JP7491517B2 - 植物から目的タンパク質を大量生産する方法 - Google Patents
植物から目的タンパク質を大量生産する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7491517B2 JP7491517B2 JP2022556552A JP2022556552A JP7491517B2 JP 7491517 B2 JP7491517 B2 JP 7491517B2 JP 2022556552 A JP2022556552 A JP 2022556552A JP 2022556552 A JP2022556552 A JP 2022556552A JP 7491517 B2 JP7491517 B2 JP 7491517B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- expression
- recombinant vector
- gene
- promoter
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 176
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 127
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 93
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 36
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 29
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 claims description 25
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 claims description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 101800000653 Helper component proteinase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 3
- 108050006628 Viral movement proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 claims description 3
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 121
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 56
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 description 39
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 24
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 24
- 102000022324 chaperone binding proteins Human genes 0.000 description 22
- 108091012160 chaperone binding proteins Proteins 0.000 description 22
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 21
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 21
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 20
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 20
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 15
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 14
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 14
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 13
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 13
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 101100400074 Arabidopsis thaliana LTI65 gene Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 9
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 9
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 8
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 7
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 5
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 4
- -1 antibody Proteins 0.000 description 4
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 101000875564 Arabidopsis thaliana Extensin-1 Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003668 hormone analog Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000209763 Avena sativa Species 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005250 Chrysanthemum indicum Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 241001672694 Citrus reticulata Species 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000011511 Diospyros Nutrition 0.000 description 1
- 241000723267 Diospyros Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101100503584 Homo sapiens FURIN gene Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 235000011430 Malus pumila Nutrition 0.000 description 1
- 235000015103 Malus silvestris Nutrition 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 235000004347 Perilla Nutrition 0.000 description 1
- 244000124853 Perilla frutescens Species 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000009827 Prunus armeniaca Nutrition 0.000 description 1
- 244000018633 Prunus armeniaca Species 0.000 description 1
- 240000005809 Prunus persica Species 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000001987 Pyrus communis Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241001247145 Sebastes goodei Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 241000722921 Tulipa gesneriana Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 241000714211 Turnip crinkle virus Species 0.000 description 1
- 101000897785 Turnip crinkle virus Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001417 Vigna umbellata Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 244000126002 Ziziphus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000008529 Ziziphus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000021018 plums Nutrition 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/06—Processes for producing mutations, e.g. treatment with chemicals or with radiation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/24—Extraction; Separation; Purification by electrochemical means
- C07K1/26—Electrophoresis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
[技術的課題]
本発明は、植物から目的タンパク質を大量発現する方法に関し、植物における一過性発現を用いて目的タンパク質を植物に形質転換することで、目的遺伝子のタンパク質を高レベルで生産する目的タンパク質の発現用バイナリーベクター、及びこれを用いた植物から目的タンパク質を大量発現する方法に関する。上述した課題を解決するため、本発明者らは、目的タンパク質の高発現用発現カセット、及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるp38の高発現用発現カセットを開発し、前記2つの高発現用発現カセット(目的タンパク質及びp38高発現カセット)を共に有するバイナリーベクターを開発した。前記バイナリーベクターを用いて目的タンパク質とp38遺伝子とを1つのアグロバクテリウム培養を用いて植物細胞に伝達することで、目的遺伝子のタンパク質の高レベルの生産を確認した。詳しくは、目的タンパク質の高発現カセットを構築するために、Macプロモーターの3’末端に一塩基多型(AをT塩基に置換)を導入することにより、元のMacプロモーターより転写レベルの高いMacTプロモーターを製造し、シロイヌナズナの様々なターミネーターのシーケンスを実験した結果、RD29Bのターミネーターが高効率のターミネーターであることを確認し、前記MacTプロモーター及びRD29Bのターミネーターを構成要素として用いて高発現用発現カセットを製造した。また、これに加え、高効率翻訳を誘導する21塩基対長の翻訳の効率を高める翻訳増強配列(translation enhancing sequence)を目的タンパク質AUGコドン(AUG codon)のimmediate upstreamに5’-非翻訳領域(5’-UTR)で用いることで、目的タンパク質のタンパク質の生産レベルを高めるようにした。目的タンパク質と共にアグロバクテリウムによって植物細胞に導入されるp38遺伝子の発現レベルを高めるために、転写効率の高い21-塩基対長の翻訳増強配列を5’-UTRに導入することによりp38の発現を高めることで、遺伝子サイレンシング抑制因子の効率を高めた。前記2つの発現カセット(目的タンパク質とp38遺伝子)をpCAMBIA1300のオリジナル遺伝子発現カセット(original gene expression cassette)とハイグロマイシン発現カセット(hygromycin expression cassette)を置換する方法で導入してpTEX1Lベクターを完成した。このpTEX1Lを用いると、P38発現用ベクターを有するアグロバクテリウムと目的タンパク質を含むアグロバクテリウムと混合し、2つの種類のアグロバクテリウムを用いて共浸潤することなく、pTEX1Lバイナリーベクターを有する1つの種類のアグロバクテリウムによって、目的タンパク質とp38を同時に伝達し、これによって目的遺伝子のタンパク質レベルの高発現を誘導し、これによって高効率のタンパク質の生産を誘導できる効果を確認した。これによって、1つのバイナリーベクターが目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるp38を同時に伝達できる二重伝達用発現ベクターを完成した。
(a)上述の組換えベクターを構築すること;
(b)前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること;
(c)前記形質転換体を培養すること;
(d)前記培養物を植物に浸潤させること;及び
(e)前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること。
上述した課題を解決するため、本発明は、(i)Macプロモーター(Mac promoter);(ii)目的タンパク質をコードする遺伝子;及び(iii)RD29B-tターミネーターを含む、植物から目的タンパク質を大量生産するための組換えベクターを製造してもよい。
(a)上述の組換えベクターを構築すること;
(b)前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること;
(c)前記形質転換体を培養すること;
(d)前記培養物を植物に浸潤させること;及び
(e)前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること。
[発明の概要]
以下で本発明をさらに詳しく説明する。
図1に開示されたように、発現ベクターを製造した(図1A)。プロモーターは、CaMV 35S、Mac、又はMacTを導入した。上記3種のそれぞれのプロモーター、水溶性緑色蛍光タンパク質(soluble green fluorescent protein;sGFP)、Nosターミネーターを連結して発現用バイナリーベクター(binary vector)を完成した。バイナリ(Binary)の基本構造(backbone)としてはpCAMBIA1300を用いた(図1A)。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングPCR(overlapping PCR)によって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン(それぞれ50mg/L及び100mg/L)を含むLBプレート(LB plate)に28℃で2日間培養した。1つのコロニーを選択した後、5mLのカナマイシンとリファンピシンを含むLBメディア(LB media)で一晩培養した。24時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.1%Triton X100、2mM DTT及び1%プロテアーゼ阻害剤カクテル(protease inhibitor cocktail))を用いて製造し、これに5Хサンプルバッファー(sample buffer)(250mM Tris-HCl[pH6.8]、10%SDS、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールv/v、及び500mM DTT)を最終1Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプル(sample)を製作した。タンパク質抽出物サンプルを5分間沸かしてから、10%SDS-ページによって分離した後、抗GFP抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。これによって、CaMV 35S、Mac、又はMacの各プロモーターの発現レベルを比較分析した。これによって、MacTプロモーターがCaMV 35Sよりは遥かに高く、Macプロモーターより少なくとも50%高いプロモーター強度(promoter strength)を示した(図1)。
図2の図式で見られるような発現コンストラクトを製作した。プロモーターはCaMV 35Sと固定し、ターミネーターとしては、効率の高いと知られたHSPターミネーター、シロイヌナズナのAtExt4遺伝子のターミネーター又はRD29Bのターミネーターを製作した。それらの間にERに発現を誘導して高いレベルで蓄積されるように、ER目的信号(targeting signal)であるBiP、水溶性GFP及びER保留シグナル(retention signal)であるHDELを含むBiP-sGFP-HDEL遺伝子を挿入して発現カセットを製作した。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングPCRによって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン(それぞれ50mg/L及び100mg/L)を含むLBプレートに28℃で2日間培養した。1つのコロニーを選択した後、5mLのカナマイシンとリファンピシンを含むLBメディアで一晩培養した。24時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.1%Triton X100、2mM DTT及び1%プロテアーゼ阻害剤カクテル)を用いて製造し、これに5Хサンプルバッファー(250mM Tris-HCl[pH6.8]、10%SDS、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールv/v、及び500mM DTT)を最終1Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを5分間沸かしてから、10%SDS-ページによって分離した後、抗GFP抗体でウェスタンブロット分析を行った。その後、前記メンブレンをクーマシーブルーで染色した。これによって、RD29Bのターミネーターが、前記3つの種類のターミネーターのうち最も発現レベルが高いことを確認した(図2)。
図3に見られるように様々な組み合わせのプロモーター及びターミネーターを発現コンストラクト(35S::Nos-t、MacT::Nos-t、35S::HSP-t、MacT::HSP-t、35S::RD29B-t、MacT::RD29B-t)を製作した。それらの間にBiP-sGFP-HDEL遺伝子(配列番号4)を挿入して発現カセットを製作した。それらの間にERに発現を誘導して高いレベルで蓄積されるようにER目的信号であるBiP、sGFP及びER保留シグナルであるHDELを含むBiP-sGFP-HDEL遺伝子を挿入して発現カセットを製作した。上記のようにデザインされたバイナリーベクターをオーバーラッピングPCRによって製作した。これらそれぞれのコンストラクトを電気穿孔法でシロイヌナズナ葉の組織から得られたプロトプラストに導入して発現を誘導した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン(それぞれ50mg/L及び100mg/L)を含むLBプレートに28℃で2日間培養した。1つのコロニーを選択した後、5mLのカナマイシンとリファンピシンを含むLBメディアで一晩培養した。24時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.1%Triton X100、2mM DTT及び1%プロテアーゼ阻害剤カクテル)を用いて製造し、これに5Хサンプルバッファー(250mM Tris-HCl[pH6.8]、10%SDS、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールv/v、及び500mM DTT)を最終1Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを5分間沸かしてから、10%SDS-ページによって分離した後、抗GFP抗体でウェスタンブロット分析を行ってsGFPのレベルを確認した。その結果、これらの6つのコンストラクトのうちMacTとRD29B-tをプロモーターと結晶部位として有する場合にsGFPの発現が最も高いことが確認された(図3)。これによって、Mac TプロモーターとRD29B-tターミネーターを有する発現カセットが目的遺伝子のタンパク質の発現を増加させるということを確認した。
1つのバイナリーベクターが目的タンパク質と遺伝子サイレンシング抑制因子であるp38を同時に伝達するように発現ベクターを製作した。図4のように、pCAMBIA1300からハイグロマイシン遺伝子を除去すると共に、Acc65IとSalI制限部位を導入し、double 35Sプロモーターの5’末端にBsrGI siteを導入してpM35Mを製作し、前記pM35MにAcc65IとSalIを用いて、tobacco codon optimized p38(coP38)遺伝子を導入してpTEX0を製造し、pTEX0にまたMacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-tをPstIとEcoRIを用いて導入してpTEX1:GFPを構築した。このとき、BiPのimmediate upstream regionの5’-UTRで5’-ggcgtgtgtgtgtgttaaaga-3’(M 5’-UTR、配列番号6)を有するようにして翻訳効率を高く誘導した。
上記実施例4に構築した発現ベクター用の二重伝達用バイナリーベクター(pTEX1:GFP)を用いて発現を確認しようとした。参照コンストラクトとしてpCAMBIA1300にMacT::BiP:sGFP:HDEL:RD29B-tを有する発現ベクター(pMEGR)を構築した。前記2種の発現ベクター(pTEX1:GFP又はpMEGR)のそれぞれをアグロバクテリウムに導入して培養した。mLのアグロバクテリウム培養液をカナマイシン及びリファンピシン(50mg/L及び100mg/L)を含む50ml LB培養液に添加した。16時間培養した後、アクロバクテリウムを8分間28℃で4000xgの条件で遠心分離して回収した。上澄み液は捨て、アクロバクテリウムの沈殿物は浸潤バッファー(10mM MES、10mM MgSO4. 7H2O;pH5.7)に溶解した。細胞の濃度は浸潤バッファーを用いてOD600で0.8になるようにした。その後、400μM アセトシリンゴン(acetosyringone)をアグロバクテリウム溶液に添加し、室温に2時間置いた。アグロバクテリウム-媒介浸潤のために、野生種のN.ベンサミアナを栽培した。植物は、種子を用いて24℃、40-65%相対湿度、長日条件(14h光/10h暗状態)で光強度が130-150μE m-2 sec-1の条件で栽培した。6株間育てた植物をアグロバクテリウム-媒介浸潤に用いた。シリンジを用いた浸潤は、注射針のない1mLサイズのシリンジを用いた。同時に遺伝子サイレンシング抑制(gene silencing suppression)遺伝子であるカブクリンクルウイルス(turnip crinkle virus)のコートタンパク質(coat protein)の遺伝子であるP38が入っているバイナリベクター(binary vector)を同時-浸潤した。このために2種の発現ベクター(pTEX1:sGFP又はpMEGR)とP38をそれぞれのアグロバクテリウムに導入した後、適切な濃度のアグロバクテリウム培養液を1:1の比率で混ぜてN.ベンサミアナ葉に浸潤した。浸潤後3日目に総タンパク質抽出物をN.ベンサミアナ葉の組織から確保してウエスタンブロット分析を行って発現レベルを確認した。総タンパク質抽出物は、抽出用バッファー(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.1%Triton X100、2mM DTT及び1%プロテアーゼ阻害剤カクテル)を用いて製造し、これに5Хサンプルバッファー(250mM Tris-HCl[pH6.8]、10%SDS、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールv/v、及び500mM DTT)を最終1Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプル(50μg)を5分間沸かしてから、12.5%SDS-ページによって展開した後、クーマシーブルーで染色した。また抗GFP抗体でウェスタンブロット分析を行ってsGFPのレベルを確認した。その結果、前記発現ベクター(pMEGRとpTEX1:sGFP)はいずれも、P38を別に共浸潤しなくてもsGFPの発現を誘導した。しかし、P38をさらに共浸潤すると、さらに高いsGFPの発現を示した。また2つの発現ベクターはほぼ同じレベルのsGFPの発現を示した。これによって、P38を自体で有しているが、十分に高いレベルの遺伝子サイレンシング抑制因子のためには、P38がさらに必要であることが確認された。したがって、pTEX1に含まれたp38の発現を高めるコンストラクトを再構築した。
pTEX1が有しているP38の発現が十分な遺伝子サイレンシング抑制因子を与えていないため、P38の発現レベルを高めるコンストラクトを構築しようとした。Original TCV-CPの塩基配列を含むpBINベースのバイナリーベクターから、PCRによって35Sプロモーター-P38-35Sターミネーターを確保し、pTEX1-EMCCでBsrGIとAcc65Iを用いて該当fragmentを置換してpTEX1Nを構築した。P38の5’-UTRに高効率の翻訳を誘導できる塩基配列である5’-attattacatcaaaacaaaaa-3’(配列番号9)を含むL:P38を導入してpTEX1Lを構築した。pTEX1、pTEX1N及びpTEX1Lを用いてシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換して発現を確認した。形質注入した後、カナマイシンとリファンピシン(それぞれ50mg/L及び100mg/L)を含むLBプレートに28℃で2日間培養した。1つのコロニーを選択した後、5mLのカナマイシンとリファンピシンを含むLBメディアで一晩培養した。24時間後、前記プロトプラストからタンパク質を抽出した。タンパク質抽出物は、抽出用バッファー(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.1%Triton X100、2mM DTT及び1%プロテアーゼ阻害剤カクテル)を用いて製造し、これに5Хサンプルバッファー(250mM Tris-HCl[pH6.8]、10%SDS、0.5%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールv/v、及び500mM DTT)を最終1Хの濃度で添加して電気泳動タンパク質サンプルを製作した。タンパク質抽出物サンプルを5分間沸かしてから、10%SDS-ページによって分離した後、抗TCP-CP(P38)抗体でウェスタンブロット分析を行った。また、メンブレンをクーマシーブルーで染色した。pTEX1、pTEX1N及びpTEX1Lをシロイヌナズナのプロトプラストに形質転換した後、P38の発現レベルを比較した結果、pTEX1が最も低い発現レベルを示し、pTEX1NはpTEX1よりは2倍程度高く発現することが確認された。一方、pTEX1LはまたこれらpTEX1Nよりも2倍程度高い発現を示した(図6D)。これによって、pTEX1Lの翻訳エンハンサー(translational enhancer)を有する発現ベクターのP38発現レベルが最も高いことが確認された。
pTEX1LにM::BiP:sGFP:HDELを含むコンストラクト(pTEX1L:sGFP)を構築し、これによって発現のレベルを確認した。pCAMBIA1300ベクターに35Sプロモーター-sGFP-HSPターミネーターが入っているベクター、pMEGRベクターとpTEX1Lベクターを運搬するアグロバクテリウムをタバコ(Nicotiana benthamiana)葉にシリンジで単独浸潤(infiltration)し、同時にp38と共浸潤させた後5日目、タバコ葉からタンパク質を抽出してGFP抗体とTCV CP抗体を用いてウエスタンブロット方法でBiP-sGFP-HDELとP38タンパク質の発現を確認した(図7B)。その結果、先ず、タバコでアグロ浸潤による一過性発現もシロイヌナズナのプロトプラスト形質転換と同様に、MacTプロモーター-RD29BターミネーターによるsGFPの発現が、35Sプロモーター-HSPターミネーターの組み合わせによる発現より2-3倍高レベルと確認された(図7)。また、P38と共浸潤したpMEGRとP38と共浸潤しないpTEX1L:sGFPのsGFPの発現で大きな差がなく、pTEX1L:sGFPをP38と共形質転換する場合も、sGFPの発現にほぼ差がないことを確認した。これによって、1つのバイナリーベクターが目的タンパク質及び遺伝子サイレンシング抑制因子であるp38を同時に伝達できる二重伝達用発現ベクターを完成した。
pTEX1Lに、M::BiP:sGFP:HDELでsGFPの代わりにtarget遺伝子としてヒトフリン(human Furin)遺伝子を置換し、pTEX1LにM::BiP:hFurin:Hisx5:HDELコンストラクトを導入したコンストラクトを構築し、これをアグロバクテリウムに導入した後、N.ベンサミアナに発現を誘導してFurin:Hisx5:HDELを高レベルで生産した。
pTEX1Lに、M::BiP:sGFP:HDELでsGFPの代わりにtarget遺伝子としてTryosinogen遺伝子を置換し、pTEX1LにM::BiP:Trysinogen:Hisx5:HDELコンストラクトを導入したコンストラクトを構築し、これをアグロバクテリウムに導入した後、N.ベンサミアナに発現を誘導してTrysinogen:Hisx5:HDELを高レベルで生産した。
Claims (13)
- (i)Macプロモーター;
(ii)目的タンパク質をコードする遺伝子;及び
(iii)RD29B-tターミネーター;
を含む、植物から目的タンパク質を生産するための組換えベクター。 - 前記Macプロモーターの遺伝子配列は、配列番号1の塩基配列を含む、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記Macプロモーターは、Macプロモーターの配列番号1の塩基配列の3’末端塩基であるAをTに置換したMac Tプロモーターである、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記Mac Tプロモーターは、配列番号2の塩基配列を含む、請求項3に記載の組換えベクター。
- 前記RD29B-tターミネーターは、配列番号3の塩基配列を含む、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記目的タンパク質は、水溶性緑色蛍光タンパク質、抗原、抗体、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、ホルモン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤、輸送タンパク質、レセプター、貯蔵タンパク質、移動タンパク質、成長因子及びリポータータンパク質からなる群より選択されるいずれか1つ以上のタンパク質である、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記ベクターの骨格は、pCAMBIA1300である、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記組換えベクターは、遺伝子サイレンシング抑制遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の組換えベクター。
- 前記遺伝子サイレンシング抑制遺伝子は、p38、P19、HC-Pro及びTAV 2bからなる群より選択されるいずれか1つ以上の遺伝子である、請求項8に記載の組換えベクター。
- 請求項1に記載の組換えベクターで形質転換された、形質転換体。
- 前記形質転換体は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)である、請求項10に記載の形質転換体。
- (a)請求項1による組換えベクターを構築すること;
(b)前記組換えベクターを細胞に導入して形質転換体を製造すること;
(c)前記形質転換体を培養すること;
(d)前記形質転換体の培養により得られた培養物を植物に浸潤させること;及び
(e)前記植物を粉砕して目的タンパク質を抽出すること;
を含む、植物から目的タンパク質を生産する方法。 - 前記(d)工程に、p38を含む組換えベクターを細胞に導入した形質転換体をさらに植物に浸潤させることを含む、請求項12に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR10-2020-0034576 | 2020-03-20 | ||
KR1020200034576A KR102643810B1 (ko) | 2020-03-20 | 2020-03-20 | 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법 |
PCT/KR2021/001283 WO2021187750A1 (ko) | 2020-03-20 | 2021-02-01 | 식물에서 목적 단백질을 대량생산하는 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023518464A JP2023518464A (ja) | 2023-05-01 |
JP7491517B2 true JP7491517B2 (ja) | 2024-05-28 |
Family
ID=77768302
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022556552A Active JP7491517B2 (ja) | 2020-03-20 | 2021-02-01 | 植物から目的タンパク質を大量生産する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230113417A1 (ja) |
EP (1) | EP4123027A4 (ja) |
JP (1) | JP7491517B2 (ja) |
KR (1) | KR102643810B1 (ja) |
CN (1) | CN115461464B (ja) |
WO (1) | WO2021187750A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102527221B1 (ko) | 2021-10-15 | 2023-05-02 | 에스케이바이오사이언스 주식회사 | 단백질의 정제방법 |
KR102621026B1 (ko) | 2021-10-15 | 2024-01-09 | 에스케이바이오사이언스(주) | 단백질의 정제방법 |
KR102677058B1 (ko) * | 2024-01-18 | 2024-06-25 | 제주대학교 산학협력단 | 식물 발현 바이러스유사입자를 이용한 바리과 신경괴사증 예방백신 조성물 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004018682A1 (ja) | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Suntory Limited | 新規糖転移酵素遺伝子 |
JP2011504103A (ja) | 2007-11-15 | 2011-02-03 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド | 遺伝子改変キク |
KR20190030263A (ko) | 2017-09-13 | 2019-03-22 | 주식회사 바이오컴 | 식물에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 |
JP2020503884A (ja) | 2017-01-17 | 2020-02-06 | バイオアプリケーションズ インコーポレイテッドBioapplications Inc. | 植物細胞における目的タンパク質の発現のための組換えベクター |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL8300698A (nl) | 1983-02-24 | 1984-09-17 | Univ Leiden | Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten. |
EP2726620B1 (en) * | 2011-07-01 | 2018-11-28 | The Regents of The University of California | Constitutively active aba receptor mutants |
BR112014000884B8 (pt) * | 2011-07-15 | 2022-11-08 | Du Pont | Construção recombinante, método de expressão de um polinucleotídeo heterólogo em uma planta e método de regulação da expressão de dois polinucleotídeos heterólogos em uma planta |
KR20140035735A (ko) * | 2012-09-14 | 2014-03-24 | 전남대학교산학협력단 | 엽록체에서 목적 단백질을 대량 생산하는 형질전환 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 식물체 |
KR101957561B1 (ko) * | 2016-05-20 | 2019-03-12 | 포항공과대학교 산학협력단 | RbcS 융합 단백질을 이용하여 식물로부터 목적 단백질을 고발현하는 방법 및 목적 단백질 발현 식물체를 이용한 의료용 단백질의 경구투여용 조성물의 제조 방법 |
JP7178223B2 (ja) | 2018-09-21 | 2022-11-25 | 株式会社Screenホールディングス | 基板処理装置 |
CN110511941B (zh) * | 2019-09-02 | 2020-09-08 | 先正达农作物保护股份公司 | 通过过表达脱落酸受体来提高植物生物量并由此提高产量的方法 |
-
2020
- 2020-03-20 KR KR1020200034576A patent/KR102643810B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-02-01 JP JP2022556552A patent/JP7491517B2/ja active Active
- 2021-02-01 US US17/912,835 patent/US20230113417A1/en active Pending
- 2021-02-01 EP EP21771801.4A patent/EP4123027A4/en active Pending
- 2021-02-01 WO PCT/KR2021/001283 patent/WO2021187750A1/ko active Application Filing
- 2021-02-01 CN CN202180022824.7A patent/CN115461464B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004018682A1 (ja) | 2002-08-20 | 2004-03-04 | Suntory Limited | 新規糖転移酵素遺伝子 |
JP2011504103A (ja) | 2007-11-15 | 2011-02-03 | インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド | 遺伝子改変キク |
JP2020503884A (ja) | 2017-01-17 | 2020-02-06 | バイオアプリケーションズ インコーポレイテッドBioapplications Inc. | 植物細胞における目的タンパク質の発現のための組換えベクター |
KR20190030263A (ko) | 2017-09-13 | 2019-03-22 | 주식회사 바이오컴 | 식물에서 단백질의 분리정제를 위한 재조합 벡터 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2023518464A (ja) | 2023-05-01 |
WO2021187750A1 (ko) | 2021-09-23 |
EP4123027A1 (en) | 2023-01-25 |
EP4123027A4 (en) | 2024-04-24 |
KR102643810B1 (ko) | 2024-03-06 |
CN115461464A (zh) | 2022-12-09 |
CN115461464B (zh) | 2024-09-03 |
KR20210117808A (ko) | 2021-09-29 |
US20230113417A1 (en) | 2023-04-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7491517B2 (ja) | 植物から目的タンパク質を大量生産する方法 | |
JP5172828B2 (ja) | 植物ウイルスに基づいた誘導性発現システム | |
JP4546029B2 (ja) | 植物における対象とする核酸配列の増幅及び発現に用いる方法及びベクター | |
JP5096743B2 (ja) | Rnaウイルス由来植物発現システム | |
CA2571029C (en) | Biologically safe transient protein expression in plants | |
JP2007518412A (ja) | 2成分のrnaウイルス由来植物発現システム | |
Buyel et al. | Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5′ UTR combination | |
KR101161622B1 (ko) | 번역 효율 증진용 dna 단편 및 이를 포함하는 재조합 벡터 | |
SG192022A1 (en) | Protein expression in plants | |
CA2824155A1 (en) | Vectors for nucleic acid expression in plants | |
KR101554678B1 (ko) | 식물 바이러스를 이용한 식물체 형질전환을 위한 유전자 전달 시스템 및 이의 용도 | |
CN113652447B (zh) | 基于vigs的高效桃叶片基因沉默方法 | |
Özcan et al. | Selectable marker genes engineered for specific expression in target cells for plant transformation | |
WO2005054478A1 (en) | Controlling gene expression in plastids | |
JP6350995B2 (ja) | 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法 | |
JP2008505622A (ja) | 植物における生物学的に安全な一過性のタンパク質発現 | |
JP7184233B2 (ja) | レタスユビキチンプロモーターを含む組換えタンパク質発現用遺伝子構築物 | |
CN111556898B (zh) | 包含猪fc片段的重组载体及用其制备重组蛋白的方法 | |
KR101724370B1 (ko) | Trsv 재조합 벡터 및 이의 용도 | |
Fan et al. | Transient expression of acidic fibroblast growth factor in pea (Pisum sativum L.) plants | |
CN113528559B (zh) | 西瓜融合基因、遗传转化方法及应用 | |
WO2011154611A2 (en) | A method for enhanced protein synthesis | |
KR20230135411A (ko) | 식물에서 목적 단백질을 대량 생산하기 위한 강한 재조합 프로모터 및/또는 종결자를 포함하는 고발현 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량 생산 방법 | |
KR20230032679A (ko) | 이종 바이러스의 RNA 침묵억제 단백질을 포함하는 Potato virus X 기반 재조합 식물 발현 벡터 및 이의 용도 | |
CN115807010A (zh) | 忍冬叶片腺毛发育基因及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221118 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221118 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20231031 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231107 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240207 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240409 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240507 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7491517 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |