CN115461464A - 从植物中大量生产目标蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从植物中大量生产目标蛋白质的方法，具体地，涉及制备目标蛋白质(target gene)的高表达用表达试剂盒构建体及基因沉寂抑制子(gene silencing suppressor)p38的高表达用表达试剂盒构建体，然后制备同时具有上述构建体的在植物细胞中的瞬时表达用(transient expression)双元载体(双元载体)，所述双元载体利用单一农杆菌培养，利用农杆菌‑介导转化，在植物叶子中以高水平生产目标蛋白质的方法。

Description

从植物中大量生产目标蛋白质的方法
技术领域
本申请要求2020年3月20日申请的韩国专利申请第10-2020-0034576号的优先权，本申请援引加入该专利申请说明书全文的内容。
本发明涉及从植物中大量生产目标蛋白质的方法，具体地，涉及制备目标蛋白质(target gene)的高表达用表达试剂盒构建体及基因沉寂抑制子(gene silencingsuppressor)p38高表达用表达试剂盒构建体，然后制备同时具有上述构建体的在植物细胞中的瞬时表达用(transient expression)双元载体(binary vector)，所述双元载体利用单一农杆菌培养，利用农杆菌-介导转化，在植物叶子中以高水平生产目标蛋白质的方法。
背景技术
近来，已有能够在植物中以低成本生产重组蛋白质的可能方案被提出，因此人们进行多种尝试(Schillberg et al.,2003；Holtz et al.,2015；Marusic et al.,2016)。尤其是确认多种医疗用蛋白质的生产可能性的研究正在进行。在植物中生产重组蛋白时会有多种优点，其中一个是几乎不存在如大肠杆菌等微生物中存在的内毒素等毒素以及不存在能够被人体感染的病原体。此外，还已知也没有如朊毒体等有害蛋白而相比动物细胞或微生物能够生产安全的重组蛋白。另外，在制备成本上也比动物细胞低廉很多，根据栽培植物的方法可以在大规模生产上相比大肠杆菌等微生物更加经济。为了实现这种可能性，需要几个必须技术的开发。其中，最重要的第一个技术是开发在植物中能够诱导基因的高表达的表达载体(Staub et al,2000；Regnard et al.,2010)。在植物中可以通过多种方法诱导基因的表达。具体的可使用方法有将重组蛋白整合(integration)到植物体的基因组的方法、整合到叶绿体的基因组的方法、利用农杆菌(Agrobacterium)瞬时表达基因的方法等多种方法(Arzola et al.,2011；Werner et al.,2011)。将重组基因整合到细胞核(Nuclear)基因组或叶绿体基因组的方法基本是通过获得转化体的过程在植物中生产蛋白质。相反，将农杆菌渗透进植物组织诱导基因的瞬时表达生产蛋白质时，不包含转化体的制造过程，因此优点是蛋白质的生产期间短，大体上相比通过转化体的蛋白质生产，蛋白质生产水平显著高(Arzola et al.,2011)。此外，还能够通过共侵染(co-infiltration)基因沉寂抑制子而能够抑制其他基因的表达抑制机制，从而能够进一步诱导蛋白质的表达水平(Garabagi et al.,2011)。但是缺点是，每当需要瞬时表达时都要分别制备引入了包含目标蛋白质的双元载体的农杆菌的培养基和引入了能够表达p38基因沉寂抑制子的双元载体的农杆菌培养基，将它们以适当比例混合实施共侵染的过程。尤其是培养2种农杆菌时在时间和经济性方面有限制。
本发明涉及制备将目标基因高表达用表达试剂盒并将其与抑制阻碍目标蛋白质表达的p38-基因沉寂抑制子(gene silencing suppressor)引入同一个双元载体，通过在植物体中瞬时表达，从而以高水平生产蛋白质的表达载体。
发明内容
发明目的
本发明涉及从植物中大量表达目标蛋白质的方法，具体地，涉及在植物中利用瞬时表达将目标蛋白质转化到植物，从而以高水平生产目标基因的蛋白质的目标蛋白质表达用双元载体及利用其的从植物中大量表达目标蛋白质的方法。
为了实现上述目的，本发明的发明人开发了目标蛋白质的高表达用表达试剂盒及基因沉寂抑制子p38的高表达用表达试剂盒，同时具有所述高表达用表达试剂盒(目标蛋白质及p38高表达试剂盒)的双元载体。利用所述双元载体将目标蛋白质和p38基因通过一个农杆菌培养传递到植物细胞，从而确认目标基因的蛋白质的高水平生产。具体而言，为了构建目标蛋白质的高表达试剂盒，在Mac启动子的3'末端引入碱基变型(A取代为T碱基)，从而制备比原来的Mac启动子转录水平更高的MacT启动子，经过对拟南芥的多种终止子的序列进行实验结果发现RD29B的终止子为高效率终止子，利用所述MacT启动子和RD29B的终止子作为构成要素制备了高表达用表达试剂盒。在此基础上，将提高诱导高效率翻译的21个碱基对长度的翻译效率的翻译增强序列(translation enhancing sequence)作为目标蛋白质的AUG密码子(codon)的紧邻上游(immediate upstream)中作为5'-非翻译区间(5'-UTR)使用，从而提高目标蛋白质的蛋白质生产水平。为了提供与目标蛋白质一同通过农杆菌引入到植物细胞的p38基因的表达水平，5'-UTR引入转录效率高的21-碱基对长度的翻译增强序列，从而通过提高p38表达提高了基因沉寂抑制子的效率。所述两个试剂盒(目标蛋白质及p38高表达试剂盒)通过取代pCAMBIA1300的original gene expression cassette和潮霉素(hygromycin)expression cassette的方法引入，从而完成pTEX1L载体。利用该pTEX1L，可以将具有p38表达用载体的均和包含目标蛋白质的农杆菌混合，不需要利用2种农杆菌，就可通过具有pTEX1L双元载体的一种农杆菌同时传递目标蛋白质和p38，由此诱导目标基因的蛋白质水平的高表达，由此确认诱导高效率蛋白质生产的效果。
本发明的目的在于，提供一种从植物中大量生产目标蛋白质的重组载体。
本发明的另一目的在于，提供用所述重组载体转化的转化体。
本发明的又一目的在于，提供一种包括下列步骤的在植物中大量生产目标蛋白质的方法，其包括：
(a)制备所述重组载体的步骤；
(b)将所述重组载体引入到细胞中制备转化体的步骤；
(c)培养所述转化体的步骤
(d)将所述培养物侵染到植物中的步骤；及
(e)粉碎上述植物萃取目标蛋白质的步骤。
技术方案
为了实现上述目的，本发明能够在包含(i)Mac启动子(Mac启动子)；(ii)编码目标蛋白质的基因；及(iii)RD29B-t终止子的植物中，制造大量生产目标蛋白质的重组载体。
根据本发明一优选实施例，所述Mac启动子的基因序列可以包括序列号1的碱基序列。
根据本发明另一优选实施例，所述所述Mac启动子可以是3’末端碱基A取代为T的Mac T启动子。
根据本发明另一优选实施例，所述Mac T启动子可以包含序列号2的碱基序列。
根据本发明另一优选实施例，所述RD29B-t终止子是序列号3的碱基序列。
根据本发明另一优选实施例，所述目标蛋白质可以是选自由水溶性绿色荧光蛋白(Soluble green fluorescent protein)、抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白质、激素、激素衍生物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白质、受体、受体片段、生物防御诱导剂、储藏蛋白质、移动蛋白质(movement protein)、开发蛋白质(exploitive protein)、生长因子及报告蛋白组成的组中的任意1种蛋白质。
根据本发明的另一优选实施例，所述载体是pCAMBIA1300。
根据本发明的另一优选实施例，所述重组载体还可以包含基因沉寂抑制子(genesilencing suppressor)基因。
根据本发明一优选实施例，所述基因沉寂抑制子(基因沉寂抑制子(genesilencing suppressor))基因可以是选自由p38,P19,HC-Pro及TVA 2b组成的组中的任意1种以上。
本发明还提供由所述重组蛋白转化的转化体。
根据本发明一优选实施例，所述转化体可以是农杆菌(Agrobacterium)。
本发明还提供一种从植物体生产目标蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：
(a)制备所述重组载体的步骤；
(b)将所述重组载体引入细胞中制备转化体的步骤；
(c)培养所述转化体的步骤；
(d)用所述培养物侵染植物的步骤；及
(e)将所述植物粉碎萃取目标蛋白质的步骤。
根据本发明一优选实施例，还可以包括所述步骤(d)中将包含p38的重组载体引入到细胞的转化体额外地侵染到植物的步骤。
发明效果
根据本发明的载体具有能够提高目标基因的蛋白质表达水平的效果。具体而言，在Mac启动子的3’末端引入单一碱基变型(将A取代为T碱基)，将比原来的Mac启动子转录水平更高的MacT启动子、提高蛋白质表达的M结构域、诱导ER高蓄积的BiP、向ER诱导高蓄积率的HDEL、RD29B的终止子、基因沉寂抑制子p38、翻译扩增序列5'-UTR按顺序连接而制备的载体。所述重组载体转化到农杆菌中进行培养，具有用真空侵染方法在植物中以低成本、高效率地生产目标蛋白质的效果。
附图说明
图1是对3种启动子(CaMV 35S、Mac或MacT(Mac启动子的3'末端单一碱基A取代为T碱基))的效率进行比较分析的结果；(a)实验所使用的构建体的开裂图；(b)所述质粒构建体引入到原生质体后萃取蛋白质，然后将所述蛋白质与抗-GFP反应，实施免疫印迹法分析的结果；(c)所述膜(membrane)用考马斯亮蓝燃料进行染色的结果：NT,未转化对照组；M,蛋白质大小水平。
图2是根据3种3'末端终止子(HSP-t、AtExt4-t或RD29B-t)的蛋白质的生产水平的比较分析结果，(a)是实验所使用的构建体的开裂图；(b)是将所述质粒构建体引入到原生质体后萃取蛋白质，然后将所述蛋白质与抗-GFP反应，实施免疫印迹法分析的结果；(c)所述膜(membrane)用考马斯亮蓝燃料进行染色的结果：NT,未转化对照组；M,蛋白质大小水平。
图3是根据2种启动子(CaMV 35S或Mac T)及3种终止子(Nos-t,HSP-t或RD29B-t)的蛋白质的生产水平的比较分析结果，(a)是实验所使用的构建体的开裂图；(b)是将所述质粒构建体引入到原生质体后萃取蛋白质，然后将所述蛋白质与抗-GFP反应，实施免疫印迹法分析的结果；(c)所述膜(membrane)用考马斯亮蓝燃料进行染色的结果：NT,未转化对照组；M,蛋白质大小水平。
图4从pCAMBIA1300制备pTEX1的过程的整理模拟示意图，从pCAMBIA1300去除潮霉素(hygromycin)基因的同时引入Acc65I
Figure BDA0003854504550000051
SalI限制位点(restriction site)，在双重35S启动子的5'末端引入BsrGI位点制备pTEX0，再利用PstI和EcoRI在pTEX0引入MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t制备pTEX1:GFP。
图5是根据pmEGR或pTEX1:GFP的P38的蛋白质的生产水平的比较分析结果，(a)是实验所使用的构建体的开裂图；(b)是利用农杆菌单独或与包含表达p38的双元载体的农杆菌混合进行共侵染，从而诱导本生烟(Nicotiana benthamiana)叶组织中的GFP的表达，侵染(Infiltration)第5天时萃取蛋白质，利用SDS-page展开，膜(membrane)用考马斯亮蓝燃料进行染色的结果：(c)是将所述蛋白质进行抗-GFP，实施免疫印迹分析的结果。
图6是利用pTEX1、pTEX1N或pTEX1L比较分析P38蛋白质的表达水平的结果，pTEX1具有coP38，pTEX1N和pTEX1L具有原始(original)P38基因，pTEX1L在P38包含了具有L序列的21个碱基对的5'UTR，(a)是所述pTEX1、pTEX1N或pTEX1L的开裂图；(b)是将pTEX1、pTEX1N或pTEX1L转化到拟南芥的原生质体中诱导P38表达，并利用抗-P38抗体实施免疫印迹分析，确认P38蛋白质的表达水平的结果：NT,未转化对照组；M,蛋白质大小水平。
图7是由pTEX1L诱导的目标蛋白质的表达水平的比较分析结果，(A)是pTEX1L的目标蛋白质的表达水平比较结果，通过农杆菌(Agrobacterium)侵染将pTEX1L、pMERG、1300-BiP-GFP-HDEL引入本生烟(N.benthamiana)比较表达水平，根据P38共转化的有(+)、无(-)利用抗-GFP抗体来比较分析目标蛋白质ER靶标(targeted)GFP蛋白质的表达水平的结果；(B)是P38的表达水平的比较分析结果，利用本生烟(N.benthamiana)叶萃取物，利用抗-38抗体进行免疫印迹法，比较分析P38表达水平的结果；(C)是考马斯亮蓝染色P38和RbcL水平的比较分析结果，进行免疫印迹法后将膜用考马斯亮蓝进行染色，确认P38水平和作为符合对照组(loading control)的RbcL水平的确认结果。
具体实施方式
下面对本发明进一步详细说明。
如上所述，利用动物细胞或微生物生产蛋白会引起如病毒、癌基因、肠毒素等各种污染源的问题，批量生产时需要消耗很多时间和费用而受限。为了克服这些问题，人们开发出了在植物中生产蛋白质的方法，但是这种方法的蛋白质表达低而受限。
因此，本发明的发明人制备了和用于从植物中增加蛋白质表达量的重组载体。本发明的重组载体包含目标蛋白质，培养包含所述目标蛋白质的重组载体后，将所述培养液侵染到植物，确认从所述植物中目标基因的蛋白质表达水平显著增加。
下面参考随附的附图对本发明的实施例进行详细说明，以使本领域技术人员能够容易地实施。但是本发明可以通过多种不同形态实现，不限于在此说明的实施例。
本发明可以提供在植物中能够大量生产目标蛋白质的重组载体，其包含：(i)Mac启动子；(ii)编码目标蛋白质的基因；及(iii)RD29B-t终止子。
本发明发明人旨在于开发出相比高表达双元载体包含的CaMV 35S启动子或相比具有双增强子(double enhancer)的35S启动子，具有更高表达的高表达启动子。由此，设计了包含CaMV 35S启动子,Mac启动子(序列号1),将Mac启动子碱基序列的3'末端碱基A取代为T的Mac T启动子(序列号2)的载体后，表达GFP，结果确认了Mac T启动子的表达效率高约50％(参照图1)。
所述Mac启动子的基因序列可以包含序列号1的碱基序列。具体地，所述基因可以是包含与序列号1的碱基序列具有70％以上同源性的碱基序列，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上序列同源性的碱基序列。对多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通过将2个最佳排列的序列进行比较区域的比较而确认，比较区域中的多聚核苷酸序列的一部分可以是相比2个序列的最佳排列的参考序列(没有添加或删除)包含添加或删除(即空位gap)的。
所述Mac启动子可以是将3'末端的碱基A取代为T的Mac T启动子，所述Mac T启动子可以包含序列号2的碱基序列，具体地，所述基因可以包含于序列号2的碱基序列具有70％以上同源性的碱基序列，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上序列同源性的碱基序列。对多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通过将2个最佳排列的序列进行比较区域的比较而确认，比较区域中的多聚核苷酸序列的一部分可以是相比2个序列的最佳排列的参考序列(没有添加或删除)包含添加或删除(即空位gap)的。
基因的表达根据终止子的不同种类的表达水平进行了确认。拟南芥基因中RD29B的表达平时以非常低的水平维持，但是当植物遭受干旱等非生物胁迫(abiotic stress)时由于如ABA的物质而被诱导快速高表达。因此，在为了迅速诱导RD29B的高转录水平，转录的终止子也会发生高效率的假设下，确认了RD29B的终止子(RD29B-t；序列号3)是否提高基因的表达水平。将拟南芥的AtExt4终止子(AtExt4-t)及诱导高表达的HSP终止子终止子(HSP-t)作为参考终止子(终止子)，制备如图2所示的表达载体后，将其引入拟南芥的原生质体中，从而确认sGFP的表达水平(参照图2)。结果，确认了RD29B终止子相比2个参考终止子能够诱导高50％以上的表达。
所述RD29B-t终止子可以包含序列号3的碱基序列，具体地，所述基因可以包含于序列号2的碱基序列具有70％以上同源性的碱基序列，优选为80％以上，更优选为90％以上，最优选为95％以上序列同源性的碱基序列。对多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通过将2个最佳排列的序列进行比较区域的比较而确认，比较区域中的多聚核苷酸序列的一部分可以是相比2个序列的最佳排列的参考序列(没有添加或删除)包含添加或删除(即空位gap)的。
如图1和图2所示，本发明的发明人分别独立地确认了MacT启动子及RD29B终止子(RD29B-t)分别增加基因蛋白质的表达水平。因此确认了所述构成个要素的组合是否仍能够增加基因的蛋白质的表达水平。将所述MacT启动子和RD29B-t用作启动子和终止子，在其中间插入BiP-sGFP-HDEL基因(序列号4)，制备了试剂盒。BiP(序列号5)是用于内质网靶向的序列；GFP(序列号6)是绿色荧光蛋白质的(green fluorescent protein)碱基序列；HDEL(序列号7)是用于将蛋白质停留于内质网的内质网滞留碱基序列。参考构建体(Referenceconstruct)如图3所示，制备了35S::Nos-t、MacT::Nos-t、35S::HSP-t、MacT::HSP-t、35S::RD29B-t。再次将BiP-sGFP-HDEL作为报告基因(reporter gene)完成了表达构建体(expression construct)。为了将它们与MacT::RD29B-t进行比较，利用拟南芥原生质体诱导了GFP的表达并确认表达水平，结果确认了如预想的一样，MacT::RD29B-t表现出最高的蛋白质的水平。由此将MacT核RD29B-t确立为新的高表达用表达试剂盒的启动子和终止子的序列。
所述“目标蛋白质”是指编码想要表达的外来产物的基因，可以是编码用重组蛋白质可表达的所有种类的蛋白质的基因。典型地有胰岛素、细胞因子(白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素、集落刺激因子、趋化因子等)、红细胞生成素、抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白质、激素、激素衍生物、酶、酶抑制剂、转运蛋白质、受体(例如，酪氨酸激酶受体等)、受体片段、生物防御诱导剂、储藏蛋白质、移动蛋白质(movement protein)、开发蛋白质(exploitive protein)、报告蛋白、生长因子、用于生产疫苗的病毒基因或细菌基因等，这种目标蛋白质可以包含引入了识别限制酶或剪切位点的核酸类即“克隆位点”，从而使得所述载体能够插入。
重组蛋白质的基因的N-和C-末端分别包含BiP的信号序列和内质网滞留信号HDEL，从而具有诱导在ER(内质网)中高浓度蓄积的效果。所述重组载体可以还包括选自由BiP(chaperone binding protein)及HDEL(His-Asp-Glu-Leu)肽组成的组中的任意1种，所述BiP(chaperone binding protein)可以包含序列号5的碱基序列，HDEL(His-Asp-Glu-Leu)可以包含序列号7的碱基序列。
此外，所述重组载体还可以包括翻译扩增序列5'-UTR，所述5'-UTR可以包含序列号6或序列号9的碱基序列。
所述重组是指细胞复制不同种的核酸，表达所述核酸，或表达由肽、不同种肽或不同种核酸而编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以将在所述细胞中天然形态下未发现的基因或基因片段表达为正义链或反义链中任何一种形态。此外，重组细胞还可以表达在天然状态细胞中为发现的基因，但是所述基因可以是变形的，可以是通过人为手段重新引入到细胞内的。
所述用于“重组表达载体”是指细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。通常，能够在宿主内进行复制并稳定的任意质粒和载体都可以使用。所述表达载体的重要特性是具有复制起始点、启动子、标记基因及翻译调控要素(translation control element)。所述重组表达载体及包含适当转录/翻译调控信号的表达载体可以通过本领域技术人员公知的方法构建。所述方法包括试管内重组DNA技术、DNA合成技术和生物体内重组技术等。
本发明的重组载体的优选例为在适当的宿主中存在时，可以将自身一部分或所谓T-区域转移到植物体的Ti-质粒载体。其他类型的Ti-质粒载体是将当前植物细胞，或杂交DNA适当插入到植物基因组内的能够生产新的植物的原生质体，用于转移杂交DNA序列。Ti-质粒载体的特别优选的形态是如EP 0120 516B1号和美国专利第4,940,838号中要求保护的所谓双元(binary)载体。能够用于将根据本发明的DNA引入植物宿主的其他适合的载体可以选自源自双链植物病毒(例如CaMV)及单链病毒、双联病毒等的病毒载体，例如可以选自非完整性植物病毒载体。这种载体的使用尤其在难以将植物宿主适当转化的时候有利。
利用诱导基因沉寂抑制子的表达和目标蛋白质的表达的两个双元载体，诱导目标蛋白质的高表达。利用瞬时性表达进行蛋白质表达时，基因沉寂抑制子的共表达对目标蛋白质的高表达来说是必须的。因此两个双元载体分别转化到农杆菌后，分别制备农杆菌培养液，将其与用分别包含目标蛋白质和基因沉寂抑制子的载体转化的农杆菌培养液以适当比例混合，进行共侵染。因此需要双倍努力和双倍的经费。从而制备通过一个双元载体同时转化目标蛋白质和基因沉寂抑制子p38的表达载体。如图4所示，按照顺序，通过将烟密码子优化的(tobacco codon optimized)p38(coP38)基因取代为pCAMBIA1300的潮霉素(hygromycin)基因的方法进行引入。由此构建pTEX0，在此引入MacT::M:BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t构建了pTEX1:GFP。此时，使得BiP的紧邻上游区域(immediate upstream region的)5'-UTR具有5'-ggcgtgtgtgtgtgttaaaga-3'(M 5'-UTR,序列号6)，从而诱导高翻译效率。利用这样构建的表达载体用双重传递用双元载体，以确认表达。作为参考构建体构建了具有MacT::BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t表达载体(pMEGR)。将所述两个构建体单独或与具有P38的农杆菌(Agrobacterium)混合共侵染，确认了sGFP的表达水平(参照图5)。pMEGR的情况而言，确认通过p38的共侵染而诱导了sGFP的高表达。同样，pTEX1的情况时也通过p38的额外的共侵染而表达变高(参照图5)。pTEX1:GFP而言即使内在含有P38，在额外进行p38共侵染时仍然会诱导sGFP的高表达，由此得出通过pTEX1表达的p38的量不够充分的结论。由此推断出由引入到同一农杆菌的T-DNA同时具有这两个基因而导致p38的表达量不够充分。因此，重新构建能够提高包含在pTEX1的p38表达的构建体。从包含原始(Original)TCV-CP的碱基序列的基于pBIN的双元载体(韩国公开专利第10-2012-0055831号的35S:CP)，通过PCR获得35S启动子-P38-35S终止子，利用BsrGI和Acc65I在pTEX1-EMCC取代对应片段。由此构建了pTEX1N-EMCC。此外，为了进一步提高P38的表达水平，决定选择提高翻译效率(translation efficiency)的方法。这在提高蛋白质生产水平的各种方法中，从细胞能量(cellular energy)方面而言是最有效率的。引入包含能够高效诱导P385'-UTR的高效率翻译的碱基序列即5'-attattacatcaaaacaaaaa-3'(序列号9)的L:P38，构建了P38表达试剂盒(pTEX1L)(参见图6)。通过此与提高p38的表达水平。将pTEX1、pTEX1N及pTEX1L转化到拟南芥的原生质体后，比较p38的表达水平，结果pTEX1显示出最低的表达水平，pTEX1N相比pTEX1具有2倍程度的高表达。相反，pTEX1L又相比pTEX1N具有2倍程度的高表达(参照图6D)。最终构建了pTEX1L中包含M::BiP:sGFP:HDEL的构建体(pTEX1L:sGFP)，通过此确认表达水平。对照组使用在pCAMBIA1300载体中含有35S启动子-sGFP-HSP终止子的载体和pMEGR，将它们同时分别与P38共侵染的情况进行比较。结果确认，首先在烟叶中通过农杆菌侵染(agro-infiltration)的瞬时性表达也铜在拟南芥原生质体转化一样，通过MacT启动子-RD29B终止子的sGFP表达相比通过35S启动子-HSP终止子组合的表达具有2-3倍高水平表达(参见图7)。而且P38的共侵染pMEGR和没有P38共侵染的pTEX1L:sGFP的sGFP表达没有太大差异，将pTEX1L:sGFP与P38共转化(co-转化)的情况下sGFP的表达也几乎没有差异。通过此一个双元载体完成了能够同时传递目标蛋白质和基因沉寂抑制子p38的双重传递用表达载体。
所述载体可以是pCAMBIA1300，可以从pCAMBIA1300中去除潮霉素(hygromycin)基因同时导入Acc65I和SalI限制位点(restriction site)，可以在双(double)35S启动子的5'末端引入BsrGI位点(site)制备(参照图4的pM35M)。可以利用Acc65I和SalI向所述载体(图4的pM35M)引入P38基因而制备(参照图4的pTEX0)。再次利用PstI和EcoRI在所述载体(图4的pTEX0)引入MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t而制备(参照图4的pTEX1)。
所述重组载体还可以包括基因沉寂抑制子(gene silencing suppressor)基因，所述基因沉寂抑制子(gene silencing suppressor)基因可以是选自由p38、P19、HC-Pro及TVA 2b组成的组中的任意1种以上，优选还可以包括p38，所述p38可以包含序列号9的碱基序列，具体地，所述基因可以包含与序列号9的碱基序列具有70％以上序列同源性，优选具有80％以上序列同源性，更优选具有90％以上序列同源性，最优选具有95％以上序列同源性的碱基序列。对多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通过将2个最佳排列的序列进行比较区域的比较而确认，比较区域中的多聚核苷酸序列的一部分可以是相比2个序列的最佳排列的参考序列(没有添加或删除)包含添加或删除(即空位gap)的。
本发明还可以提供由所述重组载体转化的转化体。
此外，将本发明的载体转化到真核细胞时，作为宿主细胞可以使用酵母(Saccharomyce cerevisiae)、昆虫细胞、人类细胞(例如，CHO细胞株(Chinese hamsterovary)、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞株)及植物细胞等，优选使用农杆菌(Agrobacterium)。
将本发明的载体转运到宿主细胞内的方法有，宿主细胞为原核细胞的情况时，可以通过CaCl2、哈纳汉方法(Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166:557-580(1983))及电穿孔法等方法实施。此外，宿主细胞为真核细胞的情况时，可以使用显微注射法、磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体介导转染法、DEAE-葡聚糖处理法及基因枪轰击法等将载体注入到宿主细胞内。
本发明还可以提供一从植物中生产目标蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括：
(a)制备所述重组载体的的步骤；
(b)将所述重组再提引入到细胞中制备转化体的步骤；
(c)培养所述转化体的步骤；
(d)将所述培养物侵染到植物的步骤；及
(e)粉碎所述植物萃取目标蛋白质的步骤。
从所述转化植物生产目标蛋白质的方法可以是将本发明的重组载体转化到植物细胞后，培养适当时间使目标蛋白质表达，然后从转化的细胞获得目标蛋白质。此时能够表达所述目标蛋白质的本领域公知方法均可使用。
本发明的步骤(d)将所述培养物侵染到植物的步骤中，还可以同时侵染除了本发明的用于生产碳酸脱水酶的重组载体培养物之外的含P38的重组载体培养物。P38是基因沉寂抑制子(gene silencing suppressor)。此外，还可以是基因沉寂抑制子(genesilencing suppressor)P19、HC-Pro、TVA 2b。
侵染所述植物的方法有化学电池法、真空或注射器侵染法，优选为注射器侵染法，但不限于此。
所述植物可以是选自包括稻、小麦、大麦、玉米、大豆、土豆、小麦、红豆燕麦、高粱的谷物作物类；包括拟南芥、白菜、萝卜、辣椒、草莓、西红柿、西瓜、黄瓜、圆白菜、香瓜、南瓜、葱、洋葱、胡萝卜的蔬菜作物类；人参、烟、棉花、芝麻、甘蔗、糖用甜菜、苏子、油菜的特定用途作物类；包括苹果树、梨树、枣树、桃、葡萄、柑橘、柿子、杏、香蕉的果蔬类；包括玫瑰、康乃馨、菊花、百合、郁金香的花卉类。
以上对本发明的一实施例进行了说明，本发明的技术思想并不限于所例示的实施例，在理解本发明技术思想的本领域技术人员所理解的同一思想范围内，可以通过构成要素的附加、变更、删除、添加等而容易地实施其他实施例，应当理解的是这些实施例也属于本发明的技术思想。
实施例1显示最佳表达水平的启动子的确认
如图1所示，制备了表达载体(参照图1A)。启动子引入了CaMV 35S、Mac、或MacT。所述3种类的各个启动子、水溶性绿色荧光蛋白质的(soluble green fluorescent protein；sGFP)、Nos终止子，完成了表达用双元载体(双元载体)。双元(Binary)的基本结构(backbone)利用了pCAMBIA1300(参照图1A)。如上所述设计的双元载体(双元载体)通过重叠PCR(overlapping PCR)制备。将这些构建体分别利用电穿孔法引入到从拟南芥叶组织中获得的原生质体中，诱导表达。转染后将包含卡那霉素
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利福平(分别为50mg/L和100mg/L)的LB板(plate)中28℃下培养培养2日。选取一个集落后接种于含5mL的卡那霉素和利福平的LB media中过夜培养。24小时后从所述原生质体中萃取蛋白质。蛋白质的萃取物利用萃取用缓冲液(50mM Tris pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X100,2mM DTT和1％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))制备，在此以最终浓度1Х加入5Х样品缓冲液(sample buffer)(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)[pH 6.8],10％SDS,0.5％溴酚蓝(bromophenol blue),50％甘油v/v,和500mM DTT)，制备了电泳蛋白质的样品(sample)。蛋白质的萃取物样品煮5分钟后，通过10％SDS-PAGE分离后，利用anti-GFP抗体，实施免疫印迹分析(western blot analysis)。由此比较分析CaMV 35S、Mac或Mac各自的启动子的表达水平。由此显示MacT启动子的表达水平显著高于CaMV 35S，相比Mac启动子至少高出50％的启动子强度(promoter strength)(参见图1)。
实施例2显示最佳表达水平的终止子的确认
如图2所示，制备了表达构建体。启动子用CaMV 35S固定，终止子制备了已知效率高的HSP终止子、拟南芥的AtExt4基因的终止子或RD29B的终止子。在其之间插入包含诱导ER表达以高水平蓄积的ER目标信号(targeting signal)BiP、水溶性GFP、内质网滞留信号HDEL的BiP-sGFP-HDEL基因，制备了表达试剂盒。如上所述设计的双元载体(双元载体)通过重叠PCR(overlapping PCR)制备。将这些构建体分别利用电穿孔法引入到从拟南芥叶组织中获得的原生质体中，诱导表达。转染后将包含卡那霉素和利福平(分别为50mg/L和100mg/L)的LB板(plate)中28℃下培养2日。选择一个集落后接种于含5mL的卡那霉素和利福平的LB media中过夜培养。选取一个集落后接种于含5mL的卡那霉素和利福平的LB media中过夜培养。24小时后从所述原生质体中萃取蛋白质。蛋白质的萃取物利用萃取用缓冲液(50mMTris pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X100,2mM DTT和1％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))制备，在此以最终浓度1Х加入5Х样品缓冲液(samplebuffer)(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)[pH6.8],10％SDS,0.5％溴酚蓝(bromophenol blue),50％甘油v/v,和500mM DTT)，制备了电泳蛋白质的样品(sample)。蛋白质的萃取物样品煮5分钟后，通过10％SDS-PAGE分离，用anti-GFP antibody实施免疫印迹分析(western blot)。接着将所述膜用考马斯亮蓝染色。由此确认了RD29B的终止子在所述3种终止子中具有最高表达水平(参照图2)。
实施例3
如图3所示，制备了能够表达多种组合的启动子和终止子的表达构建体(35S::Nos-t,MacT::Nos-t,35S::HSP-t,MacT::HSP-t,35S::RD29B-t,MacT::RD29B-t)。在其之间插入BiP-sGFP-HDEL基因(序列号4)制备了表达试剂盒。在其之间插入包含诱导ER表达以高水平蓄积的ER目标信号(targeting signal)BiP、水溶性GFP、内质网滞留信号HDEL的BiP-sGFP-HDEL基因，制备了表达试剂盒。如上所述设计的双元载体(双元载体)通过重叠PCR(overlapping PCR)制备。将这些构建体分别利用电穿孔法引入到从拟南芥叶组织中获得的原生质体中，诱导表达。转染后将包含卡那霉素和利福平(分别为50mg/L和100mg/L)的LB板(plate)中28℃下培养2日。选择一个集落后接种于含5mL的卡那霉素和利福平的LBmedia中过夜培养。选取一个集落后接种于含5mL的卡那霉素和利福平的LB media中过夜培养。24小时后从所述原生质体中萃取蛋白质。蛋白质的萃取物利用萃取用缓冲液(50mMTris pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X100,2mM DTT和1％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))制备，在此以最终浓度1Х加入5Х样品缓冲液(samplebuffer)(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)[pH6.8],10％SDS,0.5％溴酚蓝(bromophenol blue),50％甘油v/v,和500mM DTT)，制备了电泳蛋白质的样品(sample)。蛋白质的萃取物样品煮5分钟后，通过10％SDS-PAGE分离，用anti-GFP antibody实施免疫印迹分析(western blot)确认了sGFP的水平。结果确认了这些6个构建体中含有MacT和RD29B-t作为启动子和决定子时，sGFP的表达水平最高(参照图3)。由此确认了具有Mac T启动子和RD29B-t终止子的表达试剂盒能够增加目标基因的蛋白质的表达。
实施例4从pCAMBIA1300到pTEX1:GFP的构建过程
制备通过一个双元载体能够同时传递目标蛋白质和基因沉寂抑制子p38的表达载体。如图4所示，从pCAMBIA1300去除潮霉素(hygromycin)基因的同时引入Acc65I和SalI限制位点(restriction site)，在双35S启动子的5'末端引入BsrGI site制备了pM35M，利用Acc65I和SalI在所述pM35M中引入了烟密码子优化的(tobacco codon optimized)p38(coP38)基因p38(coP38)基因制备pTEX0，在pTEX0中利用PstI和EcoRI再次引入MacT::BiP:sGFP:HDEL::RD29B-t构建pTEX1:GFP。此时使得BiP的紧邻上游区域(immediate upstreamregion)的5'-UTR具有5'-ggcgtgtgtgtgtgttaaaga-3'(M 5'-UTR,序列号6)，诱导了高翻译效率。
实施例5pMEGR的载体地图(vector map)和利用其的表达水平的比较
利用实施例4构建的表达载体用双重传递用双元载体(pTEX1:GFP)，确认表达。构建了pCAMBIA1300中具有MacT::BiP:sGFP:HDEL:RD29B-t的表达载体(pMEGR)作为参考构建体。将所述2种表达载体(pTEX1:GFP或pMEGR)分别引入农杆菌进行培养。mL的农杆菌培养液添加到含有卡那霉素及利福平(50mg/L和100mg/L)的50ml LB培养液中。培养16小时后，在28℃下4000xg条件离心分离8分钟进行回收。弃去上澄液，将农杆菌的沉淀物溶解于侵染缓冲液(10mM MES,10mM MgSO4.7H2O；pH 5.7)。细胞的浓度利用侵染缓冲液在OD600调整为0.8。接着在农杆菌溶液中添加400μM的乙酰丁香酮(acetosyringone)，在室温静置2小时。为了进行农杆菌-介导侵染，栽培了野生种本生烟(N.benthamiana)。植物是通过将种子在24℃、相对湿度40-65％、长日照条件(14h光/10h暗状态)光强为130-150μE m-2sec-1的条件下栽培。栽培6周后将植物用于农杆菌-介导侵染。利用注射器的侵染使用没有注射针的1mL大小的注射器实施。同时侵染了含有基因沉积抑制(gene silencing suppression)基因芜菁皱缩病毒(turnip crinkle virus)的外壳蛋白(coat protein)基因P38的双重(双元载体)。为此，将2种表达载体(pTEX1:sGFP或pMEGR)和P38分别引入农杆菌后，适当浓度的农杆菌培养液1:1进行混合，侵染到本生烟叶上。侵染3天后从本生烟叶组织中获得总蛋白质萃取物，实施免疫印迹法(Western blot)分析，确认了表达水平。总蛋白质的萃取物利用萃取用缓冲液(50mM Tris pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X100,2mM DTT和1％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))制备，在此以最终浓度1Х加入5Х样品缓冲液(sample buffer)(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)[pH 6.8],10％SDS,0.5％溴酚蓝(bromophenol blue),50％甘油v/v,和500mM DTT)，制备了电泳蛋白质的样品(sample)。蛋白质的萃取物样品(50μg)煮5分钟后，利用12.5％SDS-PAGE进行展开，利用考马斯亮蓝染色。此外用anti-GFP antibody实施免疫印迹分析确认sGFP的水平。结果，所述表达载体(pMEGR和pTEX1:sGFP)均在没有额外共侵染P38的情况下诱导了sGFP的表达。但是在额外共侵染P38时显示出更高的sGFP的表达。此外，两表达载体显示出几乎相等水平的sGFP表达。由此可以确认虽然自身具有P38，但是为了充分高水平的基因沉寂抑制子还需要更多P38。因此重新构建能够提高pTEX1中包含的p38表达的构建体。
实施例6pTEX1、pTEX1N和pTEX1L的表达载体地图(map)
由于pTEX1具有的P38表达没有提供充分的基因沉寂抑制子，从而构建能够提高P38表达的构建体。通过PCR从包含Original TCV-CP的碱基序列的pBIN based双元载体中获得35S启动子-P38-35S终止子，利用BsrGI和Acc65I从pTEX1-EMCC取代相应片段(fragment)，构建了pTEX1N。在P38的5'-UTR引入含有能够诱导高效率翻译的碱基序列5'-attattacatcaaaacaaaaa-3'(序列号9)的L:P38，构建了pTEX1L。利用pTEX1、pTEX1N及pTEX1L转化到拟南芥(Arabidopsis)的原生质体中，确认表达。转染后在包含卡那霉素和利福平(分别50mg/L和100mg/L)的LB plate中在28℃下培养2日。选取一个集落在含有5mL的卡那霉素和利福平的LB media中过夜培养。24小时后从所述原生质体中萃取蛋白质。蛋白质的萃取物利用萃取用缓冲液(50mM Tris pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X100,2mMDTT和1％蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail))制备，在此以最终浓度1Х加入5Х样品缓冲液(sample buffer)(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)[pH6.8],10％SDS,0.5％溴酚蓝(bromophenol blue),50％甘油v/v,和500mM DTT)，制备了电泳蛋白质的样品(sample)。蛋白质的萃取物样品煮5分钟后，通过10％SDS-PAGE分离，用anti-TCP-CP(P38)antibody实施免疫印迹分析(western blot)。然后将膜用考马斯亮蓝染色。将pTEX1、pTEX1N及pTEX1L转化到拟南芥的原生质体中，比较P38的表达水平，结果确认pTEX1显示最低表达水平，但是相比pTEX1N pTEX1而言显示高2倍程度的表达。相反，pTEX1L显示相比pTEX1N还高2倍程度的表达(参照图6D)。由此可以确认具有pTEX1L的translational enhancer的表达载体的P38表达水平最高。
实施例7
在pTEX1L中构建包含M::BiP:sGFP:HDEL的构建体(construct)(pTEX1L:sGFP)，通过此确认表达水平。将搬运pCAMBIA1300载体中包含35S启动子-sGFP-HSP终止子的载体、pMEGR载体和pTEX1L载体的农杆菌(Agrobacterium)通过注射器单独侵染(infiltration)至烟(Nicotiana benthamiana)叶中，同时与p38一同侵染后，在第五天从烟叶中萃取蛋白质，使用GFP抗体和TCV CP抗体通过免疫印迹法，确认了BiP-sGFP-HDEL核P38蛋白质的表达(参照图7B)。其结果是首先确认了在烟叶中通过农杆菌(agro-infiltration)的瞬时性表达与在拟南芥原生质体转化一样，通过MacT启动子-RD29B终止子sGFP表达相比通过35S启动子-HSP终止子组合的表达的2-3倍的水平(参照图7)。并且，P38共侵染的pMEGR和没有P38共侵染的pTEX1L:sGFP的sGFP表达没有太大差异，将pTEX1L:sGFP与P38共转化的情况下，确认sGFP的表达上也几乎没有差异。由此完成了通过一个双元载体能够同时传递目标蛋白质和基因沉寂抑制子p38的双重传递用表达载体。
实施例8
pTEX1L中在M::BiP:sGFP:HDEL中将sGFP替换为目标基因人弗林蛋白酶(humanFurin)，从而构建了pTEX1L中引入了M::BiP:hFurin:Hisx5:HDEL结构的构建体，将其引入农杆菌后，在本生烟(N.benthamiana)中诱导表达，从而以高水平生产了Furin:Hisx5:HDEL。
实施例9
pTEX1L中在M::BiP:sGFP:HDEL中将sGFP替换为目标基因胰蛋白酶(Tryosinogen)，从而构建了pTEX1L中引入了M::BiP:Trysinogen:Hisx5:HDEL结构的构建体，将其引入农杆菌后，在本生烟(N.benthamiana)中诱导表达，从而以高水平生产了Furin:Hisx5:HDEL。
序列表
<110> 浦项工科大学校产学协力团
巴伊沃爱普有限公司
<120> 从植物中大量生产目标蛋白质的方法
<130> SOP115995CN
<150> KR 10-2020-0034576
<151> 2020-03-20
<160> 10
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1220
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> Mac 启动子
<400> 1
agagatctcc tttgccccag agatcacaat ggacgacttc ctctatctct acgatctagt 60
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<211> 1220
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<213> 人造的
<220>
<223> Mac T 启动子
<400> 2
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tttggtcgtt tatttcggcg tgtaggacat ggcaaccggg cctgaatttc gcgggtattc 960
tgtttctatt ccaacttttt cttgatccgc agccattaac gacttttgaa tagatacgct 1020
gacacgccaa gcctcgctag tcaaaagtgt accaaacaac gctttacagc aagaacggaa 1080
tgcgcgtgac gctcgcggtg acgccatttc gccttttcag aaatggataa atagccttgc 1140
ttcctattat atcttcccaa attaccaata cattacacta gcatctgaat ttcataacca 1200
atctcgatac accaaatcgt 1220
<210> 3
<211> 520
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> RD29B 终止子
<400> 3
aattttactc aaaatgtttt ggttgctatg gtagggacta tggggttttc ggattccggt 60
ggaagtgagt ggggaggcag tggcggaggt aagggagttc aagattctgg aactgaagat 120
ttggggtttt gcttttgaat gtttgcgttt ttgtatgatg cctctgtttg tgaactttga 180
tgtattttat ctttgtgtga aaaagagatt gggttaataa aatatttgct tttttggata 240
agaaactctt ttagcggccc attaataaag gttacaaatg caaaatcatg ttagcgtcag 300
atatttaatt attcgaagat gattgtgata gatttaaaat tatcctagtc aaaaagaaag 360
agtaggttga gcagaaacag tgacatctgt tgtttgtacc atacaaatta gtttagatta 420
ttggttaaca tgttaaatgg ctatgcatgt gacatttaga ccttatcgga attaatttgt 480
agaattatta attaagatgt tgattagttc aaacaaaaat 520
<210> 4
<211> 1025
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> BiP-sGFP-HDEL
<400> 4
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt taaggatcca agatgatgat gataaggtga 300
gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 360
taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 420
tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 480
ccaccttcac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 540
acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 600
acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 660
gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 720
agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 780
aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 840
accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 900
gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 960
agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag cacgatgagc 1020
tctag 1025
<210> 5
<211> 272
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> BiP
<400> 5
atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggtgag 60
tgattttccg atcttcttct ccgatttaga tctcctctac attgttgctt aatctcagaa 120
ccttttttcg ttgttcctgg atctgaatgt gtttgtttgc aatttcacga tcttaaaagg 180
ttagatctcg attggtattg acgattggaa tctttacgat ttcaggatgt ttatttgcgt 240
tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 272
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> 5' UTR, M
<400> 6
ggcgtgtgtg tgtgttaaag a 21
<210> 7
<211> 714
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> sGFP
<400> 7
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caag 714
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> HDEL
<400> 8
cacgatgagc tc 12
<210> 9
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> P38
<400> 9
atggaaaatg atcctagagt ccggaagttc gcatctgatg gcgcccaatg ggcgataaag 60
tggcagaaga agggctggtc aaccctaacc agcagacaga aacagaccgc ccgcgcagcg 120
atggggatca agctctctcc tgtggcgcaa cctgtgcaga aagtgactcg actgagtgct 180
ccggtggccc ttgcctaccg cgaggttacc acccagcctc gggtctctac tgccagggac 240
ggcataacca gaagcggttc tgaactgatc acaaccttga agaagaacac tgacactgaa 300
cctaagtaca ccacagctgt gcttaaccca agcgaacccg gaacattcaa ccagctcatt 360
aaggaggcgg cccagtatga aaaataccga ttcacgtcac tcagatttag gtactccccc 420
atgagccctt caaccaccgg aggcaaggtg gctctggcat tcgatcgaga tgccgccaaa 480
cctccgccca acgacctcgc ttccctctac aacatagagg gttgtgtatc tagcgtgccc 540
tggacagggt ttattttgac cgtcccaaca gattctactg accgctttgt ggcggatggt 600
atcagcgatc caaagcttgt cgatttcggc aagcttatca tggccaccta cggccaagga 660
gccaatgatg ccgcccaact cggtgaagtg cgagtcgagt acaccgtgca gctcaagaac 720
agaactggct caaccagcga cgcccagatt ggggacttcg caggtgttaa ggacggaccc 780
aggctggttt catggtccaa gaccaagggg acagctgggt gggagcacga ttgtcatttt 840
ctcggaaccg gaaacttctc gttgacattg ttctacgaga aggcgccggt ctcggggcta 900
gaaaacgcag acgcctctga cttctcggtc ctgggagaag ccgcagcagg tagtgtccaa 960
tgggcaggag tgaaggtagc agaaagggga caaggcgtga aaatggtcac aactgaggag 1020
cagccaaagg gtaaatggca agcactcaga atttag 1056
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人造的
<220>
<223> L 5'-UTR
<400> 10
attattacat caaaacaaaa a 21

Claims (13)

1.一种用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其特征在于，所述载体包括：
(i)Mac启动子；
(ii)编码目标蛋白质的基因；
(iii)RD29B-t终止子。
2.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述Mac启动子的基因序列包含序列号1的碱基序列。
3.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述Mac启动子是将Mac启动子的3'末端碱基A取代为T的Mac T启动子。
4.根据权利要求3所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述MacT启动子包含序列号2的碱基序列。
5.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，RD29B-t终止子包含序列号3的碱基序列。
6.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述目标蛋白质是选自由水溶性绿色荧光蛋白、抗原、抗体、抗体片段、结构蛋白质、调节蛋白质、转录因子、毒蛋白质、激素、激素衍生物、细胞因子、酶、酶抑制剂、转运蛋白质、受体、受体片段、生物防御诱导剂、储藏蛋白质、移动蛋白质、开发蛋白质、生长因子及报告蛋白组成的组中的任意1种以上蛋白质。
7.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述载体是pCAMBIA1300。
8.根据权利要求1所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述重组载体还包括基因沉寂抑制子基因。
9.根据权利要求8所述的和用于从植物中大量生产蛋白质的重组载体，其中，所述基因沉寂抑制子基因是选自由p38、P19、HC-Pro及TVA 2b组成的组中的任意1种以上的蛋白质。
10.由权利要去1所述的重组载体转化的转化体。
11.根据权利要求10所述的转化体，其中，所述转化体为农杆菌。
12.从植物中生产目标蛋白质的方法，其特征在于，包括：
(a)根据权利要求1所述的重组载体的步骤；
(b)将所述重组载体引入细胞中制备转化体的步骤；
(c)培养所述转化体的步骤；
(d)将所述培养物侵染到植物的步骤；
(e)将所述植物粉碎萃取目标蛋白质的步骤。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述步骤(d)还可以包括：将含有p38的重组载体引入细胞的转化体额外地侵染到植物的步骤。
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