISTING <110> POSTECH Research and Business Development Foundation <120> High expression vector containing recombinated strong promoter and/or terminator for high amount of target protein in plants and method for mass producing target protein using the same <130> 1070536 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 208 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Figwort subgenomic transcript promoter (-270 to -63 position from the transcription start position) <400> 1 tttacagtaa gaactgataa caaaaatttt acttatttcc ttagaattaa tcttaaaggt 60 gatagtaaac aaggacgatt agtccgttgg caaaattggt tcagcaagta tcaatttgat 120 gtcgaacatc ttgaaggtgt aaaaaacgtt ttagcagatt gcctcacgag agattttaat 180 gcttaaaaac gtaagcgctg acgtatga 208 <210> 2 <211> 181 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript promoter (-306 to -125 position from the transcription start position) <400> 2 gttttacagt caggacagat aatgtaaatc ttttaaaagg atttatgaat aaaaagatta 60 ctggtgacag taaacaggga aggctaataa gatggcaaat gtggttttca cattacacct 120 ttaaggtgga ccacctaaaa ggagaacaaa atgtgctggc tgattatctc accagagaat 180 t 181 <210> 3 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mirabilis mosaic virus full-length transcript promoter (-193 to +63 position from the transcription start position) <400> 3 aaaagatgat gcccgacagc cacttgtgtg aagcatgtga agccggtccc tccactaaga 60 aaattagtga agcatcttcc agtggtccct ccactcacag ctcaatcagt gagcaacagg 120 acgaaggaaa tgacgtaagc catgacgtct aatcccacaa gaatttcctt atataaggaa 180 cacaaatcag aaggaagaga tcaatcgaaa tcaaaatcgg aatcgaaatc aaaatcggaa 240 tcgaaatctc tcatct 256 <210> 4 <211> 770 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> FMM-UD promoter <400> 4 atccacgggt gacagccctc cgacgggtga cagccctccg acgggtgaca gccctccgac 60 gggtgacagc cctccggatt ttacagtaag aactgataac aaaaatttta cttatttcct 120 tagaattaat cttaaaggtg atagtaaaca aggacgatta gtccgttggc aaaattggtt 180 cagcaagtat caatttgatg tcgaacatct tgaaggtgta aaaaacgttt tagcagattg 240 cctcacgaga gattttaatg cttaaaaacg taagcgctga cgtatgagtt ttacagtcag 300 gacagataat gtaaatcttt taaaaggatt tatgaataaa aagattactg gtgacagtaa 360 acagggaagg ctaataagat ggcaaatgtg gttttcacat tacaccttta aggtggacca 420 cctaaaagga gaacaaaatg tgctggctga ttatctcacc agagaattag cgtgggcggc 480 gtgggcgtag atctagcgtg ggcggcgtgg gcgtaaaaga tgatgcccga cagccacttg 540 tgtgaagcat gtgaagccgg tccctccact aagaaaatta gtgaagcatc ttccagtggt 600 ccctccactc acagctcaat cagtgagcaa caggacgaag gaaatgacgt aagccatgac 660 gtctaatccc acaagaattt ccttatataa ggaacacaaa tcagaaggaa gagatcaatc 720 gaaatcaaaa tcggaatcga aatcaaaatc ggaatcgaaa tctctcatct 770 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'UTR <400> 5 attattacat caaaacaaaa a 21 <210> 6 <211> 211 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CaMV 35S terminator <400> 6 gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctctatttt tctccagaat 60 aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt 120 tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 180 tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga c 211 <210> 7 <211> 556 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PI-II terminator <400> 7 ctagagtcac cctgcaatgt gaccctagac ttgtccatct tctggattgg ccaacttaat 60 taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct aatcactata atgtgggcat 120 caaagttgtg tgttatgtgt aattactaat tatctgaata agagaaagag atcatccata 180 tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc agatgcattt 240 tattaaccaa ttccatatac atataaatat taatcatata taattaatat caattgggtt 300 agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gctaattatt gggggatagt gcaaaaagaa 360 atctacgttc tcaataattc agatagaaaa cttaataaag tgagataatt tacatagatt 420 gcttttatcc tttgatatat gtgaaaccat gcatgatata aggaaaatag atagagaaat 480 aattttttac atcgttgaat atgtaaacaa tttaattcaa gaagctagga atataaatat 540 tgaggagttt atgatt 556 <210> 8 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RB7 <400> 8 accaactcgg tccatttgca cccctaatca taatagcttt aatatttcaa gatattatta 60 agttaacgtt gtcaatatcc tggaaatttt gcaaaatgaa tcaagcctat atggctgtaa 120 tatgaattta aaagcagctc gatgtggtgg taatatgtaa tttacttgat tctaaaaaaa 180 tatcccaagt attaataatt tctgctagga agaaggttag ctacgattta cagcaaagcc 240 agaatacaaa gaaccataaa gtgattgaag ctcgaaatat acgaaggaac aaatattttt 300 aaaaaaatac gcaatgactt ggaacaaaag aaagtgatat attttttgtt cttaaacaag 360 catcccctct aaagaatggc agttttcctt tgcatgtaac tattatgctc ccttcgttac 420 aaaaattttg gactactatt gggaacttct tctgaaaata gt 462 <210> 9 <211> 1242 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3PR terminator <400> 9 gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca aatctatctc tctctatttt tctccagaat 60 aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt 120 tgagcatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 180 tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga cgagctccta gagtcaccct gcaatgtgac 240 cctagacttg tccatcttct ggattggcca acttaattaa tgtatgaaat aaaaggatgc 300 acacatagtg acatgctaat cactataatg tgggcatcaa agttgtgtgt tatgtgtaat 360 tactaattat ctgaataaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca 420 cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcattttat taaccaattc catatacata 480 taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt 540 gtgttttgct aattattggg ggatagtgca aaaagaaatc tacgttctca ataattcaga 600 tagaaaactt aataaagtga gataatttac atagattgct tttatccttt gatatatgtg 660 aaaccatgca tgatataagg aaaatagata gagaaataat tttttacatc gttgaatatg 720 taaacaattt aattcaagaa gctaggaata taaatattga ggagtttatg attgagctca 780 ccaactcggt ccatttgcac ccctaatcat aatagcttta atatttcaag atattattaa 840 gttaacgttg tcaatatcct ggaaattttg caaaatgaat caagcctata tggctgtaat 900 atgaatttaa aagcagctcg atgtggtggt aatatgtaat ttacttgatt ctaaaaaaat 960 atcccaagta ttaataattt ctgctaggaa gaaggttagc tacgatttac agcaaagcca 1020 gaatacaaag aaccataaag tgattgaagc tcgaaatata cgaaggaaca aatattttta 1080 aaaaaatacg caatgacttg gaacaaaaga aagtgatata ttttttgttc ttaaacaagc 1140 atcccctcta aagaatggca gttttccttt gcatgtaact attatgctcc cttcgttaca 1200 aaaattttgg actactattg ggaacttctt ctgaaaatag tg 1242 <210> 10 <211> 272 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> BiP <400> 10 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60 tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120 ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180 ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240 tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272 <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> BiP <400> 11 Met Ala Arg Ser Phe Gly Ala Asn Ser Thr Val Val Leu Ala Ile Ile 1 5 10 15 Phe Phe Gly Cys Leu Phe Ala Leu Ser Ser Ala Ile Glu Glu Ala Thr 20 25 30 Lys Leu <210> 12 <211> 180 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> MP <400> 12 gcaaacatca ctgtggatta cttatataac aaggaaacta aattatttac agcaaagcta 60 aatgttaatg agaatgtgga atgtggaaac aatacttgca caaacaatga ggtgcataac 120 cttacagaat gtaaaaatgc gtctgtttcc atatctcata attcatgtac tgctcctgat 180 <210> 13 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MP <400> 13 Ala Asn Ile Thr Val Asp Tyr Leu Tyr Asn Lys Glu Thr Lys Leu Phe 1 5 10 15 Thr Ala Lys Leu Asn Val Asn Glu Asn Val Glu Cys Gly Asn Asn Thr 20 25 30 Cys Thr Asn Asn Glu Val His Asn Leu Thr Glu Cys Lys Asn Ala Ser 35 40 45 Val Ser Ile Ser His Asn Ser Cys Thr Ala Pro Asp 50 55 60 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> linker <400> 14 ggtggaggtg ggtctggtgg tggatca 27 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> linker <400> 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 16 <211> 480 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> CBM3 <400> 16 gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60 ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120 accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180 gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240 ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300 gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360 tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420 tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggtccc 480 <210> 17 <211> 160 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CBM3 <400> 17 Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp 1 5 10 15 Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val 35 40 45 Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile 50 55 60 Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr 65 70 75 80 Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu 85 90 95 Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile 100 105 110 Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn 115 120 125 Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val 130 135 140 Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly Pro 145 150 155 160 <210> 18 <211> 234 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> bdSUMO <400> 18 atgcatatta atttgaaagt gaagggacag gacggaaacg aggttttctt ccgtatcaaa 60 agatcaacac aactcaagaa actcatgaat gcttactgcg atagacaaag cgtggacatg 120 acagctatag ctttcctatt tgatgggaga aggttgagag cggaacagac tccggatgag 180 cttgaaatgg aagatggaga tgagattgac gcaatgttac atcagactgg tggt 234 <210> 19 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> bdSUMO <400> 19 Met His Ile Asn Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Gly Asn Glu Val Phe 1 5 10 15 Phe Arg Ile Lys Arg Ser Thr Gln Leu Lys Lys Leu Met Asn Ala Tyr 20 25 30 Cys Asp Arg Gln Ser Val Asp Met Thr Ala Ile Ala Phe Leu Phe Asp 35 40 45 Gly Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gln Thr Pro Asp Glu Leu Glu Met Glu 50 55 60 Asp Gly Asp Glu Ile Asp Ala Met Leu His Gln Thr Gly Gly 65 70 75 <210> 20 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> hIL6 <400> 20 atggttcctc caggagagga ttctaaggat gtggctgcac ctcatagaca gccattgacc 60 tcttcagaaa gaatcgataa gcaaattagg tacattctcg atggtatatc tgctttaagg 120 aaggagacat gtaataagtc aaacatgtgc gaaagttcta aggaggctct cgcagaaaat 180 aaccttaatt tgcctaagat ggctgaaaaa gatggatgtt ttcagtctgg tttcaacgaa 240 gagacttgcc ttgttaaaat tatcacagga cttttggaat ttgaggtgta tcttgaatac 300 ttacaaaaca gattcgaatc aagtgaagag caggctaggg cagttcaaat gagtactaag 360 gtgcttatac agttcttgca aaagaaagct aagaaccttg atgcaatcac tacacctgat 420 ccaaccacta atgcttcact cttaacaaag cttcaagcac agaaccaatg gttgcaggat 480 atgacaaccc accttattct caggtcattc aaggagtttt tacagtcaag tcttagggct 540 cttaggcaga tg 552 <210> 21 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> hIL6 <400> 21 Met Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg 1 5 10 15 Gln Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile 20 25 30 Leu Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn 35 40 45 Met Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu 65 70 75 80 Glu Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val 85 90 95 Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala 100 105 110 Arg Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys 115 120 125 Lys Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn 130 135 140 Ala Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp 145 150 155 160 Met Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met 180 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HDEL <400> 22 cacgatgagc tc 12 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HDEL <400> 23 His Asp Glu Leu 1

Claims

다음의 (i) 및 (ii)가 순차적으로 연결된 FMM-UD 프로모터를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트:
(i) 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터; 및
(ii) 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, 효모의 GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열.
제1항에 있어서, 상기 피그워트 하위유전체 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하고, 상기 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함하며, 상기 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체 프로모터 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제1항에 있어서, 상기 FMM-UD 프로모터 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제1항에 있어서, 상기 FMM-UD 프로모터의 3' 말단에는 TATA 박스 서열이 포함되고, 상기 FMM-UD 프로모터의 5' 말단에는 5' UTR 유전자가 연결되는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제4항에 있어서, 상기 5' UTR 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 유전자, 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator)를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제6항에 있어서, 상기 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 종결자 유전자는 서열번호 6의 염기서열을 포함하고, 상기 감자 단백질 분해효소 억제제 II 유전자의 3' 영역은 서열번호 7의 염기서열을 포함하며, 상기 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제6항에 있어서, 상기 3PR 종결자는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
다음의 (i) 및 (ii)를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트:
(i) 피그워트 하위유전체 전사체(Figwort subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편, 미라빌리스 모자이크 바이러스 하위유전체 전사체(Mirabilis mosaic virus subgenomic transcript) 프로모터 유전자 단편 및 미라빌리스 모자이크 바이러스 전장 전사체(Mirabilis mosaic virus full-length transcript) 프로모터 유전자 단편이 순차적으로 연결된 FMM 프로모터, 및 상기 FMM 프로모터의 5' 말단에 연결된, 효모의 GAL4-결합 부위 (GAL4-binding site)인 업스트림 활성 서열 (Upstream activation sequence, UAS)이 4회 반복된 업스트림 DNA (Upstream DNA, UD) 서열을 포함하는 FMM-UD 프로모터; 및
(ii) 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 종결자 및 감자 단백질 분해효소 억제제 II(potato proteinase inhibitor II) 유전자의 3' 영역 및 RB7 스캐폴드 부착(RB7 scaffold attachment) 영역의 유전자가 순차적으로 연결된 3PR 종결자(3PR terminator).
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제10항에 있어서, 목적 단백질은 인간 유래 인터루킨 6(human interleukin 6), 전사인자(transcription factor), 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 이동 단백질(movement protein), 효소, 효소 저해제, 수송 단백질, 구조 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 익스플로이티드 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질, 항원, 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질인, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제9항에 있어서, 상기 (i) 및 (ii) 사이에 BiP(Chaperone binding protein) 유전자, MP(Mannosylated peptide region) 유전자, CBM3(Cellulose-binding module 3) 유전자, SUMO(Small ubiquitin-related modifier) 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 유전자 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제12항에 있어서, 상기 BiP의 아미노산 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 MP의 아미노산 서열은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 CBM3의 아미노산 서열은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 SUMO의 아미노산 서열은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제13항에 있어서, 상기 BiP 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 포함하고, 상기 MP 유전자는 서열번호 12의 염기서열을 포함하며, 상기 CBM3 유전자는 서열번호 16의 염기서열을 포함하고, 상기 SUMO 유전자는 서열번호 18의 염기서열을 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 유전자 컨스트럭트.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 유전자 컨스트럭트; 및
목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 재조합 발현 벡터.
제15항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 형질전환체.
제16항에 있어서, 상기 형질전환체는 아그로박테리움인 것인, 목적 단백질의 유전자의 고발현을 위한 형질전환체.
제16항의 형질전환체가 도입된 식물 세포.
제16항의 형질전환체가 도입된 식물체.
제19항에 있어서, 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 레몬 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 해바라기, 코스모스 및 튤립을 포함하는 화훼류로부터 선택되는 것인, 식물체.
(a) 제15항에 따른 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(d) 상기 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 단계;
를 포함하는, 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 식물체의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 형질전환체의 제조 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법인 것인, 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 식물체의 제조방법.
(a) 제15항에 따른 재조합 발현 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 형질전환체를 배양하는 단계;
(d) 상기 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계의 식물체를 분쇄하여 목적 단백질을 추출하는 단계;
를 포함하는, 목적 단백질의 대량 생산 방법.
제23항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 형질전환체의 배양물을 식물체에 도입하는 방법은 상기 형질전환체의 배양물을 식물의 잎에 주사(syringe infiltration) 하거나 또는 진공주입법(vaccum infiltration)으로 도입하는 것인, 목적 단백질의 대량 생산 방법.