CN105671108A - 甜菊糖苷的重组生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甜菊糖苷的重组生产,公开了经过改造能够表达编码甜菊醇生物合成酶和UDP-糖基转移酶(UGTs)的新型重组基因的重组微生物、植物和植物细胞。这些微生物、植物或植物细胞可以产生甜菊醇或甜菊糖苷(例如甜叶悬钩子苷或莱鲍迪苷A),作为食品中的天然甜味剂和膳食补充剂。
Description
本申请是中国专利申请CN201180038475.4的分案申请,原申请是国际申请号PCT/US2011/038967于2013年2月4日进入中国国家阶段的申请。
序列表
本申请含有以ASCII格式经EFS-Web提交的序列表,该序列表通过引用全部并入本文。所述2011年6月2日生成的ASCII拷贝命名为25933WO1.txt,大小为483,406字节。
技术领域
本公开涉及甜菊醇(steviol)和甜菊糖苷(steviolglycoside)的重组制备。具体来说,本公开涉及通过诸如重组微生物、植物或植物细胞的重组宿主制备甜菊醇和甜菊糖苷,比如甜叶悬钩子苷(rubusoside)和/或莱鲍迪苷(rebaudioside)A。本公开还提供了含有所述甜菊糖苷的组合物。
背景技术
甜味剂是常用于食品、饮料或糖果业的为人熟知的成分。甜味剂既可以用于在生产过程中加入最终食品,也可以在适当稀释的情况下作为佐餐甜味剂或者作为烘培中糖的家用替代品来单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(比如蔗糖、高果糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)和人工甜味剂(比如阿斯巴甜、糖精和蔗糖素)。甜菊提取物是可以从常青灌木甜叶菊(Steviarebaudiana)中分离和提取的一种天然甜味剂。甜菊在南美和亚洲被广泛种植用于商业生产甜菊提取物。纯化程度各不相同的甜菊提取物常常被作为食品中的高甜度甜味剂,或者混合或单独作为佐餐甜味剂。
甜菊植物的提取物含有莱鲍迪苷和其它带来甜味的甜菊糖苷,虽然不同产品批次之间每种糖苷的量往往不同。现有的商品中占优势的是莱鲍迪苷A,和量少一些的其它糖苷,比如莱鲍迪苷C、D和F。甜菊提取物还可能含有杂质,比如造成异味的来源于植物的化合物。这些异味根据食物系统或者目标用途会带来或多或少的问题。潜在的杂质包括色素、脂类、蛋白、酚类、糖类、斯巴醇和其它倍半萜烯、半日花烷型二萜类、单萜烯、癸酸、8,11,14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-和β-香树素、羽扇豆醇酯、β-香树脂醇乙酸乙酯、五环三萜、centauredin、quercitin、epi-α-杜松醇、carophyllenes和衍生物、β-松油萜、β-谷甾醇和赤霉素。
发明内容
本文提供了诸如微生物的重组宿主,所述重组宿主包含一或多个生物合成基因,这些基因的表达导致甜菊醇的产生。这类基因包括编码柯巴基焦磷酸合酶的基因、编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因,和编码甜菊醇合成酶的基因。重组宿主可以包含编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因。这些基因中至少一个是重组基因。在一些实施方案中,重组宿主还包含编码香叶基香叶基(geranylgeranyl)焦磷酸合酶的基因。重组宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA还原酶的基因和/或编码CPR的基因。这些基因中一或多个的表达可以是诱导性的。
本文本一个方面提供了重组宿主,所述重组宿主包含编码UGT91D2多肽(例如UGT91D2e或UGT91D2m多肽)的重组基因。UGT91D2多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列可以有至少90%的同一性(例如,至少95%或99%同一性)。UGT91D2多肽可以包含位于SEQIDNO:5的残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。例如,UGT91D2多肽包含位于选自SEQIDNO:5的残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。在一个实施方案中,UGT91D2多肽包含相对SEQIDNO:5位于残基位点206的精氨酸、残基位点207的半胱氨酸。在一个实施方案中,UGT91D2多肽包含相对SEQIDNO:5位于残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。多肽可以具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:95的氨基酸序列。
本文描述的宿主还包含编码与SEQIDNO:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。例如,UGT85C多肽可以包含位于SEQIDNO:3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。
本文描述的宿主还包含编码与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。例如,UGT76G多肽可以包含位于SEQIDNO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。
本文本还提供了包含重组基因的重组宿主,所述重组基因编码的UGT85C多肽与SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性,并且有位于SEQIDNO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。例如,UGT85C多肽可以包含位于SEQIDNO:3的残基13、15、60、270、289和418的取代。例如,UGT85C多肽可以包含a)位于SEQIDNO:3的残基13、60和270的取代;b)位于SEQIDNO:3的残基60和87的取代;c)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、243和270的取代;d)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、243、270和441的取代;e)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、389和394的取代;f)位于SEQIDNO:3的残基65、71、270和289的取代;g)位于SEQIDNO:3的残基15和65的取代;h)位于SEQIDNO:3的残基65和270的取代;i)位于SEQIDNO:3的残基65和440的取代;j)位于SEQIDNO:3的残基65和441的取代;k)位于SEQIDNO:3的残基65和418的取代;1)位于SEQIDNO:3的残基220、243、270和334的取代;或者m)位于SEQIDNO:3的残基270和289的取代。
本文本另一方面提供了包含重组基因的重组宿主,所述重组基因编码的UGT76G多肽与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性,并且有位于SEQIDNO:7中残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。例如,UGT76G多肽可以包含a)位于氨基酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208和291的取代;b)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285和291的取代;或者c)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的取代。
本文描述的任一种宿主还可以包含编码UGT74G1多肽的基因(例如,编码UGT74G1多肽的重组基因)。
本文描述的任一种宿主还可以包含下述的一或多个:(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因;(ii)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;(iv)编码甜菊醇合成酶的基因;(v)编码截短的HMG-CoA的基因;(vi)编码CPR的基因;(vii)编码鼠李糖合成酶的基因;(viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因和(ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)基因中的至少一个是重组基因。在一些实施方案中,(i)、(ii)、(iii)和(iv)基因中的每一个都是重组基因。
本文本还提供了分离的核酸,其编码的多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列有至少90%序列同一性(例如,至少95%或99%序列同一性)。多肽可以包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。多肽可以包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。多肽可以包含位于SEQIDNO:5中残基206的精氨酸,位于残基207的半胱氨酸和位于残基343的精氨酸。在一些实施方案中,多肽包含位于SEQIDNO:5中的残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸。
本文本另一方面提供了分离的多肽,其氨基酸序列与SEQIDNO:5的氨基酸序列有至少90%同一性。
本文本还提供了重组宿主,所述重组宿主包含(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因;(ii)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;(iv)编码甜菊醇合成酶的基因;其中所述基因中至少一个。当宿主被培养在使每个基因得以表达的条件下时可以产生甜菊醇,并且可以在培养基中积累到至少1mg/L。香叶基香叶基焦磷酸合酶与SEQIDNOs:121-128中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。柯巴基焦磷酸合酶与SEQIDNOs:129-131中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。异贝壳杉烯合酶与132-135中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。异贝壳杉烯氧化酶与138-141中给出的每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。甜菊醇合成酶与SEQIDNOs:142-146中每个氨基酸序列有90%以上的序列同一性。宿主还可以包含编码截短的HMG-CoA的基因和/或编码CPR的基因。
任一种重组宿主还可以包含编码UGT74G1多肽、UGT85C2多肽、UGT76G1多肽或UGT91D2多肽的基因中的一或多个。
当任一种重组宿主被培养在使每个基因得以表达的条件下时可以产生至少一种甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷(dulcoside)A。当在所述条件下培养时,甜菊糖苷可以累积到至少1mg/升(例如至少10mg/升或20mg/升)培养基。
任一种重组宿主还可以包含下述中的一或多个:i)编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因;ii)编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因;iii)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因;iv)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因;v)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合酶(MCS)的基因;vi)编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因;或者vii)编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。
任一种重组宿主还可以包含下述中的一或多个:ix)编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因;x)编码截短的HMG-CoA还原酶的基因;xi)编码甲羟戊酸激酶的基因;xii)编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因;或者xiii)编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。
在本文描述的任一种宿主中,一或多个基因的表达是可诱导的。
本文描述的任一种宿主可以是微生物(例如糖酵母(比如酿酒酵母)或者大肠杆菌),或者植物或植物细胞(例如,甜菊(比如甜叶菊)、中欧葫芦藓(Physcomitrella)或者烟草植物或植物细胞)。
本文本另一方面提供了制备甜菊醇或甜菊糖苷的方法。所述方法包括将本文描述的宿主在基因得以表达的条件下生长在培养基中;和回收由宿主产生的甜菊醇或甜菊糖苷。培养步骤可以包括诱导一或多个所述基因的表达。甜菊醇或甜菊糖苷选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。
本文还提供了制备甜菊醇或甜菊糖苷的方法。所述方法包括将微生物在香叶基香叶基焦磷酸合酶、柯巴基焦磷酸合酶、异贝壳杉烯合酶、异贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-羟化酶(kaurenoicacid13-hydroxylase)基因和任选地UGT74G1和/或UGT85C2基因能够被表达的条件下生长在培养基中,和回收由微生物产生的甜菊醇或甜菊糖苷。微生物可以是糖酵母属物种(Saccharomycesspp)。在一些实施方案中,培养步骤包括诱导香叶基香叶基焦磷酸合酶、柯巴基焦磷酸合酶、异贝壳杉烯合酶、异贝壳杉烯氧化酶、异贝壳杉烯酸13-羟化酶、UGT74G1和UGT85C2基因中的一或多个的表达。在一些实施方案中,回收步骤包括通过HPLC从培养基中纯化甜菊醇或甜菊糖苷。甜菊醇或甜菊糖苷可以是甜菊醇、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。
本文还提供了包含一或多个生物合成基因的重组糖酵母属菌株,所述基因的表达导致对映-异贝壳杉烯的产生。所述生物合成基因包括编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因。菌株在表达柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶时,即可产生对映-异贝壳杉烯。
本文本另一方面提供了分离的核酸,其与SEQIDNOs:18-25、34-36、4-43、48、49、52-55、60-64、70-72、77或79中给出的每个核苷酸序列有90%以上的序列同一性(例如,95%或99%以上的序列同一性)。
本文本还提供了重组宿主,其包含(i)编码UGT74G1的基因;(ii)编码UGT85C2的基因;(iii)编码UGT76G1的基因;和(iv)编码UGT91D2的基因,其中至少一个所述基因是重组基因。在一些实施方案中,每个基因都是重组基因。当宿主在每个基因都能被表达的条件下培养时,可以产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。本文本还提供了由所述宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷D和含量减少的来自甜菊植物的杂质。相对甜菊提取物,所述组合物可以含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷E和含量减少的来自甜菊植物的杂质。
本文还提供了分离的核酸,其编码的多肽与UGT91D2e和UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性,除了UGT91D2m的氨基酸序列,并且分离的多肽与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上序列同一性,除了UGT91D2m的氨基酸序列。
本文本还提供了由本文描述的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物,所述组合物含有的来自甜菊植物的杂质水平下降。
本文本另一方面提供了重组宿主。所述宿主包含(i)编码UGT91D2的重组基因;(ii)编码UGT74G1的重组基因;(iii)编码UGT85C2的重组基因;(iv)编码UGT76G1的重组基因;和(v)编码鼠李糖合成酶的基因,其中宿主被培养在每个基因都能得到表达的条件下时,产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷C或杜尔可苷A。该文本还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物,所述组合物含有占甜菊糖苷总重15%以上的莱鲍迪苷C和含量减少的来自甜菊植物的杂质。还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物,所述组合物可以含有占甜菊糖苷总重15%以上的杜尔可苷A和含量减少的来自甜菊植物的杂质。
本文本还提供了重组宿主。所述宿主包含(i)编码UGT91D2的重组基因;(ii)编码UGT74G1的重组基因;(iii)编码UGT85C2的重组基因;(iv)编码UGT76G1的重组基因;(v)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因;和(vi)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因,其中宿主当培养在每个基因都能被表达的条件下时,产生至少一种甜菊糖苷。宿主还可以包含(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因、或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。所述甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷F。本文本还提供了由这样的宿主产生的甜菊糖苷组合物。相对甜菊提取物,所述组合物可以含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷F和含量减少的来自甜菊植物的杂质。
本文本另一方面提供了制备甜菊糖苷组合物的方法。所述方法包括将本文描述的宿主在每个基因都能得以表达的条件下生长在培养基中;和回收由所述宿主产生的甜菊糖苷组合物,其中相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物,回收到的组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。宿主(例如微生物)产生的甜菊糖苷组合物相对甜菊提取物可能来自甜菊植物的杂质含量减少。
本文本还提供了食品,所述食品包含的甜菊糖苷组合物相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。
本文本另一方面提供了鉴定某多态性是否与性状差异关联的方法。所述方法包括确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座有关;和测量所述群体中植物的性状差异与所述群体中植物的一或多个基因多态性之间的相关性,从而确认所述一或多个基因多态性是否与性状差异关联。
本文本再一方面提供了制备植物系的方法。所述方法包括确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联;鉴定群体中的一或多个植物,所述植物中存在至少一个与性状差异关联的基因多态性;将鉴定到的一或多个植物自身或者与不同植物杂交产生种子;将从种子长出的至少一个子代植物自身或者与不同植物杂交;和再重复所述杂交步骤0-5个世代以得到所述植物系,其中该植物系中存在至少一个所述基因多态性。
本文本还提供了将第二糖部分转移至甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2′的方法。所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二糖部分转移到甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。UGT91D2多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列有至少90%序列同一性(例如,至少95%或99%)。UGT91D2多肽可以包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。UGT91D2多肽可以包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。甜菊糖苷可以选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷和莱鲍迪苷A。甜菊糖苷可以是甜叶悬钩子苷,第二糖部分是葡萄糖,在转移了第二葡萄糖部分时产生甜菊苷。甜菊糖苷可以是甜菊苷,第二糖部分可以是葡萄糖,在转移了第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷E。甜菊糖苷可以是甜菊苷,其中甜菊苷与UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在适合产生莱鲍迪苷D的反应条件下进行接触。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,通过转移所述第二葡萄糖部分而产生甜菊醇-1,2二糖苷。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,在转移了第二糖部分时产生甜菊醇-1,2-木二糖苷。甜菊糖苷可以是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,通过转移第二糖部分而产生甜菊醇-1,2-鼠李二糖苷。甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A,在转移了第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。
本文本另一方面提供了确定甜菊(Stevia)植物中存在多核苷酸的方法。所述方法包括将至少一个探针或引物对与来自甜菊植物的核酸进行接触,其中所述探针或引物对是编码UGT多肽的多核苷酸特异的,其中所述UGT多肽与SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7有至少90%的序列同一性;和确定所述甜菊植物中是否存在多核苷酸。
本文本还提供了用于甜菊(Stevia)生物样品的基因作图的试剂盒。所述试剂盒包含能够特异扩增多核苷酸的引物对或者能够与多核苷酸特异杂交的探针,其中所述多核苷酸编码的UGT多肽与SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7有至少90%的序列同一性。
本文还提供了包含一或多个生物合成基因的重组微生物,所述生物合成基因的表达会导致产生一或多种甜菊糖苷。所述生物合成基因包括编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因、编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因、编码甜菊醇合成酶的基因,和编码UGT74G1和/或UGT85C2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。微生物可以包含编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因代替编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因。
重组微生物被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,产生至少一种甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以是甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、杜尔可苷B或者杜尔可苷A。
重组微生物可以是糖酵母(例如酿酒酵母),并且带有一或多个基因修饰,所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物,EXG1和EXG2糖苷水解酶的活性下降;并且带有一或多个基因修饰,所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物,麦角固醇生物合成下降。糖酵母被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,产生甜叶悬钩子苷。甜叶悬钩子苷可以积累到至少10mg/升培养基。糖酵母可以是被指定为CEY171、CEY191或CEY213的酿酒酵母菌株。
重组微生物还可以包含编码SM12UGT的基因和编码UGT76G1的基因,并且在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,产生甜菊糖苷。所述甜菊糖苷可以是莱鲍迪苷A。
本文还提供了重组微生物,其包含的一或多个生物合成基因在表达时导致产生至少一种甜菊糖苷。生物合成基因包括编码SM12UGT的基因、编码UGT74G1的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT85C2的基因。重组微生物被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,产生莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B。培养基中的莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B可以累积到至少1mg/L。
本文还提供了重组微生物,其包含编码UGT91D2多肽的基因,例如重组UGT91D2基因。
本文还提供了重组微生物,其包含编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因、编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因(或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因)、编码异贝壳杉烯氧化酶的基因、编码甜菊醇合成酶的基因、编码UGT74G1的基因、编码UGT85C2的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT91D2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。重组微生物在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,可以产生至少一种甜菊糖苷,例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B和/或莱鲍迪苷F。重组微生物在被培养在这种条件下时,可以累积至少20mg甜菊糖苷/升培养基。重组微生物可以是糖酵母(例如酿酒酵母),并且带有一或多个基因修饰,所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物,EXG1和EXG2糖苷水解酶的活性下降;并且带有一或多个基因修饰,所述基因修饰使得相对没有这样的基因修饰的对照微生物,麦角固醇生物合成下降。
本文还提供了重组微生物,其包含编码UGT74G1的基因、编码UGT85C2的基因、编码UGT76G1的基因和编码UGT91D2的基因。所述基因中的至少一个是重组基因。重组微生物在被培养在每个基因都能得以表达的条件下时,可以产生甜菊糖苷,例如莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B。莱鲍迪苷A或莱鲍迪苷B在培养基中可以累积到至少15mg/L。
以上描述的重组微生物还可以包含编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因,和/或编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因,和/或编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因,和/或编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因,和/或编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合酶(MCS)的基因,和/或编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因,和/或编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。
以上描述的重组微生物还可以包含编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因,和/或编码截短的HMG-CoA还原酶的基因,和/或编码甲羟戊酸激酶的基因,和/或编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因,和/或编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。
除非另有定义,本文使用的所有科技术语均与发明所属领域的普通技术人员理解的含义形同。虽然与本文描述的类似或等同的方法和材料可以用于发明的实施,以下描述了合适的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和其它提及的参考文献均通过引用全部并入本文。有冲突的情况下,由本说明书包括定义决定。此外,材料、方法和实施例仅用于说明而非限制的目的。由以下详细描述,本发明的其它特征和优点是显而易见的。申请人保留按照专利法的标准做法,使用连接词“包含”、“基本由...构成”或者“由...构成替代地要求保护任一种公开的发明的权利。
附图说明
图1是显示由香叶基香叶基焦磷酸生物合成甜菊醇的示意图。
图2A-D显示由甜菊醇生物合成甜菊糖苷的代表性途径。
图3显示了不同甜菊糖苷的化学结构。
图4是酿酒酵母中rebA产生的示意图。
图5是基因串联形成eYACs的示意图。
图6显示了酵母菌株CEY13在各种培养条件下的甜叶悬钩子苷产量。
图7显示了与甜叶悬钩子苷的文献记录数值相比,由酵母菌株CEY213产生的化合物的1H和13CNMR分析得到的数据。
图8是UGT91D1和UGT91D2氨基酸序列(SEQIDNOs:14、16、12、5和10)的分别序列比对。
图9显示了含有质粒pMUS47的酵母CEY213在24和99小时培养后产生的莱鲍迪苷A、甜菊苷和甜叶悬钩子苷。
图10A是显示上清液中RebA、甜叶悬钩子苷和19-SMG的浓度的曲线。图10B是酵母细胞被饲喂100μM甜菊醇的试验中,在细胞沉淀中测量到的RebA、甜叶悬钩子苷和19-SMG的浓度的曲线。两个曲线中,第一组条带代表未标签的对照菌株;第二组条带代表含有UGT74G1、UGT76G1和UGT91D2e融合蛋白(其中每个UGT融合了MDM2蛋白的N端的158个氨基酸)以及UGT85C2融合蛋白(其中合成PMI肽的四个重复与85C2的N末端符合读框融合)的菌株。Y轴是微摩尔单位的浓度。
不同附图中的类似符号表示类似的元件。
具体实施方式
两种糖苷甜菊苷和莱鲍迪苷A是商品甜菊提取物中的主要化合物。甜菊苷据报道比莱鲍迪苷A的味道更苦,甜味淡一些,因此,优选在提取物制品中含有更高比例的莱鲍迪苷A。然而甜菊提取物组合物根据植物所生长的土壤和气候可能批次之间各不相同。取决于所来源的植物、气候条件和提取过程,商业制品中莱鲍迪苷A的量据报道在甜菊糖苷总含量的20-97%之间变化,一般>50-80%,有时高达甜菊糖苷总量的>95-97%。而且,甜菊提取物中还有其它不同量的甜菊糖苷,这使得通过提取和纯化从甜菊植物中制备具有一致口味的甜味剂更加复杂。例如,莱鲍迪苷B通常含量低于1-2%,而莱鲍迪苷C可能达到7-15%的水平。莱鲍迪苷D一般在2%或更低的水平,组合物中的莱鲍迪苷F一般是总甜菊糖苷的3.5%或更低。甚至据报道痕量的次要甜菊糖苷都会影响甜菊提取物的风味。此外,人们认为甜菊植物中的一些杂质,即使浓度非常低,也可能给某些植物提取物商品带来异味。
本文本基于这样的发现,即可以开发诸如植物细胞、植物或微生物的重组宿主来表达用于生物合成甜菊醇的多肽。并且,这类宿主可以表达适合产生甜菊糖苷(比如甜叶悬钩子苷和莱鲍迪苷A)的尿苷5′-二磷酸(UDP)糖基转移酶。重组微生物是尤其有用的宿主。这些生物合成多肽在各种微生物框架的表达使得可以由能量和碳源(比如糖、醇、CO2、H2和阳光)以持续、可重复的方式产生甜菊醇及其糖苷。重组宿主产生的各种甜菊糖苷的比例可以通过将预先选定的生物合成酶引入宿主并以合适的水平表达这些酶来具体决定,从而产生具有一致口味的甜味剂组合物。此外,重组宿主产生的甜菊糖苷的浓度预期比甜菊植物中产生的甜菊糖苷水平更高,这样可以提高下游纯化的效率。相对甜菊提取物中存在的杂质的量,这样的甜味剂组合物含有极少甚至没有源于植物的杂质。
所述基因中至少有一个是重组基因,具体的重组基因取决于选中的种或菌株。为了增加甜菊醇和糖苷的产量,提高能量和碳源转化为甜菊醇及其糖苷的效率,和/或增强细胞培养物或植物的产率,可以包含上其它基因或生物合成模块。这类其它生物合成模块包括参与类萜前体、异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙焦磷酸的合成的基因。其它生物合成模块包括萜合酶和萜环化酶基因,比如编码香叶基香叶基焦磷酸合酶和柯巴基焦磷酸合酶的基因;这些基因可以是内源基因或者是重组基因。
I.甜菊醇和甜菊糖苷生物合成多肽
A.甜菊醇生物合成多肽
甜菊提取物中存在的几种化合物,包括二萜甜菊醇和各种甜菊糖苷的化学结构如图3所示。以下表A中显示了它们的CAS编号。还可以参见SteviolGlycosidesChemical andTechnicalAssessment69thJECFA,由HarrietWallin制作,FoodAgric.Org.(2007)。
表A.
化合物 | CAS编号 |
甜菊醇 | 471-80-7 |
莱鲍迪苷A | 58543-16-1 |
甜菊醇二糖苷 | 41093-60-19 --> |
甜菊苷 | 57817-89-7 |
莱鲍迪苷B | 58543-17-2 |
莱鲍迪苷C | 63550-99-2 |
莱鲍迪苷D | 63279-13-0 |
莱鲍迪苷E | 63279-14-1 |
莱鲍迪苷F | 438045-89-7 |
甜叶悬钩子苷 | 63849-39-4 |
杜尔可苷A | 64432-06-0 |
已有发现在宿主比如微生物中表达某些基因可以赋予所述宿主合成甜菊醇的能力。正如下文更详细地描述的,宿主中可能天然存在一或多个这类基因。但是通常一或多个这类基因是被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主中的重组基因。
产生甜菊醇的生化途径涉及香叶基香叶基焦磷酸的形成、环化形成(-)柯巴基焦磷酸,随后是氧化和羟化形成甜菊醇。参见图1。因此,在重组微生物中香叶基香叶基焦磷酸转化为甜菊醇涉及编码异贝壳杉烯合酶(KS)的基因、编码异贝壳杉烯氧化酶(KO)的基因以及编码甜菊醇合成酶(KAH)的基因的表达。甜菊醇合成酶又被称为异贝壳杉烯酸13-羟化酶。
合适的KS多肽是已知的。例如,合适的KS酶包括甜叶菊、玉米(Zeamays)和杨树(Populustrichocarpa)产生的那些。参见SEQIDNOs:132-135。以下更详细地描述了编码这些多肽的核苷酸序列。参见例如,表3和SEQIDNOs:40-47。
合适的KO多肽是已知的。例如,合适的KO酶包括甜叶菊、拟南芥、腾仓赤霉(Gibberellafujikoroi)和变色栓菌(Trametesversicolor)所产生的那些。参见SEQIDNOs:138-141。编码这些多肽的核苷酸序列在下文有更详细的描述。参见例如,表5和SEQIDNOs:52-59。
合适的KAH多肽是已知的。例如,合适的KAH酶包括甜叶菊、拟南芥、欧亚种葡萄(Vitisvinifera)和蒺藜苜蓿(Medicagotrunculata)产生的那些。参见例如,SEQIDNOs:142-146;美国专利公开2008-0271205;美国专利公开No.2008-0064063和Genbank登录号gi189098312。来自拟南芥的甜菊醇合成酶被分类为CYP714A2。编码这些多肽的核苷酸序列在下文有更详细的描述。参见例如,表6和SEQIDNOs:60-69。
在一些实施方案中,重组微生物含有编码KO和/或KAH多肽的重组基因。这类微生物一般还含有编码细胞色素P450还原酶(CPR)多肽的重组基因,因为某些KO和/或KAH多肽的组合需要外源CPR多肽的表达。特别是包含上编码外源CPR多肽的重组基因可以显著地提高植物来源的KO和/或KAH多肽的活性。合适的CPR多肽是已知的。例如,合适的CPR酶包括甜叶菊、拟南芥和腾仓赤霉产生的那些。参见例如,SEQIDNOs:147-149。编码这些多肽的核苷酸序列在下文有更详细的描述。参见例如,表7和SEQIDNOs:70-75。
这些基因在重组微生物中的表达导致香叶基香叶基焦磷酸转化为甜菊醇。
B.甜菊糖苷生物合成多肽
在一些实施方案中,本文描述的重组宿主可以将甜菊醇转化为甜菊糖苷。这类宿主(例如微生物)含有编码一或多个UDP糖基转移酶(又称为UGTs)的基因。UGTs能够将活化的核苷酸糖上的单糖单元转移给受体部分,此处的情况中,即甜菊醇或甜菊醇衍生物上的-OH或-COOH部分。根据序列同源性,UGTs被划分为家族和亚家族(Lietal.J.Biol.Chem.276:4338-4343(2001))。
B.1甜叶悬钩子苷生物合成多肽
甜叶悬钩子苷的生物合成涉及甜菊醇13-OH和19-COOH的糖基化。参见图2A。已经发现重组宿主(比如微生物)中甜菊醇转化为甜叶悬钩子苷可以通过表达编码UGTs85C2和74G1的基因来实现,其中甜菊醇分别给13-OH或者19-COOH转移葡萄糖单元。
因此,合适的UGT85C2可以发挥尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-OH转移酶和尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-糖苷13-OH转移酶的作用。有活性的UGT85C2多肽还可以催化葡糖基转移酶反应,该反应使用甜菊醇和甜菊醇-19-O-糖苷以外的甜菊糖苷底物。
合适的UGT74G1多肽可以发挥尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇19-COOH转移酶和尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡萄糖苷19-COOH转移酶的作用。有活性的UGT74G1多肽还可以催化糖基转移酶反应,该反应使用甜菊醇和甜菊醇-13-O-葡萄糖苷以外的甜菊糖苷底物,或者转移来自尿苷二磷酸葡糖以外的供体的糖部分。
当培养基中饲喂甜菊醇时,表达功能性UGT74G1和功能性UGT85C2的重组微生物可以产生甜叶悬钩子苷和两种甜菊醇单糖苷(即,甜菊醇13-O-单葡萄糖苷和甜菊醇19-O-单葡萄糖苷)。宿主中可能天然存在一或多个这类基因。但一般来说这类基因是被转化到天然情况下不具备这些基因的宿主(例如微生物)的重组基因。
术语“重组宿主”用于本文是指这样的宿主,其基因座增加了至少一个引入的DNA序列。这类DNA序列包括但不限于天然情况不存在的基因、通常不会被转录为RNA或翻译为蛋白(“表达”)的DNA序列,以及希望引入非重组宿主的其它基因或DNA序列。可以理解,一般说来本文描述的重组宿主的基因组通过稳定导入一或多个重组基因而扩大。通常,导入的DNA本来不存在于接受所述DNA的宿主中,但本发明的范围包括从给定宿主中分离DNA节段并随后将该DNA的一或多个额外拷贝导入相同的宿主,从而例如增加基因产物的产量或者改变基因的表达模式。在一些情况中,导入的DNA会通过例如同源重组或定点突变修饰甚至取代内源基因或DNA序列。合适的重组宿主包括微生物、植物细胞和植物。
术语“重组基因”是指被导入受体宿主的基因或DNA序列,无论所述宿主中是否已经存在相同或类似的基因或DNA序列。本语境中的“导入”或“增加”在本领域中已知意味着人为导入或增加的。因此重组基因可以是来自另一个物种的DNA序列;或者是来源于或存在于相同物种,但通过基因工程方法引入宿主形成重组宿主的DNA序列。可以理解,被导入宿主的重组基因可以与转化宿主中正常存在的DNA序列相同,导入它是为了提供该DNA的一或多个额外拷贝,从而能够过表达或者修饰表达该DNA的基因产物。
合适的UGT74G1和UGT85C2多肽包括甜叶菊产生的那些。Richman,etal.Plant J.41:56-67(2005)中报道了来自甜菊的编码活性UGT74G1和UGT85C2多肽的基因。SEQIDNOs:1和3中分别给出了甜叶菊UGT74G1和UGT85C2多肽的氨基酸序列。SEQIDNOs:2和4中分别给出了经过优化用于在酵母菌中进行表达的编码UGT74G1和UGT85C2的核苷酸序列。还可参见实施例17和18中分别描述的UGT85C2和UGT74G1变体。
在一些实施方案中,重组宿主是微生物。可以将重组微生物生长在含有甜菊醇的培养基中以便产生甜叶悬钩子苷。但在其它实施方案中,重组微生物表达一或多个参与甜菊醇生物合成的重组基因,例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此,除了UGT74G1和UGT85C2基因,还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物不需要培养基中包含甜菊醇即可产生甜菊醇单糖苷和甜叶悬钩子苷。
在一些实施方案中,重组微生物还表达编码香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的重组基因。合适的GGPPS多肽是已知的。例如,合适的GGPPS酶包括甜叶菊、腾仓赤霉、小家鼠、假微型海链藻(Thalassiosirapseudonana)、正棒状链霉菌(Streptomycesclavuligerus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfulobusacidocaldarius)、聚球蓝细菌(Synechococcussp.)和拟南芥产生的那些。参见SEQIDNOs:121-128。下文中更详细地描述了编码这些多肽的核苷酸序列。参见表1和SEQIDNOs:18-33。在一些实施方案中,重组微生物还表达参与二萜生物合成或类萜前体的产生的重组基因,例如以下讨论的甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径中的基因或者甲羟戊酸(MEV)途径中的基因。
B.2莱鲍迪苷A生物合成多肽
莱鲍迪苷A的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体来说,莱鲍迪苷A的形成可以通过甜菊醇的13-OH的葡糖基化(形成13-O-甜菊醇单糖苷)、甜菊醇中13-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化(形成甜菊醇-1,2-二糖苷)、甜菊醇-1,2-二糖苷中C-19羧基的葡糖基化(形成甜菊苷)、以及甜菊苷中C-13-O-葡萄糖的C-3’的葡糖基化。各个葡糖基化反应进行的顺序可以改变。参见图2A。
已经发现重组宿主中甜菊醇转化为莱鲍迪苷A可以通过表达编码以下活性UGT(74G1、85C2、76G1和91D2)的基因来实现。因此当在培养基中饲喂甜菊醇时,表达这四种UGT的重组微生物可以制备莱鲍迪苷A。一般来说,这些基因中的一或多个是被转化到天然情况下不具有这些基因的微生物中的重组基因。还发现本文中被指定为SM12UGT的UGT可以替换UGT91D2。
合适的UGT74G1和UGT85C2多肽包括以上讨论过的那些。合适的UGT76G1给受体分子(甜菊醇1,2糖苷)的C-13-O-葡萄糖的C-3’添加葡萄糖部分。因此,UGT76G1可以发挥例如尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇13-O-1,2葡萄糖苷C-3’葡糖基转移酶和尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇-19-O-葡萄糖,13-O-1,2二糖苷C-3’葡糖基转移酶的作用。有活性的UGT76G1多肽还可以催化葡糖基转移酶反应,所述反应利用含有葡萄糖之外的糖的甜菊糖苷底物,例如甜菊醇鼠李糖苷和甜菊醇木糖苷。参见图2A、2B、2C和2D。合适的UGT76G1多肽包括甜叶菊产生的和Richman,etal.PlantJ.41:56-67(2005)中报道的那些。SEQIDNO:7中给出了甜叶菊UGT76G1多肽的氨基酸序列。编码SEQIDNO:7的UGT76G1多肽的核苷酸序列经过优化用于在酵母菌中的表达,在SEQIDNO:8中给出。还可参见实施例18中给出的UGT76G1变体。
合适的UGT91D2多肽可以发挥尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶(又被称为甜菊醇-13-单葡萄糖苷1,2-葡糖基化酶)的作用,给受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’转移上葡萄糖部分。一般来说,合适的UGT91D2多肽还可以发挥尿苷-5’-二磷酸葡糖基:甜叶悬钩子苷转移酶的作用,给受体分子甜叶悬钩子苷中13-O-葡萄糖的C-2’转移上葡萄糖部分。
活性UGT91D2多肽还可以催化利用除了甜菊醇-13-O-葡萄糖苷和甜叶悬钩子苷以外的甜菊糖苷底物的反应,例如活性UGT91D2多肽可以利用甜菊苷作为底物,将葡萄糖部分转移到19-O-葡萄糖残基的C-2’上从而产生莱鲍迪苷E。活性UGT91D2多肽还可以利用莱鲍迪苷A作为底物,将葡萄糖部分转移到19-O-葡萄糖残基的C-2’上从而产生莱鲍迪苷D。但是,活性UGT91D2多肽一般不会给在C-13位置具有1,3-结合的葡萄糖的甜菊醇化合物转移葡萄糖部分,即不会发生葡萄糖部分到甜菊醇1,3-二糖苷和1,3-甜菊苷的转移。
活性UGT91D2多肽可以转移来自除了尿苷二磷酸葡糖以外的糖部分。例如,活性UGT91D2多肽可以发挥尿苷5’-二磷酸D-木糖基:甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶的作用,将木糖部分转移到受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’。另一个例子,活性UGT91D2多肽可以发挥尿苷5’-二磷酸L-鼠李糖基:甜菊醇-13-O-葡萄糖苷转移酶的作用,将鼠李糖部分转移到受体分子甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’。
合适的活性UGT91D2多肽包括本文公开的那些,例如被指定为UGT91D2e和UGT91D2m的多肽。SEQIDNO:5中给出了来自甜叶菊的示范性UGT91D2e多肽的氨基酸序列。SEQIDNO:6是经过优化用于在酵母菌中表达的编码SEQIDNO:5的多肽的核苷酸序列。SEQIDNO:9中给出了编码SEQIDNO:5的多肽的甜叶菊核苷酸序列。SEQIDNOs:10和12中给出了来自甜叶菊的示范性UGT91D2m多肽的氨基酸序列,它们分别由SEQIDNOs:11和13中给出的核酸序列编码。还可以参见实施例16的UGT91D2变体,例如在氨基酸残基206、207和343含有取代的变体。
正如以上表明的,本文中被指定为SM12UGT的UGTs可以替代UGT91D2。合适的SM12UGT多肽包括圆叶牵牛(Ipomoeapurpurea)(日本牵牛花)产生的和Moritaetal.PlantJ.42,353-363(2005)中描述的那些。SEQIDNO:76中给出了编码圆叶牵牛IP3GGT多肽的氨基酸序列。SEQIDNO:77是经过密码子优化用于在酵母菌中表达的编码SEQIDNO:76的多肽的核苷酸序列。另一个合适的SM12UGT多肽是含有R25S突变的Bp94B1多肽。参见Osmanietal.PlantPhys.148:1295-1308(2008)和Sawadaetal.J.Biol.Chem.280:899-906(2005)。SEQIDNO:78中给出了编码雏菊(Bellisperennis)(红色雏菊)UGT94B1多肽的氨基酸序列。SEQIDNO:79是经过密码子优化用于在酵母菌中表达的编码SEQIDNO:78的多肽的核苷酸序列。
在一些实施方案中,为了产生莱鲍迪苷A,将重组微生物生长在含有甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-19-O-葡萄糖苷的培养基上。在这种实施方案中,微生物含有并表达编码活性UGT91D2、活性UGT74G1和活性UGT76G1的基因,并且能够在培养基中饲喂甜菊醇、一或两种甜菊醇单糖苷或甜叶悬钩子苷时产生莱鲍迪苷A。
在其它实施方案中,为了产生莱鲍迪苷A,将重组微生物生长在含有甜叶悬钩子苷的培养基中。在这种实施方案中,微生物含有并表达编码活性UGT91D2和活性UGT76G1的基因,并且能够在培养基中饲喂甜叶悬钩子苷时产生莱鲍迪苷A。
在其它实施方案中,重组微生物表达一或多个参与甜菊醇生物合成的基因,例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此,例如,除了UGT74G1、UGT85C2、UGT91D2基因,还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物不需要在培养基中包含甜菊醇即可产生莱鲍迪苷A。
在一些实施方案中,重组微生物还含有并表达重组GGPPS基因从而提供水平增加的二萜前体香叶基香叶基焦磷酸,提高经过莱鲍迪苷A生物合成途径的流量。在一些实施方案中,重组微生物还包含并表达参与二萜生物合成或者类萜前体产生的重组基因,例如以下讨论的MEP或MEV途径中的基因。
B.3杜尔可苷A和莱鲍迪苷C生物合成多肽
莱鲍迪苷C和/或杜尔可苷A的生物合成涉及葡糖基化和糖苷配基甜菊醇的鼠李糖基化。具体来说,形成杜尔可苷A可以通过甜菊醇中13-OH的葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’的鼠李糖基化形成1,2鼠李二糖苷,以及1,2鼠李二糖苷中C-19羧基的葡糖基化。每个糖基化反应的顺序可以变化。参见图2B。
已经发现,重组宿主中甜菊醇转化为杜尔可苷A可以通过表达编码以下活性UGTs:85C2、91D2和74G1的基因来实现。因此,表达这三种UGTs和鼠李糖合成酶的重组微生物可以在培养基中饲喂甜菊醇时产生杜尔可苷A。替代地,表达两种UGTs,91D2和74G1以及鼠李糖合成酶的重组微生物在被培养基中饲喂单糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷或甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时能够产生杜尔可苷A。类似地,实现重组微生物中甜菊醇到莱鲍迪苷C的转化可以通过在饲喂甜菊醇时表达编码UGTs85C2、91D2、74G1和76G1以及鼠李糖合成酶的基因;在饲喂甜菊醇-13-O-葡萄糖苷时,表达编码UGTs91D2、74G1和76G1以及鼠李糖合成酶的基因;在饲喂甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时表达编码UGTs85C2、91D2和76G1以及鼠李糖合成酶的基因;或者在饲喂甜叶悬钩子苷时,表达编码UGTs91D2和76G1以及鼠李糖合成酶的基因。一般来说,这些基因中的一或多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的微生物中的重组基因。
合适的UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2多肽包括本文讨论的活性UGT多肽。鼠李糖合成酶给甜菊醇化合物受体的鼠李糖基化提供了更多量的UDP-鼠李糖供体。合适的鼠李糖合成酶包括拟南芥产生的那些,比如拟南芥RHM2基因的产物。
在一些实施方案中,UGT79B3多肽替换了UGT91D2多肽。合适的UGT79B3多肽包括拟南芥产生的那些,它们能够将甜菊醇13-O-单糖苷体外鼠李糖基化。拟南芥UGT79B3可以将葡糖基化的化合物鼠李糖基化形成1,2-鼠李糖苷。SEQIDNO:150中给出了拟南芥UGT79B3的氨基酸序列。SEQIDNO:151中给出了编码SEQIDNO:150的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中,可以在提供适当的UDP-糖或无细胞系统来再生UDP-糖的情况下体外产生莱鲍迪苷C。参见例如,“Anintegratedcell-freemetabolicplatformforproteinproductionandsyntheticbiology”byJewettMC,CalhounKA,VoloshinA,WuuJJandSwartzJRinMolecularSystemsBiology,4,article220(2008)。反应可以同时或者分步进行。例如,可以由甜叶悬钩子苷,加入化学计算量的UDP-鼠李糖和UGT91d2e,然后加入UGT76G1和过量或的计算量的UDP-葡萄糖来产生莱鲍迪苷C。在一些实施方案中,利用磷酸酶来去除次级产物和提高反应产量。
在其它实施方案中,重组宿主表达一或多个参与甜菊醇生物合成的基因,例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此,例如除了UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2基因和UGT76G1基因,还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物,无需在培养基中包含甜菊醇即可产生莱鲍迪苷C。此外,重组宿主一般还表达编码鼠李糖合成酶的内源或重组基因。这样的基因可用于给甜菊醇化合物受体的鼠李糖基化提供更多的UDP-鼠李糖供体。合适的鼠李糖合成酶包括拟南芥产生的那些,比如拟南芥RHM2基因的产物。
本领域技术人员可以认识到通过调整不同UGT基因的相对表达水平以及UDP-鼠李糖的可得性,可以使重组宿主适合以所需比例特异地产生甜菊醇和甜菊糖苷产物。甜菊醇生物合成基因和甜菊糖苷生物合成基因的转录调控可以利用本领域已知技术,结合转录的活化和抑制来实现。对于体外反应,本领域技术人员可以认识到,加入不同水平的UGT酶组合或者在会影响组合中不同UGTS相对活性的条件下,会使合成反应朝向每种甜菊糖苷按照所需比例的方向进行。
在一些实施方案中,为了提供更高水平的二萜前体香叶基香叶基焦磷酸,重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因,以便提高经莱鲍迪苷A生物合成途径的流量。在一些实施方案中,重组宿主还含有基因构建体用于沉默或者减少消耗香叶基香叶基焦磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼焦磷酸的非甜菊醇途径的表达,从而提供增加的经甜菊醇和甜菊糖苷生物合成途径的流量。例如,可以通过下调ERG9基因减少向固醇产生途径(比如麦角固醇)的流量。在产生赤霉素的细胞中,可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在类胡萝卜素-产生生物中,通过下调一或多个类胡萝卜素生物合成基因可以提高到甜菊醇的流量。
在一些实施方案中,重组宿主还含有并表达参与二萜生物合成或者萜类前体的产生的重组基因,例如以下讨论的MEP或MEV途径中的基因。
在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的甜菊糖苷组合物含有占总的甜菊糖苷至少15%以上的莱鲍迪苷C,例如至少20%莱鲍迪苷C、30-40%莱鲍迪苷C、40-50%莱鲍迪苷C、50-60%莱鲍迪苷C、60-70%莱鲍迪苷C、70-80%莱鲍迪苷C、80-90%莱鲍迪苷C。在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的甜菊糖苷组合物含有至少90%莱鲍迪苷C,例如90-99%莱鲍迪苷C。其它存在的甜菊糖苷可能包括图2A和B中示意的那些,比如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、甜菊醇鼠李二糖苷、莱鲍迪苷A和杜尔可苷A。在一些实施方案中,宿主产生的富含莱鲍迪苷C的组合物可以进一步纯化,然后这样纯化的莱鲍迪苷C或杜尔可苷可以与其它甜菊糖苷、调味品或甜味剂混合从而得到所需的调味系统或者甜味组合物。例如,重组微生物产生的富含莱鲍迪苷C的组合物可以与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、F或D的组合物;与从甜菊提取物纯化的鲍迪苷A、F或;或者与体外产生的莱鲍迪苷A、F或D合并。
B.4莱鲍迪苷E和莱鲍迪苷D生物合成多肽
莱鲍迪苷E和/或莱鲍迪苷D的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化。具体来说,形成莱鲍迪苷E可以通过甜菊醇中13-OH的葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化形成甜菊醇-1,2-二糖苷、1,2-二糖苷中C-19羧基的葡糖基化形成1,2-甜菊苷和1,2-甜菊苷中19-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化形成莱鲍迪苷E。莱鲍迪苷D可以通过莱鲍迪苷E中C-13-O-葡萄糖的C-3’的葡糖基化形成。每个糖基化反应发生的顺序可以不同。例如,19-O-葡萄糖的C-2’的葡糖基化可以是途径中的最后一个步骤,其中莱鲍迪苷A是途径中的中间产物。参见图2C。
已经发现,重组宿主中甜菊醇转化为莱鲍迪苷D可以通过表达编码以下活性UGTs:85C2、91D2和74G1和76G1的基因来实现。因此,表达这四种UGTs的重组微生物可以在培养基中饲喂甜菊醇时产生莱鲍迪苷D。替代地,表达两种活性UGTs91D2和76G1的重组微生物在被培养基中饲喂甜叶悬钩子苷或1,2-甜菊苷时能够产生莱鲍迪苷D。作为另一种替代方法,表达三种活性UGTs74G1、91D2和76G1的重组微生物可以通过在培养基中饲喂单糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷来产生莱鲍迪苷D。类似地,实现重组微生物中甜菊醇-19-O-葡萄糖苷到莱鲍迪苷D的转化可以通过在饲喂甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时表达编码UGTs85C2、91D2和76G1的基因。一般来说,这些基因中的一或多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的微生物中的重组基因。
合适的UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2多肽包括本文讨论的功能性UGT多肽。在一些实施方案中,正如以上讨论过的,UGT79B3多肽替代了UGT91。
在一些实施方案中,可以在提供适当的UDP-糖或无细胞系统来再生UDP-糖的情况下体外产生莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。参见例如JewettMCetal.MolecularSystemsBiology,Vol.4,article220(2008)。反应可以同时或者分步进行。例如,可以由商品的富含莱鲍迪苷A的提取物或经过生物合成产生的莱鲍迪苷A,加入化学计算量或过量的UDP-葡萄糖和UGT91D2e来产生莱鲍迪苷D。在一些实施方案中,利用磷酸酶来去除次级产物和提高反应产量。
本领域技术人员可以认识到通过调整不同UGT基因的相对表达水平,可以使重组宿主适合以所需比例特异地产生甜菊醇和甜菊糖苷产物。甜菊醇生物合成基因和甜菊糖苷生物合成基因的转录调控可以利用本领域已知技术,结合转录的活化和抑制来实现。对于体外反应,本领域技术人员可以认识到,加入不同水平的UGT酶组合或者在会影响组合中不同UGTS相对活性的条件下,会使合成反应朝向每种甜菊糖苷按照所需比例的方向进行。本领域技术人员可以认识到,使用对19-O-葡萄糖苷反应比对13-O-葡萄糖苷反应(底物莱鲍迪苷A和甜菊苷)有更高活性的二糖基化酶,可以得到更高比例的莱鲍迪苷D或E,或者更有效地转化为莱鲍迪苷D或E。
在其它实施方案中,重组宿主表达一或多个参与甜菊醇生物合成的基因,例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此,例如除了UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2基因和UGT76G1基因,还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物,无需在培养基中包含甜菊醇即可产生莱鲍迪苷E和D。
在一些实施方案中,为了提供更高水平的二萜前体香叶基香叶基焦磷酸,重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因,以便提高经甜菊醇生物合成途径的流量。在一些实施方案中,重组宿主还含有基因构建体用于沉默或者减少消耗香叶基香叶基焦磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼焦磷酸的非甜菊醇途径的表达,从而提供增加的经甜菊醇和甜菊糖苷生物合成途径的流量。例如,可以通过下调ERG9基因减少向固醇产生途径(比如麦角固醇)的流量。在产生赤霉素的细胞中,可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在类胡萝卜素-产生生物中,通过下调一或多个类胡萝卜素生物合成基因可以提高向甜菊醇的流量。在一些实施方案中,重组宿主还含有并表达参与二萜生物合成或类萜前体的产生的重组基因,例如以下讨论的MEP或MEV途径中的基因。
在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的富含莱鲍迪苷D的组合物含有占总的甜菊糖苷重量至少3%以上的莱鲍迪苷D,例如至少4%莱鲍迪苷D、至少5%莱鲍迪苷D、至少10-20%莱鲍迪苷D、至少30-40%莱鲍迪苷D、40-50%莱鲍迪苷D、50-60%莱鲍迪苷C、60-70%莱鲍迪苷C、70-80%莱鲍迪苷D。在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的甜菊糖苷组合物含有至少90%莱鲍迪苷D,例如90-99%莱鲍迪苷C。其它存在的甜菊糖苷可能包括图2C中示意的那些,比如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷E和甜菊苷。在一些实施方案中,宿主(例如微生物)产生的富含莱鲍迪苷D的组合物可以进一步纯化,然后这样纯化的莱鲍迪苷莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E可以与其它甜菊糖苷、调味品或甜味剂混合从而得到所需的调味系统或者甜味组合物。例如,重组微生物产生的富含莱鲍迪苷D的组合物可以与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、C或F的组合物;与从甜菊提取物纯化的鲍迪苷A、F或C;或者与体外产生的莱鲍迪苷A、F或C合并。
B.5莱鲍迪苷F生物合成多肽
莱鲍迪苷F的生物合成涉及糖苷配基甜菊醇的葡糖基化和木糖基化。具体来说,莱鲍迪苷F可以如下形成:甜菊醇中13-OH葡糖基化形成甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷中13-O-葡萄糖的C-2’木糖基化形成甜菊醇-1,2-木二糖苷、该1,2-木二糖苷中的C-19羧基葡糖基化形成1,2-甜菊木糖苷、1,2-甜菊木糖苷中C-13-O-葡萄糖的C-3’葡糖基化形成莱鲍迪苷F。每个糖基化反应发生的顺序可以不同。参见图2D。
已经发现,重组宿主中甜菊醇转化为莱鲍迪苷F可以通过表达编码以下活性UGTs:85C2、91D2和74G1和76G1的基因,以及内源或者重组表达的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶来实现。因此,表达这四种UGTs以及以及内源或者重组UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶的重组微生物可以在培养基中饲喂甜菊醇时产生莱鲍迪苷F。替代地,表达两种活性UGTs91D2和76G1的重组微生物在培养基中饲喂甜叶悬钩子苷时能够产生莱鲍迪苷F。作为另一种替代方法,表达活性UGT76G1的重组微生物可以通过在培养基中饲喂1,2甜菊醇鼠李糖苷来产生莱鲍迪苷F。作为另一种替代方法,表达三种活性UGTs74G1、91D2和76G1的重组微生物可以通过在培养基中饲喂单糖苷、甜菊醇-13-O-葡萄糖苷来产生莱鲍迪苷F。类似地,实现重组微生物中甜菊醇-19-O-葡萄糖苷到莱鲍迪苷F的转化可以通过在饲喂甜菊醇-19-O-葡萄糖苷时表达编码UGTs85C2、91D2和76G1的基因。一般来说,这些基因中的一或多个是已经被转化到天然情况下不具备这些基因的微生物中的重组基因。
合适的UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1和UGT85C2多肽包括本文讨论的活性UGT多肽。在一些实施方案中,正如以上讨论过的,UGT79B3多肽替换了UGT91。UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶给甜菊醇化合物受体的木糖基化提供了更多量的UDP-木糖供体。合适的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶包括拟南芥或新型隐球菌产生的那些。例如合适的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶多肽分别由拟南芥UGD1基因和UXS3基因编码。参见OkaandJigami,FEBSJ.273:2645-2657(2006)。
在一些实施方案中,可以在提供适当的UDP-糖或无细胞系统来再生UDP-糖的情况下体外产生莱鲍迪苷F。参见例如JewettMCetal.MolecularSystemsBiology,Vol.4,article220(2008)。反应可以同时或者分步进行。例如,可以由甜叶悬钩子苷,加入化学计算量的UDP-木糖和UGT91D2e,随后加入过量或者化学计算量的UDP-葡萄糖来产生莱鲍迪苷F。在一些实施方案中,利用磷酸酶来去除次级产物和提高反应产量。
在其它实施方案中,重组宿主表达一或多个参与甜菊醇生物合成的基因,例如CDPS基因、KS基因、KO基因和/或KAH基因。因此,例如除了UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2基因和UGT76G1基因,还含有CDPS基因、KS基因、KO基因和KAH基因的微生物,无需在培养基中包含甜菊醇即可产生莱鲍迪苷F。此外,重组宿主一般还表达编码UDP-葡萄糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶的内源或重组基因。这些酶可以用于给甜菊醇化合物受体的木糖基化提供更多量的UDP-木糖供体。合适的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶包括拟南芥或新型隐球菌产生的那些。例如合适的UDP-葡糖脱氢酶和UDP-葡糖醛酸脱羧酶多肽分别由拟南芥UGD1基因和UXS3基因编码。参见OkaandJigami,FEBSJ.273:2645-2657(2006)。
本领域技术人员可以认识到通过调整不同UGT基因的相对表达水平和调整UDP-木糖的可得性,可以使重组宿主适合以所需比例特异地产生甜菊醇和甜菊糖苷产物。甜菊醇生物合成基因的转录调控可以利用本领域已知技术,结合转录的活化和抑制来实现。对于体外反应,本领域技术人员可以认识到,加入不同水平的UGT酶组合或者在会影响组合中不同UGTS相对活性的条件下,会使合成反应朝向每种甜菊糖苷按照所需比例的方向进行。
在一些实施方案中,为了提供更高水平的二萜前体香叶基香叶基焦磷酸,重组宿主还含有并表达重组GGPPS基因,以便提高经甜菊醇生物合成途径的流量。在一些实施方案中,重组宿主还含有基因构建体用于沉默或者减少消耗香叶基香叶基焦磷酸、对映-异贝壳杉烯酸或法尼焦磷酸的非甜菊醇途径的表达,从而提供增加的经甜菊醇和甜菊糖苷生物合成途径的流量。例如,可以通过下调ERG9基因减少向固醇产生途径(比如麦角固醇)的流量。在产生赤霉素的细胞中,可以下调赤霉素合成来提高对映-异贝壳杉烯酸到甜菊醇的流量。在类胡萝卜素-产生生物中,通过下调一或多个类胡萝卜素生物合成基因可以提高向甜菊醇的流量。在一些实施方案中,重组宿主还含有并表达参与二萜生物合成的重组基因,例如以下讨论的MEP途径中的基因。
在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的富含莱鲍迪苷F的组合物含有占总的甜菊糖苷重量至少4%以上的莱鲍迪苷F,例如至少5%莱鲍迪苷F、至少6%莱鲍迪苷F、至少10-20%莱鲍迪苷F、至少30-40%莱鲍迪苷F、40-50%莱鲍迪苷F、50-60%莱鲍迪苷F、60-70%莱鲍迪苷F、70-80%莱鲍迪苷F。在一些实施方案中,重组宿主(比如微生物)产生的甜菊糖苷组合物含有至少90%莱鲍迪苷F,例如90-99%莱鲍迪苷F。其它存在的甜菊糖苷可能包括图2A和D中示意的那些,比如甜菊醇单糖苷、甜菊醇葡糖二糖苷、甜菊醇木二糖苷s、莱鲍迪苷A、甜菊醇木糖苷、甜叶悬钩子苷和甜菊苷。在一些实施方案中,宿主产生的富含莱鲍迪苷F的组合物可以与其它甜菊糖苷、调味品或甜味剂混合从而得到所需的调味系统或者甜味组合物。例如,重组微生物产生的富含莱鲍迪苷F的组合物可以与不同重组微生物产生的富含莱鲍迪苷A、C或D的组合物;与从甜菊提取物纯化的鲍迪苷A、C或D;或者与体外产生的莱鲍迪苷A、C或D合并。
C.其它多肽
还可以给重组宿主导入那些其表达能够便于更有效或更大规模地产生甜菊醇或甜菊糖苷的其它多肽的基因。例如,重组微生物、植物或植物细胞还可以含有一或多个编码香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS,又被称为GGDPS)的基因。作为另一个例子,重组宿主可以含有一或多个编码鼠李糖合成酶的基因,或者一或多个编码UDP-葡糖脱氢酶和/或UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。作为另一个例子,重组宿主还含有一或多个编码细胞色素P450还原酶(CPR)的基因。重组CPR的表达有助于NADP+循环再生为NADPH,后者是类萜生物合成中的辅因子。也可以利用其它方法来再生NADHP水平。在NADPH有限的情况下,可以将菌株进一步改造以包含外源的转氢酶基因。参见例如,Saueretal.,J.Biol.Chem.279:6613-6619(2004)。能够减少或者以其它方式改变NADH/NADPH比率,从而提高所需辅因子的水平的其它方法是本领域技术人员已知的。
作为另一个例子,重组宿主可以含有一或多个编码参与MEP途径或甲羟戊酸途径的酶的基因。这些基因是有用的,因为它们能够提高碳向二萜生物合成途径的流量,从而由所述途径产生的异戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙焦磷酸生成香叶基香叶基焦磷酸。由于甜菊醇生物合成多肽和甜菊糖苷生物合成多肽的表达,这样产生的香叶基香叶基焦磷酸可以被引导向甜菊醇和甜菊糖苷生物合成。
C.1MEP生物合成多肽
在一些实施方案中,重组宿主含有一或多个编码参与类异戊二烯生物合成的甲基赤藓糖醇4-磷酸(MEP)途径的酶的基因。MEP途径中的酶包括脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合酶(MCS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)和1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)。可以将一或多个DXS基因、DXR基因、CMS基因、CMK基因、MCS基因、HDS基因和/或HDR基因引入重组微生物。参见Rodríguez-ConcepciónandBoronat,PlantPhys.130:1079-1089(2002).
编码DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDS和/或HDR多肽的合适基因包括大肠杆菌、拟南芥和聚球藻(Synechococcusleopoliensis)产生的那些。在例如美国专利7,335,815中描述了编码DXR多肽的核苷酸序列。
C.2甲羟戊酸生物合成多肽
在一些实施方案中,重组宿主含有一或多个编码参与类异戊二烯生物合成中甲羟戊酸途径的酶的基因。适合转化到宿主中的基因编码甲羟戊酸途径中的酶,比如截短的3-羟基-3-甲基-戊二酰(HMG)-CoA还原酶(tHMG);和/或编码甲羟戊酸激酶(MK)的基因;和/或编码磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)的基因;和/或编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPPD)的基因。因此,可以给重组宿主(比如微生物)引入一或多个HMG-CoA还原酶基因、MK基因、PMK基因和/或MPPD基因。
合适的编码甲羟戊酸途径多肽的基因是已知的。例如,合适的多肽包括大肠杆菌、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)、酿酒酵母、拟南芥、Kitasatosporagriseola、智人、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、原鸡(Gallusgallus)、链霉菌KO-3988、渐窄叶烟草(Nicotianaattenuate)、Kitasatosporagriseola、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)和雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)产生的那些。参见例如,美国专利7,183,089、5,460,949和5,306,862。
D.功能同源物
以上描述的多肽的功能同源物也适合用于在重组宿主中产生甜菊醇或甜菊糖苷。功能同源物是与参照多肽具有序列相似性,并且可以执行参照多肽的一或多项生化或生理功能的多肽。功能同源物和参照多肽可以是天然多肽,它们的序列相似性可能是由于趋同或趋异进化事件。因此,功能同源物在文献中有时被称为同源物或者直系同源物或旁系同源物。天然功能同源物的变体,比如由野生型编码序列的突变体编码的多肽可能自身就是功能同源物。还可以通过对多肽的编码序列进行定点突变,或者通过将来自不同天然多肽的编码序列的结构域合并(“结构域互换domainswapping”)来形成功能同源物。用于修饰编码本文描述的活性UGT多肽的基因的技术是已知的,包括尤其是定向进化技术、定点突变技术和随机突变技术,可以用于以希望的方式提高多肽的比活、改变底物特异性、改变表达水平、改变亚细胞定位或者改变多肽:多肽相互作用。这类修饰过的多肽被认为是功能同源物。术语“功能同源物”有时用于指编码功能上同源的多肽的核酸。
通过对核苷酸和多肽序列比对的分析可以鉴定功能同源物。例如,对核苷酸或多肽序列数据库进行查询可以鉴定到甜菊醇或甜菊糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及用GGPPS、CDPS、KS、KO或KAH氨基酸序列作为参照序列,对非冗余数据库进行的BLAST、ReciprocalBLAST或PSI-BLAST分析。某些情况中,氨基酸序列是从核苷酸序列推测出的。数据库中那些具有40%以上序列同一性的多肽是进一步评估是否适合作为甜菊醇或甜菊糖苷生物合成多肽的候选分子。氨基酸序列同一性允许保守性氨基酸取代,比如用一个疏水残基取代另一个,或者一个极性残基取代另一个。如果需要,可以对这类候选物进行人工检查,以便缩小需要进一步评估的候选物的数量。人工检查可以通过选择似乎具有甜菊醇生物合成多肽中存在的结构域(例如保守的功能结构域)的那些候选物来进行。
保守区的鉴定可以通过找出甜菊醇或甜菊糖苷生物合成多肽的氨基酸一级序列中那些重复序列、形成某些二级结构(例如螺旋和β折叠)、形成带正电或负电的结构域、或者代表蛋白基元或结构域的区域。参见例如,描述多种蛋白基元和结构域的共有序列,位于sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/的Pfam网站。Pfam数据库中包含的信息在Sonnhammeretal.,Nucl.AcidsRes.,26:320-322(1998)、Sonnhammeretal.,Proteins,28:405-420(1997)和Batemanetal.,Nucl.AcidsRes.,27:260-262(1999)中有描述。保守区还可以通过将来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列进行比对来确定。密切相关的物种优选来自相同的家族。在一些实施方案中,来自两个不同物种的序列的比对是足够的。
一般来说,显示出至少约40%氨基酸序列特异性的多肽可以用于保守区的鉴定。相关多肽的保守区显示至少45%的氨基酸序列同一性(例如,至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中,保守区显示至少92%、94%、96%、98%或99%的氨基酸序列特异性。
例如,适合用于在重组宿主中生产甜菊糖苷的多肽包括UGT91D2e、UGT91D2m、UGT85C和UGT76G的功能同源物。这类同源物与UGT91D2e(SEQIDNO:5)、UGT91D2m(SEQIDNO:10)、UGT85C(SEQIDNO:3)或UGT76G(SEQIDNO:7)的氨基酸序列具有90%以上(例如至少95%或99%)的序列同一性。UGT91D2、UGT85C和UGT76G多肽的变体在氨基酸一级序列中一般有10个或更少的氨基酸取代,例如7个或更少的氨基酸取代、5个或更少的保守氨基酸取代、或者1-5个取代。但在一些实施方案中,UGT91D2、UGT85C和UGT76G多肽的变体可以含有10个或更多个氨基酸取代(例如10、15、20、25、30、35、10-20、10-35、20-30或25-35个氨基酸取代)。取代可能是保守的,或者在一些实施方案中,是非保守性的。UGT91D2e多肽中的非保守性变化的非限制性例子包括甘氨酸->精氨酸和色氨酸->精氨酸。UGT76G多肽中的非保守性取代的非限制性例子包括缬氨酸->谷氨酸、甘氨酸->谷氨酸、谷氨酰胺->丙氨酸和丝氨酸->脯氨酸。UGT85C多肽中的变化的非限制性例子包括组氨酸->天冬氨酸、脯氨酸->丝氨酸、赖氨酸->苏氨酸和苏氨酸->精氨酸。
在一些实施方案中,有用的UGT91D2同源物可以在预测的环以外的多肽区域含有氨基酸取代(例如,保守性氨基酸取代),例如SEQIDNO:5中的残基20-26、39-43、88-95、121-124、142-158、185-198和203-214是预测的N末端结构域中的环,残基381-386是预测的C末端结构域中的环。例如,有用的UGT91D2同源物可以在SEQIDNO:5中的残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473包含至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中,UGT91D2同源物可以在SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基含有氨基酸取代。例如,UGT91D2功能同源物可以在SEQIDNO:5中残基206、207和343中的一或多个含有氨基酸取代,比如位于残基206的精氨酸、残基207的半胱氨酸和残基343的精氨酸。参见SEQIDNO:95。UGT91D2的其它功能同源物可以含有下述中的一或多个:位于SEQIDNO:5的残基30的酪氨酸或苯丙氨酸、残基93的脯氨酸或谷氨酰胺、残基99的丝氨酸或缬氨酸、残基122的酪氨酸或苯丙氨酸、残基140的组氨酸或酪氨酸、残基142的丝氨酸或半胱氨酸、残基148的丙氨酸或苏氨酸、残基152的甲硫氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丙氨酸或丝氨酸、残基162的甘氨酸、残基195的亮氨酸或甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的赖氨酸或谷氨酸、残基211的亮氨酸或甲硫氨酸、残基213的亮氨酸、残基221的丝氨酸或苯丙氨酸、残基253的缬氨酸或异亮氨酸、残基286的缬氨酸或丙氨酸、残基427的赖氨酸或天冬酰胺、残基438的丙氨酸以及残基462的丙氨酸或苏氨酸。参见,实施例11和16以及表12和14。还可以在图8列出的序列比对的基础上构建有用的变体UGT91D2多肽。
在一些实施方案中,有用的UGT85C同源物可以含有位于SEQIDNO:3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。有用的UGT85C同源物的非限制性例子包括这样的多肽,所述多肽含有(相对SEQIDNO:3)位于残基65的取代;位于残基65结合残基15、270、418、440或441;位于残基13、15、60、270、289和418的取代;位于残基13、60和270的取代;位于残基60和87的取代;位于残基65、71、220、243和270的取代;位于残基65、71、220、243、270和441的取代;位于残基65、71、220、389和394的取代;位于残基65、71、270和289的取代;位于残基220、243、270和334的取代;或者位于残基270和289的取代。参见实施例17和表15。
在一些实施方案中,有用的UGT76G同源物可以含有位于SEQIDNO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。有用的UGT76G同源物的非限制性例子包括这样的多肽,所述多肽含有(相对SEQIDNO:7)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208和291;残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285和291;或者残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的取代。参见实施例18和表16。
改造例如UGT91D2e的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的,包括但不限于定点/理性突变手段、随机定向进化手段和组合方法,其中在酶的活性部分附近进行随机突变/饱和技术。参见例如SarahA.Osmani,etal.Phytochemistry70(2009)325-347。
候选序列一般长度是参照序列长度的80%-200%,例如参照序列长度的82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190或200%。任一种候选核酸或多肽相对参照核酸或多肽的同一性百分比可以如下确定。使用计算机程序ClustalW(1.83版本,缺省参数)可以将参选序列(例如,核酸序列或氨基酸序列)与一或多个候选序列进行比对,该程序使核酸或多肽序列能够在整个长度上进行比对(全局比对)。Chennaetal.,Nucl.AcidsRes.,31(13):3497-500(2003)。
ClustalW计算参照和一或多个候选序列之间的最佳匹配,并将它们对位排列,从而可以确定同一性、相似性和差异。可以给参照序列、候选序列或者两者插入一或多个残基缺口以实现序列对位排列的最大化。对于核酸序列的逐对比对,使用以下缺省参数:序列长度:2;窗口大小:4;打分方法:百分比;topdiagonals的数量:4和空位罚分:5。对于核酸序列的多重比对,使用以下参数:空位设置罚分:10.0;空位延伸罚分:5.0和加权转换:是。对于蛋白序列的快速逐对比对,使用以下参数:序列长度:1;窗口大小:5;打分方法:百分比;topdiagonals的数量:5;空位罚分:3。对于蛋白序列的多重比对,使用以下参数:加权矩阵:Blosum;空位设置罚分:10.0;空位延伸罚分:0.05;亲水性空位:开;亲水性残基:Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys;残基特异性空位罚分:开。ClustalW的输出是反映序列之间的关系的序列比对。ClustalW可以在例如BaylorCollegeofMedicineSearchLauncher互联网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和EuropeanBioinformaticsInstitute互联网站(ebi.ac.uk/clustalw)使用。
为了确定候选核酸或氨基酸序列与参照序列的同一性百分比,将序列用ClustalW进行比对,比对中相同匹配的数量除以参照序列的长度,结果乘以100。注意可以将同一性百分比数值取到最近的十分位。例如,78.11、78.12、78.13和78.14舍到78.1,而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19入到78.2。
可以理解,活性UGT91D2多肽可以包含不参与葡糖基化或者UGT91D2执行的其它酶活性的额外氨基酸,因此这样的多肽比不含额外氨基酸的更长。例如,UGT91D2多肽可以包含纯化标签、叶绿体转运肽、线粒体转运肽、造粉体肽、信号肽或者添加在氨基或羧基端的分泌标签。在一些实施方案中,UGT91D2多肽包含具有报告分子作用的氨基酸序列,例如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
II.甜菊醇和甜菊糖苷生物合成核酸
编码本文描述的多肽的重组基因包含所述多肽的编码序列,该序列与适合多肽的表达的一或多个调控区按照有义方向可操纵地连接。因为许多微生物能够由多顺反子mRNA表达出多种基因产物,因此如果需要,可以将这些微生物在单一调控区的控制下表达多种多肽。当调控区和编码序列的位置使得调控区能够有效地调节所述序列的转录或翻译时,该编码序列和调控区被认为是可操纵地连接。一般来说,对于单顺反子基因,编码序列的翻译读框的翻译起始位点位于调控区下游1到约50个核苷酸之间。
许多情况中,本文描述的多肽的编码序列是在重组宿主以外的物种中鉴定到的,即编码序列是外源核酸。因此,如果重组宿主是微生物,编码序列可以来自其它原核或真核微生物、植物或动物。然而在一些情况中,编码序列是宿主先天具有的被重新导入该生物的序列。先天序列与天然存在的序列常常可以通过与外源核酸连接的不是先天的序列来区分,例如重组核酸构建体中先天序列侧翼的非先天的调控序列。此外,稳定转化的外源核酸一般整合到先天序列的正常位点之外的位点。
“调控区”是指含有会影响转录或翻译的起始和速率,以及转录或反应产物的稳定性和/或迁移性的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于,启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白识别位点、可诱导性元件、蛋白结合序列、5′和3′非翻译区(UTRs)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子以及它们的组合。调控区一般包含至少一个核心(基础)启动子。调控区还可以包含至少一个调控元件,比如增强子序列、上游元件或者上游激活区(UAR)。通过安排调控区与编码序列的位置使得调控区能够有效地调节序列的转录或翻译,从而调控区可操纵地连接编码序列。例如,为了可操纵地连接编码序列和启动子序列,编码序列的翻译读框的翻译起始位点一般位于启动子下游的1到约50个核苷酸之间。但调控区也可能被安排在翻译起始位点上游最多约5000个核苷酸,或者转录起始位点上游约2000核苷酸的位置。
对要包含的调控区的选择取决于几个因素,包括但不限于效率、可选择性、可诱导性、希望的表达水平,以及在某些培养阶段优先表达的特性。对本领域技术人员来说,通过恰当地选择调控区和安排调控区相对编码序列的位置来调整编码序列的表达是一项常规操作。可以理解可能存在一个以上的调控区,例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和可诱导性元件。
可以将一或多个基因组合在一起形成重组核酸构建体中的“模块(modules)”,用于甜菊醇和/或甜菊糖苷生产的一个独立方面。在模块中组合复数个基因,特别是多顺反子模块便于在多种物种中使用所述模块。例如,可以将甜菊醇生物合成基因簇或者UGT基因簇合并在多顺反子模块中,从而使得在插入合适的调控区后,能够将模块导入众多的物种。作为另一个例子,可以将UGT基因簇合并,使每个UGT编码序列可操纵地连接独立的调控区从而形成UGT模块。这样的模块可以用在那些必须或者希望单顺反子表达的物种中。除了对甜菊醇或甜菊糖苷产生有用的基因,重组构建体一般还含有复制原点和一或多个选择标记用于将构建体保持在合适的物种中。
可以理解,由于遗传密码的简并性,许多核酸可以编码某个特定多肽,即对于许多氨基酸,有一个以上的核苷酸三联体可以作为该氨基酸的密码子。因此,利用特定宿主(例如,微生物)的密码子偏向性表格,可以将给定多肽的编码序列中的密码子进行修饰,从而实现在所述宿主中的最佳表达。SEQIDNOs:18-25、34-36、40-43、48-49、52-55、60-64和70-72给出了编码甜菊醇和甜菊糖苷生物合成的某些酶的核苷酸序列,经过修饰后在酵母中的表达提高。作为分离的核酸,这些经过修饰的序列可以纯化分子的形式存在,也可以整合到载体或病毒中用于构建重组核酸构建体的模块。
在一些情况中,为了将代谢中间体转向甜菊醇或甜菊糖苷生物合成,希望抑制内源多肽的一或多个功能。例如,可能希望通过例如下调鲨烯氧化酶来下调酵母菌株中的固醇合成以便进一步提高甜菊醇或甜菊糖苷产量。作为另一个例子,可能希望抑制某些内源基因产物(例如能够去除次级代谢物的葡萄糖部分的糖基水解酶)的降解功能。作为另一个例子,可以抑制参与甜菊糖苷转运的膜转运蛋白的表达,从而抑制糖基化甜菊苷的分泌。这种调控是有益的,因为可以在微生物的培养过程中将甜菊糖苷的分泌抑制希望的一段时间,从而提高收获时糖苷产物的产量。这种情况中,可以在转化到菌株中的重组构建体中包含能够抑制多肽或基因产物的表达的核酸。替代地,可以利用突变来生成希望抑制其功能的基因的突变体。
III.宿主
A.微生物
有许多原核和真核细胞适用于构建本文描述的重组微生物,例如革兰氏阴性细菌、酵母菌和真菌。首先对选中作为甜菊醇或甜菊糖苷生产菌株的种类和菌株进行分析,确定哪些生产基因对于该菌株是内源的,哪些不存在。菌株中不含有其内源对应基因的那些基因要组织在一或多个重组构建体,然后转化到菌株内以提高缺少的功能。
示范性的原核和真核种类在下文有更详细的描述。但可以理解其它种可能也是合适的。例如,合适的种可能属于选自下述的属:蘑菇属(Agaricus)、曲霉属、芽孢杆菌属、假丝酵母属、棒状杆菌属、埃希氏菌属、镰孢菌/赤霉属、克鲁维酵母属、硫磺菌(Laetiporus)属、香菇(Lentinus)属、发夫酵母(Phaffia)属、平革菌(Phanerochaete)属、毕赤氏酵母属、中欧葫芦藓属、红酵母属(Rhodoturula)、糖酵母属、裂殖酵母属、痂圆孢属(Sphaceloma)、发夫酵母属(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母。来自这些属的示范性的种包括虎皮香菇(Lentinustigrinus)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、巴斯德毕赤酵母、小立碗藓(Physcomitrellapatens)、粘红酵母(Rhodoturulaglutinis)32、Rhodoturulamucilaginosa、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)UBV-AX、红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)、Fusariumfujikuroi/腾仓赤霉、产朊假丝酵母和解脂耶氏酵母。在一些实施方案中,微生物可以是子囊菌,比如腾仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、黑曲霉或者酿酒酵母。在一些实施方案中,微生物可以是原核生物,比如大肠杆菌、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)或者荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)。可以理解某些微生物可以用于以高通量的方式对目的基因进行筛选和测试,而其它微生物因为具有希望的产率或生长特性,可以用于大规模生产甜菊糖苷。
酿酒酵母
酿酒酵母是合成生物学中广泛使用的框架生物,可以作为重组微生物平台。酿酒酵母拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息,因此能够理性设计各种模块来增强产物的产量。制备重组微生物的方法是已知的。
利用多种已知质粒中的任一种一种都可以在酵母中表达甜菊醇生物合成基因簇。过量产生萜类的菌株是已知的,可以用于提高香叶基香叶基焦磷酸的量,以供甜菊醇和甜菊糖苷的生产。
曲霉物种
曲霉属的种,比如米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉是广泛用于食品生产的微生物,也可以作为重组微生物平台。构巢曲霉、烟曲霉、米曲霉、棒曲霉、黄曲霉、黑曲霉和土曲霉的基因组核苷酸序列是已知的,因此能够理性设计和改造内源途径以增强流量和提高产物产量。已经建立了曲霉属的代谢模型,以及转录组学研究和蛋白组学研究。黑曲霉被培养用于工业生产多种食物成分,比如柠檬酸和葡糖酸,因此诸如黑曲霉的种通常适合食品成分,比如甜菊醇和甜菊糖苷的生产。实施例23描述了在构巢曲霉中生产甜菊糖苷的克隆方法学。
大肠杆菌
另一种合成生物学中广泛使用的平台生物大肠杆菌也可以作为重组微生物平台。与糖酵母类似,大肠杆菌拥有可供使用的突变体文库、质粒、代谢的详细计算机模型和其它信息,因此能够理性设计各种模块来增强产物的产量。与以上描述的用于糖酵母属的方法类似的方法可以用来制备重组大肠杆菌微生物。
蘑菇属、赤霉属和平革菌属物种
蘑菇、赤霉和平革菌已知在培养物中可以产生大量的赤霉素,因此可能是有用的。因此用于大量生产甜菊醇和甜菊糖苷的萜烯前体已由内源基因产生了。所以可以将含有甜菊醇或甜菊糖苷生物合成多肽的重组基因的模块导入来自这些属的种,而无需导入甲羟戊酸或MEP途径基因。
红细菌物种
红细菌可以作为重组微生物平台。与大肠杆菌类似,该菌有突变体文库以及合适的质粒载体可供使用,使得可以理性设计各种模块以增加产物产量。红细菌中的膜状细菌种类的类异戊二烯途径经过基因工程化,类胡萝卜素和CoQ10的产量得到了提高。参见美国专利公开20050003474和20040078846。与以上描述的用于大肠杆菌的方法相似的方法可以用于制备重组红细菌微生物。
中欧葫芦藓
中欧葫芦藓属苔藓当生长在悬浮培养液中时,具有与酵母或其它真菌培养物类似的特性。这个属日渐成为重要的细胞类型,用于产生那些难以在其它类型细胞中产生的植物次级代谢物。实施例22描述了在小立碗藓中产生甜菊糖苷途径中的活性UGT酶。
B.植物细胞或植物
在一些实施方案中,本文描述的核酸和多肽被导入植物或植物细胞以提高总的甜菊糖苷产量,或者相对其它甜菊糖苷富集某特定甜菊糖苷的产量。因此,宿主可以是包含至少一个本文描述的重组基因的植物或植物细胞。植物或植物细胞可以通过将重组基因整合到它们的基因组中而被转化,即可以被稳定地转化。被稳定转化的细胞一般在每次细胞分裂时可以保持导入的核酸。植物或植物细胞还可以被瞬时转化,这样重组基因不被整合到基因组中。被瞬时转化的细胞一般在每次细胞分裂时会丢失全部或部分导入的核酸,这样在足够数量的细胞分裂后,子代细胞中不能再检测到导入的核酸。被瞬时转化和稳定转化的转基因植物和植物细胞都可以用于本文描述的方法中。
本文描述的方法中使用的转基因植物细胞可以构成整个植物的部分或全部。可以将这类植物以适合该物种的方式生长在培养室、温室或田野的条件下。可以根据具体目的来培育转基因植物,例如将重组核酸导入其它系、将重组核酸转移到其它种,或者用于进一步选择其它所需性状。替代地,可以对那些适合这类技术的转基因植物进行营养繁殖。用于本文,转基因植物也指开始的转基因植物的后代,如果所述后代继承了转基因。由转基因植物产生的种子可以生长然后自交(或者异型杂交和自交)从而获得对于核酸构建体纯化的种子。
转基因植物可以生长在悬浮培养、或者组织或器官培养中。为了本发明的目的,可以使用固体和/或液体组织培养技术。使用固体培养基时,可以将转基因植物细胞直接放置在培养基上或者放置在滤膜上,然后将滤膜与培养基接触放置。使用液体培养基时,可以将转基因植物细胞放置在助浮装置上,例如与液体培养基接触的带孔的膜。
使用瞬时转化的植物细胞时,可以在转化过程中包含报告序列,然后在转化后的合适时机进行报告序列活性或表达情况的分析,所述报告序列编码具有报告分子活性的报告多肽。进行分析的合适时机一般是转化后约1-21天,例如约1-14天、约1-7天或者约1-3天。对于在不同物种中的快速分析,或者为了确认异源多肽在那些以前不曾被确认可以表达该多肽的特定受体细胞中有表达,使用瞬时法尤其方便。
将核酸导入单子叶和双子叶植物的技术是本领域已知的,包括但不限于农杆菌介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和粒子枪转化(美国专利5,538,880、5,204,253、6,329,571和6,013,863)。如果使用细胞或培养组织作为转化的受体组织,需要时,可以通过本领域技术人员已知的技术,由被转化的培养物再生植物。
可以对转基因植物群进行筛选和/或选择群体中那些具有了由于转基因的表达而被赋予的性状或表型的成员。例如,可以筛选单一转化事件的子代群体中那些具有所需甜菊醇或甜菊糖苷生物合成多肽或核酸表达水平的植物。可以利用物理和生化方法来鉴定表达水平。这些方法包括检测多核苷酸的Southern分析或者PCR扩增;检测RNA转录物的Northern印迹、S1RNase保护法、引物延伸或者RT-PCR扩增;检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶分析法;以及检测多肽的蛋白凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫分析。其它诸如原位杂交、酶染色和免疫染色的技术也可以用于检测多肽和/或核酸的存在与否或者表达情况。所有提及的这些技术的实施方法都是已知的。替代地,可以对包含独立转化事件的植物群体进行筛选以得到那些具有所需性状(比如生产甜菊糖苷或者调控地生物合成甜菊糖苷)的植物。选择和/或筛选可以在一或多个世代,和/或一个以上地理位置进行。在一些情况中,可以将转基因植物在这样的条件下生长和选择,所述条件能够在转基因植物中诱导希望的表型或者以其它方式对产生希望的表现是必须的。此外,可以在植物预期展现出表型的特定发育阶段进行选择和/或筛选。可以进行选择和/或筛选来挑选那些与缺少转基因的对照植物相比,甜菊糖苷水平有显著差异的转基因植物。
本文描述的核酸、重组基因和构建体可以用于转化许多单子叶和双子叶植物和植物细胞系统。合适的单子叶植物的非限制性例子包括,例如诸如大米、黑麦、高梁、小米、小麦、玉米和大麦。植物可以是非谷类单子叶,比如芦笋、香蕉或洋葱。植物还可以是双子叶的,比如甜菊(甜叶菊)、大豆、棉花、向日葵、豌豆、天竺葵、菠菜或烟草。在一些情况中,植物可能含有产生磷酸苯酯的前体途径,比如一般在细胞质和线粒体中可见的甲羟戊酸途径。非甲羟戊酸途径更经常在植物叶绿体中看到[Dubey,etal.,2003J.Biosci.28637-646]。本领域技术人员可以通过使用前导序列将甜菊糖苷生物合成多肽的表达定靶到合适的细胞器,比如使甜菊糖苷生物合成发生在植物细胞中希望的位置。如果需要,本领域技术人员可以使用合适的启动子将合成引导到例如植物的叶子。如果需要,表达还可以发生在组织培养物中,比如愈伤组织培养或毛状根培养。
在一个实施方案中,本文描述的一或多个核酸或多肽被导入到甜菊(例如,甜叶菊)中,从而使得整体甜菊糖苷生物合成被提高或者整个甜菊糖苷组合物被选择性地富集了一或多种特定甜菊糖苷。例如,可以将一或多个重组基因导入甜菊,使得下述中的一或多个得到表达:UGT91D酶,比如UGT91D2e(例如,SEQIDNO:5或其功能同源物)、UGT91D2m(例如SEQIDNO:10);UGT85C酶,比如表15中给出的标题;或者UGT76G1酶,比如实施例18中给出的变体。核酸构建体一般包含与编码UGT多肽的核酸可操纵地连接的合适的启动子(例如35S、e35S或ssRUBISCO启动子)。核酸可以通过农杆菌介导的转化、电穿孔介导的基因转移到叶绿体,或者通过颗粒轰击导入甜菊。参见例如,Singh,etal.,CompendiumofTransgenicCropPlants:TransgenicSugar,TuberandFiber,EditedbyChittaranjanKoleandTimothyC.Hall,BlackwellPublishingLtd.(2008),pp.97-115。对于来源于甜菊叶子的愈伤组织的颗粒轰击,参数如下:6cm距离、1100psi赫压力、金颗粒和一次轰击。
甜菊植物可以按照Singh等(2008,同前)的描述通过体细胞胚发生来再生。具体来说,从5-6周龄体外培养的植物取叶子节段(大概1-2cm长),温育(近轴面朝下)在补充了B5维生素、30g蔗糖和3gGelrite的MS培养基上。可以将2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)与6-苄基腺嘌呤(BA)、激动素(KN)或玉米素组合使用。传代培养8周后出现原胚团。传代培养2-3周内,培养物表面会出现体细胞胚胎。胚可以在含有BA结合2,4-D、a-萘乙酸(NAA)或者吲哚丁酸(IBA)的培养基中成熟。从愈伤组织上切除发芽并形成小苗的成熟体细胞胚胎。待小苗达到3-4周龄后,将苗转移到含有蛭石的盆中,在培养室中生长6-8周以适应环境并转移到温室中。
在一个实施方案中,甜菊糖苷是在大米中产生。利用诸如农杆菌介导的转化的技术可以容易地转化大米和玉米。双元载体系统常用于农杆菌将外源基因导入单子叶植物。参见例如,美国专利6,215,051和6,329,571。在双元载体系统中,一个载体含有包含目的基因(例如本文描述的UGT)的T-DNA区,另一个载体是含有vir区的非致瘤Ti质粒(disarmedTiplasmid)。还可以使用共整合载体和可移动载体。待转化组织的类型和预处理、所用d农杆菌菌株、接种的持续时间、农杆菌引起的过度生长和坏死的预防,可以由本领域技术人员容易地进行调节。可以制备未成熟的大米胚细胞,利用双元载体借助农杆菌进行转化。使用的培养基中补充了酚类化合物。替代地,可以使用植物原位真空渗入进行转化。参见例如,WO2000037663、WO2000063400和WO2001012828。
IV.制备甜菊醇和甜菊糖苷的方法
本文描述的重组宿主可以用于生产甜菊醇或甜菊糖苷的方法中。例如,如果重组宿主是微生物,方法可以包括将重组微生物在适合甜菊醇和/或甜菊糖苷生物合成基因表达的条件下生长在培养基中。重组微生物可以分批培养或者连续培养。一般来说,是将重组微生物在限定的温度下在发酵罐中生长所需的时间。根据方法中使用的具体微生物,还可以含有并表达其它重组基因,比如异戊烯生物合成基因和萜烯合酶。底物和中间产物(例如异戊烯基焦磷酸、二甲基烯丙焦磷酸、香叶基香叶基焦磷酸、异贝壳杉烯和异贝壳杉烯酸)的水平可以通过从培养基中取样按照公开的方法分析来确定。
重组微生物已经在培养基中生长所需的时间后,然后可以利用本领域已知的各种技术从培养物中回收甜菊醇和/或一或多种甜菊糖苷。如果重组宿主是植物或植物细胞,可以利用各种已知技术从植物组织中提取甜菊醇或甜菊糖苷。例如,可以将经过培养的微生物或植物组织的粗裂解物离心以获得上清。然后将得到的上清加样到层析柱(例如C-18柱)中,用水洗来去除亲水性化合物,之后用溶剂(比如甲醇)来洗脱目的化合物。然后可以经由制备HPLC将化合物进一步纯化。还可参见WO2009/140394。
产生的甜菊醇或甜菊糖苷的量可能在约1mg/l-约1,500mg/l,例如约1-约10mg/l、约3-约10mg/l、约5-约20mg/l、约10-约50mg/l、约10-约100mg/l、约25-约500mg/l、约100-约1,500mg/l,或者约200-约1,000mg/l。通常,培养时间越长,产物的量越大。因此,可以将重组微生物培养1天-7天、1天-5天、3天-5天、约3天、约4天或者约5天。
可以理解,本文讨论的各种基因和模块可以存在于两个或更多个重组微生物中,而不是单个微生物中。当使用复数个重组微生物时,可以将它们生长在混合培养物中来产生甜菊醇和/或甜菊糖苷。例如,第一微生物可以包含用于产生甜菊醇的一或多个生物合成基因,而第二微生物包含甜菊糖苷生物合成基因。替代地,两个或更多个微生物可以各自生长在独立的培养基中,可以将第一培养基中的产物(例如甜菊醇)引入第二培养基中以转化为后续的中间产物或者终产物(比如莱鲍迪苷A)。然后回收第二或者最后的微生物所产生的产物。同样可以理解,在一些实施方案中,重组微生物的生长使用了营养源而不是培养基,利用的是发酵罐以外的系统。
甜菊糖苷在不同食品系统中不一定有等同的表现。因此有能力引导合成选中的甜菊糖苷组合物是有益的。本文描述的重组宿主可以产生选择性富集了某特定甜菊糖苷并具有一致的口味的组合物。因此本文描述的重组微生物、植物和植物细胞可以协助制备这样的组合物,所述组合物能够针对性地满足给定食品所需要的甜化性能并且批次之间各种甜菊糖苷的比例是一致的。本文描述的微生物不会产生甜菊提取物中存在的不需要的植物副产品。因此,本文描述的重组微生物所产生的甜菊糖苷组合物与从甜菊植物提取的组合物是有区别的。
V.食品
通过本文描述的方法获得的甜菊醇和甜菊糖苷可以用于制作食品、膳食补充剂和甜味剂组合物。例如,可以将基本纯的甜菊醇或甜菊糖苷(比如莱鲍迪苷A)包含在食品中,比如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸奶、烘培食品、口香糖、硬糖和软糖以及酱汁。还可以将基本纯的甜菊醇或甜菊糖苷包含在非食品中,比如医药产品、药品、膳食补充剂和营养补充剂。还可以在农业和陪伴动物业的动物饲料中包含基本纯的甜菊醇或甜菊糖苷。替代地,通过分开培养重组微生物或者培养不同的植物/植物细胞,所述微生物或植物/植物细胞分别产生特定的甜菊醇或甜菊糖苷;从每个微生物或植物/植物细胞中回收基本纯形式的甜菊醇或甜菊糖苷;然后将化合物合并得到含有处于需要比例的每种化合物的混合物,可以制备到甜菊醇和/或甜菊糖苷的混合物。本文描述的重组微生物、植物和植物细胞使得可以获得比现有甜菊产品更精确和一致的混合物。在另一种替代方法中,可以将基本纯的甜菊醇或甜菊糖苷与其它甜味剂(例如糖精、葡聚糖、蔗糖、果糖、赤藓糖醇、阿斯巴甜、蔗糖素、monatin或者乙酰磺胺酸钾)一起加入食品。可以改变甜菊醇或甜菊糖苷相对其它甜味剂的重量比以实现最终食品中的满意口味。参见例如,美国专利申请2007/0128311。在一些实施方案中,可以将甜菊醇或甜菊糖苷与调味品(例如柑橘)一起提供作为调味品的调整剂。例如,特别是对于基于碳水化合物的甜味剂,可以将莱鲍迪苷C作为甜味增强剂或者甜味调整剂,这样就可以减少食品中糖的用量。
可以将由本文描述的重组微生物、植物或植物细胞产生的组合物加入食品。例如,可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物根据甜菊糖苷的类型和食品,按照基于干重约20mg甜菊糖苷/kg食品到约1800mg甜菊糖苷/kg食品的量加入食品。例如,可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入甜点、冷的甜品(例如冰淇淋)、奶制品(例如酸奶)或者饮料(例如碳酸饮料),使食品含有基于干重的最多500mg甜菊糖苷/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入烘培食品(例如,饼干),使食品含有基于干重的最多300mg甜菊糖苷/kg食物food。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入调味汁(例如,巧克力糖浆)或蔬菜制品(例如腌菜),使食品含有基于干重的最多1000mg甜菊糖苷/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入面包,使食品含有基于干重的最多160mg甜菊糖苷/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入硬糖或软糖,使食品含有基于干重的最多1600mg甜菊糖苷/kg食物。可以将重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊糖苷组合物加入加工过的水果制品(例如果汁、果馅、果酱和果冻),使食品含有基于干重的最多1000mg甜菊糖苷/kg食物。
例如,这类甜菊糖苷组合物可以含有90-99%莱鲍迪苷A和无法检测量的来自甜菊植物的杂质,所述组合物可以按照就干重来说25-1600mg/kg加入食品,例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或者500-1000mg/kg。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有3%以上莱鲍迪苷B的富含莱鲍迪苷B的组合物,可以加入食品使产品中的莱鲍迪苷B的量就干重来说处于25-1600mg/kg,例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。一般来说,富含莱鲍迪苷B的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有15%以上莱鲍迪苷C的富含莱鲍迪苷C的组合物,可以加入食品使产品中的莱鲍迪苷C的量就干重来说处于20-600mg/kg,例如100-600mg/kg、20-100mg/kg、20-95mg/kg、20-250mg/kg、50-75mg/kg或50-95mg/kg。一般来说,富含莱鲍迪苷C的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有3%以上莱鲍迪苷D的富含莱鲍迪苷D的组合物,可以加入食品使产品中的莱鲍迪苷D的量就干重来说处于25-1600mg/kg,例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。一般来说,富含莱鲍迪苷D的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有3%以上莱鲍迪苷E的富含莱鲍迪苷E的组合物,可以加入食品使产品中的莱鲍迪苷E的量就干重来说处于25-1600mg/kg,例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。一般来说,富含莱鲍迪苷E的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有4%以上莱鲍迪苷F的富含莱鲍迪苷F的组合物,可以加入食品使产品中的莱鲍迪苷F的量就干重来说处于25-1000mg/kg,例如100-600mg/kg、25-100mg/kg、25-95mg/kg、50-75mg/kg或50-95mg/kg。一般来说,富含莱鲍迪苷F的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
这类甜菊糖苷组合物可以是含有4%以上杜尔可苷A的富含杜尔可苷A的组合物,可以加入食品使产品中的杜尔可苷A的量就干重来说处于25-1000mg/kg,例如100-600mg/kg、25-100mg/kg、25-95mg/kg、50-75mg/kg或50-95mg/kg。一般来说,富含杜尔可苷A的组合物含有无法检测量的来自甜菊植物的杂质。
在一些实施方案中,将基本纯的甜菊醇或甜菊糖苷加入佐餐甜味剂或“代糖”产品中。这类产品一般用本领域技术人员已知的一或多种膨松剂(例如麦芽糊精)稀释到合适的甜度。可以将富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A的甜菊糖苷组合物以例如基于干重10,000-30,000mg甜菊糖苷/kg产品的量包装在小袋中供佐餐。
VI.植物育种
A.多态性
本文描述的核酸(例如UGT91D2核酸)的多态性可以作为甜菊植物基因作图和植物育种计划中的标记物。参见例如,Yaoetal.,Genome,1999,42:657-661。因此,本文描述的多态性可以用于鉴定多态性是否与某性状差别关联的方法。所述方法涉及测量甜菊植物系或者群体中性状差别与这些植物中存在的一或多个基因多态性之间的相关性,从而减低所述基因多肽性是否与性状差别相关联。一般来说,所述性状是植物叶子中存在的甜菊糖苷总量,虽然性状也可以是特定甜菊糖苷(例如莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A)的量。在一些实施方案中,性状是甜菊醇的量或者类异戊二烯前体的量。利用合适的参数化或非参数化统计,例如卡方检验、Student′st检验、Mann-Whitney检验或者F检验可以确定性状与多态性标记物之间的统计学显著相关性。例如植物中莱鲍迪苷A的量和存在多态性标记物直接的统计学显著相关性表明该标记物可以用于标记物协助的育种计划,以便选择莱鲍迪苷A水平变化。
可以通过本领域已知的手段来检测多态性,包括但不限于限制酶切片段长度多态性(RFLP)随机扩增多态DNA检测(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复(SSR)或微卫星。文献中对多态性的发现、检测和基因作图已有描述。参见例如Henry,ed.(2001)PlantGenotyping.TheDNAFingerprintingofPlantsWallingford:CABIPublishing;andPhillipsandVasil,eds.(2001)DNA-basedMarkersinPlantsDordrecht:KluwerAcademicPublishers。例如,来源于SEQIDNO:6、SEQIDNO:9或SEQIDNO:96或者它们的互补序列给出的核酸序列的引物或探针可以用于鉴定一或多个个体植物,所述植物具有与所需甜菊糖苷组合物相关的多态性等位基因。然后可以将这些植物用于育种计划,将多态性等位基因与位于其它基因座的与所需甜菊糖苷组合物相关的复数个其它等位基因结合起来。对本领域技术人员显而易见的,根据要选择的性状和每个标记物的相关程度,需要的标记物的数量和类型可能各不相同。因此,在某些实施方案中方法涉及在植物基因组中检测复数个多态性。可以理解,方法还包括将检测复数个多态性的步骤的结果储存在计算机可读介质上。
因此,在一些实施方案中,鉴定甜菊植物系或群体的方法包括提供甜菊植物的核酸样品;提供用于扩增样品中甜菊植物与UGT基因对应的区域的扩增引物,所述UGT基因与编码SEQIDNOs:1、3、5或7中给出的多肽的序列有90%或以上的序列同一性;给核酸样品使用扩增引物以便发生所述区域的扩增;和根据扩增核酸样品中存在的一或多个与性状相关的多态性,鉴定出具有所需性状的植物。
在一些实施方案中,确定甜菊植物中存在某多核苷酸的方法涉及将至少一个探针或引物对与来自植物的核酸进行接触。所述探针或引物对编码UGT多肽的多核苷酸是特异的,所述UGT多肽与SEQIDNOs:1、3、5或7有至少90%的序列同一性。然后可以确定是否存在多核苷酸。
除了用于甜菊植物检测多态性和确定基因型的方法,还描述了适合实施方法的试剂盒,以及通过这类方法产生的含有方法所生成的数据的计算机可读介质。用于甜菊生物样品基因作图的试剂盒包含能够特异扩增多核苷酸的引物对,或者与所述多核苷酸特异杂交的探针,所述多核苷酸编码的UGT多肽与SEQIDNOs:1、3、5或7有至少90%的序列同一性。这类试剂盒一般有装在合适的包装材料中的引物或探针。
在本文描述的方法和试剂盒的一些实施方案中,使用了一或多组寡核苷酸,每组能够识别具体和限定基因座位点的存在与否。对于多倍体甜菊系或群体,需要更多的寡核苷酸。下限是一个寡核苷酸对,上限由希望达到的方法的分辨率和测试试剂盒决定。优选采用例如末端转移酶和常规可记录标记,通过任一种常规标记系统来原位记录寡核苷酸与来自甜菊植物的DNA的杂交。作为原位标记的替代,可以将发生杂交的样品DNA从固体支持物上释放出来,然后与带有标记的多核苷酸序列杂交,其中的多核苷酸序列对应附着在固体支持物上的本来的每种寡核苷酸序列。任选杂交是可逆的,固体支持物可以恢复到原来的状态以便重新使用。如果寡核苷酸与基因座DNA杂交作为模板,可以在寡核苷酸的末端引入带标记的二脱氧核苷酸。与寡核苷酸匹配的区域的相邻基因组位点的核苷酸序列是已知的,因此将要引入的具体核苷酸(A、C、G、T或U)是已知的。利用成对的(即两个)或平行的(即三个)旁侧寡核苷酸序列可以实现共显性评分。得到的结果被记录为完整(full)、空位(empty)、failure或无效(null)等位基因,可以用于区分杂合和/或纯合基因型。为了去除没有与附着在固体支持物上的寡核苷酸序列完全杂交的样品DNA,在例如标记前和标记后提供任选的杂交后处理,包括洗涤和消化。使用能够记录杂交状态的方法,在通常是计算机可读介质上记录杂交是否发生。
B.育种计划
甜菊一般是异型杂交物种,虽然偶尔也会观察到自身受粉。因此甜菊植物育种计划一般涉及使用下述的一或多项:轮回选择混合选择(Recurrentselectionmassselection)、混合选择(bulkselection)和互交(intercrossing)。这些技术可以在育种技术中单独使用或者与一或多种其它技术联合使用。参见Yadavetal.,Can.J.Plant Sci.91:1-27(2011)。每个鉴定到的植物可以与不同植物杂交产生种子,然后发芽形成子代植物。来自一或多个具有所需表型和所需多态性的后代植物的种子混合,然后随机交配形成后续的子代。为了在得到保持多态等位基因的植物群体中达到预期的稳定性,育种计划可以按照需要将这些步骤重复额外的0-5个世代。在多数育种计划中,每个世代都要对特定多态性等位基因进行分析,虽然如果希望分析可以隔代进行。对于有自交可能的那些甜菊系和群体,可以进行子代植物的自交。
轮回选择是植物育种计划中用于提高植物数量的一种方法。该方法将各个植物相互授粉以形成子代。子代生长后通过任意数量的选择方法挑选优良的子代,包括个体植物、半同胞子代、全同胞子代和自花传粉子代。将选中的子代自花传粉或者相互授粉形成另一个子代群体。将该群体种植,再次挑选优良植物进行自花传粉或者相互授粉。轮回选择是一个循环过程,因此可以按照需要重复许多次。轮回选择的目的是提高群体的性状。然后改良后的群体作为育种材料资源来获得新的经济或育种用品种,包括产生综合品种。综合品种是由几个选中的品种互交形成的子代。用于生成综合品种的亲代植物品种、群体、野生种质、生态型的数量可能在少到10和多达500的范围变化。一般来说,使用约100到300个品种、群体等作为亲代来产生综合品种。来自综合品种的原种繁育圃的种子可以卖给农民。替代地,根据原种圃中产生的种子量和对种子的需求量,从原种繁育圃得到的种子可以再进行一或两代繁殖。
混合选择(Massselection)在与分子标记物协助的选择联用时是一种有用的技术。在混合选择中,对来自个体的种子基于表型或基因型进行选择。然后将这些选中的种子集中在一起,用来生长下一世代。混合选择(Bulkselection)需要将植物群体生长在一大块地(bulkplot)中,允许植物自花传粉,批量收获种子,然后用批量收获的种子样品去种植下一代。而且,育种技术可以一部分使用定向传粉,而不是自花传粉。
因此,在一些实施方案中,制备甜菊植物系或群体的方法包括鉴定植物系或群体中的一或多个植物,所述植物中某基因座存在的多态性与目的性状差别关联,所述基因座含有的核苷酸序列编码与SEQIDNO:1、3、5或7至少90%相同的多肽。然后将鉴定到的植物自交或者与不同植物杂交产生种子,将从种子长出的至少一个子代植物再次自交或者与不同植物杂交0-5个世代以得到具备所述多态性的系或群体。
在一些情况中,还进行了对其它有用性状的选择,例如选择对疾病的抗性。对这类其它性状的选择可以在鉴定具有所需多态性等位基因的个体植物之前、之中或者之后进行。
可以给其它类型的鉴定技术额外使用,或者作为替代方法使用标记物协助的育种技术。
以下实施例将对发明进一步描述,这些实施例不会限制权利要求中描述的发明范围。
VI.实施例
实施例1--贝壳杉烯生物合成途径基因的构建
将编码截短的发面酵母HMGCoA还原酶的核苷酸序列克隆到酵母高拷贝附加体质粒载体中,使编码序列可操纵地连接会被氨基酸甲硫氨酸阻遏的启动子,并且转录受其调控。参见美国专利5,460,949和5,306,862。
将编码如表1所示GGPPS酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(参见SEQIDNOs:18-25),克隆到大肠杆菌载体中,使编码序列可操纵地连接会被氨基酸甲硫氨酸阻遏的酵母启动子,并且转录受其调控。表1中还显示了每个含有表达盒的质粒(“进入载体”)的名称。SEQIDNOs:26-33给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。使用由来自指定为EV270的长春花(Catharanthusroseus)未修饰核苷酸序列、来自指定为C301的构巢曲霉未修饰核苷酸序列和来自指定为C413的红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)未修饰核苷酸序列表达的GGPPS酶构建了其他进入载体。
表1.GGPPS克隆
将表2显示的编码CDPS酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:34-36),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:37-39给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。使用由来自指定为EV64拟南芥未修饰核苷酸序列、来自指定为EV65的玉米未修饰核苷酸序列和来自指定为EV66的番茄(Lycopersiconesculentum)未修饰核苷酸序列表达的CDPS酶构建了其他进入载体。
表2.CDPS克隆
将表3显示的编码KS酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:40-43),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:44-47给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。使用由来自指定为EV70的拟南芥未修饰核苷酸序列、来自指定为EV71的印度南瓜(Cucurbitamaxima)的未修饰核苷酸序列和来自指定为EV72的黄瓜(Cucumissativus)未修饰核苷酸序列表达的KS酶构建了其他进入载体。
表3.KS克隆
将表4显示的编码CDPS-KS融合酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:48和49),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:50和51给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。
表4.CDPS-KS克隆
将表5显示的编码KO酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:52-55),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:56-59给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。
表5.KO克隆
将表6显示的编码KAH酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:60-64),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:65-69给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。
表6.KAH克隆
*=序列如美国专利申请公开2008-0064063中所示
将表7显示的编码CPR酶的核苷酸序列进行改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:70-72),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:73-75给出了来自最初鉴定到多肽的来源生物的核苷酸序列。
表7.CPR克隆
实施例2--甜菊糖苷途径基因的构建
将含有编码表8列出的UGT85C2和UGT74G1酶的核苷酸序列的整合载体转化到酵母中。获得含有整合到基因组的UGT85C2、或UGT85C2和UGT74G1的转化子。
表8.UGT克隆
将编码IP3GGT和UGT94B1R25S酶的核苷酸序列经过改造以适应在酵母中的表达(见SEQIDNOs:77和79),克隆到酵母进入载体中。SEQIDNOs:76和78分别给出了IP3GGT和UGT94B1R25S的氨基酸序列。含有经过改造的IP3GGT核苷酸序列的高拷贝附加体载体被指定为pEF1155。含有经过改造的UGT94B1R25S核苷酸序列的高拷贝附加体载体被指定为pEF1156。
实施例3-酵母菌株的构建
指定为EFSC301的酵母菌株通过用铜诱导型CUP1启动子代替内源ERG9启动子被改造。菌株EFSC301是EUROSCARF保藏酵母菌株BY4742的衍生菌株。参见互联网uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/by.html。在标准酵母生长培养基中,ERG9基因的转录水平非常低,因为这类培养基中的铜浓度很低。该菌中麦角固醇产量的下降导致供给甜菊醇生物合成的异戊二烯单元的量增加。酵母菌株还进行了基因组整合甜菊UGT85C2和UGT74G1基因的改造,每个基因都处于强组成型GPD1启动子的转录调控下。参见表8。所述菌株含有整合到MUS1241菌株基因组中的各一个拷贝的甜菊UGT85C2和UGT74G1基因。
实施例4--酵母中甜菊糖苷途径基因表达的分析
为了检验酵母中的甜菊糖苷生物合成,将表1-7和实施例1中的36个进入载体的表达盒在连接反应中随机串联形成人工酵母染色体(“eYACs”)。该过程如图5示意。
进行了两组不同的连接反应。连接组A包括了表1-7中所有的基因,但不含有双功能CDPS-KS基因(表4)。连接组B包括了表1-7中的所有基因,但不含有单一功能的CDPS和KS基因(表2-3)。
由每个含有表达盒的进入载体制备30-200μgDNA。使用限制性内切酶AscI从每个载体上释放基因表达盒。然后通过使用T4连接酶进行3小时连接反应将表达盒随机串联到eYACs中。因为串联DNA非常粘稠,通过反应混合液的粘度即可评估串联反应已成功。将含有着丝粒、两个端粒以及LEU2和TRP1选择标记的DNA片段(“手臂”)添加到串联的表达盒末端,从而形成有功能的eYACs。
eYACs转化到感受态酵母菌株MUS1243的原生质球中是通过经酵母裂解酶消化酵母细胞壁,然后用CaCl2/PEG缓冲液处理,使原生质球对大分子(比如eYACs)有通透性。
转化完成后,将酵母原生质球包埋在基于Noble琼脂的固体培养基中,细胞壁能够在此进行再生。接种后4-8天开始出现菌落。再生培养基不含氨基酸亮氨酸和色氨酸,这样就可以选择存在带有两个臂的eYACs的酵母细胞。
每组获得了大约3,000个转化子。将每个转化子再次划线接种,测试酵母菌株标记物和含有eYAC的两个臂,即LEU2和TRP1标记物。97%以上的转化子具有正确的基因型。给予每个转化子一个CEY指定编号。
首先,将来自每组的24个CEYs在2ml不含甲硫氨酸的合成完全培养基(SC)中生长24小时,以便诱导由eYACs进行的基因表达。24小时后,收集每个培养物的上清进行LC-MS(液相色谱质谱联用(TripleQuadropole))分析以证实甜叶悬钩子苷的存在。因为甜菊UGT74G1和UGT85C2基因在每个CEY转化子中是共表达的,当产生甜菊醇时预期的终产物是甜叶悬钩子苷(甜菊醇-(13-β-D-吡喃葡糖氧基)-β-D-吡喃葡糖酯)。
B组的CEYs都没有产生可检测水平的甜叶悬钩子苷,而A组的7个CEYs产生了。菌株CEY19的产量最高。CEY19产生了一种质量为665.2的化合物,可能对应甜叶悬钩子苷的盐加成物。还看到质量为643.2的化合物,可能对应质子化的甜叶悬钩子苷。对质量665.2化合物的基于MS-MS的分子分离产生了503.2的裂解质量,对应作为盐加成物的甜菊醇单糖苷。由于该化合物的质量、分离模式、HPLC谱图和保留标准与利用甜菊酶85C2和74G1通过甜菊醇葡糖基花体外产生的甜叶悬钩子苷标准的完全对应,确认由CEY产生的化合物是甜叶悬钩子苷。
甜叶悬钩子苷产生的附加筛选
将来自组A和组的另外95个克隆和来自组B的95个克隆生长在96深孔板的不含甲硫氨酸的1mlSC培养基中。将每个培养物的上清每两个克隆合并成一个集合,经LC-MS分析,确定MS信噪比。MSs/n比率是相对甜叶悬钩子苷含量的一个大概衡量。当发现两个CEYs的集合能够产生甜叶悬钩子苷时,对该集合中的每个克隆再单独分析。结果显示B组中没有CEY产生甜叶悬钩子苷,而A组有至少28个CEYs产生了可检测水平的甜叶悬钩子苷。
鉴定甜叶悬钩子苷产生CEY克隆中存在的基因
为了建立eYACs基因内容与甜叶悬钩子苷产生之间的相关性,开发了可以将eYAC所有可能带有的基因的相似大小片段(0.5kb)扩增的PCR方案。加入了20-25nt的内部引物以便可以使用类似的退火温度来扩增所有基因。由4个没有甜叶悬钩子苷产生的CEYs、4个低甜叶悬钩子苷产量的CEYs和6个高到非常高甜叶悬钩子苷产量的CEYs制备了包含eYACDNA的基因组DNA。使用等摩尔量的这14个DNA制品,对14个CEYs以及阳性和阴性对照的所有37个基因进行分析PCR。除了一个因为引物不成功,所有基因都得到扩增。
6个高产甜叶悬钩子苷的CEY菌株中存在的基因如表9所示。8个低或无甜叶悬钩子苷产生的CEY菌株中存在的基因如表10所示。
表9.高产甜叶悬钩子苷CEY菌株中存在的基因
表10.产生低到无甜叶悬钩子苷的CEY菌株中存在的基因
实施例5-酵母培养条件的改进
为了确定有助获得最大甜叶悬钩子苷产量的培养条件,用菌株CEY213进行试验。出发材料是CEY213的甘油冻存(-80℃)菌种。冷冻细胞原来来自含有SC酵母培养基的琼脂板,培养基中没有色氨酸、亮氨酸和组氨酸(SC-TLH),但含有2mM甲硫氨酸。向5ml液体SC-TLH培养基接种一环冻存CEY213酵母细胞。在这些条件下eYAC在CEY213中的表达被抑制。细胞于30℃缓慢震荡(170rpm)培养过夜,指定为“预培养物”。
将CEY213预培养物用于接种25-50ml不含甲硫氨酸的SC培养基,其中以下指出的参数不同。测量每个生长条件下的甜叶悬钩子苷产量是通过离心500μl各培养基,将250μl上清转移到新的管子中,加入250μl甲醇,充分混匀,最高速离心10分钟。取一小份上清经LC-MS分析甜叶悬钩子苷产量。
铜水平
将CEY213预培养物生长在加入了50μM浴酮灵二磺酸(bathocuproinedisulfonicacid)的SC培养基中。浴酮灵二磺酸能够螯合培养基中的铜。CEY213中的ERG9基因经过改造其表达由CUP1启动子控制。培养基中的铜水平下降将进一步降低ERG9活性,从而提高供给甜菊醇生物合成的异戊二烯单元的量。
培养基中铜离子的螯合对酵母培养物的生长产生有害影响,甜叶悬钩子苷产量成比例下降。这些结果表明,即使没有铜螯合,菌株CEY213处于最低的麦角固醇生物合成速率,没有异戊二烯单元可以从麦角固醇生物合成转向甜菊糖苷产生。
葡萄糖
将葡萄糖供应量从2%加倍到4%对甜叶悬钩子苷产生只有微小的影响,甜叶悬钩子苷产量增长了大约5-10%。
限量氮
CEY213预培养物生长在氮限量的条件下。酵母菌培养中限制氮的供给已知能够提高麦角固醇的生产。当NH4SO4浓度由4g/l降低到2、1或0.4g/l时,CEY213的生长速率根据氮的含量按比例下降。甜叶悬钩子苷的生产随着生长的下降而成比例下降。
培养物的通气
将CEY213生长在带有或不带有隔板的Ehrlenmeyer瓶中。结果表明使用隔板对增加通气最多有微小的影响。不带隔板导致的缺少通气提高了产量。
初始光密度、发酵时间和生长温度
在预培养的CEY213的两个不同光密度(OD600=0.1或OD600=1.0)开始培养。然后在20、25或30℃的温度进行24、48、72或144小时发酵。
如图6所示,发酵开始时批量培养物的密度、培养温度和培养时长,各种组合对CEY213的甜叶悬钩子苷产生量有显著的影响。因此,OD600=1.0的起始光密度,在30℃生长144小时的培养物最终得到不低于8.5mgs/升的甜叶悬钩子苷。
实施例6--甜叶悬钩子苷的大规模生产
通过使用3种酵母培养基(丰富培养基和两种合成培养基)、改变接种密度和变化eYAC基因盒的表达时机对CEY213进行了一系列发酵试验。
批量发酵的条件
批量发酵的进行是将CEY213预培养物离心、弃去上清和将细胞重悬于6升含有100μM甲硫氨酸和4%葡萄糖的SC-TLH培养基中。在100ml不带隔板的Ehrlenmeyer锥形瓶中将OD600调节到1.0,允许细胞在30℃下缓慢震荡培养144小时。
甜叶悬钩子苷的回收
发酵结束后,将培养物离心,上清与等量甲醇混合,充分混匀,离心除去沉淀物质。得到的上清以甲醇为洗脱液进行快速C18-硅柱层析,然后进行制备HPLC获得一个主要化合物,还检测到一个次要化合物。
纯化的化合物经1H和13CNMR分析,数据如图7所示。根据与甜叶悬钩子苷的1H和13CNMR文献数据相比,确认化合物是甜叶悬钩子苷。定量分析表明CEY213发酵产生了12.8mgs/升的甜叶悬钩子苷。
实施例7--IP3GGT活性
1.圆叶牵牛3GGT糖基转移酶的体外酶活
以甜菊醇为底物,体外确定了圆叶牵牛3GGT糖基转移酶(IP3GGT)的酶活性。甜叶菊UGT85C2和IP3GGT糖基转移酶的基因各自在大肠杆菌中表达并对每种酶进行了纯化。
酶反应分两步进行。首先,将0.5mM甜菊醇(总共9.55mgs)与约0.5μgUGT85C2酶于30℃在反应缓冲液(含有1mMUDP-葡萄糖、100mMTris-HCl(pH8.0)、5mMMgCl2、1mMKCl、0.1U/ul牛小肠磷酸酶)中温育16小时。然后加入约0.5μgIP3GGT酶,将反应混合液在30℃再温育20小时。
对反应产物的分析表明甜菊醇大约100%转化为甜菊醇-13-O-单糖苷,其中的25%进一步糖基化为甜菊醇-13-O-1,2-二糖苷。理论上的甜菊醇-13-O-1,2-二糖苷产量是大约4.8mg。然后对反应混合液进行制备HPLC,得到2.5mg甜菊醇-13-O-1,2-二糖苷(52%纯化产量)。使用LC-MS发现纯化化合物的质量与甜叶悬钩子苷和甜菊醇-13-O-1,3-二糖苷的保留时间不同。纯化化合物进行1HNMR、异核单量子相干(HSQC)-NMR和异核多键相关(HMBC)-NMR分析,证实化合物是甜菊醇-13-O-1,2-二糖苷。
2.IP3GGT在甜菊醇或甜菊醇单糖苷饲喂酵母中的体内表达
为了确定IP3GGT在酵母中是否有活性,将2μ高拷贝(附加体)质粒pMUS10转化到酵母菌株MUS1245中,所述质粒含有与强GPD1启动子可操纵连接的未经修饰的IP3GGT编码序列。MUS1245含有整合到基因组的UGT85C2表达盒。将得到的酵母菌株以OD600=0.2的起始密度生长在不含组氨酸的SC培养基中以选择持续含有的IP3GGT表达质粒。将甜菊醇或甜菊醇单糖苷以3mM的浓度加入培养基。在30℃培养72小时后,经HPLC分析培养物上清中的甜菊醇和甜菊醇葡萄糖苷。
LC-MS分析表明饲喂甜菊醇后没有检测到1,2-糖基化的甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,虽然可以检测到甜菊醇-13-O-单糖苷。相反,饲喂甜菊醇-13-O-单糖苷后,携带pMUS10的MUS1245产生了虽然低但可以检测到量的甜菊醇1,2-二糖苷。这些结果显示天然圆叶牵牛3GGT编码序列在酵母中的表达水平足够得到可检测的甜菊醇单糖苷到甜菊醇1,2-二糖苷的体内转化。
实施例8-酵母菌株的改造
EXG1知EXG2
酿酒酵母可能含有能够降解甜菊醇1,2-和甜菊醇1,3-二糖苷中的1,2或1,3糖苷键的酶。为了检验这种可能性,将酵母菌株CEY213于30℃在含有0.1mM这两种二糖苷中的一种的培养基上生长3天。对培养物的LC-MS分析显示1,2-二糖苷的水平稳定,而1,3-二糖苷中的1,3-键似乎在方法的检测限度内被完全水解。
检验了25个酿酒酵母突变体(每个带有一个被打断的已知或推测的糖苷水解酶)降解甜菊醇二糖苷的能力。每个酵母突变体的培养物如上所述生长在含有甜菊醇1,3-二糖苷的培养基上,并经LC-MS分析。发现携带EXG1(1,3-β-葡聚糖外切酶)基因突变的酵母菌株丢失了大部分的1,3-二糖苷水解活性。酵母EXG1基因的核苷酸序列在VazquezdeAldanaetal.Gene97:173-182(1991)中有报道。携带EXG2基因(另一个1,3-β-葡聚糖外切酶)突变的酵母菌株显示水解酶活性的少量下降。Correa,etal.,CurrentGenetics22:283-288(1992)。
制备了双突变酵母菌株(exg1exg2)。当双突变菌株生长在含有甜菊醇1,3-二糖苷的培养基上时,没有检测到二糖苷的水解。
实施例9-滴度提高的甜菊醇生物合成
来自实施例4(和表11)中测试的每个不同酶类型的个别酶克隆利用eYAC技术进行了检验以鉴定由焦磷酸异戊烷和法尼焦磷酸产生最大量甜菊醇的特定克隆。在表达甜菊醇途径中所有其他酶步骤的酿酒酵母菌株中,于eYACs上测试了GGPPS、KO和KAH酶,测试或者单独进行,或者对于GGPPS酶是单独或每两个一组(例如,聚球蓝细菌+嗜酸热硫化叶菌GGPPS或者单独的构巢曲霉GGPPS)进行。结果表明聚球蓝细菌GGPPS克隆MM-7(由SEQIDNO:24编码)是最高效的。来自构巢曲霉和嗜酸热硫化叶菌的GGPPS克隆也非常活跃。结果还表明在KO和KAH克隆中,甜菊KO克隆MM-18(由SEQIDNO:52编码)和拟南芥KAH克隆MM-24(由SEQIDNO:62编码)造成最高的甜菊醇产量。
表11.
*美国专利申请公开20080064063
用高拷贝质粒转化实施例4中描述过的酿酒酵母菌株CEY213,所述质粒携带与强GPD1启动子可操纵连接的表11中显示的CDPS或KS基因中的一个。初步试验表明CEY213中甜叶菊CDPS(CDPS-1,由SEQIDNO:34编码)的过表达使得甜叶悬钩子苷产量相对缺少高拷贝CDPS-1过表达质粒的CEY213提高。试验还表明甜叶菊KO(KO-1,由SEQIDNO:52编码)是测试的两种中最活跃的KO。
为了构建持续高产甜菊糖苷的酵母菌株,含有GGPPS-10克隆、KO-1克隆(SEQIDNO:52)和KAH-3克隆(SEQIDNO:62)的表达盒被稳定地整合到酿酒酵母菌株CEN.PK111-61A的基因组中。这些表达盒的表达由组成型GPD1和TPI1启动子驱动。此外,含有KS-1(SEQIDNO:40)、CDPS-1(SEQIDNO:34)和UGT74G1(SEQIDNO:2)的表达盒被稳定地整合到基因组中。但是得到的酵母菌株EFSC1751当在实施例6描述的条件下进行实验室规模培养时不产生任何甜菊醇-19-O-单糖苷。
为了确定EFSC1751中没有甜菊糖苷产生的根源,在菌株EFSC1751中单独或者组合表达了CDPS-3、CDPS-4、CDPS-5和CPR-1基因。CPR-1来自甜叶菊,其序列可见GenbankAccessionDQ269454.4。结果显示CPR-1当与CDPS-3、CDPS-4或CDPS-5一起表达时,导致EFSC1751中产生甜菊醇-19-O-单糖苷。这些基因中没有一个单独在同一菌株中表达时能导致产生甜菊醇-19-O-单糖苷。这些结果表明整合到基因组的甜菊酶CDPS-1拷贝在该酵母构建体中没有活性,而慢生型根瘤菌、拟南芥或玉米CDPS克隆在该构建体中有活性。此外,该构建体中整合到染色体的来自植物的KAH和/或KO基因似乎需要外源CPR才有活性。来自藤仓赤霉(MM-29)的CPR似乎也能够与来自植物的KAH和/或KO多肽一起发挥作用。
两个领先的GGPPS候选物,GGPPS-6(由SEQIDNO:23编码)和GGPPS-7(由SEQIDNO:24编码)分别在酿酒酵母菌株中做了进一步表达,所述酵母菌株含有活性的甜菊糖苷途径(包括UGT74G1)但没有GGPPS基因。然后通过对已经在50%DMSO中煮沸5分钟并于16000相对离心力(RCF)离心5分钟的培养物样品进行LC-MS分析来分析转化子的19-SMG产生情况。发现许多含有表达GGPPS-6的质粒的转化子不产生19-SMG。
极少数获得的转化子含有GGPPS-7,这表明GGPPS-7(聚球蓝细菌)可能是两种酶中活性更高的,而且活性高到可能引起了毒性。例如,GGPP产生的剧烈增加可能导致下游途径(比如麦角固醇产生)的流失。为了测试这种设想,将UPC2-1基因与GGPPS-7共表达,并且尝试了给细胞饲喂麦角固醇看能否拯救细胞的生长。但是未能拯救细胞生长。
细胞毒性还可能是由于GGPP或者GGPP的代谢物的累积。为了测试这个设想,进一步在表达GGPPS-7的酵母菌株中过表达了CDPS-5看是否能通过提高GGPP的使用来减轻毒性。CDPS5过表达的确表现出一定程度的对细胞生长的拯救,因为含有过表达该酶和GGPPS-7的质粒的转化子形成了少数菌落。转化子的数量仍然很低。在类似菌株中与GGPPS-10而不是GGPPS-7一起过表达CDPS-5导致甜菊糖苷产量加倍,这些结果一起说明CDPS是被诱导的甜菊糖苷生物合成途径中的限制瓶颈。
总之,根据用酵母培养基+2%葡萄糖在30℃进行24-72小时的试管细胞培养产生的19-SMG或甜叶悬钩子苷,可以给eYAC构建体得出以下结论:KS-1(甜叶菊,由SEQIDNO:40编码)、KO-1(甜叶菊,由SEQIDNO:52编码)和KAH-1(甜叶菊)或KAH-3(拟南芥,由SEQIDNO:62编码)似乎是甜菊醇途径的最佳组合。GGPPS-7(聚球藻)似乎显示出对该步骤最高活性,但如果存在下游瓶颈,过表达也可能导致毒性和整体的低水平甜菊糖苷。测试了CDPS和CPR基因类似物的所有组合,发现表11中的所有3种CPRs都有活性,并且CPR-1(甜叶菊,由SEQIDNO:70编码)或CPR-3(藤仓赤霉,由SEQIDNO:72编码)与CDPS-5(玉米)或CDPS-4(拟南芥)的组合尤其有用。CDPS-5似乎是途径中的最佳CDPS。可以在固醇途径流量下降的报告菌株中进一步测试这些组合。
为了考察来自玉米的CDPS(CDPS-5)是否可能有更高的活性,利用GPD启动子从2μ多拷贝质粒表达带有或者不带有质体信号肽的该基因以确定定位序列被去除时是否细胞质中的活性更高。来自玉米并且含有叶绿体信号肽的CDPS-5的核苷酸序列和氨基酸序列分别在SEQIDNOs:80和81中给出。叶绿体信号肽由SEQIDNO:80中核苷酸1-150编码,对应SEQIDNO:81的氨基酸1-50。将质粒转化到稳定甜叶悬钩子苷产生菌株(EFSC1859)中,该菌株含有整合到基因组中并且从强组成型GPD和TPI启动子表达的GGPPS-10、CDPS-5、KS-1、KO-1、KAH-3、CPR-1和UGT74G1(SEQIDNO:2)。而且,在菌株EFSC1859中,通过用CUP1诱导型启动子代替内源启动子使ERG9所编码的角鲨烯合酶的表达被下调。除了这些基因,菌株EFSC1859还利用GPD1启动子从2μ多拷贝载体表达UGT85C2(SEQIDNO:3)。经LC-MS测量甜叶悬钩子苷和19-SMG产量来估计生产水平。与野生型序列相比,质体前导序列的去除似乎没有提高甜菊糖苷的产生。但是这项工作显示可以去除前导序列而不丢失甜菊醇途径功能。
类似地,可以给CPR-3、KAH-3和KO-1构建不带膜锚定序列(即,SEQIDNO:72的核苷酸4-63;SEQIDNO:62的核苷酸4-87;和SEQIDNO:52的核苷酸1-117)的质粒,并转化到含有整合在染色体而不是质粒上的UGT85C2的菌株EFSC1859中。预计这些酶在没有锚定序列的情况下仍有活性。
实施例10-鉴定甜菊醇-1,3-O-单葡萄糖苷1,2-葡糖基转移酶序列
甜菊EST分析
使用完整番薯属UGT79型UGT(IP3GGT)、雏菊UGT94B1、甜菊UGT79A2、甜菊UGT76G1和甜菊UGT91D1氨基酸序列作为查询项对甜菊(甜叶菊)叶子EST(ExpressedSequenceTags)数据库(Brandleetal.,PlantMol.Biol.50:613-622,2002)进行了tBLASTN检索,代表来自已知主要含有二糖基转移酶的所有家族1糖基转移酶亚家族。鉴定到9个以前没有描述过的UGT基因的部分序列。部分序列中的一个来自UGT79亚家族(“79-EV1”),一个来自UGT76亚家族(“76-EV1”),两个来自UGT91亚家族(“91-EV-1”和“91-EV2”),还有UGT71、72、78、84和88亚家族的成员。利用甜菊cDNA或cDNA文库作为分离的PCR模板分离到了7个部分序列。此外,分离到UGT76亚家族的两个甜菊成员,即属于76G1亚家族(Mohankumar)成员的GenBank登录号ACT33422.1,和属于76G2(Yang)亚家族成员的GenBank登录号ACM47734.1。
焦磷酸测序
通过用甜菊cDNA如下进行焦磷酸测序鉴定和分离了其他UGT克隆。使用MicroPolyPuristTMmRNA制备试剂盒从甜菊叶子制备甜菊mRNA。作为质量控制,通过用和每个序列5’-和3’端21个核苷酸相同的寡核苷酸引物进行分析PCR来测试反转录的mRNA中是否存在甜菊莱鲍迪苷A途径UGT基因85C2、74G1和76G1。然后将扩增好的全长mRNA进行焦磷酸测序和重叠群组装(contigassembly)(MOgene,St.Louis,MOUSA)。进行了大约3百40万个平均长度393核苷酸的读取,使用得到的未加工序列获得25907个序列重叠群。构建了数据库含有总共约1,500UGTs的公开氨基酸序列。大约150个测序的UGTs是来自多种亚家族的完全注释的UGTs。其余测序的UGTs是这些的部分注释的同源物。使用25907甜菊EST重叠群作为查询项,进行了BLASTX检索(CLCGenomics,Muehltal,Germany)来构建UGT数据库(遗传密码=1,低复杂度=是,预期值=10.0,序列长度=3,处理器数量=2,矩阵=BLOSUM62,空位成本(开放)=11,空位成本(延伸)=1)。结果表明焦磷酸测序数据库中存在90个以上先前未知的来自甜菊的UGTs序列。
焦磷酸测序数据库中没有鉴定到其他UGT79亚家族或UGT94亚家族成员。但是分析显示有UGT76和91亚家族的新成员。对于少数几个基因,可以立即从焦磷酸测序EST数据得到全长序列数据。利用以前构建的甜菊质粒cDNA文库获取那些得到部分序列数据的成员的全长序列。将与每个具体部分UGT序列相同的寡核苷酸引物和与文库质粒载体序列相同的寡核苷酸引物合并。在PCR中采用这些引物来获得全长产物,然后将它们测序。基于全长序列,用有校正功能的PCR聚合酶以甜菊cDNA文库作为反应模板进行了扩增全长UGT基因的第二PCR。利用这一策略,分离到UGT76亚家族的5个成员、UGT91亚家族的6个成员以及其他UGT亚家族的10个成员。
将从甜菊EST数据库鉴定到的7个UGTs、2个公开的甜菊UGT76序列和焦磷酸测序鉴定到的21个UGTs中的每一个克隆到大肠杆菌表达载体pET30A+或pETDuet(为纯化目的使用了HIS-标签)中,并在易于自溶的大肠杆菌菌株XjA和XjB中表达。这些UGTs中的许多表达UGT蛋白导致内涵体的形成。为了克服形成这些内涵体,将这些UGTs中的一些在低温表达菌株“ArcticExpress”(AgilentTechnologies)中表达。对于未能在该系统中表达的那些,尝试了PCR产物的体外偶联转录-翻译(QuickforPCRDNA试剂盒,Promega),使得其余UGTs被成功表达。通过标记35S-甲硫氨酸、在SDS-PAGE上分离以及对目标UGT蛋白的预期大小蛋白条带的磷屏显影检测来确保反应效率。
如上所述表达的来自每个克隆的UGT多肽使用甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷作为底物测试了1,2-糖基化活性。将大概对应25μL反应中形成的总蛋白的五分之一的体外转录/翻译蛋白用于体外反应,反应使用0.5mM甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷(SMG)作为底物,在反应缓冲液(含有1mMUDP-葡萄糖、100mMTris-HCl(pH8.0)、5mMMgCl2、1mMKCl、0.1U/μl牛小肠磷酸酶)中进行。反应混合物在30℃温育20小时。然后经LC-MS分析反应混合物中存在的甜菊醇-1,2-二糖苷。LC-MS分析使用了安装有SynergyHydro-RP柱子(250x3mm,3μm颗粒、孔大小)的Agilent1100SeriesHPLC系统(AgilentTechnologies),并且连接到带有电喷雾电离的TSQQuantum(ThermoFisherScientific)三重四极杆质谱。洗脱使用含有MeCN(0.01%甲酸)和H2O(0.01%甲酸)的流动相(30℃),通过施加梯度进行,所述梯度由0.6→0.4ml/min,5%MeCN4分钟;0.4ml/min,5→40%MeCN2分钟;0.4ml/min,40→55%MeCN11分钟;0.4→1.0ml/min,55→100%MeCN3分钟构成。用SIM(单离子监测SingleIonMonitoring)对Mw665.2[M+Na+]来检测甜菊醇二糖苷。测试的30个UGT酶中没有显示可检测的甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷糖基化活性。
将通过焦磷酸测序鉴定到的6个UGT91成员的核苷酸序列与Genbank登录号AY345980中甜菊UGT91D1的序列进行了比较。结果显示相对通过焦磷酸测序鉴定到的6个序列,GenBank序列在N末端编码额外的12个氨基酸。为了重新测试UGT91D1家族成员的活性,通过PCR扩增甜菊叶子cDNA再次分离了UGT91D1序列。将得到的PCR产物克隆到质粒载体中,如上所述通过在大肠杆菌中的GST-标签表达、体外偶联转录-翻译和/或在酵母中的体内表达来测量每个产物的酶活。所有三种方法中都检测到一个克隆的甜菊醇1,2-葡糖基化活性。该克隆被指定为UGT91D2e。SEQIDNO:5中给出了UGT91D2e的氨基酸序列。相反,与登录号AY345980(蛋白质登录号AAR06918)描述的序列相同但缺少氨基端12个氨基酸的克隆没有检测到1,2-葡糖基化活性。
实施例11-UGT91D2e序列的分析
UGT91D2e的序列变体
正如图19B显示的,在活性(91D2e)变体和最接近的失活同源物(91D1)之间存在少量氨基酸修饰。Maetal.,ShiYanShengWuXueBao.200336(2):123-9(蛋白质登录号AAM53963,GI:21435782)和Brandleetal.,同前(蛋白质登录号AAR06918,GI:37993665)克隆的91D1基因未表现出RebA生物合成所需的1,2-糖苷化活性。为了确认哪个氨基酸是活性必需的,制备了21个单定点突变体将UGT91D2e(SEQIDNO:5)中的氨基酸改变为失活同源物中的相应氨基酸。参见表12。此外,还做了改变位点364的定点突变(S→P)。突变体是根据制造商的试验方案(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)使用IISite-DirectedMutagenesis试剂盒制备的,并将pGEX-4TI载体转化到XJbAutolysis大肠杆菌菌株(ZymoResearch,Orange,CA)中。没有制备将残基162从甘氨酸变为天冬氨酸的突变体。
为了评估突变体酶的活性,使用大肠杆菌中产生的蛋白体外进行了底物饲喂试验。首先,将大肠杆菌细胞在30℃过夜培养,然后用3mM阿拉伯糖和0.1mMIPTG进行诱导,并在20℃进一步温育。对于体外分析,细胞在20℃过夜诱导,通过冻融循环来裂解,使用粗细胞提取物进行酶反应,反应底物为0.5mM甜菊醇-13-O-葡萄糖苷和0.5mM甜叶悬钩子苷。
对于甜菊醇单葡萄糖苷(SMG)和甜叶悬钩子苷(Rub)底物,结果如表12所示。“+”表明检测到了二糖基化活性,“-”表示没有检测到活性,“NA”表示没有进行该项分析。提到的突变根据91D2e序列(SEQIDNO:5)的编号。
因为其中一些基因倾向于在大肠杆菌中的内涵体内表达,在大肠杆菌试验中未显示活性的编码序列还象以上实施例10中那样通过PCR产物的体外偶联转录-翻译(QuickforPCRDNA试剂盒,Promega)进行了产生。简单来说,将5个单突变体和野生型酶的PCR扩增取2μLDNA在30℃与试剂盒Mastermix和1μLL-[35S]-甲硫氨酸在总共25μL反应中温育90分钟。每个样品取2μL终反应跑SDS-PAGE胶。目测SDS-PAGE胶判断所有6个蛋白显示出相似水平的可溶性重组蛋白。表12右侧显示了体外翻译蛋白的结果。该表中的百分数表明根据底物和产物的相对峰面积,底物转化为产物的大概量。
表12
发现相对UGT91D2e(SEQIDNO:5),以13-SMG为底物,二糖基化活性的大概量是:对于T144S,是6.1%;对于M152L,是26.2%;对于L213F,是30.7%;对于S364P,是4.3%;对于G384C,是14.7%。对甜叶悬钩子苷,相对UGT91D2e,二糖基化活性的大概量对于T144S、M152L、L213F、S364P和G384C分别是1.4%、23.4%、43.7%、10.9%和35.2%。
这些结果表明,22个氨基酸突变中的5个在独立进行时明显损害活性。其他17个突变在组合情况下也可能导致无活性或者活性的缺失。
通过将91D2e序列和以上描述的变体与命名为At72B1、Mt85H2、VvGT1和Mt71G1的蛋白(Osmanietal(2009)Phytochemistry70,325-347)进行比对,并且对预测的三级结构(α螺旋、β折叠和卷曲)的分析,可以鉴定到突变可能导致二糖基化活性丢失的区域。前三个有害的突变存在于N末端结构域中被认为是环的区域中。N末端结构域(氨基酸残基1-240),特别是N末端结构域中的预测环区(氨基酸20-26、39-43、88-95、121-124、142-158、185-198和203-214)被认为主要负责结合葡萄糖受体分子底物。第4个表现出损害活性的突变存在于C末端结构域中相信是C5环(对应氨基酸381-386)的区域内。这个环还被认为对于葡萄糖受体底物特异性很重要。将失活和活性甜叶悬钩子苷二糖基化酶区分开的22个突变中的19个位于位于91D2e中预测的受体底物结合区内的5个氨基酸。因此,可能公开的91D1酶催化UDP-葡萄糖和另外的受体底物之间的糖基转移酶反应。
实施例12-酵母中的莱鲍迪苷A产生
饲喂甜菊醇的酵母中的莱鲍迪苷A产生
将含有整合到基因组的UGT74G1表达盒的酵母菌株EFSC1580转化三个不同的2μ高拷贝(附加体)质粒以便共表达甜菊UGTs91D2e(SEQIDNO:5)、85C2(SEQIDNO:3)和76G1(SEQIDNO:7)。这三个被命名为pMUS44、pMUS7和pMUS9的质粒分别含有与强GPD1启动子可操纵连接的编码UGT91D2e、UGT85C2和UGT76G1的序列。将得到的酵母菌株培养在不含尿嘧啶、组氨酸和亮氨酸的SC培养基中以便选择持续含有pMUS44、pMUS7和pMUS9表达质粒。将甜菊醇加入培养基至终浓度250μM,菌株在30℃培养。在培养18小时和72小时,取小份上清和细胞沉淀经LC-MS分析存在的莱鲍迪苷A。LC-MS分析使用了安装有SynergyHydro-RP柱子(250x3mm,3μm颗粒、孔大小)的Agilent1100SeriesHPLC系统(AgilentTechnologies),并且连接到带有电喷雾电离的TSQQuantum(ThermoFisherScientific)三重四极杆质谱。洗脱使用含有MeCN(0.01%甲酸)和H2O(0.01%甲酸)的流动相(30℃),通过施加梯度进行,所述梯度由0.6→0.4ml/min,5%MeCN4分钟;0.4ml/min,5→40%MeCN2分钟;0.4ml/min,40→55%MeCN11分钟;0.4→1.0ml/min,55→100%MeCN3分钟构成。用SIM(单离子监测SingleIonMonitoring)检测甜菊醇二糖苷。
LC-MS结果显示,当含有pMUS44,pMUS7andpMUS9的菌株EFSC1580在有甜菊醇的情况下生长时,培养18和72小时的培养物上清中发现了可检测量的莱鲍迪苷A。产物与莱鲍迪苷A标准一起洗脱,预期质量经证实是[M+Na]+=989。通过比较产物的吸光度和10μM莱鲍迪苷A标准的吸光度,估计细胞培养物上清中的累积在18小时超过6mg/L,在72小时超过15mg/L。
饲喂葡萄糖的酵母中莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D的产生
实施例4中描述的酵母菌株CEY213含有由eYACs以及整合到基因组的UGT74G1和UGT85C2表达盒表达的甜菊醇生物合成途径基因。如实施例6所述,菌株CEY213产生甜叶悬钩子苷。
将菌株CEY213转化2μ高拷贝(附加体)双重表达质粒pMUS47以便同时表达UGT91D2e(SEQIDNO:5)和UGT76G1(SEQIDNO:7)。pMUS47质粒含有两个表达盒,一个带有UGT91D2e的编码序列,另一个带有UGT76G1的编码序列。两个编码序列均可操纵地连接强组成型GPD1启动子。将得到的酵母菌株于30℃预培养过夜,SC培养基中不含组氨酸、亮氨酸和色氨酸以便持续选择存在的eYACs,不含尿嘧啶以便持续选择pMUS47,但含有甲硫氨酸(2mM)以便抑制eYACs上的启动子。第二天,将细胞洗涤并转移到相同的培养基中,但培养基不含甲硫氨酸以便诱导eYAC启动子。温育24小时和99小时后,收集样品,并如上所述利用LC-MS分析上清和细胞沉淀中的莱鲍迪苷A和莱鲍迪苷D。
结果显示24小时和99小时的上清中均发现了可检测量的莱鲍迪苷A。产物与莱鲍迪苷A标准一起洗脱,预期质量经证实是[M+Na]+=989。通过比较产物和10μM莱鲍迪苷A标准的吸光度,估计上清中莱鲍迪苷A的累积在24小时超过3mg/L,在99小时超过6mg/L。参见图9。结果还表明酵母细胞沉淀中存在少量的甜菊苷和甜叶悬钩子苷,培养物上清中有可检测量的甜菊苷和甜叶悬钩子苷。参见图9。
结果还显示产生了虽然少但是可以检测到的莱鲍迪苷D,说明UGT91D2e能够给产生甜菊苷的莱鲍迪苷E的19-O葡萄糖或者直接给莱鲍迪苷A的19-O缀合上另外的葡萄糖。这些结果还说明UGT76G1可能能够接受莱鲍迪苷E作为底物以产生莱鲍迪苷D。参见图2C。
实施例13-UGT序列密码子优化后的莱鲍迪苷A的产生
利用GeneArt(Regensburg,Germany)(分别是SEQIDNOs:6、2、8和4)或DNA2.0(MenloPark,CA)(分别是SEQIDNOs:84、83、85和82)提供的两种方法学,设计并合成了用于酵母表达的UGT91d2e、74G1、76G1和85C2的优化编码序列。UGT91d2e、74G1、76G1和85C2的氨基酸序列(分别是SEQIDNOs:5、1、7和3)没有变化。
构建了含有表达盒的高拷贝质粒并进行了表达,所述表达盒包含所有四种优化UGT,将它们的活性与含有野生型序列的类似构建体的产物进行了比较。质粒被转化到通用Watchmaker菌株EFSC301(实施例3中有描述)中。将UGTs插入到高拷贝(2μ)载体中并从强组成型启动子(GPD1)表达(载体P423-GPD、P424-GPD、P425-GPD和P426-GPD)。过夜生长后,以OD6000.25的密度重新接种到新鲜培养基中,该培养基(SC-leu-trp-ura-his)补充有25μM甜菊醇(终浓度),24小时后测量培养基中的甜叶悬钩子苷(Rub)、19-SMG(19SMG)和RebA(RebA)产量。试验重复了一次,部分因为第一批样品中有一个检测不到19-SMG。
以下表13显示的来自两个独立研究的结果表明所有8个密码子优化的UGTs都有活性。但是,每种策略中,至少有一个密码子优化UGT的酶表达被制备构建体使用的新的密码子优化算法减少。似乎在GeneArt改造构建体(SEQIDNOs:6、2、8和4)中,甜叶悬钩子苷和RebA之间可能会形成瓶颈。预期对酵母菌株中表达的这些编码序列进行个体酶活性检验和表达分析可以实现途径中UGT基因的最佳组合。
表13
nd=低于检测下限
实施例14-利用带有序列标签的UGTs产生莱鲍迪苷A
小肽或蛋白结合结构域与UGT蛋白质85C2、91D2e、74G1和76G1的融合可以促进UGTs之间的相互作用(沟通),或者协助UGTs靶向/锚定到酵母细胞的特定成分。
为了评估是否在RecA途径搭入UGTs会产生有活性的途径酶,将DNA2.0密码子优化UGTs85C2和74G1与p53蛋白基元和一串4个高亲和力的短(又称为PMI)肽符合读框地融合,所述肽与53蛋白基元相似。在人体中,p53蛋白基元与MDM2蛋白相互作用(参见Lietal.,J MolBiol.2010,398(2):200-13)。将DNA2.0密码子优化的UGTs85C2、91D2e、74G1和76G1(分别是SEQIDNOs:82、84、83和85)与人蛋白MDM2(基因登录号ABT17086)的前158个氨基酸符合读框地融合。在UGTs的N端甲硫氨酸之前还融合了小的富含GS的连接分子区。未融合时,PMI/MDM2结合的亲和力处于低nM范围,代表高亲和力结合。转化有以上构建体的酵母细胞预计能够产生围绕在从N端融合在85C2蛋白(指定为85C2_P53)支架的XPMI(P53样)肽重复周围的UGT支架。
将缺失了TRP1的实验室酵母菌株BY4741转化表达质粒p423-426GPD(Mumbergetal,Gene,156(1995),119-122),该质粒表达的甜叶菊UGTs74G1、76G1和91D2e带有N端符合读框融合的人MDM2蛋白的前158个氨基酸;质粒还表达甜叶菊UGT85C2,后者带有N端符合读框融合的重复四次的合成PMI肽(4XTSFAEYWNLLSP,SEQIDNO:86)。参见85C2、74G1、91D2e和76G1融合蛋白分别的氨基酸序列SEQIDNOs:88、90、92和94;参见编码融合蛋白的核苷酸序列SEQIDNOs:89、92、93和95。将该酵母菌株和对照菌株(表达不含任何融合的四种UGT’s)在合成酵母培养基中生长过夜以便选择质粒的存在,然后第二天转移到含有合成酵母培养基的96深孔板中达到OD600为1的细胞密度。加入终浓度100μM的甜菊醇。72小时后,如实施例12所述取样经LC-MS分析。正如图10A和10B所示,当UGTs被表达带有各种融合标签时,在酵母中是有活性的。
实施例15-UGT91D2e活性
利用由3种不同遗传背景的甜菊来源制备的cDNA/文库制品克隆了其他亚家族91UGTs。利用与UGT91D1/91D2e相同的寡核苷酸引物PCR扩增cDNA制品,将得到的正确大小的PCR产物克隆到合适的质粒载体中。每个试验对大量克隆进行了测序,测序结果显示序列略有变化的UGT91D核酸可以被扩增。相对UGT91D2e序列差别最大的20个UGT91D变体在用酶法测试甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷-1,2-糖基化活性后,通过体外转录-翻译进行了表达。其中一个变体显示出微弱的1,2-二糖苷葡糖基化活性,其他的则未显示可检测的葡糖基化活性。因此UGT91D2多肽似乎是甜菊中主要的甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷-1,2-糖基化酶。
UGT91D2e的酶活
利用UDP-木糖或UDP-鼠李糖而不是UDP-葡萄糖作为糖供体,在体外酶分析法中测试了通过体外偶联转录-翻译制备的UGT91D2e(SEQIDNO:5)木糖基化和鼠李糖基化甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷的能力。
木糖基化分析如下进行:将3mMUDP-葡糖醛酸与约1μg拟南芥编码的UDP-葡糖醛酸脱羧酶UXS3(在大肠杆菌中产生,然后纯化)、100mMTris-HCl(pH8.0)、1mMDTT、6μgBSA、1mMMgCl2和1%牛小肠磷酸酶混合。反应混合物于30℃温育30分钟,以便UDP-葡糖醛酸转化为UDP-木糖。然后向混合物中加入1.5mM甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷底物和约0.5μg按照实施例9的描述制备的UGT91D2e酶,混合物在30℃再温育20小时。
鼠李糖基化分析如下进行:将3mMUDP-葡萄糖与拟南芥编码的RHM2鼠李糖合成酶(在大肠杆菌中产生,然后纯化)的N端和C端部分各0.6μg、100mMTris-HCl(pH8.0)、1mMDTT、1.5mMNADPH、1.5mMNAD+、6μgBSA、1mMMgCl2和1%牛小肠磷酸酶混合。反应混合物于30℃温育30分钟,以便UDP-葡萄糖转化为UDP-鼠李糖。然后向混合物中加入1.5mM甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷底物和约0.5μgUGT91D2e酶,混合物在30℃再温育20小时。
结果表明UGT91D2e能够以在UDP-葡萄糖中观察到的速率的一半到三分之一将甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷底物木糖基化,形成1,2-木糖基化的甜菊醇-13-O-单糖苷,即莱鲍迪苷F的前体。UGT91D2e能够以在UDP-葡萄糖中观察到的大概相同的速率将甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷底物鼠李糖基化,形成1,2-鼠李糖基化的甜菊醇-13-O-单糖苷,即莱鲍迪苷C的前体(杜尔可苷B)。这些结果表明体内合成合适的前体分子和表达合适的UGTs莱鲍迪苷F和C。参见图2B和2D。
还测试了UGT91D2e在体外将甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷以外的底物(即甜叶悬钩子苷、甜菊醇-1,3-二糖苷和1,3-甜菊苷)1,2-葡糖基化的能力。结果表明当有1,3-结合的葡萄糖(例如甜菊醇1,3-二糖苷和1,3-甜菊苷)时,UGT91D2e没有活性,而即使19-O位点存在主要葡糖基化,UGT91D2e都有活性。这些结果显示可能rebA形成的体内甜菊途径中不存在甜菊醇1,3-二糖苷和1,3-甜菊苷。参见图2A和图3。
实旋例16-UGT91D同源物
不同生态型甜叶菊在遗传上是多样化的。对来自不同甜菊RNA登录的91Ds的96个克隆进行的考察揭示了6个被考察生态型之间的许多氨基酸变化(例如,在核苷酸74(导致氨基酸G到D的变化)、89(Y到F)、131(V到A)、137(F到S)、278(P到Q)、295(S到V或P)、331(E到Q)、365(Y到F)、395(A到V)、418(H到Y)、425(S到G)、431(T到I)、442(A到T)、454(M到L)、458(G到A)、466(A到S)、485(G到D)、583(L到M)、587(V到E)、595(K到E)、614(D到G)、616(G到R)、631(L到M)、637(L到F)、662(S到F)、664(K到E)、671(Y到C)、857(V到A)、867(S到R)、919(F到L)、989(V到A)、1000(R到C)、1090(S到P)、1150(G到C)、1232(L到S)、1281(K到N)、1313(E到A)、1354(Q到R)和1369(V到I)),编号是根据SEQIDNO:9中给出的91D2e核苷酸进行的。还提到了这些多态性的一些其他变异,可能是由于测序或PCR错误造成的,特别是如果只发现了一次的多态性。选择了20个编码区做进一步分析。参见表14中对分离到的克隆的描述。表14中氨基酸的编号基于SEQIDNO:5中给出的UGT91D2e的氨基酸序列。
表14
使用13-SMG作为底物,测试了表14中所有克隆的活性。克隆5有微弱的1,2-糖基化活性,而其他19个克隆在测试条件下似乎没有活性。SEQIDNO:95给出了克隆5的序列,相对野生型UGT92D2e(SEQIDNO:5)含有以下突变:G206R、Y207C和W343R。
实施例17-UGT85C同源物
检验了来自6个不同甜叶菊生态型的UGT85Cs的遗传多样性,以便鉴定在甜菊糖苷生产途径中具有相同或提高的活性的同源物。设计了对UGT85C基因的特异PCR引物,在cDNA上进行了PCR反应(一些用cDNA文库进行,一些用cDNA制品进行)。得到的PCR产物被克隆,对96个克隆进行了测序。对氨基酸多态性进行了基因定位,选择了其中16个有不同程度的共有多态性的UGT85C克隆。参见表15。还记录了一些克隆的额外的修饰,但可能是因为PCR错误或者不是共有的多态性。对多态性的描述是基于登录号AY345978.1(见表8)中给出的野生型甜叶菊UGT85C核苷酸序列的核苷酸和氨基酸编号。
表15
如前面的实施例所述,将克隆通过体外偶联转录-翻译(QuickforPCRDNA试剂盒,Promega)PCR产物进行表达并用底物甜菊醇和甜菊醇-19-O-葡萄糖苷(0.5mM)分析糖基化活性。克隆1、4、16、17、19、20、21、26、29、30、31、37和39产生的UGT85Cs是可溶性的,在90分钟检验法中能够将19-SMG转化为甜叶悬钩子苷。克隆27产生的UGT85C被认为是不溶的。虽然克隆2和3产生的UGT85Cs被认为是不溶的,有痕量的甜叶悬钩子苷产生,尽管看不到蛋白条带。这些试验独立进行了三次。试验显示以下氨基酸的突变没有造成活性的丢失:V13F、F15L、H60D、A65S、E71Q、I87F、K220T、R243W、T270M、T270R、Q289H、L334S、A389V、I394V、P397S、E418V、G440D和H441N。有活性克隆中看到的其他突变包括克隆37中的K9E、克隆26中的K10R、克隆2中的Q21H、克隆30中的M27V、克隆4中的L91P、克隆31中的Y298C、克隆37中的K350T、克隆1中的H368R、克隆19中的G420R、克隆4中的L431P、克隆16中的R444G和克隆30中的M471T。
唯一没有测试的共有多态性是T270A和I336T,两者都是相当保守的取代。克隆17与UGT85C相比包含了最多变化,6/480氨基酸。似乎可能发生变化的17-20个氨基酸代表了氨基酸水平上大概4%的差别。
通常,85Cs中有较低的遗传多样性,有可能表15中含有共有多态性的全部85C同源物都有活性。
实施例18-UGT76G同源物
对来自6个不同甜叶菊生态型的UGT76Gs的遗传多样性进行了检验以便鉴定在甜菊糖苷生产途径中有相同或更高活性的同源物。设计了对UGT76G特异的PCR引物,在cDNA上进行了PCR反应(cDNA文库或cDNA制品)。得到的PCR产物被克隆,对96个克隆进行了测序。共有的氨基酸多态性进行了基因定位,选择了其中16个有不同程度的共有多态性的UGT76G克隆,包括(氨基酸编号):R10S、I16L、F22V、M29I、K52S、V74K/E、P80S、L85A、V87S/G、L91P、I92F、I93F、H96Y、G97R、L108V、E113D、G116E、A123T、Q125A、I126L、Y128H、T130A、L142I、V145M、S147N、N151T、F152I、H153L、H155Y、V156D、Q160L、E163D、L167F、P169L、K188N、K191Q、C192S/F、S193G/A、F194Y、M196N、K198Q、K199(I,V,Q)、Y200(L,A,G)、Y203I、F204L、E205G、N206K、I207M、T208I、V217I/F、E226Q、S228P、L230V、V233I、I234T、E236D、I237F、S253P、P266Q、S273P、R274S、G284T/A、T285S、287-3bp缺失、R298H、P326A、L330V、G331A、P341L、L346I、S376L、D377A、G379A、L380F、S438P和K441N。通常76Gs有非常高的多样性。
按照前面实施例的描述,克隆通过体外翻译进行了表达,并利用0.5mM甜菊醇-13-O-葡萄糖苷和0.5mM甜菊苷作为底物分析糖基化活性。反应在30℃进行90分钟。在三个被指定为76G_C4、76G_G7和76G_H12的新的76Gs中发现了天然的76G1活性,因为使用甜菊醇-13-O-葡萄糖苷作为底物时形成了1,3-二糖苷。这种情况中是通过与阳性对照,即有功能的76G1比较确定活性。克隆76G_G7和76G_H12比对照产生的RebA水平略高,而76G_C4比对照产生的Reb略少。这些克隆中改变的数量代表与对照酶在氨基酸水平上大约7%的差别。SEQIDNOs:98、100和102分别给出了76G_C4、76G_G7和76G_H12的氨基酸序列。SEQIDNOs:97、99和101分别给出了编码76G_C4、76G_G7和76G_H12的核苷酸序列。SEQIDNOs:98、100和102分别给出了76G_C4、76G_G7和76G_H12的氨基酸序列。SEQIDNOs:97、99和101分别给出了编码76G_C4、76G_G7和76G_H12的核苷酸序列。
表16总结了具有活性的76G克隆相对野生型酶的氨基酸变化。活性克隆中有大量重叠的多态性,因此预计这些多态性不含导致酶活性的丢失。某些突变在失活克隆中似乎经常出现,比如位点80的P→S突变和位点22的F→V突变。
表16
实施例19-截短的酵母HMG-CoA还原酶和其他HMG-CoA还原酶的表达
在酿酒酵母中,甲羟戊酸途径受到大量调控,例如在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的酶水平调节。表达截短的HMG-CoA还原酶(tHMG1,编码被稳定化不会被降解的酶)是提高酵母中流向PPP生产的一种方法。例如,tHMG1在酵母中的表达导致过量生产β-胡萝卜素。参见Verwaaletal.,2007,Appl.Environ.Microbiol.73:4342。有趣的是,这样的酵母没有象预期的那样在固体培养基上呈现更深的桔色,而是更深的黄色,可能是由于中间产物八氢番茄红素过表达更高。
为了确定是否可以利用表达HMG-CoA还原酶来提高向甜菊醇和甜菊糖苷途径的流量,通过用CUP1启动子代替ERG9基因的先天启动子制备了用于测试异戊二烯流量的酵母报告菌株。参见2010年5月20日提交的美国专利申请61/346853。
表17显示了用于制备所述酵母菌株的基因。根据DNA2.0IncTM将来自来源生物的基因进行密码子优化。为了监测细胞异戊烯基磷酸酯的可得性,制备了带有高拷贝数质粒的构建体,所述质粒含有的基因表达盒(甲硫氨酸抑制性启动子)有异戊烯磷酸酯转化为β-胡萝卜素所需的三种酶(来自红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)的GGPP合酶;来自红发夫酵母(X.dendrorhous)的八氢番茄红素合酶和β-胡萝卜素合酶;以及来自粗糙脉孢霉(Neurosporacrassa)的ζ胡萝卜素合酶和δ胡萝卜素合酶)的基因。参见Verwaaletal.,2007同前;和美国专利申请61/346853。
表17HMGCoA还原酶和其他甲羟戊酸基因的来源
在基于CEN.PK的产生β胡萝卜素的酵母菌株中表达酵母菌tHMG1,导致颜色从桔色变为浅黄。有趣的是,表达来自黄花蒿、克氏锥虫和金黄色葡萄球菌的全长HMGs以及来自Pseudomonasmevalonii和闪烁古生球菌的NADH依赖性HMG’s产生类似的结果,这表明这些基因也提高了酵母中经由甲羟戊酸途径的流量(牛HMG的类似过表达没有这样的效应)。最后,在过表达婴儿利什曼虫乙酰CoAC-乙酰转移酶(甲羟戊酸途径的第一个酶,表17有描述)或自然酿酒酵母(CAB1,YDR531W)或芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌(登录号YP004204141)泛酸激酶(已知会提高乙酰CoA的产生)后可以看到相同的颜色变化。
为了测试这些试验中的颜色变化的确是由于更高的GGPP可得性,在稳定的19-SMG产生菌株中表达了酵母tHMG1、P.mevalonii或金黄色葡萄球菌HMGs、或者枯草芽孢杆菌泛酸激酶。这些构建体在测试条件下似乎都没有产生更多的19-SMG或甜叶悬钩子苷(UGT85C2共表达的)。给酵母报告菌株饲喂甲羟戊酸也没有造成甜叶悬钩子苷产量提高。但是甜叶悬钩子苷报告菌株没有被基因改造以减少ERG9编码的向麦角固醇生物合成的流向。预期利用对β胡萝卜素产生有益的HMG还原酶基因和其他甲羟戊酸途径基因来控制向麦角固醇生产方向的流量可以造成甜菊糖苷生产的提高。
实施例20-RebC的体内生产
实施例15中显示了莱鲍迪苷C前体分子甜菊醇-13-O-吡喃葡萄糖基-1,2-鼠李糖苷的体外合成。在那个实施例中,甜菊醇-13-O-单葡萄糖苷和UDP-葡萄糖、拟南芥RHM2酶(基因座标签AT1G53500)和UGT91D2e一起被作为底物。为了进一步展示图2B中显示的途径,完成了体内由甜菊醇到莱鲍迪苷C的产生。
构建了能够产生莱鲍迪苷C的酵母菌株,通过LC-MS分析莱鲍迪苷C和莱鲍迪苷A的产量。构建了经过改造的酿酒酵母菌株BY4742并制定为EYS583-7A。Naesbyetal.,Microb CellFact.8:45(2009)中描述过BY4742的使用。全部四种UGTs(91D2d、76G1、74G1和85C2)利用GPD启动子在质粒中组成性表达。Naesbyet.al,MicrobCellFact.8:45(2009)描述过这种类型的菌株。UGT85C2被插入到质粒P423GPD(ATCC#87355)中,UGT74G1被克隆到P424GPD(ATCC#87357)中,UGT91D2e和UGT76G1均被克隆到P425-GPD(ATCC#87359)中;其中91D2e在本来的多克隆位点(MCS),76G1插入后有额外的GPD启动子和CYC终止子。将得到的菌株转化质粒P426GPD(ATCC#87361),该质粒含有从GPD启动子开始表达的RHM2基因。将菌株在缺少组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的SC培养基上生长24小时。然后将培养物接种到含有25μM甜菊醇的新鲜培养基中至OD600为0.4,允许酵母生长72小时,然后检测上清和细胞沉淀中是否存在莱鲍迪苷C。使用认证的莱鲍迪苷C标准(Chromadex,IrvineCA)给莱鲍迪苷C定量。上清中检测到总共1.27μM±0.36μM的RebC。类似地,在细胞沉淀中检测到3.17μM±1.09μMRebA。本领域技术人员可以认识到通过调整RHM2酶的活性和/或使用对UDP-鼠李糖反应的活性更高的类UGT91D2e或UGT76G1酶,可以得到不同的RebC对RebA的比率。替代的UGTs可以是野生型酶的突变版本或者新发现的独特的酶。
本领域技术人员可以认识到能够由葡萄糖产生莱鲍迪苷A的酵母菌株(比如实施例12中转化了含有UGT91D2e和UGT76G1的质粒的菌株CEY213)在通过载体或者整合到染色体添加了RHM2基因时会产生莱鲍迪苷C。
实施例21-在大肠杆菌中利用表达的UGTs生产甜菊糖苷UGT酶在革兰氏阴性细菌
中的活性
将UGTs91D2e、74G1、76G1和85C2的野生型基因利用购自Novagen(EMD4Biosciences,Madison,WI)的pET30载体系统(除了UGT91D2e是被克隆到pGEX4T-1(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)载体中)各自克隆到大肠杆菌XjB-自溶BL21(DE3)细胞中。实施例7和10中描述了类似的克隆。所有载体都使用IPTG诱导性启动子。按照商家的描述将质粒DNA转化到化学感受态细胞中。
将呈现所需抗生素抗性的转化子于30℃在使用NZCYM-培养基和抗生素的2mL培养液中生长过夜。对于体内饲喂,生长了5份培养物:单独的UGT91d2e、74G1、76G1和85C2,以及所有4种克隆的混合。第二天,对培养物进行诱导,达到终浓度0.3mMIPTG和3mM阿拉伯糖,于20℃在有50μM甜菊醇(UGT74G1、UGT85C2和四重混合物)或50μM甜叶悬钩子苷(UGT91D2e和UGT76G1)的情况下生长2天。将温度提高到30℃,细胞再生长一天。然后通过4000rpm离心5分钟收集细胞,移取上清进行LC-MS分析。将细胞重悬在50%DMSO中,80℃裂解5分钟,经LC-MS分析裂解物。
对于体外分析,将呈现所需抗生素抗性的转化子于30℃在使用NZCYM-培养基和抗生素的2mL培养液中生长过夜。第二天,对培养物进行诱导,达到终浓度0.3mMIPTG和3mM阿拉伯糖,于20℃生长24小时。然后通过4000rpm离心5分钟收集细胞并重悬在200μLGT缓冲液(RBCBioscience)和3片蛋白酶抑制剂Completemini(Roche)/100ml中,转移到Eppendorf管中,涡旋混匀,在-80℃冷冻1.5小时。细胞在冰上融化,置于室温3分钟。当大约一半融化时,向每个管中加入15μl0.14mg/mlH2ODNase溶液+30μl0.05MMgCl2,样品在室温下温育大约5分钟。细胞在最高速下离心5分钟。取100μL上清(裂解物)转移到新鲜离心管中,加入100μL甘油。
酶分析的进行加入了15.15μLH2O,7.5μL4XBuffer(400mMTris,20mMMgCl2,4mMKCl)、0.3μL来自Fermentas的FastAPTM(1u/μL)、0.45μL100mMUDP-葡萄糖储液、0.6μL底物(甜菊醇或甜叶悬钩子苷)和6μL如上所述的粗酶制品。将UGT74G1、UGT85C2以及四种UGTs的混合物与甜菊醇温育。UGT76G1和85C2与甜叶悬钩子苷温育。酶分析在37℃温育过夜。4000rpm离心5分钟后,取30μL样品转移到新鲜的96孔板并加入30μLDMSO。然后将样品进行LC-MS分析。还用甜菊醇1,2-二糖苷(给UGT76G1和UGT74G1)或莱鲍迪苷B(给UGT74G1)作为底物进行了类似的体外试验。
体内饲喂中没有检测到活性。表18阐述了体外分析的结果。
表18
这些结果表明UGT酶在大肠杆菌细胞中都有活性。但是,底物可能不容易被输入到细胞质中。预计如果在大肠杆菌中甜菊醇是由前体途径产生的,由葡萄糖产生各种甜菊糖苷产品就是可行的。没有预料到底物特异性略有重叠的74G1和85G1UGTs可以单独由甜菊醇产生甜叶悬钩子苷。四种粗酶制品的混合物给出了非常低水平的单糖苷,这说明向二和三糖苷的转化是充分的。对于UGT91D2e,所用的制品在长期保存后失去了某些原来的活性。我们预计新鲜的酶制品应当会产生更高水平的莱鲍迪苷A。
实施例22-小立碗藓中的甜菊糖苷产生
在苔藓细胞中的饲喂试验
利用美国专利公开20100297722中描述的pTHUbi:Gateway载体系统,将UGT91d2e、74G1、76G1和85C2的基因克隆到小立碗藓中。该载体使用的是玉米的泛素强启动子。PCR引物是前面实施例中设计用于扩增编码区(自然序列)的引物,在起始密码子的上游添加了“CACC”。质粒DNA用SwaI消化并用于转化到原生质体(通常大约0.5x106个原生质体)中。将呈现所需抗性的转化子在10mL培养基中生长1天,然后如表19所示饲喂甜菊醇、甜叶悬钩子苷或者缓冲液+DMSO。每10mL培养物加入0.5mL含有底物的缓冲液,并向培养物中加入终浓度0.1%的DMSO、50μM甜菊醇或甜叶悬钩子苷、和0.125mM磷酸缓冲液。阳性对照是在有甜菊醇或只有缓冲液和DMSO的情况下表达YFP(黄色荧光蛋白)。培养物再生长2天,然后分离细胞并在液氮中冷冻直至进一步分析。一些情况中,将多个含有UGT的质粒转化到相同原生质体细胞中以阐释苔藓细胞内的多步骤转化。
表19
荧光信号观察测量到对照(管1和2)的表达是阳性的。试验得到的上清经LC-MS分析;将200μL每个上清样品与等体积的50%DMSO混合。将样品快速转(15,700相对离心力,10分钟),取100微升得到的上清经LC-MS分析。
原生质体沉淀在冰上融化,加入含有3片蛋白酶抑制剂CompleteMini(Roche)/100ml的10mMTris-HClpH8至终体积150μL。将溶液分为两份:取75μL转移到新管子中,离心沉淀原生质体(15,700相对离心力,1分钟)。沉淀用75μLMilli-Q水清洗,然后重悬在150μLDMSO(50%)中。然后将样品加热(80摄氏度,10分钟)、涡旋混匀并离心(15,700相对离心力,10分钟)。取50μL得到的上清经LC-MS分析。
上清和沉淀中都没有检测到甜菊糖苷产生。甜菊醇和甜叶悬钩子苷是否能被转运到苔藓细胞内是未知的。
沉淀提取物的体外饲喂
对样品1、3、4、5、6、11、13和17进行了体外饲喂试验。向剩下的75μL原来的重悬液中加入玻璃珠(425-600微米),通过在4摄氏度涡旋混匀3次(涡旋混匀之间保存在冰上),每次2分钟将原生质体机械破裂。将样品快速旋转(15,700相对离心力,10分钟,4摄氏度),取6μL得到的上清用于体外酶反应。酶反应使用了FastAPTM磷酸酶(Fermentas)(0.3U/反应),UDP-葡萄糖:底物的比率是5。根据表20,样品被饲喂甜菊醇或甜叶悬钩子苷。
表20
细胞提取物来自的管号 | UGT基因 | 饲喂的底物 |
1 | YFP | 无 |
1 | YFP | 0.5mM甜菊醇 |
1 | YFP | 0.5mM甜叶悬钩子苷 |
3 | 74G1 | 0.5mM甜菊醇 |
4 | 76G1 | 0.5mM甜叶悬钩子苷 |
5 | 85C2 | 0.5mM甜菊醇 |
6 | 91D2E | 0.5mM甜叶悬钩子苷 |
11 | 74G1/85C2 | 0.5mM甜菊醇 |
13 | 74G1/85C2/91D2E | 0.5mM甜菊醇67 --> |
17 | 76G1/91D2E | 0.5mM甜叶悬钩子苷 |
反应在30℃温育过夜。温育后,向样品中加入等量的DMSO(100%)并混匀,然后将样品快速旋转(15,700相对离心力,10分钟),取30μL得到的上清经LC-MS分析。
LC-MS分析显示甜叶悬钩子苷被UGT76G1转化为1,3-甜菊苷。没有检测到其他甜菊糖苷。不知道中欧葫芦藓中是否发生UGTs的可溶性表达。我们预计如果一个UGT在苔藓细胞中有活性,其他UGT如果发生了表达应当也有活性。此外,克隆是以瞬时的方式进行的。基因的稳定整合预计会产生其他测试时有UGT活性的克隆。
提高重组蛋白可溶性表达的方法是本领域技术人员已知的。替代的启动子、核糖体结合位点、密码子使用、与伴侣分子共表达以及改变温度是提高重组蛋白可溶性表达的方法的非限制性例子。
实施例23--构巢曲霉中的甜菊糖苷产生
UGT酶在真菌细胞中的活性
利用PCR构建的表达盒和USER载体系统将UGT91D2e、74G1、76G1和85C2的天然基因克隆到构巢曲霉中。克隆方法在Hansenetal.,Appl.Environ.Microbiol.77:3044-3051(2011)中有描述。简单来说,将编码每个UGT的核苷酸序列插入到载体的组成型PgpdA启动子和TtrpC终止子之间,所述载体含有额外两个用于基因组整合的定靶序列和作为选择标记的argB。按照Nielsenetal.,FungalGenet.Biol.43:54-64(2006)andJohnstoneetal.,EMBOJ.4:1307-1311(1985)将质粒DNA转化到构巢曲霉原生质体中。将呈现所需抗性的转化子在150mL使用基本培养基(1%葡萄糖、10mMNaNO3、矿物质混合物)的培养基中生长48小时。
利用玻璃珠破坏菌丝制备的细胞裂解物被用于确定各个UGT的体外活性。表达74G1和85C2的菌株的细胞裂解物与0.5mM甜菊醇,表达76G1和91D2e的菌株的裂解物与0.5mM甜菊醇-13-O-葡萄糖苷温育24小时,利用LC/MS进一步分析上清。没有检测到甜菊糖苷。
不知道UGT酶是否实现了可溶性表达,因为这些产物一般在SDS-PAGE上是看不到的。鉴于曲霉和酵母都是真菌,预计更多试验会得到活性克隆。提高重组蛋白可溶性表达的方法是本领域技术人员已知的。替代的启动子、诱导物水平、核糖体结合位点、密码子使用、与伴侣分子共表达以及改变温度是提高重组蛋白可溶性表达的方法的非限制性例子。
其他实施方案
应当理解,虽然结合详细的说明书对发明进行了描述,以上描述旨在对发明的阐述而非对发明范围的限制,发明范围由所附权利要求限定。其他方面、优点和改进都在以下权利要求的范围内。
以下部分对应于母案申请的权利要求书:
1.重组宿主,其包含编码UGT91D2多肽的重组基因。
2.项1所述的重组宿主,其中所述UGT91D2多肽是UGT91D2e或UGT91D2m。
3.项1或2所述的重组宿主,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列有至少90%的同一性。
4.项3所述的重组宿主,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列有至少95%的同一性。
5.项4所述的重组宿主,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5中给出的氨基酸序列有至少99%的同一性。
6.项1-5中任一项所述的宿主,其中所述宿主是微生物。
7.项6所述的宿主,其中所述微生物是酵母属微生物。
8.项6所述的宿主,其中所述酵母属微生物是酿酒酵母。
9.项6所述的宿主,其中所述微生物是大肠杆菌。
10.项1-5中任一项所述的宿主,其中所述宿主是植物或植物细胞。
11.项10所述的宿主,其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或烟草植物或植物细胞。
12.项11所述的宿主,其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞。
13.项1-12中任一项所述的宿主,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。
14.项1-13中任一项所述的宿主,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。
15.项14所述的宿主,其中所述多肽相对SEQIDNO:5包含位于残基206的精氨酸,位于残基207的半胱氨酸和位于残基343的精氨酸。
16.项14所述的宿主,其中所述多肽相对SEQIDNO:5包含位于残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸。
17.项1-15中任一项所述的宿主,其中所述多肽包含SEQIDNO:95的氨基酸序列。
18.项1-12中任一项所述的宿主,其中所述多肽包含SEQIDNO:5的氨基酸序列。
19.项1-18中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码与SEQIDNO:3给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT85C多肽的重组基因。
20.项19所述的宿主,其中所述UGT85C多肽包含位于SEQIDNO:3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。
21.项1-20中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性的UGT76G多肽的重组基因。
22.项21所述的宿主,所述UGT76G多肽包含位于SEQIDNO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。
23.重组宿主,所述宿主包含的重组基因编码的UGT85C多肽与SEQIDNO:3中给出的氨基酸序列有至少90%同一性,并且有位于SEQIDNO:3中的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代。
24.项23所述的宿主,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:3的残基13、15、60、270、289和418的取代。
25.项23所述的宿主,其中所述多肽包含a)位于SEQIDNO:3的残基13、60和270的取代;b)位于SEQIDNO:3的残基60和87的取代;c)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、243和270的取代;d)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、243、270和441的取代;e)位于SEQIDNO:3的残基65、71、220、389和394的取代;f)位于SEQIDNO:3的残基65、71、270和289的取代;g)位于SEQIDNO:3的残基15和65的取代;h)位于SEQIDNO:3的残基65和270的取代;i)位于SEQIDNO:3的残基65和440的取代;j)位于SEQIDNO:3的残基65和441的取代;k)位于SEQIDNO:3的残基65和418的取代;1)位于SEQIDNO:3的残基220、243、270和334的取代;或者m)位于SEQIDNO:3的残基270和289的取代。
26.重组宿主,其包含的重组基因编码的UGT76G多肽与SEQIDNO:7给出的氨基酸序列有至少90%同一性,并且有位于SEQIDNO:7中残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代。
27.项26所述的宿主,其中所述多肽含有a)位于氨基酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208和291的取代;b)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285和291的取代;或者c)位于残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的取代。
28.项23-27中任一项所述的宿主,其中所述宿主是微生物。
29.项28所述的宿主,其中所述微生物是酵母属微生物。
30.项29所述的宿主,其中所述酵母属微生物是酿酒酵母.
31.项28所述的宿主,其中所述微生物是大肠杆菌。
32.项23-27中任一项所述的宿主,其中所述宿主是植物或植物细胞。
33.项32所述的宿主,其中所述植物或植物细胞是甜菊、中欧葫芦藓或者烟草植物或植物细胞.
34.项33所述的宿主,其中所述甜菊植物或植物细胞是甜叶菊植物或植物细胞.
35.项1-34中任一项所述的宿主,所述宿主含包含编码UGT74G1多肽的基因。
36.项35所述的宿主,其中所述编码所述UGT74G1多肽的基因是重组基因。
37.项1-36中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个:
(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因;
(ii)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;和
(iv)编码甜菊醇合成酶的基因。
38.项1-37中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个:
(v)编码截短的HMG-CoA还原酶的基因;
(vi)编码CPR的基因;
(vii)编码鼠李糖合成酶的基因;
(viii)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因;和
(ix)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因。
39.项38所述的宿主,其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)、(vii)、(viii)或(ix)中的至少一个基因是重组基因。
40.项37所述的宿主,其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的每个基因都是重组基因。
41.分离的核酸,其编码与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性的多肽。
42.项41所述的核酸,其中所述多肽与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少95%同一性。
43.项41或42所述的核酸,其中所述多肽与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少99%同一性。
44.项41-43中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。
45.项41-44中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438中的一或多个残基的氨基酸取代。
46.项41-45中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中残基206的精氨酸、残基207的半胱氨酸和残基343的精氨酸。
47.项41-45中任一项所述的核酸,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5的残基位点30的苯丙氨酸、残基位点93的谷氨酰胺、残基位点99的缬氨酸、残基位点122的苯丙氨酸、残基位点140的酪氨酸、残基位点142的半胱氨酸、残基位点148的苏氨酸、残基位点153的丙氨酸、残基位点156的丝氨酸、残基位点195的甲硫氨酸、残基位点196的谷氨酸、残基位点199的谷氨酸、残基位点211的甲硫氨酸、残基位点221的苯丙氨酸、残基位点286的丙氨酸、残基位点427的天冬酰胺或者残基位点438的丙氨酸。
48.分离的多肽,其具有与IDNO:5的氨基酸序列有至少90%同一性的氨基酸序列。
49.重组宿主,所述宿主包含:
(i)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因;
(ii)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(iii)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;和
(iv)编码甜菊醇合成酶的基因;
其中所述基因中的至少一个是重组基因。
50.项49所述的宿主,其中所述宿主被培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生甜菊醇。
51.项50所述的宿主,其中当培养在所述条件下时,所述甜菊醇累积到至少1mg/L培养基。
52.项49-51中任一项所述的宿主,其中所述香叶基香叶基焦磷酸合酶与SEQIDNOs:121-128给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
53.项49-52中任一项所述的宿主,其中所述柯巴基焦磷酸合酶与SEQIDNOs:129-131给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
54.项49-53中任一项所述的宿主,其中所述异贝壳杉烯合酶与SEQIDNOs:132-135给出的氨基酸序列有90%以上的序列同一性。
55.项49-54中任一项所述的宿主,其中所述异贝壳杉烯氧化酶与SEQIDNOs:138-141给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性.
56.项49-55中任一项所述的宿主,其中所述甜菊醇合成酶与SEQIDNOs:142-146给出的氨基酸序列之一有90%以上的序列同一性。
57.项49-56中任一项所述的宿主,还包含编码截短的HMG-CoA的基因。
58.项49-57中任一项所述的宿主,还包含编码CPR的基因。
59.项49-58中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码UGT74G1多肽的基因。
60.项49-59中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码UGT85C2多肽的基因。
61.项49-60中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码UGT76G1多肽的基因。
62.项49-61中任一项所述的宿主,所述宿主还包含编码UGT91D2多肽的基因。
63.项59-62中任一项所述的宿主,其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
64.项63所述的宿主,其中所述甜菊糖苷选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。
65.项64所述的宿主,其中当培养在所述条件下时,所述甜菊糖苷累积到至少1mg/升培养基。
66.项65所述的宿主,其中当培养在所述条件下时,所述甜菊糖苷累积到至少10mg/升培养基。
67.项66所述的宿主,其中当培养在所述条件下时,所述甜菊糖苷累积到至少20mg/升培养基。
68.项49-67中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个
i)编码脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因;
ii)编码D-1-脱氧木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)的基因;
iii)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇合酶(CMS)的基因;
iv)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)的基因;
v)编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合酶(MCS)的基因;
vi)编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸合酶(HDS)的基因;
vii)编码1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯基4-焦磷酸还原酶(HDR)的基因。
69.项49-68中任一项所述的宿主,所述宿主还包含下述中的一或多个:
ix)编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶的基因;
x)编码截短的HMG-CoA还原酶的基因;
xi)编码甲羟戊酸激酶的基因;
xii)编码磷酸甲羟戊酸激酶的基因;
xiii)编码甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶的基因。
70.项49-69中任一项所述的宿主,其中所述基因中的一或多个是可诱导性的。
71.项49-70中任一项所述的宿主,其中所述宿主是微生物、植物或植物细胞。
72.项71所述的宿主,其中所述宿主是酿酒酵母。
73.生产甜菊醇或甜菊糖苷的方法,所述方法包括:
a)将项71或72所述的宿主在所述基因能够得以表达的条件下生长在培养基中;和
b)回收所述宿主产生的甜菊醇或甜菊糖苷。
74.项73所述的方法,其中所述生长步骤包括诱导一或多个所述基因的表达。
75.项73或74所述的方法,其中所述甜菊醇或甜菊糖苷选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜菊醇-19-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F和杜尔可苷A。
76.重组酵母属菌株,其包含:
(i)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者
(ii)编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
其中所述菌株在表达所述柯巴基焦磷酸合酶和所述异贝壳杉烯合酶时即产生对映-异贝壳杉烯。
77.分离的核酸,其与SEQTDNOs:18-25、34-36、4-43、48、49、52-55、60-64、70-72、77或79给出的核苷酸序列之一有90%以上的序列同一性。
78.重组宿主,所述宿主包含:
(i)编码UGT74G1的基因;
(ii)编码UGT85C2的基因;
(iii)编码UGT76G1的基因;和
(iv)编码UGT91D2的基因,
其中所述基因中的至少一个是重组基因。
79.项78所述的宿主,其中每个所述基因都是重组基因。
80.项78或79所述的宿主,其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
81.项78-80中任一项所述的宿主,还包含
(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;
(c)编码甜菊醇合成酶的基因;
(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
82.项78-81中任一项所述的宿主,其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A。
83.分离的核酸,其编码的多肽与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性,除去UGT91D2m的氨基酸序列。
84.分离的多肽,其与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列有90%以上的序列同一性,除去UGT91D2m的氨基酸序列。
85.由项78-81中任一项所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物相对甜菊提取物含有的来自甜菊植物的杂质水平下降。
86.重组宿主,所述宿主包含:
(i)编码UGT91D2的重组基因;
(ii)编码UGT74G1的重组基因;
(iii)编码UGT85C2的重组基因;和
(iv)编码UGT76G1的重组基因;和
(v)编码鼠李糖合成酶的基因,
其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
87.项86所述的宿主,还包含
(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;
(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和
(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
88.项86或87的宿主,其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷C或杜尔可苷A。
89.由项86或87所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量15%以上的莱鲍迪苷C,并且相对甜菊提取物来自甜菊植物的杂质水平下降。
90.由项86或87所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量15%以上的杜尔可苷A,并且相对甜菊提取物来自甜菊植物的杂质水平下降。
91.重组宿主,所述宿主包含:
(i)编码UGT91D2的重组基因;
(ii)编码UGT74G1的重组基因;
iii)编码UGT85C2的重组基因;和
(iv)编码UGT76G1的重组基因;
其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
92.项91所述的宿主,还包含
(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;
(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和
(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
93.项91或92所述的宿主,其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷D或莱鲍迪苷E。
94.由项91或92所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷D,并且相对甜菊提取物来自甜菊植物的杂质水平下降。
95.由项91或92所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷E,并且相对甜菊提取物来自甜菊植物的杂质水平下降。
96.重组宿主,所述宿主包含:
(i)编码UGT91D2的重组基因;
(ii)编码UGT74G1的重组基因;
(iii)编码UGT85C2的重组基因;
(iv)编码UGT76G1的重组基因;
(v)编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因;和
(vi)编码UDP-葡糖醛酸脱羧酶的基因,
其中所述宿主当培养在每个所述基因都能得以表达的条件下时产生至少一种甜菊糖苷。
97.项96所述的宿主,还包含
(a)编码双功能柯巴基焦磷酸合酶和异贝壳杉烯合酶的基因,或者编码柯巴基焦磷酸合酶的基因和编码异贝壳杉烯合酶的基因;
(b)编码异贝壳杉烯氧化酶的基因;
(c)编码甜菊醇合成酶的基因;和
(d)编码香叶基香叶基焦磷酸合酶的基因。
98.项96或97所述的微生物,其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷F。
99.由项96或97所述的宿主产生的甜菊糖苷组合物,所述组合物含有占全部甜菊糖苷重量4%以上的莱鲍迪苷F,并且相对甜菊提取物来自甜菊植物的杂质水平下降。
100.产生甜菊糖苷组合物的方法,其包括:
a)将项86-88、91-93或96-9871中任一项所述的宿主在每个所述基因都能够得以表达的条件下生长在培养基中;和
b)回收所述宿主产生的甜菊糖苷组合物,其中相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物,所述组合物富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A。
101.项100所述的方法,其中所述微生物产生的所述甜菊糖苷组合物相对甜菊提取物,来自甜菊植物的杂质含量下降。
102.食品,其包含相对野生型甜菊植物的甜菊糖苷组合物,富含莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷F或杜尔可苷A的甜菊糖苷组合物。
103.鉴定多态性是否与性状差别关联的方法,所述方法包括:
a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联;和
b)测量所述群体中的植物的性状差别与所述群体中的植物是否存在所述一或多个基因多态性之间的相关性,从而确认所述一或多个基因多态性是否与所述性状的差别关联。
104.制备植物系的方法,所述方法包括:
a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联;
b)鉴定所述群体中的一或多个植物,所述植物中存在至少一个与性状差异关联的基因多态性;
c)将鉴定到的一或多个所述植物自交或者与不同植物杂交产生种子;
d)将从种子长出的至少一个子代植物自交或者与不同植物杂交;和
e)将步骤c)和d)再重复0-5个世代以得到所述植物系,其中所述植物系中存在至少一个所述基因多态性。
105.给甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2′转移第二糖部分的方法,所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二糖部分转移到所述甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。
106.项105所述的方法,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性。
107.项106所述的方法,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少95%同一性。
108.项107所述的方法,其中所述UGT91D2多肽与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少99%同一性。
109.项105-108中任一项所述的方法,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代。
110.项105-109中任一项所述的方法,其中所述多肽包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。
111.项105-110中任一项所述的方法,其中所述甜菊糖苷选自甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷和莱鲍迪苷A。
112.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜叶悬钩子苷,其中所述第二糖部分是葡萄糖,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊苷。
113.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊苷,其中所述第二糖部分是葡萄糖,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷E。
114.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊苷,其中甜菊苷与所述UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在所述合适的反应条件下进行接触以产生莱鲍迪苷D。
115.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊醇-1,2二糖苷。
116.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1,2-木二糖苷。
117.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1,2-鼠李二糖苷。
118.项111所述的方法,其中所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。
119.确定甜菊植物中是否存在某多核苷酸的方法,所述方法包括:
a)将至少一个探针或引物对与来自所述甜菊植物的核酸进行接触,其中所述探针或引物对是编码UGT多肽的多核苷酸特异的,其中所述UGT多肽与SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7有至少90%序列同一性,和
b)确定所述甜菊植物中是否存在所述多核苷酸。
120.用于甜菊生物样品基因作图的试剂盒,所述试剂盒包含对多核苷酸特异扩增的引物对或者特异结合的探针,其中所述多核苷酸编码的UGT多肽与SEQIDNO:5、SEQIDNO:1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7有至少90%序列同一性。
Claims (10)
1.给甜菊糖苷中的葡萄糖的C-2′转移第二糖部分的方法,所述方法包括将甜菊糖苷与UGT91D2多肽和UDP-糖在适合第二糖部分转移到所述甜菊糖苷上的反应条件下进行接触。
2.权利要求1所述的方法,其中所述UGT91D2多肽包含具有以下的多肽:
(a)与SEQIDNO:5给出的氨基酸序列有至少90%同一性;
(b)具有位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代;或
(c)具有位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代。
3.权利要求1所述的方法,其中所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或莱鲍迪苷A。
4.权利要求3所述的方法,其中:
(a)所述甜菊糖苷是甜叶悬钩子苷,所述第二糖部分是葡萄糖,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊苷;
(b)所述甜菊糖苷是甜菊苷,所述第二糖部分是葡萄糖,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷E;
(c)所述甜菊糖苷是甜菊苷,甜菊苷与所述UGT91D2多肽和UGT76G1多肽在所述合适的反应条件下进行接触以产生莱鲍迪苷D;
(d)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生甜菊醇-1,2二糖苷;
(e)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1,2-木二糖苷;
(f)所述甜菊糖苷是甜菊醇-13-O-葡萄糖苷,并且在转移了所述第二糖部分时产生甜菊醇-1,2-鼠李二糖苷;
(g)所述甜菊糖苷是莱鲍迪苷A,并且在转移了所述第二葡萄糖部分时产生莱鲍迪苷D。
5.权利要求1的方法,其中所述体外方法是酶促体外方法或者全细胞体外方法。
6.权利要求5的方法,其中所述全细胞体外方法的细胞是酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或者细菌细胞。
7.能够在细胞液体培养基中生产甜菊糖苷组合物的重组宿主细胞,其包含:
(a)编码能够对甜菊糖苷的13-O-葡萄糖的C2’进行β1,2葡糖基化之多肽的基因;
其中所述多肽将额外的糖部分转移到所述甜菊糖苷中葡萄糖的C2’;
(b)编码能够对甜菊糖苷的19-O-葡萄糖的C2’进行β1,2葡糖基化之多肽的基因;
其中所述多肽将额外的糖部分转移到所述甜菊糖苷中葡萄糖的C2’;和/或
(c)编码能够对甜菊糖苷的13-O-葡萄糖的C3’进行β1,3葡糖基化之多肽的基因;
其中所述基因至少之一是重组基因;
其中所述甜菊糖苷包括甜菊醇-13-O-葡萄糖苷、甜叶悬钩子苷、甜菊苷或者莱鲍迪苷A;并且
其中所述甜菊糖苷组合物包含甜菊苷、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷D、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜菊醇-1,2-木二糖苷和/或甜菊醇-1,2-鼠李二糖苷。
8.鉴定多态性是否与性状差别关联的方法,所述方法包括:
a)确定植物群体中的一或多个基因多态性是否与SEQIDNO:5中给出的多肽及其功能同源物的基因座关联;和
b)测量所述群体中的植物的性状差别与所述群体中的植物是否存在所述一或多个基因多态性之间的相关性,从而确认所述一或多个基因多态性是否与所述性状的差别关联。
9.分离的核酸:
(a)其编码包括以下的多肽:
(i)多肽,其包含位于SEQIDNO:5中残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380或387-473的至少一个氨基酸取代;或
(ii)多肽,其包含位于SEQIDNO:5中选自残基30、93、99、122、140、142、144、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427和438的一或多个残基的氨基酸取代;或
(iii)多肽,其包含在SEQIDNO:5的残基206的精氨酸,残基207的半胱氨酸和残基343的精氨酸;或
(iv)多肽,其包含在SEQIDNO:5的残基30的苯丙氨酸、残基93的谷氨酰胺、残基99的缬氨酸、残基122的苯丙氨酸、残基140的酪氨酸、残基142的半胱氨酸、残基148的苏氨酸、残基153的丙氨酸、残基156的丝氨酸、残基195的甲硫氨酸、残基196的谷氨酸、残基199的谷氨酸、残基211的甲硫氨酸、残基221的苯丙氨酸、残基286的丙氨酸、残基427的天冬酰胺或者残基438的丙氨酸;
(v)SEQIDNO:10的多肽;或者
(b)其编码包括以下的多肽:
(i)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444和471的一或多个氨基酸取代;或
(ii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基13,60和270的氨基酸取代;或
(iii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基60和87的氨基酸取代;或
(iv)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65,71,220,243和270的氨基酸取代;或
(v)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65,71,220,243,270和441的氨基酸取代;或
(vi)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65,71,220,389和394的氨基酸取代;或
(vii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65,71,270和289的氨基酸取代;或
(viii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基15和65的氨基酸取代;或
(ix)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65和270的氨基酸取代;或
(x)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65和440的氨基酸取代;或
(xi)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65和441的氨基酸取代;或
(xii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基65和418的氨基酸取代;或
(xiii)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基220,243,270和334的氨基酸取代;或
(xiv)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基270和289的氨基酸取代;或
(xv)多肽,其包含位于SEQIDNO:3的残基13,15,60,270,289和418的氨基酸取代;或者
(c)其编码包括以下的多肽:
(i)多肽,其包含位于SEQIDNO:7的残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331和346的一或多个氨基酸取代;或
(ii)多肽,其包含位于SEQIDNO:7的残基74,87,91,116,123,125,126,130,145,192,193,194,196,198,199,200,203,204,205,206,207,208和291的氨基酸取代;或
(iii)多肽,其包含位于SEQIDNO:7的残基74,87,91,116,123,125,126,130,145,192,193,194,196,198,199,200,203,204,205,206,207,208,266,273,274,284,285和291的氨基酸取代;或
(iv)多肽,其包含位于SEQIDNO:7的残基74,87,91,116,123,125,126,130,145,192,193,194,196,198,199,200,203,204,205,206,207,208,266,273,274,284,285,291,330,331和346的氨基酸取代;或者
(d)其编码SEQIDNO:1的多肽;或
(e)其编码SEQIDNO:76的多肽;或
(f)其编码SEQIDNO:78的多肽。
10.分离的多肽,其具有与SEQIDNO:5的氨基酸序列有至少90%序列同一性的氨基酸序列;或者,分离的多肽,其具有与UGT91D2e或UGT91D2m的氨基酸序列至少90%的序列同一性;或者,分离的多肽,其具有与SEQIDNO:76所示氨基酸序列至少90%的序列同一性;分离的多肽,其具有与SEQIDNO:78所示氨基酸序列至少90%的序列同一性;分离的多肽,其具有与SEQIDNO:150所示氨基酸序列至少90%的序列同一性。
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