CN111556898B

CN111556898B - 包含猪fc片段的重组载体及用其制备重组蛋白的方法

Info

Publication number: CN111556898B
Application number: CN201880085087.3A
Authority: CN
Inventors: 李勇直
Original assignee: Bioapplications Inc
Current assignee: Bioapplications Inc
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2038-12-06
Also published as: JP2021502051A; KR20200033036A; JP6932393B2; WO2020059960A1; KR102148405B1; CN111556898A

Abstract

本发明涉及包含猪Fc片段的重组载体。利用本发明的重组载体将猪Fc片段与各种靶蛋白融合，不仅可以利用包括植物在内的各种宿主表达靶蛋白，还可以提高靶蛋白的产量和稳定性。

Description

包含猪FC片段的重组载体及用其制备重组蛋白的方法

技术领域

本发明涉及包含猪Fc片段的重组载体、使用该载体制备重组蛋白的方法等。

背景技术

生物医药是利用体内存在的物质生产的药物，在更广泛的意义上，可以定义为基于生物工程技术生产的药物，如基因重组、细胞融合、细胞培养等，这些技术都是先进的生物技术。这类生物医药分为蛋白质药物、治疗性抗体、疫苗、基因治疗、细胞治疗等。其中，蛋白质药物、治疗性抗体等一般是利用酵母、细菌、动物细胞、昆虫细胞等宿主生产的，这些药物的使用近年来不断增加。因此，为了有效地生产这些生物医药，需要持续开发提高重组蛋白产量、促进重组蛋白分离和提高重组蛋白稳定性的方法。

同时，分子生物学和基因工程技术的显著发展已被应用于植物领域，并因此稳步地持续努力从植物中生产有用的生理活性物质。从植物中生产有用物质可以显著降低生产成本，从根本上排除通过常规方法(从动物细胞或微生物中合成蛋白质的方法，以及分离和纯化蛋白质的方法)产生的各种污染物(病毒、癌基因、肠毒素等)，并且不同于动物细胞或微生物(韩国专利注册号10-1732624)，能够使用种子管理种子储备，即使是在商业化过程中。

因此，如果有一个重组蛋白生产系统，其即使在植物中也能使用，并且显著提高重组蛋白的产量，并且通过增加重组蛋白的溶解度和稳定性来促进重组蛋白的分离和储存，则预期能够高效生产各种领域需要的重组蛋白。

发明内容

技术问题

本发明旨在解决上述问题，本发明的目的是提供一种包含猪Fc片段的重组载体、使用该载体制备重组蛋白的方法等。

然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，对于本领域技术人员来说，通过阅读以下描述，其它未提及的技术问题将变得显而易见。

技术方案

本发明提供一种重组载体，其包含编码由SEQ ID NO:4表示的猪Fc片段的多核苷酸和编码靶蛋白的多核苷酸。

在本发明的一个实施方式中，在重组载体中，启动子基因、编码Fc片段的多核苷酸和编码靶蛋白的多核苷酸；或者启动子基因、编码靶蛋白的多核苷酸和编码Fc片段的多核苷酸可以按此顺序依次连接。

在本发明的另一实施方式中，启动子可以是来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、来自花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子、pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子等，只要启动子是已知的启动子，就不特别地限制。

在本发明的另一个实施方式中，靶蛋白可以是抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白、调节蛋白、转录因子、毒素蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶片段、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体片段、生物防御诱导剂、贮藏蛋白、运动蛋白、开发蛋白或报告蛋白，但只要靶蛋白是重组载体能够产生的蛋白质，就没有特别的限制。

在本发明的另一实施方式中，重组载体可进一步包括编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸、编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的基因、M17的5'非翻译区(UTR)位点基因等。

在本发明的另一实施方式中，重组载体增加融合了作为标签的Fc片段的靶蛋白的表达量，并增加靶蛋白的溶解度。融合可以是这样一种形式，其中靶蛋白通过肽键连接到Fc片段的N-末端和/或C-末端，但本发明不限于此，并且Fc片段连接到靶蛋白的任何形式都是可能的。

本发明还提供了用重组载体转化的转基因生物体。

在本发明的一个实施方式中，转基因生物体可以是微生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、沙门氏菌(Salmonella)、酵母等，昆虫细胞，包括人类细胞的动物细胞，动物，例如小鼠、大鼠、狗、猴子、猪、马、牛等、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、植物等，植物的例子包括粮食作物，包括水稻、小麦、大麦、玉米、豆类、土豆、红豆、燕麦和高粱；蔬菜作物包括拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大白菜、白萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、卷心菜、甜瓜(oriental melons)、南瓜、大葱(spring onions)、洋葱和胡萝卜；特殊用途农作物包括人参、烟草、棉花、芝麻、甘蔗、甜菜、紫苏、花生和油菜；水果作物包括苹果树、梨树、枣树、桃子、葡萄、橘子、柿子、李子、杏和香蕉；花卉包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合和郁金香，但本发明不限于此，可以使用能够用本发明的重组载体转化的任何活体。

本发明还提供一种重组蛋白的制备方法，其包括(a)培养转基因生物体；和(b)从转基因生物体或培养液中分离融合了Fc片段的靶蛋白并纯化靶蛋白。转基因生物体可以优选为细胞本身或含有细胞的培养物，并且培养液可以优选为通过培养细胞和去除细胞而获得的培养液，但本发明不限于此，包括本发明的重组蛋白的任何培养液都是可能的。

本发明还提供一种用于标记靶蛋白的组合物，其包括由SEQ ID NO:4表示的猪Fc片段作为活性成分。

本发明还提供由SEQ ID NO:4代表的猪Fc片段标记重组蛋白的用途。

本发明还提供一种将猪Fc片段与重组蛋白结合的方法，其包括将由SEQ ID NO:4表示的猪Fc片段与重组蛋白结合。

在本发明的一个实施方式中，该方法增加重组蛋白的稳定性。

有益效果

根据本发明的包含猪Fc片段的重组载体通过将pFc片段与各种靶蛋白融合不仅提高了靶蛋白的产量，而且增加了靶蛋白的溶解度和稳定性，促进了重组蛋白的分离和储存，因此可广泛应用于具有各种活性的靶蛋白，从而预期能够在各个领域高效生产重组蛋白。

附图说明

图1是示出根据本发明实施方式的pCAMBIA1300载体图谱的示意图。

图2是示出根据本发明实施方式的用于表达pFc融合VP1重组蛋白的基因的排列的示意图。

图3示出确认根据本发明实施方式的pFc融合VP1重组蛋白的表达量的蛋白质印迹法结果。

图4示出确认根据本发明实施方式的pFc融合VP1重组蛋白稳定性的蛋白质印迹法结果。

图5示出确认根据本发明实施方式的pFc融合VP1重组蛋白的溶解度的蛋白质印迹法结果。

图6示出确认根据本发明实施方式的pFc融合GP5重组抗原的溶解度的蛋白质印迹法结果。

图7示出确认根据本发明实施方式的pFc融合PCV2重组蛋白的溶解度和产量的蛋白质印迹法结果。

图8示出确认根据本发明实施方式的pFc融合E2重组抗原的产量的结果。

具体实施方式

在本发明中，已证实当猪免疫球蛋白Fc片段与各种生理活性蛋白质、抗原、肽等结合时，该片段不仅可以增加蛋白质的表达量和产量，而且可以增加蛋白质的溶解度和稳定性，本发明的目的是提供一种重组载体，其包括编码猪Fc片段的多核苷酸和使用该重组载体制备重组蛋白的方法。

如本文所使用的，术语“Fc片段”是指不具有抗原结合位点的Fc片段，其中当免疫球蛋白用木瓜蛋白酶消化时，只有重链(H链)部分通过S-S键连接，并且本发明的Fc片段优选为猪Fc片段，更优选由SEQ ID NO:4代表的猪Fc片段，但本发明不限于此，并且可以使用在与靶蛋白融合时增加靶蛋白的表达量和溶解度的任何Fc片段。此外，本发明的SEQ IDNO:4的Fc片段的变体在本发明的范围内。具体而言，该基因可包括与SEQ ID NO:3的碱基序列具有90％或更多、优选95％或更多、更优选98％或更多序列同源性的碱基序列。通过比较最优排列的序列与比较区域来确定相对于多核苷酸的“序列同源性％”，并且与参考序列(没有添加或删除)相比，相对于序列的最佳排列，比较区域中的多核苷酸序列的一部分可以包括添加或删除(即间隙)。

如本文所使用的，术语“靶蛋白”是指使用基因工程方法生产的蛋白质，并且靶蛋白可以优选地是需要大量生产的市售蛋白质，并且更优选地是，抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白、调节蛋白、转录因子、毒素蛋白、激素、激素类似物、细胞因子、酶、酶片段、酶抑制剂、转运蛋白、受体、受体片段、生物防御诱导剂、贮藏蛋白、运动蛋白、开发蛋白或报告蛋白，但本发明不限于此，可以使用能够用本发明的重组载体产生的任何蛋白质。

如本文所使用的，术语“重组载体”是指能够表达由插入载体中的异源核酸编码的肽或蛋白质的载体，并且优选地是指构建用于表达猪Fc片段融合靶蛋白的载体。本文中使用的术语“载体”是指用于在体外、离体(ex vivo)或体内将碱基引入和/或转移到宿主细胞中的任何载体，并且可以是指可以附加另一个DNA片段以实现附加片段的复制的复制子。术语“复制子”是指作为体内DNA复制的自主单元，即能够通过自我调节进行复制的任何遗传单元(例如，质粒、噬菌体、粘粒(cosmid)、染色体、病毒等)。本发明的重组载体可以优选地包括作为RNA聚合酶结合的转录起始因子的启动子、用于调节转录的任意操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列、调控转录和翻译终止的序列、终止子等。更优选地，重组载体可进一步包括M17的5’UTR位点基因、用于将靶蛋白运输至囊泡的BiP基因、用于最小化蛋白质降解以使蛋白质能够稳定地维持在囊泡中的HDEL基因等。更优选地，重组载体还可以包括用于容易地分离重组蛋白(Fc片段除外)的附加标签的基因、其是用于选择抗生素抗性基因等以选择转基因生物体的标记基因等。

除本发明的Fc片段以外，可另外地包括用于标签的基因以便于分离，其为标签蛋白，其示例可包括Avi标签、钙调素标签、多聚谷氨酸标签、E标签、FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、IgG Fc标签、CTB标签、Softag 1标签、Softag 3标签、Strep标签、TC标签、V5标签、VSV标签、Xpress标签等。用于选择的标记基因的示例可以包括抗除草剂(例如草甘膦和草铵膦)的基因，抗抗生素(例如卡那霉素、G418、博莱霉素、潮霉素和氯霉素)的基因，aadA基因等，启动子的示例可以包括pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子、来自花椰菜花叶病毒的35S启动子、来自花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、延伸因子-1α(EF-1α)启动子等，终止子的示例可包括胭脂碱合酶(NOS)、水稻淀粉酶RAmyl A终止子、菜豆蛋白终止子、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因终止子和大肠杆菌(E.coli)rrnB1/B2终止子，但本发明不限于此，在已知的重组载体中使用的任何基因都可以使用。

如本文所使用的，术语“融合蛋白”是指通过猪Fc片段与靶蛋白融合而产生的重组蛋白，优选地是指通过与Fc片段融合而增强溶解度的重组蛋白，但本发明不限于此，与猪Fc片段结合产生的任何重组蛋白都可以使用。

如本文所使用的，术语“转化”统称为通过注入DNA改变生物体的遗传特性，术语“转基因生物体”指通过使用分子遗传方法注入外部基因而产生的活生物体，优选地是指由本发明的重组载体转化的活生物体。只要活生物体是活生物体，如微生物、真核细胞、昆虫、动物、植物等，则活生物体并不特别受限，其示例包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、芽孢杆菌、酵母、动物细胞、小鼠、大鼠、狗、猴子、猪、马、牛、根癌农杆菌和植物。转基因生物体可以使用诸如转化、转染、农杆菌介导的转化方法、基因枪轰击、超声波、电穿孔和聚乙二醇(PEG)介导的转化方法等方法产生，但本发明不限于此，并且可以使用能够注入本发明的载体的任何方法。

如本文所使用的，术语“溶解度”是指靶蛋白或肽可溶解于适于施用于人体的溶剂中的程度。具体地说，溶解度可指示在特定温度下溶质相对于给定溶剂的饱和程度。溶解度可以通过测定溶质的饱和浓度来测量，例如，向溶剂中加入过量的溶质并搅拌和过滤该溶液，然后使用紫外光谱仪、高效液相色谱等测量其浓度，但本发明不限于此。高溶解度更适合于重组蛋白的分离和纯化，抑制重组蛋白的聚集，从而有效地维持重组蛋白的生理活性或药理活性。

以下，将描述示例性实施方式以帮助理解本发明。然而，提供以下示例仅仅是为了便于理解本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例

实施例1：pFc融合VP1重组蛋白表达载体的制备

为了制备重组载体，以通过增加靶蛋白的表达量和增强其溶解度来产生分离和纯化效率提高的重组蛋白，使用猪Fc片段(pFc)的pFc1(SEQ ID NO:1)、pFc2(SEQ ID NO:3)或者pFc3(SEQ ID NO:5)构建重组载体。更具体地说，如图1和2所示，将M17的5'非翻译区(UTR)位点基因(SEQ ID NO：7)、编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸(SEQ ID NO：8)、口蹄疫病毒(FMDV)的VP1基因(SEQ ID NO：9)、编码pFc的多核苷酸、编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)蛋白的多核苷酸按顺序克隆到pCAMBIA1300载体的CaMV 35S启动子基因和NOS终止子之间，从而完成重组载体的制备。对于pFc片段，通过插入pFc1、pFc2或pFc3制备不同的重组载体。

实施例2：pFc融合VP1重组蛋白表达实验

2.1.确认pFc融合VP1重组蛋白表达量的实验

为了确定以与实施例1相同的方式制备的pFc融合VP1重组蛋白表达载体的蛋白表达量，通过PEG介导的转化，将该载体导入从拟南芥叶片中分离的原生质体中制备转基因生物体，然后收集培养的原生质体并进行裂解，BiP:FMDV-VP1：pFc的表达模式(其是由其表达的重组蛋白)，用pFc识别的抗猪二级抗体(1:5000，Abcam)通过蛋白质印迹法进行证实。更具体地说，将30微升细胞裂解液与SDS样品缓冲液混合，然后加热。然后，在10％SDS-PAGE凝胶上按大小通过电泳分离蛋白质，将分离的蛋白质转移到PVDF膜上，然后使用5％脱脂牛奶进行封闭，然后将蛋白质与抗体结合，并使用制造商提供的方法用ECL溶液处理以识别pFc融合的重组蛋白。其结果如图3所示。

如图3所示，在与各种pFc片段融合的重组蛋白中，pFc2融合重组蛋白的表达量最高。从以上结果可以证实，相同的免疫球蛋白片段并没有表现出相同的效果。

2.2.pFc融合VP1重组蛋白的稳定性确认实验

为了确认以与实施例1相同的方式制备的pFc融合重组蛋白表达载体的蛋白质的稳定性，使用与实施例2.1相同的方法，通过蛋白质印迹法检测提取重组蛋白时的样品(0)和在4℃保存1小时后获得的样品(1)。其结果如图4所示。

如图4所示，已证实pFc2融合重组蛋白表现出最大的表达量和高稳定性。

2.3.pFc2融合VP1重组蛋白的溶解度确认实验

为了确认以与实施例1相同的方式制备的pFc2融合重组蛋白表达载体的蛋白质的溶解度，使用瞬态表达方法，将用该载体转化的根癌农杆菌接种于本氏烟(Nicotianabenthamiana)叶片以表达pFc2融合重组蛋白(BiP:FMDV-VP1：pFc2)，从植物叶片中提取蛋白质并离心，然后使用与实施例2.1中相同的方法对溶液中包含的可溶形式的蛋白质(S)和颗粒部分(P)中存在的蛋白质进行蛋白质印迹法。作为对照，使用编码已知纤维素结合模块(CBM3)的多核苷酸(SEQ ID NO:13)而不是pFc片段融合产生的重组蛋白。其结果如图5所示。

如图5所示，已确认在颗粒部分中未观察到pFc2融合重组蛋白，而其包含在溶液中。然而，在CBM3融合重组蛋白的情况下，在颗粒部分观察到相当数量的重组蛋白。以上结果证实，pFc2融合重组蛋白由于靶蛋白与pFc2片段的结合，通过结构修饰，显示出增加的溶解度，从而证实pFc2融合重组蛋白在分离和纯化方面更为有效，并且由于抑制了重组蛋白的聚集而有效地维持了其生理活性或药理活性。

实施例3：pFc2融合GP5重组抗原的溶解度确认实验

将pFc2片段与猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的GP5抗原蛋白融合，插入编码猪GP5抗原蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO:11)，而不是实施例1的包括在重组载体中的FMDV的VP1基因，以制备表达GP5:pFc2重组抗原的重组载体。然后，将用该载体转化的根癌农杆菌接种本氏烟(Nicotiana benthamiana)的叶片，使用瞬时表达方法，表达pFc2融合的GP5重组抗原(GP5:pFc2)，从植株叶片中提取蛋白质并离心，使用与实施例2.1中相同的方法，对溶液中包含的可溶形式的蛋白质(S)和颗粒部分(P)中存在的蛋白质进行蛋白质印迹法。作为对照，使用与CBM3(SEQ ID NO:14)融合而不是与pFc片段融合的GP5重组抗原，对于CBM3融合GP5重组抗原，使用HA抗体进行实验以用于蛋白质印迹法。其结果如图6所示。

如图6所示，已确认在pFc2融合GP5重组抗原的情况下，虽然在颗粒部分观察到一些蛋白质，但大多数蛋白质包含在溶液中。相反，在CBM3融合GP5重组抗原的情况下，在颗粒部分观察到相当数量的重组蛋白。上述结果证实，无论是哪种类型的蛋白，pFc2融合重组蛋白都显示出增加的溶解度。

这些结果证实，通过将猪Fc片段，特别是含有由SEQ ID NO:4代表的氨基酸序列的pFc2片段与靶蛋白融合，提高了靶蛋白的表达量和溶解度，从而使靶蛋白能够稳定和容易地易分离和储存。

实施例4：pFc2融合PCV2重组蛋白的产量和溶解度确认实验

为了将pFc2片段与猪圆环病毒2型(PCV2)蛋白融合，插入编码PCV2蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO:15)，而不是包含在实施例1的重组载体中的FMDV的VP1基因，以制备表达PCV2:pFc2重组蛋白的重组载体。然后用该载体转化的根癌农杆菌接种本氏烟(Nicotianabenthamiana)的叶片，采用瞬时表达法表达pFc2融合的PCV2重组蛋白，从植株叶片中提取蛋白并离心，然后使用与实施例2.1中相同的方法，对包含在溶液中的可溶形式的蛋白质和存在于颗粒部分(P)中的蛋白质进行蛋白质印迹法。作为对照，使用与代替pFc片段的His标签融合的PCV2重组蛋白，并且对于His标签融合的PCV2重组蛋白，使用抗His抗体进行实验用于蛋白质印迹法。其结果如图7所示。

如图7所示，证实pFc2融合的PCV2重组蛋白主要包含在溶液中，并且与His标签融合的PCV2重组蛋白相比，表现出显著的产量提高。

实施例5：pFc2融合E2重组蛋白表达实验

为了确认pFc2片段是否与抗原蛋白融合并可用，插入编码E2蛋白(其为猪瘟抗原)的多核苷酸(SEQ ID NO:17)，而不是包含在实施例1的重组载体中的FMDV的VP1基因，以制备表达BiP:E2：pFc2重组蛋白的重组载体。然后，利用所制备的重组载体，采用农杆菌介导的转化方法对拟南芥进行转化，筛选出抗卡那霉素的拟南芥，最终获得经世代进化稳定表达pFc2融合E2重组蛋白的同源种子，从而完成转化植物的制备。然后，使用蛋白质提取常用的蛋白质提取缓冲液从8g最终获得的转化植株中分离蛋白质，并使用配备蛋白质A-琼脂糖凝胶柱(Protein A-Sepharose column)的AKTA prime(通用电气医疗集团)分离pFc融合的E2重组蛋白。然后，作为对照，使用通过CBD(SEQ ID NO:19)而不是pFc片段融合产生的BiP:E2:CBD重组蛋白。用无定形纤维素(AMC)从5g转化植株中分离出CBD融合的E2重组蛋白。随后，用磷酸盐缓冲液(PBS)对分离的重组蛋白进行透析，然后用离心过滤管进行浓缩。用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法测定分离的重组蛋白的量。此时，重组蛋白使用牛血清白蛋白(BSA)标准曲线进行定量。其结果如图8所示。

如图8所示，已证实，虽然CBD融合的E2重组抗原的产量约为每1g植物30微克，但pFc2融合的E2重组抗原的产量为每1g植物302微克。以上结果证实，使用pFc2片段可使靶抗原的表达量增加10倍或更多。

以上结果证实，将本发明的作为标签的pFc2片段与各种靶蛋白融合，不仅可以显著提高靶蛋白的产量，而且可以提高其溶解度和稳定性，抑制靶蛋白的聚集，因此，pFc2融合靶蛋白在高效生产重组蛋白方面具有显著的效果。

本发明的上述描述仅用于说明目的，本发明所属领域的技术人员应当理解，本发明可以容易地被修改为其它特定形式，而不改变本发明的技术精神或基本特征。因此，上述实施方式应被解释为仅用于说明目的而不是用于限制目的。

工业实用性

本发明涉及一种包含猪Fc片段的重组载体，通过使用本发明的重组载体将猪Fc片段与各种靶蛋白融合，可以使用包括植物在内的各种宿主来表达各种蛋白质，并且通过将本发明的Fc片段作为标签结合，可以显著地提高靶蛋白的产量和稳定性，因此预期该重组载体可以广泛地应用于各种商业化靶蛋白的制备。

<110> 巴伊沃爱普有限公司

<120> 包含猪FC片段的重组载体及用其制备重组蛋白的方法

<130> MPO19-020CN

<150> KR 10-2018-0112442

<151> 2018-09-19

<160> 19

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc1的DNA序列

<400> 1

ggaactaaga ctaagccacc ttgtcctatt tgtccagggt gcgaggtagc cggtcccagc 60

gtgtttattt ttccaccaaa accaaaggat actttgatga tatctcaaac accggaagtt 120

acttgcgttg tggtcgacgt ttcaaaagag catgccgaag ttcagttctc ttggtatgtg 180

gatggtgtgg aagtgcacac cgctgagaca cgtcctaaag aggaacagtt taactctact 240

tacagagtcg tgtccgtatt gcccattcag catcaagact ggcttaaggg aaaagaattt 300

aaatgtaagg taaataatgt tgatctgcca gcacctataa ctagaaccat ctcgaaagct 360

attggacaat ctagagaacc tcaagtttat acattgcctc ctccagctga ggaactttct 420

agaagtaaag tcactgttac atgcttagtt attggattct atccaccaga tatccatgtt 480

gaatggaaat caaatggtca gcccgaacct gagggcaact acagaacaac accaccacag 540

caagatgtag atggtacttt tttcctctac tcaaaactag ctgttgataa ggctaggtgg 600

gatcatggcg agacatttga gtgtgcagtc atgcacgaag cacttcataa tcactatacc 660

caaaagtcca taagtaagac gcaaggaaag 690

<210> 2

<211> 230

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc1的氨基酸序列

<400> 2

Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val

1 5 10 15

Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

20 25 30

Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

35 40 45

Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

50 55 60

Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys

85 90 95

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro

100 105 110

Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln

115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val

130 135 140

Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val

145 150 155 160

Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr

165 170 175

Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

180 185 190

Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys

195 200 205

Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile

210 215 220

Ser Lys Thr Gln Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc2的DNA序列

<400> 3

gttggaagac catgccctat atgtcctgct tgtgaaggtc caggtccctc tgcttttata 60

ttcccaccaa agccgaagga taccttgatg atttcacgta caccacaagt tacttgtgtt 120

gttgtggatg tttcacaaga aaatcctgag gtacaattca gctggtatgt tgatggggta 180

gaagtgcaca ctgcacagac tcgaccaaag gaggcccagt ttaactcgac ttatagagtt 240

gtttctgttc tcccaatcca acacgaagat tggctgaagg gcaaggaatt tgaatgcaag 300

gttaacaata aagatctacc agcaccaatt accaggatta tttctaaggc aaaaggaccc 360

tccagagagc cccaagttta cacattgtct ccttctgctg aggagcttag tagaagtaaa 420

gtgagcatta cctgcttagt gacgggattc taccctccag acatcgacgt cgaatggaaa 480

tctaatggtc aacctgagcc agaaggtaac tataggacta ctccaccaca acaggacgtc 540

gatggcacat actttcttta ttcaaaactt gctgtcgata aggcaagttg gcaaagagga 600

gatccatttc agtgtgctgt aatgcatgag gctttgcata atcattatac acagaaatca 660

gtttctaaaa cacaagggaa a 681

<210> 4

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc2的氨基酸序列

<400> 4

Val Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro Gly Pro

1 5 10 15

Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

20 25 30

Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn

35 40 45

Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr

50 55 60

Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Ala Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

65 70 75 80

Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Glu Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu

85 90 95

Phe Glu Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg

100 105 110

Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Pro Ser Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

115 120 125

Leu Ser Pro Ser Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr

130 135 140

Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Lys

145 150 155 160

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val

180 185 190

Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Val Ser Lys Thr

210 215 220

Gln Gly Lys

225

<210> 5

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc3的DNA序列

<400> 5

attgagccac cgacacctat ttgtcctgaa atatgctctt gccctgcggc cgaagtttta 60

ggagcaccgt cggtctttct gtttccacct aaacctaagg acattttaat gatctctagg 120

acgcccaagg taacttgtgt tgttgttgat gtttctcaag aagaagctga ggttcaattc 180

tcctggtatg tagacggcgt tcaattgtac accgcacaga ctaggcctat ggaagaacag 240

tttaactcaa catacagagt agtgtccgtg ttgccgatcc aacatcaaga ttggttgaaa 300

ggtaaagagt ttaagtgtaa agtgaacaat aaggatctcc tttctcctat taccagaact 360

ataagtaaag ctaccggacc atctcgggtt ccacaggtct acactcttcc accagcttgg 420

gaggagctta gcaagtcaaa ggtaagcatc acttgtctcg taacgggatt ctatccacca 480

gatattgatg tggaatggca gagtaatggt caacaggaac ccgagggtaa ttaccgaaca 540

actcctcctc agcaggatgt tgacggtact tattttcttt attcaaagct agctgttgat 600

aaagtgagat ggcaacgtgg cgatttgttc cagtgcgcag tcatgcatga ggctcttcat 660

aatcactata cacaaaaatc aatttctaag acacaaggga ag 702

<210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pFc3的氨基酸序列

<400> 6

Ile Glu Pro Pro Thr Pro Ile Cys Pro Glu Ile Cys Ser Cys Pro Ala

1 5 10 15

Ala Glu Val Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Ile Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser Gln Glu Glu Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Gln Leu Tyr Thr Ala Gln Thr Arg Pro Met Glu Glu Gln

65 70 75 80

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp

100 105 110

Leu Leu Ser Pro Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Thr Gly Pro Ser

115 120 125

Arg Val Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ala Trp Glu Glu Leu Ser

130 135 140

Lys Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro

145 150 155 160

Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln Gln Glu Pro Glu Gly

165 170 175

Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe

180 185 190

Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Val Arg Trp Gln Arg Gly Asp

195 200 205

Leu Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

210 215 220

Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys

225 230

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> M17基因的5'UTR

<400> 7

ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21

<210> 8

<211> 272

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 伴侣结合蛋白(BiP)的DNA序列

<400> 8

atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60

tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120

ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180

ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240

tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272

<210> 9

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV-VP1的DNA序列

<400> 9

actacaagta ccggcgaatc tgctgatcca gttactgcta cagttgaaaa ttatggtgga 60

gaaacacaag tgcaaagaag acatcataca gatgtttctt ttatcctaga taggtttgtt 120

aaggtcactc ctaaggattc aattaatgtt ttggacctga tgcagactcc cccacataca 180

ttggttggcg ctctacttcg tactgcaact tattatttcg ctgatttaga ggtagccgtt 240

aaacacgaag gtgatttaac atgggttcct aatggagcac ctgaggctgc actcgataat 300

actactaatc caactgctta ccacaaagca ccactcacta gactcgcgct tccttacact 360

gccccgcata gggttcttgc tactgtttat aacgggaact gcaaatacgc aggtggttca 420

ttgcctaatg tacgaggaga tttgcaagta ttggctcaaa aagcagcatg gccattacct 480

acttctttta actatggagc tataaaggct acacgtgtga cggaacttct ttataggatg 540

aagagagctg agacatactg tcctagacca ttactggctg ttcatccatc cgccgcaaga 600

cacaaacaga aaattgtggc tcccgttaag cagagcctt 639

<210> 10

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FMDV-VP1的氨基酸序列

<400> 10

Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile

35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Trp Pro Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

195 200 205

Val Lys Gln Ser Leu

210

<210> 11

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GP5的DNA序列

<400> 11

aacggcaaca gctcgacata ccaatacata tataacttga cggtatgcga gctgaatggg 60

accgcctggt tgtctaccca cttttcttgg gcagtcgaga ccggaggcgg gggtagcaaa 120

aattgtatgg cttgccgcta cgcccgcacc cggttcacca acttcattgt agacgaccgg 180

gggaggattc atcggtggaa gtccccggtg gtggtggaga aatttggcaa agccgaaatt 240

ggcggcggtc ttgtcaccat caaacatgtc gtcctcgaag gggttaaagc tcaacccttg 300

acgaggactt cggctgagca atgggaagcc 330

<210> 12

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GP5的氨基酸序列

<400> 12

Asn Gly Asn Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr Val Cys

1 5 10 15

Glu Leu Asn Gly Thr Ala Trp Leu Ser Thr His Phe Ser Trp Ala Val

20 25 30

Glu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala

35 40 45

Arg Thr Arg Phe Thr Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Ile His

50 55 60

Arg Trp Lys Ser Pro Val Val Val Glu Lys Phe Gly Lys Ala Glu Ile

65 70 75 80

Gly Gly Gly Leu Val Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys

85 90 95

Ala Gln Pro Leu Thr Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala

100 105 110

<210> 13

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM3的DNA序列

<400> 13

gtatcaggta accttaaggt ggagttttac aactcgaacc cttctgatac aactaactca 60

ataaacccac agttcaaagt tacaaacaca ggcagctctg cgatcgattt gtctaaatta 120

accctcagat actattatac ggttgatgga cagaaggacc agactttctg gtgtgatcat 180

gcagctatca ttggttctaa cggtagctac aacggaatta catcaaacgt gaagggcact 240

ttcgttaaga tgtcctctag cactaacaac gcagacacat atttggagat cagttttacg 300

gggggaaccc ttgaaccagg tgctcacgtc cagattcaag gaagattcgc taaaaacgac 360

tggtcgaact atacccaaag taatgattac agttttaaat ccgcctcaca atttgttgag 420

tgggatcagg tcactgctta cctgaacggg gttctagtgt ggggaaagga acctggt 477

<210> 14

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CBM3的氨基酸序列

<400> 14

Val Ser Gly Asn Leu Lys Val Glu Phe Tyr Asn Ser Asn Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Thr Asn Ser Ile Asn Pro Gln Phe Lys Val Thr Asn Thr Gly Ser

20 25 30

Ser Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Thr Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Val

35 40 45

Asp Gly Gln Lys Asp Gln Thr Phe Trp Cys Asp His Ala Ala Ile Ile

50 55 60

Gly Ser Asn Gly Ser Tyr Asn Gly Ile Thr Ser Asn Val Lys Gly Thr

65 70 75 80

Phe Val Lys Met Ser Ser Ser Thr Asn Asn Ala Asp Thr Tyr Leu Glu

85 90 95

Ile Ser Phe Thr Gly Gly Thr Leu Glu Pro Gly Ala His Val Gln Ile

100 105 110

Gln Gly Arg Phe Ala Lys Asn Asp Trp Ser Asn Tyr Thr Gln Ser Asn

115 120 125

Asp Tyr Ser Phe Lys Ser Ala Ser Gln Phe Val Glu Trp Asp Gln Val

130 135 140

Thr Ala Tyr Leu Asn Gly Val Leu Val Trp Gly Lys Glu Pro Gly

145 150 155

<210> 15

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCV2的DNA序列

<400> 15

aaaaatggca ttttcaatac acgcctcagt cgaacttttg gatatactgt caagcgtact 60

acagtcacca cgccatcttg ggctgtggat atgatgagat ttaagttgga tgactttgtt 120

cctcctggag ggggaaccaa caaaatttct ataccgtttg agtactatag aatcagaaaa 180

gttaaggttg agttctggcc gtgttccccc ataactcagg gtgatagggg tgtgggttca 240

actgctgtta ttctagatga taacttcgta cctaaggcca acgcattgac ttatgacccc 300

tatgtaaact actcatctag acatacaatc ccacaacctt tctcctacca ctcgcgttat 360

tttacaccaa agcctgtttt agattctacc attgattatt tccaaccaaa taacaagagg 420

aatcagcttt ggttgagatt acaaacctca cggaacgtgg atcatgtcgg attgggtact 480

gcatttgaaa atagtaagta tgatcaggac tacaatatcc gtgtgacaat gtacgttcaa 540

tttagggaat ttaatcttaa agacccacca cttaatcca 579

<210> 16

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PCV2的氨基酸序列

<400> 16

Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr

1 5 10 15

Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met

20 25 30

Arg Phe Lys Leu Asp Asp Phe Val Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys

35 40 45

Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu

50 55 60

Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser

65 70 75 80

Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Pro Lys Ala Asn Ala Leu

85 90 95

Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln

100 105 110

Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp

115 120 125

Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp

130 135 140

Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr

145 150 155 160

Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr

165 170 175

Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn

180 185 190

Pro

<210> 17

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> E2的DNA序列

<400> 17

aacggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcaatatc atcaaccaat gagatagggc 60

tactcggggc cggaggtctc accaccacct ggaaagaata caaccacgat ttgcaactga 120

atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaagtcaca gcacttaatg 180

tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataaggaggc tttacccact tccgtgacat 240

tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caactgagga aatgggagat gacttcgggt 300

tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaagg aaagtacaat acaaccttgt 360

tgaacggtag tgctttctat cttgtctgtc caatagggtg gacgggtgtt atagagtgca 420

cagcagtgag cccaacaact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg agggacaagc 480

cctttccgca cagaatggat tgtgtgacca caacagtgga aaatgaagat ttattctact 540

gtaagttggg gggcaactgg acatgtgtga aaggtgaacc agtggtctac acgggggggc 600

tagtaaaaca atgcagatgg tgtggctttg acttcaatga gcctgacgga ctcccacact 660

accccatagg taagtgcatt ttggcaaatg agacaggtta cagaatagtg gattcaacag 720

actgtaacag agatggtgtt gtaatcagca cagaggggag tcatgagtgc ttgatcggta 780

acacgactgt caaggtgcat gcatcagatg aaagactggg ccccatgcca tgcagaccta 840

aagagatcgt ctctagtgca ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtacattc aactacgcaa 900

aaactttgaa gaacaagtac tatgagccca gggacagcta cttccagcaa tatatgctta 960

agggcgagta tcagtactgg tttgacctgg acgtgactga ccgccactca gattacttcg 1020

cagaag 1026

<210> 18

<211> 341

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2的氨基酸序列

<400> 18

Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn

1 5 10 15

Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu

20 25 30

Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys

35 40 45

Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg

50 55 60

Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe

65 70 75 80

Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp

85 90 95

Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys

100 105 110

Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val

115 120 125

Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro

130 135 140

Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro

145 150 155 160

Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp

165 170 175

Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu

180 185 190

Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly

195 200 205

Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys

210 215 220

Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp

225 230 235 240

Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys

245 250 255

Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu

260 265 270

Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro

275 280 285

Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn

290 295 300

Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser

325 330 335

Asp Tyr Phe Ala Glu

340

<210> 19

<211> 429

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤维素结合域的DNA序列

<400> 19

tttcgaagtt caccagtgcc tgcacctggt gataacacaa gagacgcata ttctatcatt 60

caggccgagg attatgacag cagttatggt cccaaccttc aaatctttag cttaccaggt 120

ggtggcagcg ccattggcta tattgaaaat ggttattcca ctacctataa aaatattgat 180

tttggtgacg gcgcaacgtc cgtaacagca agagtagcta cccagaatgc tactaccatt 240

caggtaagat tgggaagtcc atcgggtaca ttacttggaa caatttacgt ggggtccaca 300

ggaagctttg atacttatag ggatgtatcc gctaccatta gtaatactgc gggtgtaaaa 360

gatattgttc ttgtattctc aggtcctgtt aatgttgact ggtttgtatt ctcaaaatca 420

ggaacttct 429

Claims

1.一种重组载体，包括编码由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的猪Fc片段的多核苷酸和编码靶蛋白的多核苷酸。

2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，在重组载体中，启动子基因、编码Fc片段的多核苷酸和编码靶蛋白的多核苷酸顺序连接。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其中启动子包含选自下列组中一个或多个：源自花椰菜花叶病毒的35S启动子、源自花椰菜花叶病毒的19S RNA启动子、植物的肌动蛋白启动子、泛素蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、猴病毒40(SV40)启动子、呼吸道合胞病毒(RSV)启动子、pEMU启动子、MAS启动子、组蛋白启动子、Clp启动子和延伸因子-1α(EF-1α)启动子。

4.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体进一步包含编码伴侣结合蛋白(BiP)的多核苷酸。

5.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体进一步包含编码His-Asp-Glu-Leu(HDEL)肽的基因。

6.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体进一步包含M17的5'非翻译区(UTR)位点基因。

7.根据权利要求1所述的重组载体，其中所述重组载体增加Fc片段融合靶蛋白的表达量和溶解度。

8.根据权利要求1至7中任一项权利要求所述的重组载体转化的转基因细胞。

9.一种重组蛋白的制备方法，所述方法包括：

(a)培养根据权利要求8所述的转基因细胞；及

(b)从转基因细胞或培养液中分离纯化Fc片段融合的靶蛋白。

10.一种用于标记靶蛋白的组合物，所述组合物包含由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的猪Fc片段作为活性成分。

11.由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的猪Fc片段标记重组蛋白的用途。

12.一种将猪Fc片段与重组蛋白结合的方法，所述方法包括将由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成的猪Fc片段与重组蛋白结合。