JP4392483B2 - 新規糖転移酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
本発明はカルコン類に糖を転移する活性を有する酵素の遺伝子、および当該糖転移酵素を利用して花色が変換された植物に関するものである。更に詳しくは、カルコン類の２’位配糖体を合成する活性を有する酵素遺伝子、好ましくはカーネーションまたはシクラメン由来のカルコン類の２’位配糖体を合成する活性を有する酵素遺伝子、及びその利用に関するものである。
花色は人が花卉を鑑賞あるいは購入する際に重要な形質であり、古くから様々な色の花が育種されてきた。単一の種ですべての色の花をもつ場合はむしろ稀であるが、これは花色として発現する色素（花色素）の生合成が遺伝的に規定されていることによる。交配育種では利用できる遺伝子資源が交配可能な近縁種に限定されているため、交配によって目的の種においてすべての色の花を作ることは実質的に不可能であった。最近になって、遺伝子組換え技術を利用して、花色素の合成に係る酵素の遺伝子をある植物から取得し、当該遺伝子を別の種で発現することにより花の色を改変することが可能となった（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）。
花の色のうち、橙、赤、紫、青は主にアントシアニンと呼ばれるフラボノイドに由来する。黄色は、カロチノイド、ベタレインといったフラボノイド以外の化合物に由来することが多いが、一部の植物種の黄色はフラボノイドに由来する。たとえば、黄色カーネーションには４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン（以下、「ＴＨＣ」とする。）の２’位配糖体が花弁中に存在することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。カルコン類としては、ＴＨＣ、ブテイン、イソリクイチゲニン等の配糖体が知られており、カーネーション、アサガオ、ボタン、アスター、ムギワラギクにはＴＨＣが、キンギョソウやスターチスには３，４，２’，４’，６’−ペンタヒドロキシカルコンが、コスモス、キクイモにはブテインが、ダリアにはブテインおよびイソリクイチゲニンをアグリコンとする配糖体が含まれている。また、キンギョソウなどの限られた種にはオーレウシジン、ブラックテアチンなどのオーロン類と呼ばれる黄色の花色素が存在するが、オーロンの吸収極大は３９９ｎｍから４０３ｎｍであるのに対し、カルコンの吸収極大は３６５ｎｍから３８２ｎｍであるから、両者の色調は異なる（例えば、非特許文献４参照）。一般にカルコン類、オーロン類とも植物細胞中では糖転移された配糖体になることにより安定化され液胞中に移行し蓄積される。アントシアニンの生合成経路はよく研究されており、アントシアニンの生合成に関与する酵素やそれらをコードする遺伝子が知られている（例えば、非特許文献５参照）。また、オーロンの生合成に関わる酵素とその遺伝子についても報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
フラボノイドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、また、種間で共通している。ＴＨＣは、３分子のマロニルＣｏＡと１分子のクマロイルＣｏＡからカルコン合成酵素の触媒作用により生合成される。図１に示すように、ＴＨＣは薄い黄色を呈するが、植物においては、カルコンイソメラーゼにより速やかに無色のナリンゲニンに変換される。また、ＴＨＣは中性付近のｐＨではきわめて不安定であり、自発的に閉環してナリンゲニンに変換される。ＴＨＣが植物細胞中で安定に存在する、すなわち黄色を安定に呈するためにはＴＨＣの２’位に糖転移され、液胞に輸送されることが必要であるとされている。したがって、ＴＨＣの２’位に糖転移する酵素の遺伝子を得ることができれば、この酵素遺伝子を植物において発現し、ＴＨＣ配糖体を蓄積させ、黄色の花を作成できると考えられていた（例えば、非特許文献７参照）。
しかしながら、ＴＨＣをはじめ、カルコン類の２’位の水酸基に糖、例えばグルコースを転移する反応を触媒する酵素の活性を測定することができなかった。従来カルコン糖転移酵素の活性測定には、ＵＤＰ−グルコースを放射性同位元素で標識し、酵素反応後、生成した配糖体を酢酸エチル抽出した有機層の放射活性を測定するという方法（例えば、非特許文献８参照）が用いられていた。しかし、ＴＨＣの配糖体はそのほとんどが水層に移動するため、放射活性でカウントされていたのは未反応でわずかに有機層に溶出したフリーのＵＤＰ−グルコースの可能性が高く、本来のＴＨＣ糖転移酵素活性を正確に測定できないという問題があった。従って、この糖転移反応を触媒する酵素が精製できなかったので、当該糖転移酵素をコードする遺伝子がクローン化できなかった。
ＴＨＣの２’位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も、花弁は淡い黄色となることは知られているが、このメチル化を触媒する酵素やその遺伝子については知られていない。ダリア、コスモスなどの黄色の品種には６’−デオキシカルコンが含まれる。マメ科植物においては、６’−デオキシカルコンは５−デオキシフラボノイドの前駆体であり、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とカルコンリダクターゼ（ＣＨＲ）の触媒作用により生合成される。ペチュニアにアルファルファのＣＨＲ遺伝子を導入したところ、ブテインなどの６’−デオキシカルコン類が生成したことが報告されているが、当該ＣＨＲ遺伝子を白い花をもつペチュニアに導入した場合、つぼみの段階ではごく薄い黄色が見られたが、開花時にはほとんど白であり、産業上有用な黄色の花を作出するに至らなかった（例えば、非特許文献９参照）。
フラボノイドをはじめ多様な花色素化合物の糖転移反応を触媒して配糖体を生成する酵素は、糖転移酵素と呼ばれ、植物はアグリコン及び転移する糖の種類に特異性を有する多様な分子種の糖転移酵素およびそれらをコードする遺伝子を持っている。グルコース転移酵素は通常ＵＤＰ−グルコースをグルコース供与体として利用するので、グルコース転移酵素はそのアミノ酸配列中にＵＤＰ−グルコースに結合するモチーフを含んでいる（例えば、非特許文献１０参照）。このモチーフを有する糖転移酵素の遺伝子は、すでにゲノムの全構造が明らかになっているアラビドプシスには、９９種あることが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。また、いくつかの糖転移酵素のアミノ酸配列と機能が解明されている。フラボノイドあるいはアントシアニジンの３位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子は、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどから得られている（例えば、非特許文献１１参照）。また、アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子は、シソ、バーベナなどから得られている（例えば、非特許文献１２参照）。
これらのグルコース転移酵素のアミノ酸配列の解析から、グルコース転移反応を触媒するという同一機能を有するタンパク質は植物種が異なっていてもアミノ酸配列は類似していること、すなわちファミリーを形成することが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。つまり、すでにアミノ酸配列とグルコース転移反応を触媒することが明らかとなっているグルコース転移酵素と同一機能を有する酵素（オルソログ）を他の植物種から得ることについては報告がある。たとえば、ペチュニアのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子は、シソのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子を用いてクローニングされた（例えば、非特許文献１３参照）。しかしながら、現在の技術水準からしても、アミノ酸配列あるいは機能の明らかではない糖転移酵素の遺伝子を取得することには、多大の試行錯誤と困難が伴う。特に、アラビドプシスの花は白であり、カルコン２’位配糖体の蓄積は報告されていない。したがって、すでにゲノム構造が決定されているアラビドプシスの糖転移酵素遺伝子の情報を利用して本遺伝子のクローニングを行うことはできない。カーネーションに関しては、カルコンイソメラーゼとジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子に変異が生じた際にＴＨＣ配糖体が蓄積し黄色を呈することが報告されている。また、シクラメンにおいてはカルコンイソメラーゼの変異によりＴＨＣ配糖体が蓄積すると考えられている。同様にカルコン２’位配糖体が蓄積する植物としてはペチュニア花粉，シャクヤク、ムギワラギク、エゾギク、シクラメン、ツキミソウ、ニチニチソウなどが知られており、また、多くの植物、特に薄い黄色の花を呈する植物にもＴＨＣの２’位に糖を転移する酵素の遺伝子が発現していると考えられる。
非特許文献１；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）
非特許文献２；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１）
非特許文献３；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，１１１（１９９６）
非特許文献４；バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社
非特許文献５；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９）
非特許文献６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００）
非特許文献７；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ）ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７）
非特許文献８；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．５３−５６，（１９７８）
非特許文献９；Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８）
非特許文献１０；Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１）
非特許文献１１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１）
非特許文献１２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５，（１９９９）
非特許文献１３；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１−１１（２００２）
花の色のうち、橙、赤、紫、青は主にアントシアニンと呼ばれるフラボノイドに由来する。黄色は、カロチノイド、ベタレインといったフラボノイド以外の化合物に由来することが多いが、一部の植物種の黄色はフラボノイドに由来する。たとえば、黄色カーネーションには４，２’，４’，６’−テトラヒドロキシカルコン（以下、「ＴＨＣ」とする。）の２’位配糖体が花弁中に存在することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。カルコン類としては、ＴＨＣ、ブテイン、イソリクイチゲニン等の配糖体が知られており、カーネーション、アサガオ、ボタン、アスター、ムギワラギクにはＴＨＣが、キンギョソウやスターチスには３，４，２’，４’，６’−ペンタヒドロキシカルコンが、コスモス、キクイモにはブテインが、ダリアにはブテインおよびイソリクイチゲニンをアグリコンとする配糖体が含まれている。また、キンギョソウなどの限られた種にはオーレウシジン、ブラックテアチンなどのオーロン類と呼ばれる黄色の花色素が存在するが、オーロンの吸収極大は３９９ｎｍから４０３ｎｍであるのに対し、カルコンの吸収極大は３６５ｎｍから３８２ｎｍであるから、両者の色調は異なる（例えば、非特許文献４参照）。一般にカルコン類、オーロン類とも植物細胞中では糖転移された配糖体になることにより安定化され液胞中に移行し蓄積される。アントシアニンの生合成経路はよく研究されており、アントシアニンの生合成に関与する酵素やそれらをコードする遺伝子が知られている（例えば、非特許文献５参照）。また、オーロンの生合成に関わる酵素とその遺伝子についても報告されている（例えば、非特許文献６参照）。
フラボノイドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、また、種間で共通している。ＴＨＣは、３分子のマロニルＣｏＡと１分子のクマロイルＣｏＡからカルコン合成酵素の触媒作用により生合成される。図１に示すように、ＴＨＣは薄い黄色を呈するが、植物においては、カルコンイソメラーゼにより速やかに無色のナリンゲニンに変換される。また、ＴＨＣは中性付近のｐＨではきわめて不安定であり、自発的に閉環してナリンゲニンに変換される。ＴＨＣが植物細胞中で安定に存在する、すなわち黄色を安定に呈するためにはＴＨＣの２’位に糖転移され、液胞に輸送されることが必要であるとされている。したがって、ＴＨＣの２’位に糖転移する酵素の遺伝子を得ることができれば、この酵素遺伝子を植物において発現し、ＴＨＣ配糖体を蓄積させ、黄色の花を作成できると考えられていた（例えば、非特許文献７参照）。
しかしながら、ＴＨＣをはじめ、カルコン類の２’位の水酸基に糖、例えばグルコースを転移する反応を触媒する酵素の活性を測定することができなかった。従来カルコン糖転移酵素の活性測定には、ＵＤＰ−グルコースを放射性同位元素で標識し、酵素反応後、生成した配糖体を酢酸エチル抽出した有機層の放射活性を測定するという方法（例えば、非特許文献８参照）が用いられていた。しかし、ＴＨＣの配糖体はそのほとんどが水層に移動するため、放射活性でカウントされていたのは未反応でわずかに有機層に溶出したフリーのＵＤＰ−グルコースの可能性が高く、本来のＴＨＣ糖転移酵素活性を正確に測定できないという問題があった。従って、この糖転移反応を触媒する酵素が精製できなかったので、当該糖転移酵素をコードする遺伝子がクローン化できなかった。
ＴＨＣの２’位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も、花弁は淡い黄色となることは知られているが、このメチル化を触媒する酵素やその遺伝子については知られていない。ダリア、コスモスなどの黄色の品種には６’−デオキシカルコンが含まれる。マメ科植物においては、６’−デオキシカルコンは５−デオキシフラボノイドの前駆体であり、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）とカルコンリダクターゼ（ＣＨＲ）の触媒作用により生合成される。ペチュニアにアルファルファのＣＨＲ遺伝子を導入したところ、ブテインなどの６’−デオキシカルコン類が生成したことが報告されているが、当該ＣＨＲ遺伝子を白い花をもつペチュニアに導入した場合、つぼみの段階ではごく薄い黄色が見られたが、開花時にはほとんど白であり、産業上有用な黄色の花を作出するに至らなかった（例えば、非特許文献９参照）。
フラボノイドをはじめ多様な花色素化合物の糖転移反応を触媒して配糖体を生成する酵素は、糖転移酵素と呼ばれ、植物はアグリコン及び転移する糖の種類に特異性を有する多様な分子種の糖転移酵素およびそれらをコードする遺伝子を持っている。グルコース転移酵素は通常ＵＤＰ−グルコースをグルコース供与体として利用するので、グルコース転移酵素はそのアミノ酸配列中にＵＤＰ−グルコースに結合するモチーフを含んでいる（例えば、非特許文献１０参照）。このモチーフを有する糖転移酵素の遺伝子は、すでにゲノムの全構造が明らかになっているアラビドプシスには、９９種あることが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。また、いくつかの糖転移酵素のアミノ酸配列と機能が解明されている。フラボノイドあるいはアントシアニジンの３位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子は、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどから得られている（例えば、非特許文献１１参照）。また、アントシアニンの５位の水酸基にグルコースを転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子は、シソ、バーベナなどから得られている（例えば、非特許文献１２参照）。
これらのグルコース転移酵素のアミノ酸配列の解析から、グルコース転移反応を触媒するという同一機能を有するタンパク質は植物種が異なっていてもアミノ酸配列は類似していること、すなわちファミリーを形成することが知られている（例えば、非特許文献１１参照）。つまり、すでにアミノ酸配列とグルコース転移反応を触媒することが明らかとなっているグルコース転移酵素と同一機能を有する酵素（オルソログ）を他の植物種から得ることについては報告がある。たとえば、ペチュニアのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子は、シソのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子を用いてクローニングされた（例えば、非特許文献１３参照）。しかしながら、現在の技術水準からしても、アミノ酸配列あるいは機能の明らかではない糖転移酵素の遺伝子を取得することには、多大の試行錯誤と困難が伴う。特に、アラビドプシスの花は白であり、カルコン２’位配糖体の蓄積は報告されていない。したがって、すでにゲノム構造が決定されているアラビドプシスの糖転移酵素遺伝子の情報を利用して本遺伝子のクローニングを行うことはできない。カーネーションに関しては、カルコンイソメラーゼとジヒドロフラボノール還元酵素遺伝子に変異が生じた際にＴＨＣ配糖体が蓄積し黄色を呈することが報告されている。また、シクラメンにおいてはカルコンイソメラーゼの変異によりＴＨＣ配糖体が蓄積すると考えられている。同様にカルコン２’位配糖体が蓄積する植物としてはペチュニア花粉，シャクヤク、ムギワラギク、エゾギク、シクラメン、ツキミソウ、ニチニチソウなどが知られており、また、多くの植物、特に薄い黄色の花を呈する植物にもＴＨＣの２’位に糖を転移する酵素の遺伝子が発現していると考えられる。
非特許文献１；Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９，１１１９（１９９８）
非特許文献２；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，１５５（２００１）
非特許文献３；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５，１１１（１９９６）
非特許文献４；バイオホルティ １ ４９−５７（１９９０）誠文堂新光社
非特許文献５；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ Ｉ（ｅｄ．Ｓａｎｋａｗａ）ｐｐ７１３−７４８，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９９）
非特許文献６；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９０，１１６３（２０００）
非特許文献７；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｎｔｓ（Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｅｖｅ，Ｐｒｅｅｃｅ ａｎｄ Ｍｅｒｋｌｅ）ｐｐ２５９−２９４，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９７）
非特許文献８；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．５３−５６，（１９７８）
非特許文献９；Ｐｌａｎｔ Ｊ．１３，２５９（１９９８）
非特許文献１０；Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２，４４６（２００１）
非特許文献１１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４３３８，（２００１）
非特許文献１２；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，７４０５，（１９９９）
非特許文献１３；Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８，４０１−１１（２００２）
本発明は、カルコン類の２’位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素及びその遺伝子、好ましくはカルコン類の２’位の水酸基に特異的にグルコースを転移する反応を触媒する酵素及びその遺伝子を提供する。さらに本発明は当該糖転移酵素遺伝子を用いて花色を改変、好ましくは黄色に変化させた植物体を提供する。
前述のように、カルコン２’位糖転移酵素の性質は知られておらず、酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。発明者らは、カーネーションの花弁ｃＤＮＡライブラリーから糖転移酵素の保存領域に対応したプローブを用いて、当該保存領域に対応する塩基配列を有する糖転移酵素遺伝子を数十種クローン化した。さらに、当該糖転移酵素遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、その中に、当該大腸菌の抽出液中にカルコンの２’位にグルコースを転移する活性、すなわちカルコン２’位糖転移酵素活性を確認し、クローン化した遺伝子が２’位糖転移酵素をコードすることを確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（２） 配列番号１に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（３） 配列番号１５に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（４） 配列番号１４に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５） 配列番号１７に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（６） 配列番号１６に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（７） 配列番号１９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（８） 配列番号１８に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（９） 配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１０） 配列番号２０に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１１） 配列番号５６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１２） 配列番号５５に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１３） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
（１４） 前記（１３）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１５） 前記（１４）に記載の宿主細胞を培養又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
（１６） 前記（１５）に記載の方法で得られたタンパク質。
（１７） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子が導入された植物体若しくは当該植物体の子孫となる植物体、又はそれら植物体の組織。
（１８） 前記（１７）に記載の植物体から採取された切り花。
（１９） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子を植物体に導入及び発現して花色が改変された植物体、及び当該植物体の子孫となる植物体。
（２０） 改変された花色が黄色であることを特徴とする前記（１８）に記載の植物体。
本発明により新規な遺伝子および酵素等が提供され、カルコン類の２’位の水酸基に特異的に糖を転移させることができ、カルコン類を安定化させることができる。本発明は、花色を改変させた植物体の作製に好適に用いられる。
前述のように、カルコン２’位糖転移酵素の性質は知られておらず、酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。発明者らは、カーネーションの花弁ｃＤＮＡライブラリーから糖転移酵素の保存領域に対応したプローブを用いて、当該保存領域に対応する塩基配列を有する糖転移酵素遺伝子を数十種クローン化した。さらに、当該糖転移酵素遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、その中に、当該大腸菌の抽出液中にカルコンの２’位にグルコースを転移する活性、すなわちカルコン２’位糖転移酵素活性を確認し、クローン化した遺伝子が２’位糖転移酵素をコードすることを確認して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１） 配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（２） 配列番号１に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（３） 配列番号１５に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（４） 配列番号１４に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（５） 配列番号１７に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（６） 配列番号１６に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（７） 配列番号１９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（８） 配列番号１８に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（９） 配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１０） 配列番号２０に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
（１１） 配列番号５６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１２） 配列番号５５に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（１３） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
（１４） 前記（１３）に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
（１５） 前記（１４）に記載の宿主細胞を培養又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
（１６） 前記（１５）に記載の方法で得られたタンパク質。
（１７） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子が導入された植物体若しくは当該植物体の子孫となる植物体、又はそれら植物体の組織。
（１８） 前記（１７）に記載の植物体から採取された切り花。
（１９） 前記（１）から（１２）のいずれか一項に記載の遺伝子を植物体に導入及び発現して花色が改変された植物体、及び当該植物体の子孫となる植物体。
（２０） 改変された花色が黄色であることを特徴とする前記（１８）に記載の植物体。
本発明により新規な遺伝子および酵素等が提供され、カルコン類の２’位の水酸基に特異的に糖を転移させることができ、カルコン類を安定化させることができる。本発明は、花色を改変させた植物体の作製に好適に用いられる。
第１図は、カルコン２’位糖転移酵素によるカルコン２’位配糖体の合成経路を示す図である。
第２図は、植物由来の糖転移酵素のアミノ酸の配列のアライメントを示す図である。矢印で示した部分のアミノ酸配列に相当する塩基配列をプライマーとして用いた。これらにより増幅される部分をＧＴ保存領域として実施例２のプローブに用いた。四角で囲んだ部分は各ＧＴ間の配列に相同性のある部分である。略号は、次の通りである。ＭＧ３ＧＧＴ：アサガオ３ＧＧＴ； ＧＧＴ７：リンドウ３ＧＴ； ＨＧＴ８：バーベナ５ＧＴ； Ｓｂ ＵＦＧＴ：コガネバナＧＴ。
第２図は、植物由来の糖転移酵素のアミノ酸の配列のアライメントを示す図である。矢印で示した部分のアミノ酸配列に相当する塩基配列をプライマーとして用いた。これらにより増幅される部分をＧＴ保存領域として実施例２のプローブに用いた。四角で囲んだ部分は各ＧＴ間の配列に相同性のある部分である。略号は、次の通りである。ＭＧ３ＧＧＴ：アサガオ３ＧＧＴ； ＧＧＴ７：リンドウ３ＧＴ； ＨＧＴ８：バーベナ５ＧＴ； Ｓｂ ＵＦＧＴ：コガネバナＧＴ。
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号２、１５、１７、１９、２１、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失または他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、もとのタンパク質と同等の酵素活性を維持することが知られている。従って本発明は、カルコン２’位糖転移酵素活性を保持しているタンパク質である限り、配列番号２、１５、１７、１９、２１、５６に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質および当該タンパク質をコードする遺伝子も本発明に属する。なお、複数個とは、２〜３０個、好ましくは２〜９個をいう。
本発明はまた、配列番号１、１４、１６、１８、２０、５５のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン２’位糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。すなわち、配列番号１、１４、１６、１８、２０、５５のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルコン２’位糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の技術的範囲に属する。ハイブリダイゼーションの条件はプローブに用いるＤＮＡの長さ及び塩基組成によって異なるから、以下に数値によって示す具体的な条件に限定されるものではないが、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、好ましくは５×ＳＳＣ、３７℃、より好ましくは５×ＳＳＣ、５０℃、さらに好ましくは２×ＳＳＣ、６５℃である。ここで、５×ＳＳＣ、３７℃の条件は、実施例２に示すように、アントシアニジン類の糖転移酵素遺伝子の保存領域をプローブとして、本発明のカルコン２’位糖転移酵素のようなホモログとハイブリダイズさせる条件として好ましく適用でき、５×ＳＳＣ、５０℃の条件は、本発明のカーネーション由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子をプローブとして他起源のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子（オルソログ）をハイブリダイズさせる条件として好ましく適用できる。
上述のようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えばシクラメン由来の遺伝子が挙げられるが、植物由来に限定されるものではない。すなわち、本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子は、カーネーション由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子に限定されるものではなく、当該遺伝子のオルソログであるシクラメン、シャクヤクなどのカルコン類の２’位配糖体を含む植物に由来するカルコン２’位糖転移酵素遺伝子であってもよく、当該遺伝子のいずれでも黄色の花を育種するのに用いることができる。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
糖転移酵素の保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すように、例えばカーネーション花弁から作成したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１５に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１４に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１７に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１９に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号２１に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号２０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号５６に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号５５に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。例えばアミノ酸配列を改変したいＤＮＡ断片をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望のアミノ酸配列の改変に対応したプライマーを用い、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望のアミノ酸配列の改変に対応したＤＮＡ断片を得ることができる。その後、この改変を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
このようにして得られた糖転移酵素遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、当該大腸菌又は酵母の抽出液中のカルコン２’位糖転移酵素の活性を測定することにより、得られた糖転移酵素遺伝子がカルコン２’位糖転移活性を示すタンパク質をコードすることを確認することができる。カルコン２’位糖転移酵素の活性は、例えば実施例５に記載したように、ゲル濾過樹脂にカルコン２’位糖転移酵素の基質となるカルコン類を吸着させた後、当該ゲル濾過樹脂を糖転移酵素遺伝子で形質転換した大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、生成したカルコン２’位配糖体を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより測定できる。
さらに、得られたカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を適切な宿主細胞で発現させることにより、当該遺伝子の産物であるカルコン２’位糖転移酵素タンパク質を得ることができる。あるいはまた、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を有するタンパク質又はペプチドに対する抗体を用いて他の生物由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を発現クローニングによって得ることもできる。配列番号１５、１７、１９、２１、５６のアミノ酸配列に関しても同様である。
本発明はまた、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、例えばバシルス．スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。真核細胞としては、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属糸状菌等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、ｔｒｐＣ等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作成は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
植物の発現ベクターの構築は、例えばアグロバクテリウムを用いる場合にはｐＢＩ１２１などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合にはｐＵＣ１９などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子で形質転換された植物体を得ることができる。当該形質転換植物を栽培することにより、開花させ、花色が改変された植物体を得ることができる。
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を培養又は栽培し、培養物または植物体等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とするカルコン２’位糖転移酵素を回収、精製することができる。
本発明はカーネーション、シクラメンのカルコン２’位糖転移酵素遺伝子のみに限定されるものではなく、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、当該遺伝子がコードするタンパク質がカルコン２’位糖転移活性を有していれば同様に花色変換へ利用できる。本発明はまた、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の利用に関するものであり、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子を植物体に導入および発現することにより、花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体又はこれら植物体の組織も本発明の技術的範囲であり、組織の形態としては切り花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレッション法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、ニチニチソウなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
また、花色を改変させる方法の他の実施形態としては、上記のように本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を導入すると共に、併せてＴＨＣがカルコン２’位配糖体以外の物質に転換される代謝を抑制するような手段を採ることもできる。例えば、本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を導入すると共に、ＣＨＩ遺伝子（ＥＭＢＯ Ｊ ７、１２５７（１９８８））、ペチュニアのフラバノン３水酸化酵素遺伝子（Ｆ３Ｈ）（Ｂｒｉｔｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１７，ｐ７４５−７５４）、ジヒドロフラボノール４還元酵素遺伝子（ＤＦＲ）（Ｂｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，ｐ４９１−５０２，Ｈｕｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，ｐ２９５−３１０）などの遺伝子群から選ばれる１種または２種以上の遺伝子の発現を抑制する形態を採用してもよい。
本発明はまた、配列番号１、１４、１６、１８、２０、５５のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡに対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン２’位糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子に関するものである。すなわち、配列番号１、１４、１６、１８、２０、５５のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡに対しストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつカルコン２’位糖転移酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も、本発明の技術的範囲に属する。ハイブリダイゼーションの条件はプローブに用いるＤＮＡの長さ及び塩基組成によって異なるから、以下に数値によって示す具体的な条件に限定されるものではないが、ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、例えば、好ましくは５×ＳＳＣ、３７℃、より好ましくは５×ＳＳＣ、５０℃、さらに好ましくは２×ＳＳＣ、６５℃である。ここで、５×ＳＳＣ、３７℃の条件は、実施例２に示すように、アントシアニジン類の糖転移酵素遺伝子の保存領域をプローブとして、本発明のカルコン２’位糖転移酵素のようなホモログとハイブリダイズさせる条件として好ましく適用でき、５×ＳＳＣ、５０℃の条件は、本発明のカーネーション由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子をプローブとして他起源のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子（オルソログ）をハイブリダイズさせる条件として好ましく適用できる。
上述のようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えばシクラメン由来の遺伝子が挙げられるが、植物由来に限定されるものではない。すなわち、本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子は、カーネーション由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子に限定されるものではなく、当該遺伝子のオルソログであるシクラメン、シャクヤクなどのカルコン類の２’位配糖体を含む植物に由来するカルコン２’位糖転移酵素遺伝子であってもよく、当該遺伝子のいずれでも黄色の花を育種するのに用いることができる。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
糖転移酵素の保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すように、例えばカーネーション花弁から作成したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１５に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１４に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１７に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１６に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号１９に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号１８に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号２１に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号２０に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。また、配列番号５６に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードするＤＮＡは、配列番号５５に記載の塩基配列を有するＤＮＡを用いて、公知の部位特定変異誘発法やＰＣＲ法によって合成することができる。例えばアミノ酸配列を改変したいＤＮＡ断片をｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望のアミノ酸配列の改変に対応したプライマーを用い、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望のアミノ酸配列の改変に対応したＤＮＡ断片を得ることができる。その後、この改変を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分のアミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
このようにして得られた糖転移酵素遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、当該大腸菌又は酵母の抽出液中のカルコン２’位糖転移酵素の活性を測定することにより、得られた糖転移酵素遺伝子がカルコン２’位糖転移活性を示すタンパク質をコードすることを確認することができる。カルコン２’位糖転移酵素の活性は、例えば実施例５に記載したように、ゲル濾過樹脂にカルコン２’位糖転移酵素の基質となるカルコン類を吸着させた後、当該ゲル濾過樹脂を糖転移酵素遺伝子で形質転換した大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、生成したカルコン２’位配糖体を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより測定できる。
さらに、得られたカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を適切な宿主細胞で発現させることにより、当該遺伝子の産物であるカルコン２’位糖転移酵素タンパク質を得ることができる。あるいはまた、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部又は一部を有するタンパク質又はペプチドに対する抗体を用いて他の生物由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を発現クローニングによって得ることもできる。配列番号１５、１７、１９、２１、５６のアミノ酸配列に関しても同様である。
本発明はまた、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主細胞に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、例えばバシルス．スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など従来公知の宿主細胞を用いることができる。真核細胞としては、例えば真核微生物、好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。酵母としては例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母が挙げられ、また糸状菌としては、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属糸状菌、及びペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属糸状菌等が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞も宿主細胞として使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存したプロモーターおよびターミネーター等の発現制御領域、及び複製起点等を含有する。細菌用、特に大腸菌における発現ベクターのプロモーターとしては、従来公知のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用できる。また、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼ、ｔｒｐＣ等のプロモーターが使用できるが、これらのプロモーターに限定されるものではない。また動物細胞用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作成は制限酵素、リガーゼ等を用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公知の方法に従って行うことができる。
植物の発現ベクターの構築は、例えばアグロバクテリウムを用いる場合にはｐＢＩ１２１などのバイナリーベクターを、パーティクルガンを用いる場合にはｐＵＣ１９などの大腸菌ベクターを用いることができる。さらに、当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、適切な植物ホルモン等の条件を用いて再分化させ、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子で形質転換された植物体を得ることができる。当該形質転換植物を栽培することにより、開花させ、花色が改変された植物体を得ることができる。
発現ベクターによって形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を培養又は栽培し、培養物または植物体等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とするカルコン２’位糖転移酵素を回収、精製することができる。
本発明はカーネーション、シクラメンのカルコン２’位糖転移酵素遺伝子のみに限定されるものではなく、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、当該遺伝子がコードするタンパク質がカルコン２’位糖転移活性を有していれば同様に花色変換へ利用できる。本発明はまた、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の利用に関するものであり、カルコン２’位糖転移酵素遺伝子を植物体に導入および発現することにより、花色が改変された植物体もしくはその子孫の植物体又はこれら植物体の組織も本発明の技術的範囲であり、組織の形態としては切り花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレッション法などによって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、ニチニチソウなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
また、花色を改変させる方法の他の実施形態としては、上記のように本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を導入すると共に、併せてＴＨＣがカルコン２’位配糖体以外の物質に転換される代謝を抑制するような手段を採ることもできる。例えば、本発明のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子を導入すると共に、ＣＨＩ遺伝子（ＥＭＢＯ Ｊ ７、１２５７（１９８８））、ペチュニアのフラバノン３水酸化酵素遺伝子（Ｆ３Ｈ）（Ｂｒｉｔｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１７，ｐ７４５−７５４）、ジヒドロフラボノール４還元酵素遺伝子（ＤＦＲ）（Ｂｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，ｐ４９１−５０２，Ｈｕｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，ｐ２９５−３１０）などの遺伝子群から選ばれる１種または２種以上の遺伝子の発現を抑制する形態を採用してもよい。
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、ＷＯ９６／２５５００号公報あるいはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
実施例１ カーネーション花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のカーネーションの新鮮な花弁５ｇから、Ｒ．ＭｃＧｏｏｋｉｎらのＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９８４）に詳細に示されているチオシアン酸グアニジン・塩化セシウムを用いる方法でＲＮＡを取得し、オリゴテックスｄＴ３０（日本ロシュ社）を用いてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびλＺＡＰＩＩＵｎｉ−ＸＲ ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、１．６ｘ１０５ プラーク・フォーミング・ユニット（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）からなっていた。
実施例２ 完全長カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の取得
図２に示した、糖転移酵素（ＧＴ）のアミノ酸配列を比較し得られた保存領域（図２中、対合する矢印で示した領域）に相当する塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅し、これをプローブとして実施例１で述べたカーネーションｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。アミノ酸配列を比較したＧＴはアサガオ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−グルコシド糖転移酵素（３ＧＧＴ）（配列番号１３に記載のアミノ酸配列）、リンドウ由来ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン３−グルコシルトランスフェラーゼ（３ＧＴ）（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐｐ．７１１（１９９６））、バーベナ由来ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼ（５ＧＴ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，７４０５，（１９９９））、コガネバナ糖転移酵素（ＧＴ）（Ｐｌａｎｔａ ２１０，１００６−１０１３（２０００））記載のアミノ酸配列の４種である。それぞれＧＴについて、図２の逆方向の矢印で示した保存領域を増幅できるオリゴヌクレオチドを作製し、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）にて製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型として１ｎｇのそれぞれのｃＤＮＡを含むプラスミド、プライマーとして各１００ｎｇの以下のオリゴヌクレオチドを使用し、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分からなる反応を１サイクルとし、２５サイクルを行った。これらのＰＣＲ増幅産物を等量混合したものをハイブリダイゼーションのプローブとして、実施例１に記載のカーネーション由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。保存領域の増幅に使用したプライマーは以下のとおりである。
ライブラリーのスクリーニングはノンラジオシステムＤＮＡ検出キット（ロッシュ・ダイアグノスティック社製）を用いて行った。ハイブリダイゼーションは、１％ＳＤＳ、３０％ホルムアミドを含む５×ＳＳＣ中で３７℃で一夜行い、フィルターの洗浄は１ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳを用いて５５℃で３０分間行った。約２７万プラークをスクリーニングし、最終的に約３０の糖転移酵素遺伝子を含むクローンを得た。このクローンの中から、実施例４及び実施例５に記載した方法でカルコン２’位糖転移活性を確認できたクローンが１つ得られ、該クローンをＴ１７０と名づけ全塩基配列を決定した。塩基配列の決定は合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法により行い、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。塩基配列と当該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１及び２に、それぞれ示した。
実施例３ カルコン２’位糖転移酵素Ｔ１７０のアミノ酸配列解析
ｐＴ１７０は、４９０アミノ酸からなる分子量５４．２ｋＤａのタンパク質をコードする１７０９ｂｐの遺伝子Ｔ１７０を含んでいた。Ｔ１７０がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９，５０９（１９９９））と２５％、シソ、バーベナ由来５ＧＴと２１％の相同性を示した。使用したソフトフェアはＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ社）に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷで、条件は、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｌｏｓｕｍ：３０、ｋｅｔｕｐｌｅ：１、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：３、Ｔｏｐｄｉａｇｏｎａｌｓ：５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ：５で行った。ＢＬＡＳＴ検索（検索はデフォルトの条件で実施した。すなわち、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓは、ｏｎ、Ｃｈｏｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒはＬｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、ＭａｔｒｉｘはＢｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ ｃｏｓｔｓはＥｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ：１）では多くのＧＴに対してホモロジーを示した。たとえば、リビングストーンデージー由来ベタニジン６ＧＴ（Ｐｌａｎｔａ Ｖｏｌ．２１４，ｐｐ．４９２（２００２））に対して５５％、サリチル酸などで誘導されるタバコＧＴ（アクセション番号ＡＢ０５２５５７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．４０８６（２００１））に対して４５％、タバコＮＴＧＴ３（アクセション番号ＡＢ０７２９１８）に対して４４％のアミノ酸配列の相同性を示した。
同じ機能、活性を有する酵素はアミノ酸配列が類似しており、ファミリーを形成することが知られているが、ＧＴにおいても、図２に示したアサガオ由来の３ＧＧＴ、リンドウ由来の３ＧＴ及びバーベナ由来の５ＧＴ及びコガネバナＧＴはファミリーを形成する。本発明のカルコン２’位糖転移酵素のアミノ酸配列はこれら４種のＧＴのアミノ酸配列とは低いホモロジーしか示さず、このファミリーには属さない。また、上記のリビングストーンデージー由来ベタニジン６ＧＴ、サリチル酸などで誘導されるタバコＧＴ及びタバコＮＴＧＴ３には比較的高いホモロジーを示したが、これらのＧＴにカルコン糖転移活性は確認されていない。
実施例４ 大腸菌におけるＴ１７０遺伝子の発現
Ｔ１７０遺伝子の大腸菌での発現は、Ｔｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。まずＴ１７０上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示す２種のプライマーＴ１７０−ＮｃｏＩおよびＭ１３ Ｍ４ を用いてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、Ｔ１７０ １００ｎｇ，１ｘＥｘ−Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔａｋａｒａ社），０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ，Ｅｘ−Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １．２５Ｕからなる。反応は、９４℃で５分反応させた後、９４℃、１分、５５℃、１分、７２℃、２分の反応を２５サイクル行い、最後に７２℃で７分間処理した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＴＯＰＯ−Ｔ１７０とした。ＰＣＲ反応によるエラーがないことを塩基配列を決定することにより確認した。ｐＱＥ６０（ＱＩＡＧＥＮ）をＮｃｏＩとＢｇｌＩＩで消化した後、同部位に相補的プライマーｐＱＥ６１−ｆとｐＱＥ６１−ｒをアニーリングさせたオリゴヌクレオチドカセットを挿入して、新たにＭＣＳを導入したベクターｐＱＥ−６１を作製した。
ｐＴＯＰＯ−Ｔ１７０をＮｃｏＩ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩで制限酵素処理し得られた約１．８ＫｂのフラグメントをベクターｐＱＥ−６１のＮｃｏＩとＫｐｎＩ切断部位に連結し、プラスミドｐＳＢ１４４３を得た。ｐＳＢ１４４３でＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ社）を形質転換した。
実施例５ Ｔ１７０ ｃＤＮＡ組換えタンパク質の糖転移酵素活性の測定
実施例４にて得られた大腸菌形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌで３７℃で一晩振とう培養した。そのうち２００μｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地１０ｍｌに加えＡ６００＝０．６〜１．０に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．０２ｍＭになるよう加え、さらに２７℃で一晩振とう培養し、冷却遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行い、得られた上清を粗酵素液とし、以下の活性測定に用いた。
ＴＨＣ（５００μｇ／ｍｌエタノール溶液）を蒸溜水で平衡化したゲル濾過樹脂、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社）１ｍｌに蒸溜水３ｍｌで希釈しながら負荷した後、水洗した。この樹脂１００μｌに粗酵素液２００μｌおよび５ｍＭ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ １０μｌを加え、３０℃で２時間反応させた。遠心上清を除去後、水洗し、０．１％ ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル３００μｌを加え反応停止させ、超音波処理によりフラボノイドを樹脂より遊離した。１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、４ｍｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ、ミリポア）を用いて不溶物を除去して、液体高速クロマトグラフィーで分析した。カルコンおよびその配糖体の分析条件は以下の通りである。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ、Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配１５分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配１０分間の溶出の後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所社）による２５０〜４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間２７．３分に溶出され、その２’位配糖体は１９．８９分に溶出されることをＴＨＣ及びＴＨＣ２’位配糖体の標準品を用いて確認した。
Ｔ１７０由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたとところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことから、Ｔ１７０に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。
以上の結果から、Ｔ１７０由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例６ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築
Ｔ１７０由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、ＴＨＣの２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡ Ｔ１７０を発現させ、本酵素とＴＨＣを基質とするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ遺伝子の１つであるＣＨＩ−Ａ遺伝子（ＥＭＢＯ Ｊ ７、１２５７（１９８８））の発現を抑制するバイナリーベクター（ｐＳＰＢ１３４２）を構築した。ｐＳＰＢ１３４２の作製は以下のように行った。
ペチュニア（品種バカラレッド、サカタのタネ社）の葉よりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、これよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡよりプライマー、ＢａｍＨＩ−ＣＨＩ−Ｆ（配列番号４９）およびＳａｌ−ＣＨＩ−Ｒ（配列番号５０）、Ｓａｌ−ＣＨＩ−Ｆ（配列番号５１）およびＥｃｏＲＩ−ＣＨＩ−Ｒ（配列番号５２）を用いてＰＣＲによりそれぞれ０．６ｋｂおよび０．８ｋｂのペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を得た。得られた断片をそれぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化したペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を作製した。一方ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）はエンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅ１２３５Ｓ）プロモーターとノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有する。ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化し、ＢａｍＨＩリンカー（タカラ）を挿入することにより、ｐＵＥ６を得た。ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカー（たとえばタカラ社）を挿入した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうちＥ１２３５Ｓプロモーターを有する断片を植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３（１９９５））のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このプラスミドｐＳＰＢ１７６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したＤＮＡ断片と前述の２種のペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を連結することによりｐＳＰＢ１６０１を得た。このｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）（ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入されているＴ１７０遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、約１．５ｋｂのＴ１７０ｃＤＮＡ断片を得た。ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）のＰａｃＩ部位をＡｓｃＩリンカーで置換したプラスミドをｐＵＣＡＡ上で、当該ｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を５’末端、ＥｃｏＲＩ切断部位を３’末端として、ＭＡＣ１プロモーター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３（１９９０））、Ｔ１７０遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子（ｍａｓ）ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを構築した（ｐＳＰＢ１５００）。
上記のようにして構築されたＴ１７０発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によって回収し、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにバイナリーベクターのレフトボーダー（ＬＢ）側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１３４２とした。
次に、ｐＳＢＰ１３４２を持つアグロバクテリウムを作製し、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法でペチュニア（品種ＰＬ）リーフディスクに形質転換を行った。形質転換の方法は公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９４ ５ ｐ８１）によった。
実施例７ Ｔ１７０の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例６で作製したｐＳＰＢ１３４２をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，９６３−９６７，１９９１）に導入し、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法でペチュニア（品種 ＰＬ）リーフディスクに形質転換を行った。アグロバクテリウムへのプラスミドの導入、形質転換の方法は公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９４ ５ ｐ８１）によった。品種ＰＬはフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子（Ｈｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，ｐ２７６−２７９）、フラボノイド３’−水酸化酵素遺伝子（Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ １９，ｐ４４１−４５１）を欠損しているため花色は白ないし薄いピンクである。なお、本実験の目的には使用するペチュニア品種はＰＬに限定されるものではない。
上記のようにして６１系統の独立した形質転換ペチュニアを得た。ペチュニア花弁からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて逆転写反応を行い、さらにＥｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて製造者の推奨する方法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１７０のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ１７０ＦとＴ１７０Ｒを、ペチュニアＣＨＩ ｍＲＮＡの増幅にはプライマーＣＨＩＦ１とＣＨＩＲ１を用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
その結果、３８系統のペチュニア花弁でＴ１７０のｍＲＮＡが検出され、３２系統のペチュニアでペチュニアＣＨＩ ｍＲＮＡの減少が観察された。
Ｔ１７０のｍＲＮＡが検出されたペチュニア花弁０．５ｇを２．５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣの条件は、ＯＤＳ−Ａ−３１２（１５０×６．０ｍｍ）を用いた実施例５と同じ条件を用いた。本条件ではカルコン２’位配糖体、カルコン４’位配糖体はそれぞれリテンションタイム１９．８９分、２１．６９分に溶出される。Ｔ１７０を発現しているペチュニアのうち３系統でカルコン２’位配糖体に対応するピークをもち、また同じ吸収スペクトルを有していた。さらにＴ１７０を発現しているペチュニア花弁の抽出物とカルコン２’位配糖体をコクロマトグラフィーにより解析したところ、両者のピークは完全に一致した。以上の結果より、Ｔ１７０の発現によりカルコン２’位配糖体が合成された、すなわちＴ１７０は植物の中で機能するカルコン２’位糖転移酵素をコードしていることを示すことができた。なお、形質転換ペチュニアにおいては、ペチュニアＣＨＩのｍＲＮＡ量は減少していたものの低レベルの転写が認められた。
実施例８ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築２
Ｔ１７０の発現とペチュニアＣＨＩ遺伝子の抑制だけでは十分量のカルコン２’位配糖体の蓄積が十分ではなかったため、ペチュニアのフラバノン３水酸化酵素遺伝子（Ｆ３Ｈ）（Ｂｒｉｔｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１７，ｐ７４５−７５４）あるいはジヒドロフラボノール４還元酵素遺伝子（ＤＦＲ）（Ｂｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，ｐ４９１−５０２，Ｈｕｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，ｐ２９５−３１０）の抑制を行うことにした。
（８−１）ペチュニアＦ３ＨｃＤＮＡ 二本鎖コンストラクト構築
ペチュニアＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２６５を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＰｈＦ３Ｈ−１−ＣｌａＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４０）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＰｈＦ３Ｈ−１断片を得た。このＰｈＦ３Ｈ断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした後、ＳａｃＩとＣｌａＩで切り出し、約０．７ｋｂの断片ＰｈＦ３Ｈ−１’とした。一方、ｐＳＰＢ２６５をＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化して約０．９ｋｂの断片を切り出しＰｈＦ３Ｈ−２’とした。ｐＵＥ６をｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）のＡｓｃＩ部位を平滑末端化し、ＰａｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＰＰとした。ｐＵＥ６をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片のうちＥ１２３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片を、ｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＳＰＢ５４０とした。ｐＳＰＢ５４０をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．７ｋｂのＤＮＡ断片と、ＰｈＦ３Ｈ−１’とＰｈＦ３Ｈ−２’断片をライゲーションによってｐＳＰＢ１４９８を構築した。結果、このｐＳＰＢ１４９８はＥＬ２３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーター制御下にｄｓＦ３Ｈを転写できる構造をとる。
次に、ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＴ１７０とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１３４２のＰａｃＩ部位に導入しＴ１７０・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子が同方向に並んだバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０１を構築した。
（８−２）ペチュニアＤＦＲｃＤＮＡ 二本鎖コンストラクト構築
ペチュニアＤＦＲ遺伝子を含むｐＣＧＰ１４０３（ＷＯ９６１３６７１６）をＢａｍＨＩおよびＳｃａＩ、ＰｖｕＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、それぞれ０．８５ｋｂおよび０．４５ｋｂの断片を得た。２本鎖ＲＮＡ構造を形成するこれら両断片とＥＬ２ ３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）ならびにｍａｓターミネーターから構成されるカセットを、植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３）のＭＣＳ内ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入し、これをｐＳＰＢ５３２とした。これをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に実施例６に記述した、ＥＬ２ ３５Ｓプロモーターと２本鎖ＲＮＡ構造をもつペチュニアＣＨＩ遺伝子ならびにＮＯＳターミネーターから構成されるカセットを含むｐＳＰＢ１６０１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、約２．５ｋｂの断片を得た。これをベクターｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入し、ｐＳＦＬ５とした。これをＰａｃＩで切断し、ｐＵＣＰＰベクターから切り出し得られた約２．５ｋｂの断片を前述のｐＳＰＢ５３２のＰａｃＩ切断部位にペチュニアのＤＦＲ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ１３とした。次にこれをＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。実施例６に記述したプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３）、Ｔ１７０遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを、ＡｓｃＩで切断し、ｐＵＣＡＡベクターから切り出し、約３．５ｋｂの断片を得た。これを前述のｐＳＦＬ１３のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＤＦＲおよびＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ１４とした。
実施例９ カルコン糖転移酵素遺伝子Ｔ１２８の取得
カーネーションにはＴ１７０以外にもカルコン糖転移酵素遺伝子が存在する可能性があるため探索を継続した。実施例２で得た糖転移酵素のうちｐＴ１２８としたプラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１４、１５に示した。ｐＴ１２８に含まれるｃＤＮＡは、４８９アミノ酸からなる分子量５５．２ｋＤａのタンパク質をコードする１４６７ｂｐの遺伝子Ｔ１２８を含んでいた。Ｔ１２８がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと５４％、バーベナ由来５ＧＴと２４％の同一性を示した。またＴ１７０とは２７％の同一性を示した。
実施例１０ 大腸菌におけるＴ１２８遺伝子の発現と活性測定
Ｔ１２８遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＴ１２８上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＴ１２８−ＮｃｏＩと実施例４で示したＭ１３ Ｍ４を用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドをｐＴＯＰＯ−Ｔ１２８とした。ＰＣＲ反応によるエラーがないことを塩基配列を決定することにより確認した。ｐＴＯＰＯ−Ｔ１２８をＮｃｏＩ、ＫｐｎＩで制限酵素処理し得られた約１．８ｋｂのフラグメントをｐＱＥ−６１ ｖｅｃｔｏｒ（ＱＩＡＧＥＮ）の同サイトに連結し、プラスミドｐＳＰＢ１４４１を得た。ｐＳＢ１４４１をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。Ｔ１２８由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分と２１．６９分に溶出される新たな物質が検出された。前者はＴＨＣの２’位配糖体で、後者はＴＨＣの４’位配糖体であることを、それぞれの標準品の保持時間と比較することで同定した。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＴ１２８に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、Ｔ１２８由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位と４’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例１１ Ｔ１２８の植物での発現ベクターの構築
Ｔ１２８由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｔ１２８を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ２１０８）を構築した。ｐＳＰＢ２１０８の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＴ１２８遺伝子を、ＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｔ１２８ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｔ１２８遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを、ｐＵＣＡＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩサイトを３’端として構築した。このＴ１２８発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
ｐＵＣＡＡベクターからＡｓｃＩで切り出した発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位に、ペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ２１０８とした。
実施例１２ カルコン糖転移酵素遺伝子ＣＧＴ９３の取得
Ｔ１７０をプローブとして、カーネーション花弁ライブラリー２４０００プラークよりスクリーニングを行った。スクリーニングによりプラスミドｐＣＧＴ９３を得た。ｐＣＧＴ９３に含まれるｃＤＮＡは、４８１アミノ酸からなる分子量５２．８ｋＤａのタンパク質をコードする１４４３ｂｐの遺伝子ＣＧＴ９３を含んでいた。ＣＧＴ９３がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと２６％、バーベナ由来５ＧＴと２３％の同一性を示した。またＴ１７０とは６３％、Ｔ１２８とは２５％の同一性を示した。ｐＣＧＴ９３中に含まれる遺伝子を含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１６、１７にそれぞれ示す。
実施例１３ 大腸菌におけるＣＧＴ９３遺伝子の発現と活性測定
ＣＧＴ９３遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＣＧＴ９３上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＡ９３−７５ＢｓｐＨＩとＡ９３−７５−ＢｇｌＩＩを用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングし、ｐＳＰＢ１４６９とした。ＰＣＲ反応によるエラーがないことを塩基配列を決定することにより確認した。このｐＳＰＢ１４６９をＢｓｐＨＩ、ＢｇｌＩＩで制限酵素処理し得られた約１．８Ｋｂのフラグメントを ｐＱＥ−６１ ｖｅｃｔｏｒのＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ切断部位に連結し、プラスミドｐＳＰＢ１４７０を得た。このｐＳＰＢ１４７０をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
ＣＧＴ ９３由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これはＴＨＣの２’位配糖体の保持時間と一致し、ｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＣＧＴ９３に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ＣＧＴ９３由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例１４ ＣＧＴ９３を含む植物発現ベクターの構築
ＣＧＴ９３由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、ＣＧＴ９３を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１４９４）を構築した。ｐＳＰＢ１４９４の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＣＧＴ９３遺伝子をＸｈｏＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）にて平滑化し、次にＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）で消化してＣＧＴ９３ ｃＤＮＡ断片を得た。得られたＣＧＴ９３ ｃＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、マンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるｐＳＰＢ１８４をＫｐｎＩで消化後ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔにて平滑化して更にＢａｍＨＩにて消化したサイトへ挿入した。ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩサイトを３’端としてＭＡＣ１プロモーター、ＣＧＴ９３遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなる遺伝子の発現カセットｐＳＰＢ１４９３を構築した。
このように構築したｐＳＰＢ１４９３をＡｓｃＩ切断によってＣＧＴ９３発現カセット全体をｐＵＣＡＡベクターから切り出し、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１４９４とした。
実施例１５ サブトラクションライブラリーの作製
実施例１に述べた方法で黄色カーネーションのつぼみの花弁と葉からｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを得た。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い製造者の推奨する方法により花弁で発現する遺伝子を濃縮したｃＤＮＡライブラリーを作製した。ランダムシークエンスの結果、ＧＴと相同性のあるクローンを１６種類得た。サブトラクションで得られたこれらＧＴホモログクローンは完全長として得られなかったので、再度ＧＴホモログ断片をプローブとして花弁ｃＤＮＡライブラリーより２４，０００クローンについてスクリーニングを行った。スクリーニングは実施例２に記載の方法に従った。
実施例１６ カルコン糖転移酵素遺伝子Ｓ６Ｂ１１の取得
実施例１５のサブトラクションによって得られたクローンｐＳ６Ｂ１１としたプラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１８、１９に示した。ｐＳ６Ｂ１１に含まれるｃＤＮＡは、４８３アミノ酸からなる分子量５４．４ｋＤａのタンパク質をコードする１４４９ｂｐの遺伝子Ｓ６Ｂ１１を含んでいた。すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと６０％、バーベナ由来５ＧＴと２６％の同一性を示した。またＴ１７０、Ｔ１２８、ＣＧＴ９３とはそれぞれ２７％、５４％、２７％の同一性を示した。
実施例１７ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現ベクターの構築
Ｓ６Ｂ１１由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｓ６Ｂ１１を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１３３５）を構築した。ｐＳＰＢ１３３５の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＳ６Ｂ１１遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｓ６Ｂ１１ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｓ６Ｂ１１遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＳ６Ｂ１１遺伝子の発現カセットを、ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩ切断部位を３’端として作製した。このＳ６Ｂ１１発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
上記のように切り出したＳ６Ｂ１１発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１３３５とした。
実施例１８ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例７に記述したように、ｐＳＰＢ１３３５をアグロバクテリウムツュメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。
上記のようにして２７系統の独立した形質転換ペチュニアＰＬ株を得た。ペチュニア花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｓ６Ｂ１１のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＳ６Ｂ１１−ＲＴ−ＦとＳ６Ｂ１１−ＲＴ−Ｒを、ＣＨＩ ｍＲＮＡの増幅には実施例７と同じＣＨＩＦ１とＣＨＩＲ１を用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
その結果、２４系統のペチュニア花弁でＳ６Ｂ１１のｍＲＮＡが検出され、１１系統のペチュニアでＣＨＩｍＲＮＡの減少が観察された。Ｓ６Ｂ１１のｍＲＮＡが検出されたペチュニア花弁から実施例７と同様にフラボノイドを抽出し、ＯＤＳ−Ａ−３１２を用いたメタノール溶媒系の高速液体クロマトグラフィーにて分析を行った。Ｓ６Ｂ１１を発現しているペチュニアのうち４系統でカルコン２’位配糖体に対応するピークをもち、また同じ吸収スペクトルを有していた。さらにＳ６Ｂ１１を発現しているペチュニア花弁の抽出物とカルコン２’位配糖体をコクロマトグラフィーにより解析したところ、両者のピークは完全に一致した。以上は、Ｓ６Ｂ１１の発現によりカルコン２’位配糖体が合成された、すなわちＳ６Ｂ１１は植物の中で機能するカルコン２’位糖転移酵素をコードしていることを示すことができた。なお、形質転換ペチュニアにおいては、ＣＨＩのｍＲＮＡ量は減少していたものの低レベルの転写が認められた。
実施例１９ カルコン糖転移酵素Ｓ１２Ａ２の取得
実施例１５のサブトラクションによって得られたクローンｐＳ１２Ａ２−ａは５’領域が欠失していた。Ｓ１２Ａ２−ＲＴ，Ｓ１２Ａ２−Ｓ１，Ｓ１２Ａ２−Ａ１，Ｓ１２Ａ２−Ｓ２，Ｓ１２Ａ２−Ａ２の４種のプライマーと５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた５’−ＲＡＣＥにより約０．４ｋｂ程度の断片をＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇした（ｐＳ１２Ａ２−ｂ）。プライマーについては以下に示す。
ｐＳ１２Ａ２−ｂを鋳型に更にＳ１２Ａ２−ＮｃｏＩとＳ１２Ａ２−Ａ２でＰＣＲして増幅した断片を再びＴＡ クローニングした（ｐＳ１２Ａ２−ｃ）。ｐＳ１２Ａ２をＮｄｅＩ，ＫｐｎＩ消化した挿入断片側を、ｐＳ１２Ａ２−ｃの同サイトに導入したベクターを構築し、全長を含むクローンが得られた（ｐＳ１２Ａ２−ｄ）。プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号２０、２１に示した。ｐＳ１２Ａ２−ｄに含まれるｃＤＮＡは、４８６アミノ酸からなる分子量５５．０ｋＤａのタンパク質をコードする１４５８ｂｐの遺伝子Ｓ１２Ａ２を含んでいた。すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと５７％、バーベナ由来５ＧＴと２５％の同一性を示した。またＴ１７０、Ｔ１２８、ＣＧＴ９３、Ｓ６Ｂ１１とそれぞれ２７％、５２％、２７％、６７％の同一性を示した。
実施例２０ 大腸菌におけるＳ１２Ａ２遺伝子の発現と活性測定
Ｓ１２Ａ２遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法でＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。実施例１９におけるｐＳ１２Ａ２−ｄをＮｃｏＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＱＥ−６１の同サイトに連結しｐＳＰＢ１４３９を構築した。ｐＳＰＢ１４３９をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
Ｓ１２Ａ２由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＳ１２Ａ２に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、Ｓ１２Ａ２由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例２１ Ｓ１２Ａ２の植物での発現ベクターの構築
Ｓ１２Ａ２由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｓ１２Ａ２を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１４７８）を構築した。ｐＳＰＢ１４７８の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＳ１２Ａ２遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｓ１２Ａ２ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｓ１２Ａ２遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＳ１２Ａ２遺伝子の発現カセットを、ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩ切断部位を３’端として構築した。このＳＴ２Ａ２発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
上記のようにして切り出したＳ１２Ａ２発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットとともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１４７８とした。
実施例２２ Ｔ１７０の植物での発現２
ｐＳＦＬ１４を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。同様にｐＳＰＢ２２０１もＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。
実施例２３ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築３
ペチュニア以外の植物、トレニア・バーベナでＴ１７０を発現させてカルコン配糖体を蓄積ささせるため、トレニアについては、トレニア由来のフラバノン３水酸化酵素（Ｆ３Ｈ）を抑制させる共発現ベクターを構築した。バーベナについてはバーベナ（タピアン（登録商標））由来のＣＨＩを抑える共発現ベクターと、ＣＨＩとＦ３Ｈ（花手毬（登録商標））の両遺伝子発現を抑える共発現ベクターを構築した。
（２３−１）トレニアＦ３ＨｃＤＮＡ二本鎖コンストラクト（ｄｓＦ３Ｈ）構築
トレニアの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，６，ｐ２３９，２０００）をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしトレニアのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
トレニアＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２６６を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４１）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｈＦ３Ｈ−１断片を得た。また同様に、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４２）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｈＦ３Ｈ−２断片を得た。ＴｈＦ３Ｈ−１断片・ＴｈＦ３Ｈ−２断片をＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴＡクローニングした後、前者はＳａｃＩとＳａｌＩで切り出し、約０．７５ｋｂの断片ＴｈＦ３Ｈ−１’とした。一方、後者はＢａｍＨＩとＳａｌＩで切り出し、約０．９ｋｂの断片ＴｈＦ３Ｈ−２’とした。ｐＵＥ６をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるプロモーターを含むＤＮＡをｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入した。これをＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．８ｋｂのＤＮＡ断片とＴｈＦ３Ｈ−１’とＴｈＦ３Ｈ−２’断片をライゲーションによってｐＳＦＬ３０８を構築した。結果、このｐＳＦＬ３０８はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＦ３ＨとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。ｐＳＦＬ３０８（ｄｓＴｈＦ３Ｈ）をＡｓｃＩにより消化した結果得られた約２．７ｋｂの断片を平滑化した後、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＳｍａＩ部位に導入してｐＳＰＢ２２１８を作製した。Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＴ１７０遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１３４２からＡｓｃＩで切り出し、ｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｔ１７０とｄｓＦ３Ｈの２つの遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２３）。
（２３−２）バーベナ（花手毬（登録商標））ｄｓＦ３Ｈの構築
バーベナの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４ ｓ１２２（２００３））をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしバーベナのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
バーベナＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ９をＢｓｔＸＩで消化後平滑化し、その後、ＢａｍＨで部分消化し、約１．１ｋｂの遺伝子断片を回収してＨａＦ３Ｈ−１とした。また、ｐＳＰＢ９をＳａｃＩとＨａｅＩＩで消化し、約０．７ｋｂの遺伝子断片を回収してＨａＦ３Ｈ−２とした。ｐＳＰＢ５４０をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．８ｋｂのＤＮＡ断片とＨａＦ３Ｈ−１とＨａＦ３Ｈ−２断片をライゲーションによってｐＳＰＢ２５０１を構築した。このｐＳＰＢ２５０１はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＦ３ＨとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。
（２３−３）バーベナ（タピアン（登録商標））ｄｓＣＨＩの構築
バーベナの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４ ｓ１２２（２００３））をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしバーベナのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
バーベナＣＨＩのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２１０９を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｐＣＨＩ−１断片を得た。また同様にＴｐＣＨＩ−ＳａｌＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４３）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｐＣＨＩ−２断片を得た。ＴｐＣＨＩ−１断片・ＴｐＣＨＩ−２断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした後、前者はＢａｍＨＩとＸｂａＩで切り出し、約０．６８ｋｂの断片ＴｐＣＨＩ−１’とした。一方、後者はＸｂａＩとＳａｌＩで切り出し、約０．５ｋｂの断片ＴｐＣＨＩ−２’とした。ｐＳＰＢ１７６のＧＵＳ遺伝子領域をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切り出して除いたＤＮＡ断片と、ＴｐＣＨＩ−１’とＴｐＣＨＩ−２’断片をライゲーションによってｐＳＰＢ１４８６を構築した。その結果、ｐＳＰＢ１４８６はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＣＨＩとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。このｐＳＰＢ１４８６をＰａｃＩで消化後、ＰａｃＩ−ＦｓｅＩＦ（配列番号４６）とＰａｃＩ−ＦｓｅＩＲ（配列番号４７）の２種類のオリゴＤＮＡをアニールさせたＰａｃＩ−ＦｓｅＩアダプターを導入し、新たにＦｓｅＩ部位を導入したｐＳＰＢ２５０８を作製した。
（２３−４）バーベナ（花手毬（登録商標））ｄｓＦ３Ｈ＋バーベナ（タピアン（登録商標））ｄｓＣＨＩの構築
ｐＳＰＢ２５０１をＰａｃＩで消化して得られる、２．９ｋｂの遺伝子断片をｐＳＰＢ２５０８のＰａｃＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ２５０４を構築した。
（２３−５）バーベナでのＴ１７０遺伝子発現ベクターの構築（Ｔ１７０＋ｄｓＣＨＩ）
実施例６のｐＳＰＢ１５００をＡｓｃＩによって切り出し、生じる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットを、ｐＳＰＢ１４８６のＡｓｃＩ部位に導入することにより、Ｔ１７０とｄｓＣＨＩの２種類の遺伝子カセットを載せたバイナリーベクターｐＳＰＢ１２８７を構築した。
（２３−６）バーベナでのＴ１７０遺伝子発現ベクターの構築２（Ｔ１７０＋ｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にＥｃｏＦｓｅ１（配列番号５７）とＥｃｏＦｓｅＲ（配列番号５８）のオリゴＤＮＡをアニールさせたアダプターＥｃｏＦｓｅ１Ｒを導入後、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＨｉｎＦｓｅＲ（配列番号５９）とＨｉｎＦｓｅ３（配列番号６０）のオリゴＤＮＡをアニールさせたアダプターＨｉｎＦｓｅ３Ｒを導入して、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトの両端側に２ヶ所のＦｓｅＩ部位を導入したベクターを構築した（ｐＳＰＢ１８３８）。ｐＳＰＢ１８３８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、末端平滑化した部位に、実施例６のｐＳＰＢ１５００をＡｓｃＩによって切り出し、生じる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットを末端平滑化後、挿入することによりｐＳＰＢ２５０５を構築。この作業によりＴ１７０の遺伝子カセットがＦｓｅＩを用いて切り出すことが可能となる。
ｐＳＰＢ２５０５をＦｓｅＩ消化して得られる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットをｐＳＰＢ２５０４のＦｓｅＩ部位に導入してｐＳＰＢ２５０７を構築した。以上の結果、ｐＳＰＢ２５０７にはｄｓＣＨＩとＴ１７０、ｄｓＦ３Ｈの３遺伝子カセットが同方向に並んだ構造をとる。
実施例２４ バーベナでのＴ１７０の発現
ｐＳＰＢ１２８７をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に導入し、田村らの方法（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１，ｐ４５９−４６６）によりバーベナ（品種 花手毬スカーレット）に形質転換を行った。
上記のようにして７系統の独立した形質転換バーベナを得た。バーベナ花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１７０のｍＲＮＡの増幅には実施例７と同様のプライマーＴ１７０ＦとプライマーＴ１７０Ｒのプライマーを用い、バーベナＣＨＩのｍＲＮＡの発現量はＴｐＣＨＩ−ＳａｌＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４３）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）を用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の増幅で確認した。その結果、７系統のバーベナ花弁でＴ１７０のｍＲＮＡが検出され、３系統のバーベナ花弁でバーベナＣＨＩのｍＲＮＡ発現量の減少が観察された。また、Ｔ１７０の発現が確認できた７系統のうち１系統（ＳａＴ１７０＃７）の花弁花色がコントロールの赤色に比べ薄く、若干の黄色を帯びていることを確認できた。
実施例２５ Ｔ１２８の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例１１で作製したｐＳＰＢ２１０８を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。
上記のようにして３７系統の独立した形質転換ペチュニアＰＬ株を得た。ペチュニア花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１２８のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ１２８−Ｆ（配列番号３８）とＴ１２８−Ｒ（配列番号３９）を、ＣＨＩのｍＲＮＡの増幅には実施例８と同じＣＨＩＦとＣＨＩＲを用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
その結果、１９系統のペチュニア花弁でＴ１２８のｍＲＮＡが検出され、２６系統のペチュニアでＣＨＩのｍＲＮＡの減少が観察された。Ｔ１２８のｍＲＮＡが検出されたペチュニア花弁中から実施例７と同様の方法でフラボノイドを抽出し、実施例５と同様の方法でＨＰＬＣにより分析を行った。Ｔ１２８を発現しているペチュニアのうち２系統でカルコン２’位配糖体に対応するピークをもち、また、同じ吸収スペクトルを有していた。さらにＴ１２８を発現しているペチュニア花弁の抽出物とカルコン２’位配糖体をコクロマトグラフィーにより解析したところ、両者のピークは完全に一致した。以上は、Ｔ１２８の発現によりカルコン２’位配糖体が合成された、すなわちＴ１２８は植物の中で機能するカルコン２’位糖転移酵素をコードしていることを示すことができた。
実施例２６ Ｔ１２８の植物での発現ベクターの構築２
（２６−１）Ｔ１２８＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＴ１２８とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２１０８のＰａｃ部位に導入しＴ１２８・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつベクターｐＳＰＢ１４９９を構築した。
（２６−２）Ｔ１２８＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＴ１２８遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ２１０８からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｔ１２８とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２４）。
実施例２７ Ｔ１２８の植物での発現２
ｐＳＰＢ１４９９を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株に形質転換した。
実施例２８ ＣＧＴ９３の植物での発現ベクターの構築２
（２８−１）ＣＧＴ９３＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＣＧＴ９３とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１４９４のＰａｃ部位に導入しＣＧＴ９３・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０２を構築した。
（２８−２）ＣＧＴ９３＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＣＧＴ９３遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１４９４からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、ＣＧＴ９３とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２５）。
実施例２９ ＣＧＴ９３の植物での発現
ｐＳＰＢ１４９４を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。また、ｐＳＰＢ２２０２をペチュニアＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。
実施例３０ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現ベクターの構築２
（３０−１）Ｓ６Ｂ１１＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＳ６Ｂ１１とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１３３５のＰａｃ部位に導入しＳ６Ｂ１１・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０５を構築した。
（３０−２）Ｓ６Ｂ１１＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＳ６Ｂ１１遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１３３５からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｓ６Ｂ１１とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２６）。
実施例３１ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現２
ｐＳＰＢ２２０５を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株に形質転換した。
実施例３２ Ｓ１２Ａ２の植物での発現ベクターの構築２
（３２−１）Ｓ１２Ａ２＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＳ１２Ａ２とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１４７８のＰａｃ部位に導入しＳ１２Ａ２・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０６を構築した。
（３２−２）Ｓ１２Ａ２＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＳ１２Ａ２遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ２２０６からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｓ１２Ａ２とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２７）。
実施例３３ Ｓ１２Ａ２の植物での発現
実施例２１で作製したｐＳＰＢ１４７８を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。また、ｐＳＰＢ２２０６もＰＬ株に形質転換した。
実施例３４ シクラメン花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のシクラメンの新鮮な花弁５ｇから実施例１と同様の方法でｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは１．７５×１０６プラーク・フォーミング・ユニット（ｐｆｕ）からなっていた。
実施例３５ カルコン糖転移酵素遺伝子ＹＣｙ３−１２の取得
Ｔ１７０をプローブとして、シクラメン花弁ライブラリー２４，０００プラークよりスクリーニングを行った。スクリーニングによりプラスミドｐＹＣｙ３−１２を得た。ｐＹＣｙ３−１２に含まれるｃＤＮＡは、４８２アミノ酸からなる分子量５４．３ｋＤａのタンパク質をコードする１４４６ｂｐの遺伝子ＹＣｙ３−１２を含んでいた。ＹＣｙ３−１２がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと２８％、バーベナ由来５ＧＴと２４％の同一性を示した。またＴ１７０とは４６％、Ｔ１２８とは２８％、ＣＧＴ９３とは４６％、Ｓ６Ｂ１１とは２８％、Ｓ１２Ａ２とは２７％の同一性を示した。ＰＹＣｙ３−１２中に含まれる遺伝子を含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号５５、５６にそれぞれ示す。
実施例３６ 大腸菌におけるＹＣｙ３−１２遺伝子の発現と活性測定
ＹＣｙ３−１２遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＹＣｙ３−１２上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＹＣｙ３−１２Ｐ１（配列番号５３）とＹＣｙ３−１２Ｐ２（配列番号５４）を用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ ｖｅｃｔｏｒ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。このようにして得られたプラスミドｐＴＯＰＯ−ＹＣｙ３−１２とした。ＰＣＲ反応によるエラーがないことを塩基配列を決定することにより確認した。ｐＴＯＰＯ−ＹＣｙ３−１２をＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理し得られた約１．８Ｋｂのフラグメントを ｐＱＥ−６１ ｖｅｃｔｏｒのＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結し、プラスミドｐＱＥ−ＹＣｙ３−１２を得た。ｐＱＥ−ＹＣｙ３−１２をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
ＹＣｙ３−１２由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これはＴＨＣの２’位配糖体の保持時間と一致し、ｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＹＣｙ３−１２に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ＹＣｙ３−１２由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例１ カーネーション花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のカーネーションの新鮮な花弁５ｇから、Ｒ．ＭｃＧｏｏｋｉｎらのＭｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．２（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．１９８４）に詳細に示されているチオシアン酸グアニジン・塩化セシウムを用いる方法でＲＮＡを取得し、オリゴテックスｄＴ３０（日本ロシュ社）を用いてｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを精製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから、ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）およびλＺＡＰＩＩＵｎｉ−ＸＲ ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは、１．６ｘ１０５ プラーク・フォーミング・ユニット（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）からなっていた。
実施例２ 完全長カルコン２’位糖転移酵素遺伝子の取得
図２に示した、糖転移酵素（ＧＴ）のアミノ酸配列を比較し得られた保存領域（図２中、対合する矢印で示した領域）に相当する塩基配列からなるＤＮＡ断片を増幅し、これをプローブとして実施例１で述べたカーネーションｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。アミノ酸配列を比較したＧＴはアサガオ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−グルコシド糖転移酵素（３ＧＧＴ）（配列番号１３に記載のアミノ酸配列）、リンドウ由来ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン３−グルコシルトランスフェラーゼ（３ＧＴ）（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐｐ．７１１（１９９６））、バーベナ由来ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼ（５ＧＴ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，７４０５，（１９９９））、コガネバナ糖転移酵素（ＧＴ）（Ｐｌａｎｔａ ２１０，１００６−１０１３（２０００））記載のアミノ酸配列の４種である。それぞれＧＴについて、図２の逆方向の矢印で示した保存領域を増幅できるオリゴヌクレオチドを作製し、ＤＩＧ標識システム（ロシュ・ダイアグノスティックス社）にて製造者が推奨する条件に従いＰＣＲによりラベルした。この際、鋳型として１ｎｇのそれぞれのｃＤＮＡを含むプラスミド、プライマーとして各１００ｎｇの以下のオリゴヌクレオチドを使用し、９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分からなる反応を１サイクルとし、２５サイクルを行った。これらのＰＣＲ増幅産物を等量混合したものをハイブリダイゼーションのプローブとして、実施例１に記載のカーネーション由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。保存領域の増幅に使用したプライマーは以下のとおりである。
実施例３ カルコン２’位糖転移酵素Ｔ１７０のアミノ酸配列解析
ｐＴ１７０は、４９０アミノ酸からなる分子量５４．２ｋＤａのタンパク質をコードする１７０９ｂｐの遺伝子Ｔ１７０を含んでいた。Ｔ１７０がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴ（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９，５０９（１９９９））と２５％、シソ、バーベナ由来５ＧＴと２１％の相同性を示した。使用したソフトフェアはＭａｃＶｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．６．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ社）に含まれるＣｌｕｓｔａｌＷで、条件は、Ｍａｔｒｉｘ Ｂｌｏｓｕｍ：３０、ｋｅｔｕｐｌｅ：１、Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：３、Ｔｏｐｄｉａｇｏｎａｌｓ：５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ：５で行った。ＢＬＡＳＴ検索（検索はデフォルトの条件で実施した。すなわち、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓは、ｏｎ、Ｃｈｏｏｓｅ ｆｉｌｔｅｒはＬｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、ＭａｔｒｉｘはＢｌｏｓｕｍ６２、Ｇａｐ ｃｏｓｔｓはＥｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１ Ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ：１）では多くのＧＴに対してホモロジーを示した。たとえば、リビングストーンデージー由来ベタニジン６ＧＴ（Ｐｌａｎｔａ Ｖｏｌ．２１４，ｐｐ．４９２（２００２））に対して５５％、サリチル酸などで誘導されるタバコＧＴ（アクセション番号ＡＢ０５２５５７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６８，ｐｐ．４０８６（２００１））に対して４５％、タバコＮＴＧＴ３（アクセション番号ＡＢ０７２９１８）に対して４４％のアミノ酸配列の相同性を示した。
同じ機能、活性を有する酵素はアミノ酸配列が類似しており、ファミリーを形成することが知られているが、ＧＴにおいても、図２に示したアサガオ由来の３ＧＧＴ、リンドウ由来の３ＧＴ及びバーベナ由来の５ＧＴ及びコガネバナＧＴはファミリーを形成する。本発明のカルコン２’位糖転移酵素のアミノ酸配列はこれら４種のＧＴのアミノ酸配列とは低いホモロジーしか示さず、このファミリーには属さない。また、上記のリビングストーンデージー由来ベタニジン６ＧＴ、サリチル酸などで誘導されるタバコＧＴ及びタバコＮＴＧＴ３には比較的高いホモロジーを示したが、これらのＧＴにカルコン糖転移活性は確認されていない。
実施例４ 大腸菌におけるＴ１７０遺伝子の発現
Ｔ１７０遺伝子の大腸菌での発現は、Ｔｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。まずＴ１７０上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示す２種のプライマーＴ１７０−ＮｃｏＩおよびＭ１３ Ｍ４ を用いてＰＣＲ反応を行った。
実施例５ Ｔ１７０ ｃＤＮＡ組換えタンパク質の糖転移酵素活性の測定
実施例４にて得られた大腸菌形質転換株を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地３ｍｌで３７℃で一晩振とう培養した。そのうち２００μｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地１０ｍｌに加えＡ６００＝０．６〜１．０に達するまで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を終濃度０．０２ｍＭになるよう加え、さらに２７℃で一晩振とう培養し、冷却遠心（３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、３０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を破砕した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）を行い、得られた上清を粗酵素液とし、以下の活性測定に用いた。
ＴＨＣ（５００μｇ／ｍｌエタノール溶液）を蒸溜水で平衡化したゲル濾過樹脂、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−４０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社）１ｍｌに蒸溜水３ｍｌで希釈しながら負荷した後、水洗した。この樹脂１００μｌに粗酵素液２００μｌおよび５ｍＭ ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ １０μｌを加え、３０℃で２時間反応させた。遠心上清を除去後、水洗し、０．１％ ＴＦＡ（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を含む５０％アセトニトリル３００μｌを加え反応停止させ、超音波処理によりフラボノイドを樹脂より遊離した。１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃で遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ０．４５μｍ、４ｍｍ Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ、ミリポア）を用いて不溶物を除去して、液体高速クロマトグラフィーで分析した。カルコンおよびその配糖体の分析条件は以下の通りである。
カラムはＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ３１２（６ｍｍφ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）を用いて、移動相にはＡ液として２％酢酸を含むＨ２Ｏ、Ｂ液としてメタノールを用い、Ｂ液１５％からＢ液４０％の直線濃度勾配１５分間の溶出後、Ｂ液４０％で５分間維持し、さらにＢ液４０％からＢ液６２％の直線濃度勾配１０分間の溶出の後、Ｂ液６２％で２分間維持した。流速は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。検出は３６０ｎｍにおける吸光度、及びＰＤＡ検出器ＳＰＤ−Ｍ６Ａ（島津製作所社）による２５０〜４００ｎｍの吸収スペクトルにより行った。この条件で、ＴＨＣは保持時間２７．３分に溶出され、その２’位配糖体は１９．８９分に溶出されることをＴＨＣ及びＴＨＣ２’位配糖体の標準品を用いて確認した。
Ｔ１７０由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたとところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことから、Ｔ１７０に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。
以上の結果から、Ｔ１７０由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例６ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築
Ｔ１７０由来のカルコン２’位糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、ＴＨＣの２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡ Ｔ１７０を発現させ、本酵素とＴＨＣを基質とするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ遺伝子の１つであるＣＨＩ−Ａ遺伝子（ＥＭＢＯ Ｊ ７、１２５７（１９８８））の発現を抑制するバイナリーベクター（ｐＳＰＢ１３４２）を構築した。ｐＳＰＢ１３４２の作製は以下のように行った。
ペチュニア（品種バカラレッド、サカタのタネ社）の葉よりＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、これよりＳｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡよりプライマー、ＢａｍＨＩ−ＣＨＩ−Ｆ（配列番号４９）およびＳａｌ−ＣＨＩ−Ｒ（配列番号５０）、Ｓａｌ−ＣＨＩ−Ｆ（配列番号５１）およびＥｃｏＲＩ−ＣＨＩ−Ｒ（配列番号５２）を用いてＰＣＲによりそれぞれ０．６ｋｂおよび０．８ｋｂのペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を得た。得られた断片をそれぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化したペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を作製した。一方ｐＥ２１１３（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９ １９９６）はエンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅ１２３５Ｓ）プロモーターとノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターを有する。ｐＥ２１１３をＳｎａＢＩで消化し、ＢａｍＨＩリンカー（タカラ）を挿入することにより、ｐＵＥ６を得た。ｐＵＥ６をＳａｃＩで消化し、平滑末端化し、ＳａｌＩリンカー（たとえばタカラ社）を挿入した。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片のうちＥ１２３５Ｓプロモーターを有する断片を植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３（１９９５））のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入した。このプラスミドｐＳＰＢ１７６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したＤＮＡ断片と前述の２種のペチュニアＣＨＩ遺伝子断片を連結することによりｐＳＰＢ１６０１を得た。このｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）（ストラタジーン社）のマルチクローニングサイトＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入されているＴ１７０遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、約１．５ｋｂのＴ１７０ｃＤＮＡ断片を得た。ｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）のＰａｃＩ部位をＡｓｃＩリンカーで置換したプラスミドをｐＵＣＡＡ上で、当該ｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を５’末端、ＥｃｏＲＩ切断部位を３’末端として、ＭＡＣ１プロモーター（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３（１９９０））、Ｔ１７０遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子（ｍａｓ）ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを構築した（ｐＳＰＢ１５００）。
次に、ｐＳＢＰ１３４２を持つアグロバクテリウムを作製し、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法でペチュニア（品種ＰＬ）リーフディスクに形質転換を行った。形質転換の方法は公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９４ ５ ｐ８１）によった。
実施例７ Ｔ１７０の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例６で作製したｐＳＰＢ１３４２をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株（Ｌａｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，９６３−９６７，１９９１）に導入し、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法でペチュニア（品種 ＰＬ）リーフディスクに形質転換を行った。アグロバクテリウムへのプラスミドの導入、形質転換の方法は公知の方法（Ｐｌａｎｔ Ｊ．１９９４ ５ ｐ８１）によった。品種ＰＬはフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子（Ｈｏｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，ｐ２７６−２７９）、フラボノイド３’−水酸化酵素遺伝子（Ｂｒｕｇｌｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｊ １９，ｐ４４１−４５１）を欠損しているため花色は白ないし薄いピンクである。なお、本実験の目的には使用するペチュニア品種はＰＬに限定されるものではない。
上記のようにして６１系統の独立した形質転換ペチュニアを得た。ペチュニア花弁からＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。このｔｏｔａｌ ＲＮＡ １μｇからＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて逆転写反応を行い、さらにＥｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いて製造者の推奨する方法によりＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１７０のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ１７０ＦとＴ１７０Ｒを、ペチュニアＣＨＩ ｍＲＮＡの増幅にはプライマーＣＨＩＦ１とＣＨＩＲ１を用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
Ｔ１７０のｍＲＮＡが検出されたペチュニア花弁０．５ｇを２．５ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリルに浸潤し、フラボノイドを抽出後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析した。ＨＰＬＣの条件は、ＯＤＳ−Ａ−３１２（１５０×６．０ｍｍ）を用いた実施例５と同じ条件を用いた。本条件ではカルコン２’位配糖体、カルコン４’位配糖体はそれぞれリテンションタイム１９．８９分、２１．６９分に溶出される。Ｔ１７０を発現しているペチュニアのうち３系統でカルコン２’位配糖体に対応するピークをもち、また同じ吸収スペクトルを有していた。さらにＴ１７０を発現しているペチュニア花弁の抽出物とカルコン２’位配糖体をコクロマトグラフィーにより解析したところ、両者のピークは完全に一致した。以上の結果より、Ｔ１７０の発現によりカルコン２’位配糖体が合成された、すなわちＴ１７０は植物の中で機能するカルコン２’位糖転移酵素をコードしていることを示すことができた。なお、形質転換ペチュニアにおいては、ペチュニアＣＨＩのｍＲＮＡ量は減少していたものの低レベルの転写が認められた。
実施例８ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築２
Ｔ１７０の発現とペチュニアＣＨＩ遺伝子の抑制だけでは十分量のカルコン２’位配糖体の蓄積が十分ではなかったため、ペチュニアのフラバノン３水酸化酵素遺伝子（Ｆ３Ｈ）（Ｂｒｉｔｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１７，ｐ７４５−７５４）あるいはジヒドロフラボノール４還元酵素遺伝子（ＤＦＲ）（Ｂｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３，ｐ４９１−５０２，Ｈｕｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｊ．６，ｐ２９５−３１０）の抑制を行うことにした。
（８−１）ペチュニアＦ３ＨｃＤＮＡ 二本鎖コンストラクト構築
ペチュニアＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２６５を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＰｈＦ３Ｈ−１−ＣｌａＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４０）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＰｈＦ３Ｈ−１断片を得た。このＰｈＦ３Ｈ断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした後、ＳａｃＩとＣｌａＩで切り出し、約０．７ｋｂの断片ＰｈＦ３Ｈ−１’とした。一方、ｐＳＰＢ２６５をＢａｍＨＩとＣｌａＩで消化して約０．９ｋｂの断片を切り出しＰｈＦ３Ｈ−２’とした。ｐＵＥ６をｐＵＣＡＰ（ｖａｎ Ｅｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４，２８８−２９０，１９９５）のＡｓｃＩ部位を平滑末端化し、ＰａｃＩリンカーを挿入したプラスミドをｐＵＣＰＰとした。ｐＵＥ６をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られる断片のうちＥ１２３５Ｓプロモーターを含むＤＮＡ断片を、ｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。このプラスミドをｐＳＰＢ５４０とした。ｐＳＰＢ５４０をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．７ｋｂのＤＮＡ断片と、ＰｈＦ３Ｈ−１’とＰｈＦ３Ｈ−２’断片をライゲーションによってｐＳＰＢ１４９８を構築した。結果、このｐＳＰＢ１４９８はＥＬ２３５ＳプロモーターとＮＯＳターミネーター制御下にｄｓＦ３Ｈを転写できる構造をとる。
次に、ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＴ１７０とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１３４２のＰａｃＩ部位に導入しＴ１７０・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子が同方向に並んだバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０１を構築した。
ペチュニアＤＦＲ遺伝子を含むｐＣＧＰ１４０３（ＷＯ９６１３６７１６）をＢａｍＨＩおよびＳｃａＩ、ＰｖｕＩＩおよびＳａｃＩにより消化し、それぞれ０．８５ｋｂおよび０．４５ｋｂの断片を得た。２本鎖ＲＮＡ構造を形成するこれら両断片とＥＬ２ ３５Ｓプロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，ｐ４９）ならびにｍａｓターミネーターから構成されるカセットを、植物形質転換用バイナリーベクターｐＢＩＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３）のＭＣＳ内ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入し、これをｐＳＰＢ５３２とした。これをＰａｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に実施例６に記述した、ＥＬ２ ３５Ｓプロモーターと２本鎖ＲＮＡ構造をもつペチュニアＣＨＩ遺伝子ならびにＮＯＳターミネーターから構成されるカセットを含むｐＳＰＢ１６０１をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、約２．５ｋｂの断片を得た。これをベクターｐＵＣＰＰのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間に挿入し、ｐＳＦＬ５とした。これをＰａｃＩで切断し、ｐＵＣＰＰベクターから切り出し得られた約２．５ｋｂの断片を前述のｐＳＰＢ５３２のＰａｃＩ切断部位にペチュニアのＤＦＲ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ１３とした。次にこれをＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。実施例６に記述したプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター（Ｃｏｍａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５，ｐ３７３）、Ｔ１７０遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを、ＡｓｃＩで切断し、ｐＵＣＡＡベクターから切り出し、約３．５ｋｂの断片を得た。これを前述のｐＳＦＬ１３のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＤＦＲおよびＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＦＬ１４とした。
実施例９ カルコン糖転移酵素遺伝子Ｔ１２８の取得
カーネーションにはＴ１７０以外にもカルコン糖転移酵素遺伝子が存在する可能性があるため探索を継続した。実施例２で得た糖転移酵素のうちｐＴ１２８としたプラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１４、１５に示した。ｐＴ１２８に含まれるｃＤＮＡは、４８９アミノ酸からなる分子量５５．２ｋＤａのタンパク質をコードする１４６７ｂｐの遺伝子Ｔ１２８を含んでいた。Ｔ１２８がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと５４％、バーベナ由来５ＧＴと２４％の同一性を示した。またＴ１７０とは２７％の同一性を示した。
実施例１０ 大腸菌におけるＴ１２８遺伝子の発現と活性測定
Ｔ１２８遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＴ１２８上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＴ１２８−ＮｃｏＩと実施例４で示したＭ１３ Ｍ４を用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。Ｔ１２８由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分と２１．６９分に溶出される新たな物質が検出された。前者はＴＨＣの２’位配糖体で、後者はＴＨＣの４’位配糖体であることを、それぞれの標準品の保持時間と比較することで同定した。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＴ１２８に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、Ｔ１２８由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位と４’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例１１ Ｔ１２８の植物での発現ベクターの構築
Ｔ１２８由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｔ１２８を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ２１０８）を構築した。ｐＳＰＢ２１０８の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＴ１２８遺伝子を、ＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｔ１２８ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｔ１２８遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＴ１７０遺伝子の発現カセットを、ｐＵＣＡＡベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩサイトを３’端として構築した。このＴ１２８発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
ｐＵＣＡＡベクターからＡｓｃＩで切り出した発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位に、ペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ２１０８とした。
実施例１２ カルコン糖転移酵素遺伝子ＣＧＴ９３の取得
Ｔ１７０をプローブとして、カーネーション花弁ライブラリー２４０００プラークよりスクリーニングを行った。スクリーニングによりプラスミドｐＣＧＴ９３を得た。ｐＣＧＴ９３に含まれるｃＤＮＡは、４８１アミノ酸からなる分子量５２．８ｋＤａのタンパク質をコードする１４４３ｂｐの遺伝子ＣＧＴ９３を含んでいた。ＣＧＴ９３がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと２６％、バーベナ由来５ＧＴと２３％の同一性を示した。またＴ１７０とは６３％、Ｔ１２８とは２５％の同一性を示した。ｐＣＧＴ９３中に含まれる遺伝子を含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１６、１７にそれぞれ示す。
実施例１３ 大腸菌におけるＣＧＴ９３遺伝子の発現と活性測定
ＣＧＴ９３遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＣＧＴ９３上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＡ９３−７５ＢｓｐＨＩとＡ９３−７５−ＢｇｌＩＩを用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
ＣＧＴ ９３由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これはＴＨＣの２’位配糖体の保持時間と一致し、ｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＣＧＴ９３に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ＣＧＴ９３由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例１４ ＣＧＴ９３を含む植物発現ベクターの構築
ＣＧＴ９３由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、ＣＧＴ９３を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１４９４）を構築した。ｐＳＰＢ１４９４の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＣＧＴ９３遺伝子をＸｈｏＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化後、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）にて平滑化し、次にＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）で消化してＣＧＴ９３ ｃＤＮＡ断片を得た。得られたＣＧＴ９３ ｃＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、マンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるｐＳＰＢ１８４をＫｐｎＩで消化後ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔにて平滑化して更にＢａｍＨＩにて消化したサイトへ挿入した。ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩサイトを３’端としてＭＡＣ１プロモーター、ＣＧＴ９３遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなる遺伝子の発現カセットｐＳＰＢ１４９３を構築した。
このように構築したｐＳＰＢ１４９３をＡｓｃＩ切断によってＣＧＴ９３発現カセット全体をｐＵＣＡＡベクターから切り出し、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１４９４とした。
実施例１５ サブトラクションライブラリーの作製
実施例１に述べた方法で黄色カーネーションのつぼみの花弁と葉からｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを得た。ＣＬＯＮＴＥＣＨ ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｂｓｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用い製造者の推奨する方法により花弁で発現する遺伝子を濃縮したｃＤＮＡライブラリーを作製した。ランダムシークエンスの結果、ＧＴと相同性のあるクローンを１６種類得た。サブトラクションで得られたこれらＧＴホモログクローンは完全長として得られなかったので、再度ＧＴホモログ断片をプローブとして花弁ｃＤＮＡライブラリーより２４，０００クローンについてスクリーニングを行った。スクリーニングは実施例２に記載の方法に従った。
実施例１６ カルコン糖転移酵素遺伝子Ｓ６Ｂ１１の取得
実施例１５のサブトラクションによって得られたクローンｐＳ６Ｂ１１としたプラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列とアミノ酸配列を配列表の配列番号１８、１９に示した。ｐＳ６Ｂ１１に含まれるｃＤＮＡは、４８３アミノ酸からなる分子量５４．４ｋＤａのタンパク質をコードする１４４９ｂｐの遺伝子Ｓ６Ｂ１１を含んでいた。すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと６０％、バーベナ由来５ＧＴと２６％の同一性を示した。またＴ１７０、Ｔ１２８、ＣＧＴ９３とはそれぞれ２７％、５４％、２７％の同一性を示した。
実施例１７ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現ベクターの構築
Ｓ６Ｂ１１由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｓ６Ｂ１１を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１３３５）を構築した。ｐＳＰＢ１３３５の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＳ６Ｂ１１遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｓ６Ｂ１１ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｓ６Ｂ１１遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＳ６Ｂ１１遺伝子の発現カセットを、ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩ切断部位を３’端として作製した。このＳ６Ｂ１１発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
上記のように切り出したＳ６Ｂ１１発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１３３５とした。
実施例１８ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例７に記述したように、ｐＳＰＢ１３３５をアグロバクテリウムツュメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。
上記のようにして２７系統の独立した形質転換ペチュニアＰＬ株を得た。ペチュニア花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｓ６Ｂ１１のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＳ６Ｂ１１−ＲＴ−ＦとＳ６Ｂ１１−ＲＴ−Ｒを、ＣＨＩ ｍＲＮＡの増幅には実施例７と同じＣＨＩＦ１とＣＨＩＲ１を用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
実施例１９ カルコン糖転移酵素Ｓ１２Ａ２の取得
実施例１５のサブトラクションによって得られたクローンｐＳ１２Ａ２−ａは５’領域が欠失していた。Ｓ１２Ａ２−ＲＴ，Ｓ１２Ａ２−Ｓ１，Ｓ１２Ａ２−Ａ１，Ｓ１２Ａ２−Ｓ２，Ｓ１２Ａ２−Ａ２の４種のプライマーと５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いた５’−ＲＡＣＥにより約０．４ｋｂ程度の断片をＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇした（ｐＳ１２Ａ２−ｂ）。プライマーについては以下に示す。
実施例２０ 大腸菌におけるＳ１２Ａ２遺伝子の発現と活性測定
Ｓ１２Ａ２遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法でＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。実施例１９におけるｐＳ１２Ａ２−ｄをＮｃｏＩとＫｐｎＩで消化し、ｐＱＥ−６１の同サイトに連結しｐＳＰＢ１４３９を構築した。ｐＳＰＢ１４３９をＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
Ｓ１２Ａ２由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これらはｐＱＥ−６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＳ１２Ａ２に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、Ｓ１２Ａ２由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
実施例２１ Ｓ１２Ａ２の植物での発現ベクターの構築
Ｓ１２Ａ２由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明らかにするために、Ｓ１２Ａ２を発現させ、本酵素と基質を同じにするペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＣＨＩ−Ａ遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーベクター（ｐＳＰＢ１４７８）を構築した。ｐＳＰＢ１４７８の作製は実施例６と同様に以下のように行った。
まず、ｐＳＰＢ１６０１をＡｓｃＩで消化後、脱リン酸化した。
次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のマルチクローニングサイトに挿入されているＳ１２Ａ２遺伝子をＢａｍＨＩ（ｃＤＮＡの５’端側）とＫｐｎＩ（ｃＤＮＡの３’端側）で消化し、Ｓ１２Ａ２ｃＤＮＡ断片を得た。次にプラスミドベクターｐＵＣＡＡ上で、ＭＡＣ１プロモーター、Ｓ１２Ａ２遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子ターミネーターからなるＳ１２Ａ２遺伝子の発現カセットを、ベクターのＢａｍＨＩ切断部位を５’端、ＫｐｎＩ切断部位を３’端として構築した。このＳＴ２Ａ２発現カセット全体をＡｓｃＩ切断によってｐＵＣＡＡベクターから切り出した。
上記のようにして切り出したＳ１２Ａ２発現カセットを、前述のｐＳＰＢ１６０１のＡｓｃＩ切断部位にペチュニアのＣＨＩ発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現カセットとともにベクターのＬＢ側が上流になるように挿入し、得られたプラスミドをｐＳＰＢ１４７８とした。
実施例２２ Ｔ１７０の植物での発現２
ｐＳＦＬ１４を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。同様にｐＳＰＢ２２０１もＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。
実施例２３ Ｔ１７０の植物での発現ベクターの構築３
ペチュニア以外の植物、トレニア・バーベナでＴ１７０を発現させてカルコン配糖体を蓄積ささせるため、トレニアについては、トレニア由来のフラバノン３水酸化酵素（Ｆ３Ｈ）を抑制させる共発現ベクターを構築した。バーベナについてはバーベナ（タピアン（登録商標））由来のＣＨＩを抑える共発現ベクターと、ＣＨＩとＦ３Ｈ（花手毬（登録商標））の両遺伝子発現を抑える共発現ベクターを構築した。
（２３−１）トレニアＦ３ＨｃＤＮＡ二本鎖コンストラクト（ｄｓＦ３Ｈ）構築
トレニアの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，６，ｐ２３９，２０００）をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしトレニアのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
トレニアＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２６６を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４１）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｈＦ３Ｈ−１断片を得た。また同様に、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒとＴｈＦ３Ｈ−ＳａｌＩ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４２）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｈＦ３Ｈ−２断片を得た。ＴｈＦ３Ｈ−１断片・ＴｈＦ３Ｈ−２断片をＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＴＡクローニングした後、前者はＳａｃＩとＳａｌＩで切り出し、約０．７５ｋｂの断片ＴｈＦ３Ｈ−１’とした。一方、後者はＢａｍＨＩとＳａｌＩで切り出し、約０．９ｋｂの断片ＴｈＦ３Ｈ−２’とした。ｐＵＥ６をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化して得られるプロモーターを含むＤＮＡをｐＵＣＡＡのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に挿入した。これをＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．８ｋｂのＤＮＡ断片とＴｈＦ３Ｈ−１’とＴｈＦ３Ｈ−２’断片をライゲーションによってｐＳＦＬ３０８を構築した。結果、このｐＳＦＬ３０８はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＦ３ＨとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。ｐＳＦＬ３０８（ｄｓＴｈＦ３Ｈ）をＡｓｃＩにより消化した結果得られた約２．７ｋｂの断片を平滑化した後、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＳｍａＩ部位に導入してｐＳＰＢ２２１８を作製した。Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＴ１７０遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１３４２からＡｓｃＩで切り出し、ｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｔ１７０とｄｓＦ３Ｈの２つの遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２３）。
バーベナの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４ ｓ１２２（２００３））をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしバーベナのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
バーベナＦ３ＨのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ９をＢｓｔＸＩで消化後平滑化し、その後、ＢａｍＨで部分消化し、約１．１ｋｂの遺伝子断片を回収してＨａＦ３Ｈ−１とした。また、ｐＳＰＢ９をＳａｃＩとＨａｅＩＩで消化し、約０．７ｋｂの遺伝子断片を回収してＨａＦ３Ｈ−２とした。ｐＳＰＢ５４０をＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化して得られる約３．８ｋｂのＤＮＡ断片とＨａＦ３Ｈ−１とＨａＦ３Ｈ−２断片をライゲーションによってｐＳＰＢ２５０１を構築した。このｐＳＰＢ２５０１はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＦ３ＨとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。
（２３−３）バーベナ（タピアン（登録商標））ｄｓＣＨＩの構築
バーベナの花弁ｃＤＮＡライブラリー（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４４ ｓ１２２（２００３））をペチュニアのＦ３Ｈ遺伝子をプローブにして実施例２に記載の方法でスクリーニングしバーベナのＦ３Ｈ遺伝子を取得した。
バーベナＣＨＩのｃＤＮＡ遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）にクローニングしたｐＳＰＢ２１０９を鋳型に用い、Ｍ１３ＲＶ Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４８）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ２ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４５）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｐＣＨＩ−１断片を得た。また同様にＴｐＣＨＩ−ＳａｌＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４３）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）の組み合わせでＰＣＲを行い、ＴｐＣＨＩ−２断片を得た。ＴｐＣＨＩ−１断片・ＴｐＣＨＩ−２断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてクローニングした後、前者はＢａｍＨＩとＸｂａＩで切り出し、約０．６８ｋｂの断片ＴｐＣＨＩ−１’とした。一方、後者はＸｂａＩとＳａｌＩで切り出し、約０．５ｋｂの断片ＴｐＣＨＩ−２’とした。ｐＳＰＢ１７６のＧＵＳ遺伝子領域をＢａｍＨＩとＳａｌＩで切り出して除いたＤＮＡ断片と、ＴｐＣＨＩ−１’とＴｐＣＨＩ−２’断片をライゲーションによってｐＳＰＢ１４８６を構築した。その結果、ｐＳＰＢ１４８６はＥＬ２３５Ｓプロモーター下にｄｓＣＨＩとＮＯＳターミネーターをもつ構造をとる。このｐＳＰＢ１４８６をＰａｃＩで消化後、ＰａｃＩ−ＦｓｅＩＦ（配列番号４６）とＰａｃＩ−ＦｓｅＩＲ（配列番号４７）の２種類のオリゴＤＮＡをアニールさせたＰａｃＩ−ＦｓｅＩアダプターを導入し、新たにＦｓｅＩ部位を導入したｐＳＰＢ２５０８を作製した。
ｐＳＰＢ２５０１をＰａｃＩで消化して得られる、２．９ｋｂの遺伝子断片をｐＳＰＢ２５０８のＰａｃＩ部位に導入し、ｐＳＰＢ２５０４を構築した。
（２３−５）バーベナでのＴ１７０遺伝子発現ベクターの構築（Ｔ１７０＋ｄｓＣＨＩ）
実施例６のｐＳＰＢ１５００をＡｓｃＩによって切り出し、生じる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットを、ｐＳＰＢ１４８６のＡｓｃＩ部位に導入することにより、Ｔ１７０とｄｓＣＨＩの２種類の遺伝子カセットを載せたバイナリーベクターｐＳＰＢ１２８７を構築した。
（２３−６）バーベナでのＴ１７０遺伝子発現ベクターの構築２（Ｔ１７０＋ｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にＥｃｏＦｓｅ１（配列番号５７）とＥｃｏＦｓｅＲ（配列番号５８）のオリゴＤＮＡをアニールさせたアダプターＥｃｏＦｓｅ１Ｒを導入後、ＨｉｎｄＩＩＩ部位にＨｉｎＦｓｅＲ（配列番号５９）とＨｉｎＦｓｅ３（配列番号６０）のオリゴＤＮＡをアニールさせたアダプターＨｉｎＦｓｅ３Ｒを導入して、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトの両端側に２ヶ所のＦｓｅＩ部位を導入したベクターを構築した（ｐＳＰＢ１８３８）。ｐＳＰＢ１８３８をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで消化した後、末端平滑化した部位に、実施例６のｐＳＰＢ１５００をＡｓｃＩによって切り出し、生じる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットを末端平滑化後、挿入することによりｐＳＰＢ２５０５を構築。この作業によりＴ１７０の遺伝子カセットがＦｓｅＩを用いて切り出すことが可能となる。
ｐＳＰＢ２５０５をＦｓｅＩ消化して得られる３．７ｋｂのＴ１７０遺伝子カセットをｐＳＰＢ２５０４のＦｓｅＩ部位に導入してｐＳＰＢ２５０７を構築した。以上の結果、ｐＳＰＢ２５０７にはｄｓＣＨＩとＴ１７０、ｄｓＦ３Ｈの３遺伝子カセットが同方向に並んだ構造をとる。
実施例２４ バーベナでのＴ１７０の発現
ｐＳＰＢ１２８７をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に導入し、田村らの方法（Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２１，ｐ４５９−４６６）によりバーベナ（品種 花手毬スカーレット）に形質転換を行った。
上記のようにして７系統の独立した形質転換バーベナを得た。バーベナ花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１７０のｍＲＮＡの増幅には実施例７と同様のプライマーＴ１７０ＦとプライマーＴ１７０Ｒのプライマーを用い、バーベナＣＨＩのｍＲＮＡの発現量はＴｐＣＨＩ−ＳａｌＩ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４３）とＴｐＣＨＩ−ＸｂａＩ１ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号４４）を用いて約０．５ｋｂの遺伝子断片の増幅で確認した。その結果、７系統のバーベナ花弁でＴ１７０のｍＲＮＡが検出され、３系統のバーベナ花弁でバーベナＣＨＩのｍＲＮＡ発現量の減少が観察された。また、Ｔ１７０の発現が確認できた７系統のうち１系統（ＳａＴ１７０＃７）の花弁花色がコントロールの赤色に比べ薄く、若干の黄色を帯びていることを確認できた。
実施例２５ Ｔ１２８の植物での発現とフラボノイド組成の変化
実施例１１で作製したｐＳＰＢ２１０８を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。
上記のようにして３７系統の独立した形質転換ペチュニアＰＬ株を得た。ペチュニア花弁のＲＮＡを用いて実施例７と同様のＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。Ｔ１２８のｍＲＮＡの増幅にはプライマーＴ１２８−Ｆ（配列番号３８）とＴ１２８−Ｒ（配列番号３９）を、ＣＨＩのｍＲＮＡの増幅には実施例８と同じＣＨＩＦとＣＨＩＲを用いた。各プライマーの配列は以下のとおりである。
実施例２６ Ｔ１２８の植物での発現ベクターの構築２
（２６−１）Ｔ１２８＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＴ１２８とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２１０８のＰａｃ部位に導入しＴ１２８・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつベクターｐＳＰＢ１４９９を構築した。
（２６−２）Ｔ１２８＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＴ１２８遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ２１０８からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｔ１２８とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２４）。
実施例２７ Ｔ１２８の植物での発現２
ｐＳＰＢ１４９９を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株に形質転換した。
実施例２８ ＣＧＴ９３の植物での発現ベクターの構築２
（２８−１）ＣＧＴ９３＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＣＧＴ９３とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１４９４のＰａｃ部位に導入しＣＧＴ９３・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０２を構築した。
（２８−２）ＣＧＴ９３＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＣＧＴ９３遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１４９４からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、ＣＧＴ９３とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２５）。
実施例２９ ＣＧＴ９３の植物での発現
ｐＳＰＢ１４９４を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。また、ｐＳＰＢ２２０２をペチュニアＰＬ株とバカラレッド株に形質転換した。
実施例３０ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現ベクターの構築２
（３０−１）Ｓ６Ｂ１１＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＳ６Ｂ１１とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１３３５のＰａｃ部位に導入しＳ６Ｂ１１・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０５を構築した。
（３０−２）Ｓ６Ｂ１１＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＳ６Ｂ１１遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ１３３５からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｓ６Ｂ１１とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２６）。
実施例３１ Ｓ６Ｂ１１の植物での発現２
ｐＳＰＢ２２０５を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株に形質転換した。
実施例３２ Ｓ１２Ａ２の植物での発現ベクターの構築２
（３２−１）Ｓ１２Ａ２＋ペチュニアｄｓＣＨＩ＋ｄｓＦ３Ｈ
ｐＳＰＢ１４９８（ｄｓＰｈＦ３Ｈ）をＰａｃＩにより消化した結果得られた約２．６ｋｂの遺伝子カセットをＳ１２Ａ２とｄｓＣＨＩをもつバイナリーベクターｐＳＰＢ１４７８のＰａｃ部位に導入しＳ１２Ａ２・ｄｓＣＨＩ・ｄｓＦ３Ｈの３種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクターｐＳＰＢ２２０６を構築した。
（３２−２）Ｓ１２Ａ２＋トレニアｄｓＦ３Ｈ
Ｍａｃプロモーターとｍａｓターミネーターに挟まれたＳ１２Ａ２遺伝子カセット約３．７ｋｂをｐＳＰＢ２２０６からＡｓｃＩで切り出し、実施例２３で作製したｐＳＰＢ２２１８のＡｓｃＩ部位に導入し、Ｓ１２Ａ２とｄｓＦ３Ｈの２遺伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した（ｐＳＰＢ２２２７）。
実施例３３ Ｓ１２Ａ２の植物での発現
実施例２１で作製したｐＳＰＢ１４７８を実施例７に記述したように、アグロバクテリウムツメファシエンスＡｇ１０株に導入し、ペチュニアＰＬ株を形質転換した。また、ｐＳＰＢ２２０６もＰＬ株に形質転換した。
実施例３４ シクラメン花弁ｃＤＮＡライブラリーの構築
黄色のシクラメンの新鮮な花弁５ｇから実施例１と同様の方法でｃＤＮＡライブラリーを構築した。得られたライブラリーは１．７５×１０６プラーク・フォーミング・ユニット（ｐｆｕ）からなっていた。
実施例３５ カルコン糖転移酵素遺伝子ＹＣｙ３−１２の取得
Ｔ１７０をプローブとして、シクラメン花弁ライブラリー２４，０００プラークよりスクリーニングを行った。スクリーニングによりプラスミドｐＹＣｙ３−１２を得た。ｐＹＣｙ３−１２に含まれるｃＤＮＡは、４８２アミノ酸からなる分子量５４．３ｋＤａのタンパク質をコードする１４４６ｂｐの遺伝子ＹＣｙ３−１２を含んでいた。ＹＣｙ３−１２がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転移酵素と実施例３に記載したように比較したところリビングストーンデージー由来ＧＴと２８％、バーベナ由来５ＧＴと２４％の同一性を示した。またＴ１７０とは４６％、Ｔ１２８とは２８％、ＣＧＴ９３とは４６％、Ｓ６Ｂ１１とは２８％、Ｓ１２Ａ２とは２７％の同一性を示した。ＰＹＣｙ３−１２中に含まれる遺伝子を含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号５５、５６にそれぞれ示す。
実施例３６ 大腸菌におけるＹＣｙ３−１２遺伝子の発現と活性測定
ＹＣｙ３−１２遺伝子の大腸菌での発現は、実施例４に記載された方法と同じＴｈｅ ＱＩＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行った。まずＹＣｙ３−１２上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの５’側にＮｃｏＩ認識配列を導入するために、以下に示すプライマーＹＣｙ３−１２Ｐ１（配列番号５３）とＹＣｙ３−１２Ｐ２（配列番号５４）を用いて実施例４と同様のＰＣＲ反応を行った。
この大腸菌形質転換株を、実施例５に記載されている方法で培養し、粗酵素液を得た。これを用いて実施例５に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移活性を測定した。
ＹＣｙ３−１２由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、ＴＨＣ（保持時間２７．３分）に加え、１９．８９分に溶出される新たな物質が検出された。これはＴＨＣの２’位配糖体の保持時間と一致し、ｐＱＥ６１ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったことからＹＣｙ３−１２に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。以上の結果から、ＹＣｙ３−１２由来の糖転移酵素はＴＨＣの２’位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。
本発明は、花卉園芸、植物育種、農業、バイオテクノロジー関連などの産業に適用される。
Claims (20)
- 配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１５に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１４に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１７に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１６に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１９に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号１８に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号２０に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号５６に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 配列番号５５に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求の範囲第１項から第１２項のいずれか一項に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
- 請求の範囲第１３項に記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求の範囲第１４項に記載の宿主細胞を培養又は生育させ、当該宿主細胞からカルコン類の２’位に糖を転移する活性を有するタンパク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
- 請求の範囲第１５項に記載の方法で得られたタンパク質。
- 請求の範囲第１項から第１２項のいずれか一項に記載の遺伝子が導入された植物体若しくは当該植物体の子孫となる植物体、又はそれら植物体の組織。
- 請求の範囲第１７項に記載の植物体から採取された切り花。
- 請求の範囲第１項から第１２項のいずれか一項に記載の遺伝子を植物体に導入及び発現して花色が改変された植物体、及び当該植物体の子孫となる植物体。
- 改変された花色が黄色であることを特徴とする請求の範囲第１８項に記載の植物体。
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