ES2820518T3

ES2820518T3 - Método para producir glucósido de esteviol

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Publication number: ES2820518T3
Application number: ES13769588T
Authority: ES
Inventors: Eiichiro Ono
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2021-04-21
Anticipated expiration: 2033-03-14
Also published as: EP2832858B1; CA2867572A1; JP6189828B2; WO2013146555A1; EP2832858A4; EP2832858A1; JPWO2013146555A1; TW201346035A; UY34708A; AR090487A1; US20150128306A1; US10113154B2; CA2867572C

Abstract

Un método para producir un glucósido de esteviol, que comprende la etapa de hacer reaccionar una proteína según cualquiera seleccionada del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación, con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación: (a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación; y (c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación: **(Ver fórmula)** en donde R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir glucósido de esteviol

La presente divulgación se refiere a un método para producir glucósidos de esteviol, un transformante que expresa mucho esteviol glucosiltransferasas, glucósidos de esteviol producidos por el método y el uso de los mismos.

Las hojas de Stevia rebaudiana contienen un metabolito secundario llamado esteviol, un miembro de los diterpenoides. Los glucósidos de esteviol provocan un gusto dulce que es aproximadamente 300 veces el dulzor del azúcar, y se han usado como edulcorantes no calóricos en la industria alimentaria. La obesidad está creciendo globalmente como un problema social grave, y la demanda para edulcorantes no calóricos crece día a día desde puntos de vista de fomento de la salud y reducción de los costes médicos. Actualmente, el aspartamo y el acesulfamo de potasio, que son derivados de aminoácidos artificialmente sintetizados, se usan como edulcorantes artificiales. Sin embargo, se espera que sea más probable que edulcorantes no calóricos naturales como los glucósidos de esteviol disfruten de la aceptación del público.

El esteviol contenido en las hojas de estevia está modificado con azúcares finalmente a un glucósido llamado rebaudiósido A con cuatro fracciones de glucosa unidas (Fig. 1). Su precursor el triglucósido de esteviol, esteviósido, es más abundante cuantitativamente, y el rebaudiósido A y el esteviósido son los componentes principales de dulzor en estevia. Además de ellos, se conoce la presencia de glucósidos considerados que con intermedios de reacción y análogos con diferentes azúcares.

Los genes de enzimas que codifican la biosíntesis de rebaudiósido A se han aislado mediante un análisis de marcador de secuencia expresada (EST) de estevia (documentos no de patente 1 y 2, documento de patente 1). El esteviol se produce mediante hidroxilación en la posición 13 del ácido ent-kaurenoico, es decir, un precursor del diterpenoide hormona vegetal, giberelinas, por la enzima citocromo P450 ácido ent-kaurenoico 13-hidroxilasa (EK13H) (Fig. 2) (documento no de patente 3, documento de patente 1). El grupo 13-hidroxi del esteviol se glucosila primero (monoglucosilación) por UGT85C2 para producir esteviolmonósido. La posición 2 de la glucosa en la posición 13 del esteviolmonósido se glucosila adicionalmente para formar esteviolbiósido, o el grupo carboxilo de la posición 19 del esteviolmonósido se glucosila para formar un diglucósido de esteviol, llamado rubusósido. El esteviolbiósido o rubusósido así producido se considera que experimenta glucosilación adicional para formar glucósidos de esteviol tal como esteviósido y rebaudiósido A. UGT74G1 y UGT76G1 son conocidos como los genes de enzimas implicados en la formación de glucósidos de esteviol.

Se sabe que UGT74G1 cataliza la glucosilación de la posición 19 del esteviolmonósido (documento no de patente 1). UGT74G1 también cataliza la glucosilación de esteviolbiósido para producir esteviósido que es un triglucósido de esteviol. El contenido de esteviósido es más abundante en las hojas de estevia; se sabe que el esteviósido es aproximadamente de 250 a 300 veces más dulce que el azúcar. Este esteviósido se glucosila adicionalmente por la UGT76G1 para producir tetraglucósido de esteviol, rebaudiósido A, que es el más dulce (de 350 a 450 veces más dulce que el azúcar) y que supuestamente tiene una calidad de gusto favorable.

En el estudio previo (documento no de patente 2) se describen varios tipos de glucosiltransferasas (UGT) mediante el análisis de e St de hojas de estevia. Sin embargo, las actividades enzimáticas detalladas de todas estas enzimas no se han investigado por completo.

[Documentos del estado de la técnica]

[Documentos de patente]

Documento de patente 1: EP 1897 951 B1

[Documentos no de patente]

Documento no de patente 1: Brandle y Telmer (2007) Phytochemistry 68, 1855-1863

Documento no de patente 2: Richman et al (2005) Plant J. 41, 56-67

Documento no de patente 3: Mizutani y Ohta (2010) Annu. Rev. Plant Biol. 61,291-315

Como resultado de estudios exhaustivos, los presentes inventores han tenido éxito en enzimas que catalizan la glucosilación de la glucosa en la posición 19 de glucósidos de esteviol en estevia y secuencias génicas que codifican las enzimas. La presente invención se basa en el hallazgo anterior.

Es decir, la presente invención se describe como sigue.

[1] Un método para producir un glucósido de esteviol, que comprende la etapa de hacer reaccionar una proteína según cualquiera seleccionada del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

(a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación; y

(c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

en donde, R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.

[2] El método según [1] anterior, en donde dicho azúcar en el UDP-azúcar es una hexosa.

[3] El método según [1] anterior, en donde dicho azúcar en el UDP-azúcar es uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.

[4] El método según [1] anterior, en donde dicho azúcar añadido al carboxilo en la posición 19 es una hexosa.

[5] El método según [1] anterior, en donde dicho azúcar añadido al carboxilo en la posición 19 es uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.

[6] El método según [1] anterior, en donde dicho R1 es H o el residuo de azúcar que es un monómero de glucosa, dímero de glucosa o trímero de glucosa.

[7] El método según [1] anterior, en donde dicho compuesto es esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol.

[8] El método según [1] anterior, en donde dicho glucósido de esteviol es esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o una combinación de los mismos.

[9] Un transformante no humano, en el que se introduce un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (c) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 2 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

[10] El transformante según [9] anterior, en donde dicha molécula de azúcar es una hexosa.

[11] El transformante según [9] anterior, en donde dicha molécula de azúcar es una seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.

[12] El transformante según [9] anterior, en donde dicho R1 es H o el residuo de azúcar que es un monómero de glucosa, dímero de glucosa o trímero de glucosa.

[13] El transformante según [9] anterior, en donde dicho compuesto es esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol.

[14] El transformante según [9] anterior, en donde dicho polinucleótido se inserta en un vector de expresión.

[15] El transformante según [9] anterior, que es una planta.

[16] Uso de un transformante no humano para producir un glucósido de esteviol, en donde un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) a (e) a continuación se introduce en el transformante no humano:

(b) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación;

(d) un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación; y

(e) un polinucleótido que hibrida en condiciones muy rigurosas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

[17] Un extracto del transformante según [9] anterior.

[18] Un alimento, composición farmacéutica o material industrial que comprende el extracto según [17] anterior.

[19] Un método para producir un glucósido de esteviol, que comprende usar el transformante no humano según [9] anterior.

[20] El método según [19] anterior, en donde dicho glucósido de esteviol es esteviobiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o una combinación de los mismos.

[21] El método de [19] o [20] anteriores, que comprende además obtener un extracto de dicho transformante.

[22] El método de [21] anterior, que comprende además obtener un alimento, composición farmacéutica o material industrial que comprende dicho extracto.

[23] Una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[24] Un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

[25] El polinucleótido según [24] anterior que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

[26] Uso de una proteína como se ha definido en [1] anteriormente o un polinucleótido que codifica tal proteína para producir un glucósido de esteviol, en donde la proteína se hace reaccionar con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

Según el método reivindicado, se pueden producir glucósidos de esteviol (por ejemplo, rubusósido, esteviósido, rebaudiósido A, etc.) con una alta eficacia. Los transformantes reivindicados tienen un alto contenido de glucósidos de esteviol (por ejemplo, rubusósido, esteviósido, rebaudiósido A, etc.). Según esto, glucósidos de esteviol (por ejemplo, rubusósido, esteviósido, rebaudiósido A, etc.) se pueden extraer y purificar con eficacia de estos transformantes.

La figura 1 muestra los nombres y estructuras de glucósidos de esteviol. En la figura 1, “Glc-Glc (p2— ^1)” indica que “Glc-Glc” se une a través de un enlace glucosídico p2,1, y “Glc-Glc (p3— 1)” indica que “Glc-Glc” se une a través de un enlace glucosídico p3,1.

La figura 2 muestra la ruta biosintética putativa de los glucósidos de esteviol.

La figura 3 muestra los resultados de SDS-PAGE de la proteína UGT de estevia expresada en Escherichia coli. Los patrones de tinción con CBB de la fracción del precipitado y la fracción eluída con una solución de imidazol se muestran en el lado izquierdo y el lado derecho, respectivamente. El asterisco indica la proteína recombinante expresada.

La figura 4 muestra la actividad glucosiltransferasa de la proteína UGT85C2 sobre esteviol.

La figura 5 muestra un cromatograma de glucósido esteviol estándar.

Los presentes inventores han dilucidado por primera vez que la proteína enzima responsable para la glucosilación de la glucosa en la posición C19 en glucósidos de esteviol es UGT85C2.

La secuencia CDS y secuencia de aminoácidos de UGT85C2 son SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. Los polinucleótidos y enzimas anteriormente descritos se pueden obtener por los métodos descritos posteriormente en los ejemplos, técnicas de ingeniería genética conocidas, métodos conocidos para síntesis, y demás.

1. Método para producir glucósidos de esteviol

La presente invención proporciona un método para producir glucósidos de esteviol, que comprende la etapa de hacer reaccionar una proteína según cualquiera seleccionada del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación (de aquí en adelante denominada “ la proteína de la presente divulgación”) con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

(a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

en donde, Ri representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.

Las proteínas descritas en (b) o (c) anteriormente son típicamente mutantes del polipéptido natural de SEQ ID NO: 2 y también incluyen esas proteínas que se pueden obtener artificialmente usando mutagénesis dirigida descrita en, por ejemplo, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)", "Gene, 34, 315 (1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)", etc.

Como se usa en el presente documento, “la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I)” incluye proteínas que contienen una secuencia de aminoácidos en donde, por ejemplo, de 1 a 48, de 1 a 47, de 1 a 46, de 1 a 45, de 1 a 44, de 1 a 43, de 1 a 42, de 1 a 41, de 1 a 40, de 1 a 39, de 1 a 38, de 1 a 37, de 36, de 1 a 35, de 1 a 34, de 1 a 33, de 1 a 32, de 1 a 31, de 1 a 30, de 1 a 29, de 1 a 28, de 1 a 27, de 1 a 26, de

25, de 1 a 24, de 1 a 23, de 1 a 22, de 1 a 21, de 1 a 20, de 1 a 19, de 1 a 18, de 1 a 17, de 1a 16, de 1 a 15, de 1 a 14, de 1 a 13, de 1 a 12, de 1 a 11, de 1 a 10, de 1 a 9 (de 1 a varios), de 1 a 8, de 1 a 7, de 1 a 6, de 1 a 5, de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2, o un aminoácidos se deleciona(n), sustituye(n), inserta(n) y/o añade(n) en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y tienen la actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I). En general, el número de deleciones, sustituciones, inserciones y/o adiciones es preferiblemente menor.

Tales proteínas incluyen proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene la identidad de aproximadamente el 90% o mayor, el 91% o mayor, el 92% o mayor, el 93% o mayor, el 94% o mayor, el 95% o mayor, el 96% o mayor, el 97% o mayor, el 98% o mayor, el 99% o mayor, el 99,1% o mayor, el 99,2% o mayor, el 99,3% o mayor, el 99,4% o mayor, el 99,5% o mayor, el 99,6% o mayor, el 99,7% o mayor, el 99,8% o mayor, o el 99,9% o mayor, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tienen la actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I). Según sea mayor el porcentaje de identidad descrito anteriormente, la proteína es preferida en general.

Como se usa en el presente documento, “la actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I)” se pretende que signifique la actividad de añadir azúcares al grupo carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

En la fórmula general (I), R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.

Como se usa en el presente documento el “alquilo de C1-C20” es preferiblemente un alquilo de C1-C10, y más preferiblemente un alquilo de C1-C6. El grupo alquilo incluye, pero no está limitado a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, tert-butilo, pentilo, hexilo, dodecanilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “alquenilo de C2-C20” es preferiblemente un alquenilo de C2-C10, y más preferiblemente un alquenilo de C2-C6. El grupo alquenilo incluye, pero no está limitado a, vinilo, alilo, propenilo, isopropenilo, 2-metil-1-propenilo, 2-metilalilo, 2-butenilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “alquinilo de C2-C20” es preferiblemente un alquinilo de C2-C10, y más preferiblemente un alquinilo de C2-C6. El grupo alquinilo incluye, pero no está limitado a, etinilo, 2-propinilo, 2-butinilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “alquildienilo de C4-C20” es preferiblemente un alquildienilo de C4-C10, y más preferiblemente un alquildienilo de C4-C6. El grupo alquildienilo incluye, pero no está limitado a,1,3-butadienilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “arilo de C6-C18” es preferiblemente un arilo de C6-C10. El grupo arilo incluye, pero no está limitado a, fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, indenilo, bifenililo, antrilo, fenantrilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “alquilarilo de C6-C20” es preferiblemente un alquilarilo de C6-C12. El grupo alquilarilo incluye, pero no está limitado a, o-tolilo, m-tolilo, p-tolilo, 2,3-xililo, 2,4-xililo, 2,5-xililo, o-cumenilo, mcumenilo, p-cumenilo, mesitilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “arilalquilo de C6-C20” es preferiblemente un arilalquilo de C6-C12. El grupo arilalquilo incluye, pero no está limitado a, bencilo, fenetilo, difenilmetilo, trifenilmetilo, 1-naftilmetilo, 2-naftilmetilo, 2,2-difeniletilo, 3-fenilpropilo, 4-fenilbutilo, 5-fenilpentilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “cicloalquilo de C4-C20” es preferiblemente un cicloalquilo de C4-C10. El grupo cicloalquilo incluye, pero no está limitado a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, etc.

Como se usa en el presente documento el “cicloalquenilo de C4-C20” es preferiblemente un cicloalquenilo de C4-C10. El grupo cicloalquenilo incluye, pero no está limitado a, ciclopropenilo, ciclobutenilo, 2-ciclopenten-1-ilo, 2-ciclohexen-1-ilo, 3-ciclohexen-1-ilo, etc.

Como se usa en el presente documento, los ejemplos del “(cicloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10” incluyen metilciclopropilo, etilciclopropilo, metilciclobutilo, etilciclopentilo, metilciclohexilo, etc.

Como se usa en el presente documento, el “residuo de azúcar” puede incluir, pero sin estar limitado a, un residuo de uno o más azúcares incluyendo una pentosa, una hexosa o una combinación de las mismas (excluyendo xilosa, ramnosa o una combinación de las mismas).

Los ejemplos de la pentosa incluyen ribosa, arabinosa y lixosa, y los ejemplos de la hexosa incluyen alosa, altrosa, glucosa, manosa, gulosa, idosa, galactosa y talosa.

Preferiblemente, el “residuo de azúcar” se refiere a un residuo de azúcar que consiste en al menos una unidad de hexosa, y más preferiblemente, un residuo de un monómero de glucosa (-Glc), dímero de glucosa (-Glc-Glc) o trímero de glucosa (-Glc(Glc)-Glc). En el residuo de azúcar del dímero de glucosa, la glucosa está unida entre sí preferiblemente mediante un enlace glucosídico (32,1. En el residuo de azúcar del trímero de glucosa, la glucosa está unida entre sí preferiblemente mediante un enlace glucosídico p2,1 y un enlace glucosídico p3,1.

El compuesto de fórmula general (I) es preferiblemente esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol.

La molécula de azúcar añadida por la proteína de la presente divulgación al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I) puede incluir, sin estar limitada a, moléculas de azúcar que consisten en al menos una pentosa, hexosa o una combinación de las mismas (excluyendo xilosa, ramnosa o una combinación de las mismas). Los ejemplos de la pentosa y la hexosa son los mismos que se han descrito anteriormente. La molécula de azúcar descrita anteriormente es preferiblemente una hexosa, y más preferiblemente, una hexosa seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa, y galactosa. La molécula de azúcar anterior es lo más preferiblemente glucosa.

La actividad de añadir la molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I) se puede confirmar como sigue. Después de incubación en un tampón (por ejemplo, tampón fosfato de sodio o tampón fosfato de potasio) en la región neutra de pH 6,0-8,0, que contiene 1-500 ng (preferiblemente, 50-200 ng, lo más preferiblemente 100 ng) de una proteína de prueba, 1-1000 pM (preferiblemente 100-700 pM, lo más preferiblemente 500 pM) de UDP-azúcar (por ejemplo, UDP-glucosa), y 1-500 pM (preferiblemente 100-500 pM, lo más preferiblemente 250 pM) de un compuesto sustrato (compuesto de fórmula general (I)) a una temperatura de 20-40°C durante 10 minutos a 2 horas, el compuesto sustrato anterior se purifica y el monoterpeno purificado se analiza por medios conocidos tal como el análisis de LC-MS (cromatografía líquida-espectrometría de masas), etc.

En el caso de que la molécula de azúcar unida al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I) se detecte como resultado del análisis de LC-MS, se considera que la proteína de prueba descrita anteriormente tiene la actividad de añadir la molécula de azúcar al carboxilo en posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I).

En general, la reacción de glucosilación se completa aproximadamente en un minuto a 12 horas.

La deleción, sustitución, inserción y/o adición de uno o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de la proteína de la divulgación se pretende que signifique que uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos se deleciona, sustituye, inserta y/o añade en una o una pluralidad de posiciones en la misma secuencia de aminoácidos. Se pueden producir dos o más tipos de deleciones, sustituciones, inserciones y adiciones al mismo tiempo.

Los ejemplos de residuos de aminoácidos que son mutuamente sustituibles se dan a continuación. Los residuos de aminoácidos en el mismo grupo son mutuamente sustituibles. Grupo A: leucina, isoleucina, norleucina, valina, norvalina, alanina, ácido 2-aminobutanoico, metionina, o-metilserina, t-butilglicina, t-butilalanina y ciclohexilalanina; Grupo B: ácido aspártico, ácido glutámico, ácido isoaspártico, ácido isoglutámico, ácido 2-aminoadípico y ácido 2-aminosubérico; Grupo C: asparragina y glutamina; Grupo D: lisina, arginina, ornitina, ácido 2,4-diaminobutanoico y ácido 2,3-diaminopropiónico; Grupo E: prolina, 3-hidroxiprolina y 4-hidroxiprolina; Grupo F: serina, treonina y homoserina; y Grupo G: fenilalanina y tirosina.

La proteína de la presente divulgación se puede obtener expresando un polinucleótido (cf., “el polinucleótido de la presente divulgación” descrito posteriormente) que codifica la proteína en una célula huésped apropiada. La proteína también se puede producir por métodos de síntesis química tal como el método Fmoc (método de fluorenilmetiloxicarbonilo), el método tBoc (método de t-butiloxicarbonilo), etc. Además, también se pueden usar sintetizadores de péptidos disponibles de Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technology Instrument, PerSeptive, Applied Biosystems, SHIMADZU Corp., etc., para la síntesis química.

Como se usa en el presente documento, el término “UDP-azúcar” se refiere a azúcar unido a uridina difosfato (uridina difosfato: UDP). En el UDP-azúcar, los ejemplos preferidos de la fracción de azúcar incluyen azúcares compuestos de al menos una pentosa, hexosa o una combinación de las mismas (excluyendo xilosa, ramnosa o una combinación de las mismas). Los ejemplos de la pentosa y la hexosa son como se ha descrito anteriormente. El UDP-azúcar es preferiblemente UDP-hexosa, y más preferiblemente, una hexosa seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa. El UDP-azúcar descrito anteriormente es lo más preferiblemente UDP-glucosa.

El método para producir el glucósido de esteviol según la presente invención comprende la etapa de hacer reaccionar la proteína de la divulgación, el UDP-azúcar y el compuesto representado por la fórmula general (I) para añadir la molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I). El método 1 de la presente invención puede incluir además la etapa de purificar el glucósido de esteviol producido en la etapa anterior.

Los ejemplos del glucósido de esteviol producido por el método de producción de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a, esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o una combinación de los mismos.

El glucósido de esteviol producido se puede purificar por técnicas conocidas incluyendo extracción con un solvente apropiado (un solvente acuoso tal como agua, etc., o un solvente orgánico tal como alcohol, éter, acetona, etc.), un gradiente con acetato de etilo u otro solvente orgánico: agua, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía de gases, espectrometría de masas tiempo de vuelo (TOF-MS), cromatografía líquida de rendimiento ultra alto (UPLC), etc.

2. Transformante no humano con alto nivel de glucósido de esteviol

Los glucósidos de esteviol también se pueden producir en células de bacterias (Escherichia coli, levaduras, etc.), plantas, insectos, mamíferos excepto seres humanos, etc., usando la proteína de la presente divulgación. Esto es debido a que la proteína de la presente divulgación es una enzima derivada de estevia o una variante de la misma y, por tanto, se espera que retenga su alta actividad incluso en medio intracelular. En este caso, el glucósido de esteviol se puede producir al introducir un polinucleótido que codifica la proteína de la presente divulgación (cf., “el polinucleótido de la presente divulgación” como se describe posteriormente) en células huéspedes derivadas de bacterias, plantas, insectos, mamíferos excepto ser humano, etc. para expresar la proteína de la presente divulgación y hacer reaccionar la proteína de la presente divulgación, el UDP-azúcar presente en las células anteriores y el compuesto representado por la fórmula general (I).

Por tanto, la presente invención proporciona un transformante no humano, en el que se introduce un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación (de aquí en adelante denominado “el transformante de la presente invención”):

(b) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (c) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 2 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (i), a continuación:

La definición y ejemplos específicos de la fórmula general (I) son los mismos que ya se han descrito anteriormente, y la definición y ejemplos específicos de la molécula de azúcar añadida al carboxilo en la posición 19 del compuesto representado por la fórmula general (I) también son los mismos que se han descrito anteriormente.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido” se pretende que signifique un ADN o ARN.

Como se usa en el presente documento, el término “polinucleótido que hibrida en condiciones muy restrictivas” se refiere a, por ejemplo, un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un polinucleótido obtenido por el método de hibridación en colonia, método de hibridación en placa, método de hibridación Southern o similar, usando como sonda todo o parte de un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Para los métodos de hibridación, se usan los métodos descritos en, por ejemplo, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001" y "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", etc.

Como se usa en el presente documento, el término “condiciones muy rigurosas” son condiciones, por ejemplo, (1) SSC 5x, solución de Denhardt 5x, SDS al 0,5% y formamida al 50% a 50°C, (2) SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 60°C, (3 ) SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 62°C, (4) SSC 0,2x y SDS al 0,1% a 65°C, o (5) SSC 0,1x y SDS al 0,1% a 65°C, pero no limitadas a las mismas. En estas condiciones, se puede esperar que se obtenga un ADN con mayor identidad de secuencia de forma eficaz a mayores temperaturas, aunque múltiples factores están implicados en la rigurosidad de la hibridación incluyendo temperatura, concentración de la sonda, longitud de la sonda, fuerza iónica, tiempo, concentración de sal y otros, y los expertos en la materia pueden seleccionar apropiadamente estos factores para lograr rigurosidad similar.

Cuando se usan kits comercialmente disponibles para la hibridación, por ejemplo, se puede usar un sistema de marcaje y detección directo Alkphos (GE Healthcare). En este caso, según el protocolo adjunto, después de la incubación con una sonda marcada durante la noche, la membrana se lava con un tampón de lavado primario que contiene SDS al 0,1% (p/v) de 55 a 60°C, detectando mediante ello ADN hibridado. Alternativamente, al producir una sonda basada en la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 o en toda o parte de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, la hibridación se puede detectar con un kit de detección de ácidos nucleicos DIG (Roche Diagnostics) cuando la sonda está marcada con digoxigenina (DIG) usando un reactivo comercialmente disponible (por ejemplo, una mezcla de marcaje de PCR (Roche Diagnostics), etc.).

Además de los descritos anteriormente, otros polinucleótidos que se pueden hibridar incluyen ADN que tienen el 80% o más, el 81% o más, el 82% o más, el 83% o más, el 84% o más, el 85% o más, el 86% o más, el 87% o más, el 88% o más, el 89% o más, el 90% o más, el 91% o más, el 92% o más, el 93% o más, el 94% o más, el 95% o más, el 96% o más, el 97% o más, el 98% o más, el 99% o más, 99,1% o más, el 99,2% o más, el 99,3% o más, el 99,4% o más, el 99,5% o más, el 99,6% o más, el 99,7% o más, el 99,8% o más o el 99,9% o más identidad con el ADN de SEQ ID NO: 1, o el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, calculado mediante software de búsqueda de homología, tal como FASTA y BLAST usando los parámetros por defecto.

La identidad entre secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos se puede determinar usando FASTA (Science 227 (4693): 1435-1441, (1985)), el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básica) por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Nail Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). Se han desarrollado programas llamados blastn, blastx, blastp, tblastn y tblastx basados en el algoritmo BLAST (Altschul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Cuando una secuencia de nucleótidos se secuencia usando blastn, los parámetros son, por ejemplo, puntuación = 100 y longitud de palabra = 12. Cuando una secuencia de aminoácidos se secuencias usando blastp, los parámetros son, por ejemplo, puntuación = 50 y longitud de palabra = 3. Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parámetros por defecto de cada uno de los programas.

Los polinucleótidos como se definen en las reivindicaciones y se describen anteriormente se pueden adquirir por técnicas de ingeniería genética conocidas, métodos conocidos para síntesis, y demás.

Los polinucleótidos como se definen en las reivindicaciones se introducen en un huésped, preferiblemente, en tal estado que se inserta en un vector de expresión apropiado.

El vector apropiado en general se construye para que contenga un casete de expresión que comprende:

(i) un promotor que se puede transcribir en una célula huésped;

(ii) cualquiera de los polinucleótidos como se definen en las reivindicaciones que está unido al promotor; y (iii) un casete de expresión que comprende como un componente una señal que funciona en la célula huésped con respecto a la terminación de la transcripción y poliadenilación de la molécula de ARN.

Para construir el vector de expresión, se usan procedimientos que usan un plásmido, fago o cósmido, pero no están particularmente limitados a los mismos.

Los vectores no están particularmente limitados a ningún tipo específico, y se pueden elegir adecuadamente los capaces de expresarse en una célula huésped. Es decir, se puede elegir una secuencia promotora adecuada dependiendo del tipo de una célula huésped para expresar de forma fiable el polinucleótido como se define en las reivindicaciones, y un vector obtenido por la incorporación de esta secuencia y el polinucleótido como se define en las reivindicaciones en varios plásmidos o similares se puede usar como un vector de expresión.

El vector de expresión de la presente divulgación contiene una región de control de expresión (por ejemplo, un promotor, un terminador, y/o un origen de replicación, etc.) dependiendo del tipo de huésped en que se va a introducir. Un promotor convencional (por ejemplo, el promotor trc, el promotor tac, el promotor lac, etc.) se usa como el promotor para un vector de expresión bacteriano. Como el promotor para levadura, se usan, por ejemplo, el promotor GAL1, el promotor GAL10, el promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, el promotor PH05, etc. Como el promotor para hongos se usan, por ejemplo, amilasa, trpC, etc. Además, los ejemplos del promotor para expresar el gen de interés en células vegetales incluyen el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, el promotor del gen rd29A, el promotor de rbcS, el promotor de mac-1 en donde una secuencia potenciadora del promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor anterior se añade al extremo 5' de la secuencia promotora de la manopina sintetasa de Agrobacterium, etc. Se usan promotores víricos (por ejemplo, promotor temprano de SV40, promotor tardío de SV40, etc.) como el promotor para células huéspedes derivadas de animales.

Preferiblemente, el vector de expresión contiene al menos un marcador de selección. Como tal marcador de selección, se pueden usar marcadores auxotróficos (ura5, niaD, TRP1, URA3, HIS3, LEU2), marcadores resistentes a sustancias químicas (higromicina, zeocina), gen de resistencia a genecitina (G418r), gen resistente a cobre (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 337 1984), gen resistente a cerulenina (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi, et al., Biochemistry, 64, p. 660, 1992; y Hussain et al., Gene, 101: p. 149, 1991, respectivamente), etc.

Un método de preparar (método de producir) el transformante de la presente invención no está particularmente limitado e incluye, por ejemplo, un método que comprende introducir el vector de expresión que porta el polinucleótido de la presente divulgación en un huésped para transformación.

Se espera que el transformante de la presente invención produzca el glucósido de esteviol con una alta eficacia. Las células huéspedes usadas para la transformación no están particularmente limitadas y varias células se pueden usar ventajosamente. Los ejemplos de las células huéspedes son bacterias tal como Escherichia coli, etc., levaduras (Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, células vegetales, células animales excepto humanas, etc.

Las células huéspedes son preferiblemente células huéspedes capaces de producir el compuesto representado por la fórmula general (I) (preferiblemente, esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol). En el presente documento, las células huéspedes no están limitadas a las capaces de producir el compuesto representado por la fórmula general (I) en un estado natural, y también pueden incluir esas genéticamente manipuladas por genes conocidos de modo que el compuesto representado por la fórmula general (I) se pueda producir.

Los genes que codifican las enzimas que contribuyen a la síntesis del compuesto representado por la fórmula general (I) incluyen genes conocidos tal como EK13H, UGT74G1 y UGT76G1 (documento no de patente 2), pero no están limitados a los mismos.

Cuando las células huéspedes son esas incapaces de producir el compuesto representado por la fórmula general (I), el gen de la presente divulgación se introduce en las células huéspedes y el compuesto representado por la fórmula general (I) (preferiblemente, esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol) o un extracto vegetal que contiene el compuesto se añade como un sustrato al sistema de cultivo del transformante resultante. Los glucósidos de esteviol se pueden, por tanto, producir incluso sin introducir el gen que codifica la enzima que contribuye al compuesto representado por la fórmula general (I).

Los medios y condiciones de cultivo adecuados para las células huéspedes anteriores se conocen bien en la técnica. El organismo que se va a transformar no está particularmente limitado, e incluye varios microorganismos, plantas y animales diferentes de seres humanos, que se dan como ejemplos de las células huéspedes anteriormente.

Para la transformación de células huéspedes, se pueden usar métodos en general conocidos. La transformación se puede realizar por el método de electroporación (Mackenzie D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000), el método de administración de partículas (documento JPA 2005-287403), el método de esferoplastos (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p. 1929 (1978)), el método de acetato de litio (los métodos descritos en J. Bacteriology, 153 p. 163 (1983)), Methods in yeast genetics, Edición 2000: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, etc.), pero no están limitados a los mismos.

Además, se puede hacer referencia a "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)", etc., para técnicas de biología molecular generales.

El glucósido de esteviol puede ser producido por el transformante mediante incubación del transformante así obtenido. Como se ha descrito anteriormente, el compuesto de la fórmula general (I) o un extracto vegetal que contiene el compuesto también se puede añadir al sistema de cultivo del transformante como un sustrato para fomentar la producción del glucósido de esteviol. El glucósido de esteviol acumulado se puede extraer y purificar para dar el glucósido de esteviol de interés.

Por tanto, la presente invención proporciona el método 2 para producir el glucósido de esteviol, que comprende usar el transformante no humano de la presente invención. Los medios y condiciones de cultivo adecuados se conocen bien en la técnica. Los procedimientos para la extracción y purificación del glucósido de esteviol ya están descritos.

El glucósido de esteviol no está particularmente limitado, y preferiblemente puede ser uno seleccionado del grupo que consiste en esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido Fm o una combinación de los mismos.

En una forma de realización adicional de la presente invención, el transformante puede ser una planta transformante. La planta transformante según esta forma de realización se puede obtener al introducir un vector recombinante que comprende el polinucleótido como se define en las reivindicaciones en una planta para expresar un polipéptido codificado por el polinucleótido.

Cuando se usa un vector de expresión recombinante, el vector de expresión recombinante usado para transformar la planta no está particularmente limitado siempre que el vector sea capaz de expresar el polinucleótido como se define en las reivindicaciones en dicha planta. Los ejemplos de tales vectores incluyen un vector que porta un promotor capaz de expresar constitutivamente el polinucleótido en células vegetales, y un vector que porta un promotor induciblemente activado por estimulación externa.

Los ejemplos del promotor que expresa constitutivamente el polinucleótido en células vegetales incluyen el promotor del ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor, el promotor del gen rd29A, el promotor de rbcS, el promotor de mac-1, etc.

Lo ejemplos del promotor induciblemente activado por estimulación externa incluyen el promotor del virus del tumor mamario del ratón (MMTV), promotor sensible a tetraciclina, promotor de metalotioneína, promotor de proteína de choque térmico, etc.

Se pretende que plantas que son objeto de transformación en la presente invención signifique cuerpos vegetales enteros, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, pétalos, tallos, raíces, semillas, etc.), tejidos vegetales (por ejemplo, epidermis, floema, parénquima, xilema, haces vasculares, tejidos en empalizada, tejidos esponjosos, etc.) o células en cultivo vegetales, o puede ser cualquiera de varios tipos de células vegetales (por ejemplo, células en cultivo en suspensión), protoplastos, porciones de hojas, callos, y similares. Las especies vegetales que se usan para la transformación no están particularmente limitadas y puede ser cualquier planta de las que pertenecen a las monocotiledóneas o las dicotiledóneas.

Se usan métodos de transformación convencionales (por ejemplo, el método de Agrobacterium, método de bombardeo de genes, método de PEG, método de electroporación, etc.) conocidos para los expertos en la materia para transferir genes a las plantas. Por ejemplo, el método mediado por Agrobacterium y el método de introducir directamente en células vegetales se conocen bien. Cuando se usa el método de Agrobacterium, el vector de expresión vegetal construido se introduce en una cepa de Agrobacterium apropiada (por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens) y esta cepa se infecta a discos de hoja asépticamente cultivados según el método de discos de hoja (Hirobumi Uchimiya, Manuals for Plant Gene Manipulation (1990), pp. 27-31, Kodansha Scientific Co., Ltd., Tokio), etc. para dar plantas transgénicas. También se puede usar el método porNagel, et al. (Micribiol. Lett., 67: 325 (1990)). Este método implica introducir primero, por ejemplo, un vector de expresión en Agrobacterium y después introducir el Agrobacterium transformado en células vegetales o tejidos vegetales por el método descrito en Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, S.B. et al., Academic Press Publishers). En el presente documento, el “tejido vegetal” incluye callos obtenidos al cultivar células vegetales. Cuando la transformación se lleva a cabo usando el método de Agrobacterium, se pueden usar vectores binarios (pBI121 o pPZP202, etc.).

Para la transferencia directa de genes a células vegetales o tejidos vegetales, se conocen el método de electroporación y el método de bombardeo de genes. Cuando se usa un cañón de partículas, se pueden usar cuerpos vegetales, órganos vegetales o tejidos vegetales por sí, o se pueden preparar porciones y después suministrarlas para uso, o también se pueden preparar protoplastos y después suministrarlos para uso. Las muestras así preparadas se pueden bombardear usando un aparato de transferencia de genes (por ejemplo, PDS-1000 (BIO-RAD, Inc.), etc.). Las condiciones de bombardeo pueden variar dependiendo de las plantas o muestras. Normalmente, el bombardeo se realiza a una presión de aproximadamente 450 a 2000 psi a una distancia de aproximadamente 4 a 12 cm.

Las células o tejidos vegetales en los que se introduce el gen primero se seleccionan para su resistencia química tal como resistencia a higromicina, etc. y después se regeneran a cuerpos vegetales de una manera convencional. La regeneración de cuerpos vegetales a partir de los transformantes se puede realizar por métodos que conocen los expertos en la materia, dependiendo de la especie de las células vegetales.

Cuando se usa una célula vegetal en cultivo como huésped, la transformación se realiza introduciendo el vector recombinante en células cultivadas mediante el método de bombardeo de genes, el método de electroporación, etc. Se pueden usar callos, brotes, raíces pilosas, etc. resultantes de la transformación directamente en cultivo celular, cultivo de tejidos o cultivo de órganos. Además, se pueden regenerar en cuerpos vegetales por métodos de cultivo de tejido vegetal convencionales mediante la administración de hormonas vegetales (por ejemplo, auxina, citoquinina, giberelina, ácido abscísico, etileno, brasinolida, etc.) a concentraciones apropiadas.

Si se ha introducido o no el polinucleótido como se define en las reivindicaciones en la planta se puede confirmar por PCR, hibridación Southern, hibridación northern o similar. Por ejemplo, se prepara ADN de planta transgénica y después se diseñan cebadores específicos de ADN para realizar PCR. Se puede realizar PCR en las mismas condiciones usadas para la preparación de plásmidos descritas anteriormente. Posteriormente, el producto amplificado se somete a electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, electroforesis capilar, etc. y se tiñe con bromuro de etidio, solución SYBR Green, etc. Al detectar el producto amplificado como una única banda, se puede confirmar que el huésped ha sido transformado. Alternativamente, se puede realizar PCR usando cebadores previamente marcados con un colorante fluorescente o similar, y el producto amplificado se puede detectar. Además, se puede emplear un método que implica unir el producto amplificado a una fase sólida tal como una microplaca, etc., y después confirmar el producto por fluorescencia o reacciones enzimáticas.

Una vez se adquiere la planta transgénica en donde el polinucleótido como se define en las reivindicaciones se ha incorporado en el genoma, se puede obtener su progenie por reproducción sexual o asexual del cuerpo vegetal. Además, el cuerpo vegetal se puede producir en masa al adquirir del cuerpo vegetal o su progenie o clones de los mismos, por ejemplo, semillas, frutos, panículas cortadas, tubérculos, raíces tuberosas, variantes, callos, protoplastos, etc., y después usarlos como el origen. Según esto, la presente invención también abarca el cuerpo vegetal en el que el polinucleótido según las reivindicaciones se introduce expresablemente, o progenies del cuerpo vegetal que tienen la misma propiedad que en el cuerpo vegetal, y tejidos derivados de los mismos.

Los métodos de transformación para varias plantas ya se han descrito. Los ejemplos de plantas transgénicas según la presente invención incluyen, pero no están limitados a, plantas solanáceas (por ejemplo, berenjena, tomate, pimiento verde, patata, tabaco, datura o yerba del disco, alkekengi, petunia, Calibrachoa sp., nierembergia, etc.), plantas leguminosas (por ejemplo, soja, haba azuki, cacahuete, judía común o Phaseolus vulgaris, haba, Lotus japonicus, etc.), plantas rosáceas (por ejemplo, fresa, ciruela, cereza, rosa, arándano, mora, arándano europeo, casis, frambuesa, Rubus suauissimus, etc.), plantas cariofiláceas (clavel, jabonera norteamericana, etc.), plantas crisantemo (crisantemo, gerbera, girasol, margarita, estevia, etc.), plantas orquidáceas (orquídea, etc.), plantas primuláceas (ciclamen, etc.), plantas gencianáceas (lisianthus, gentiana, etc.), plantas iridáceas (freesia, iris, gladiolo, etc.), plantas escrofulariáceas (antirrhinum, torenia, etc.), Kalanchoe pinnata (Kalanchoe), plantas liliáceas (lirio, tulipán, etc.), plantas convolvuláceas (campanilla, bejuquillo de Caracas, estramonio, batata, Ipomoea quamoclit, Evolvulus o azul americano, etc.), plantas hydrangea (hortensia, deutizia, etc.), plantas cucurbitáceas (calabaza de peregrino, etc.), plantas geraniáceas (pelargonium, geranio, etc.). plantas oleáceas (forsythia, etc.), plantas vitáceas (por ejemplo, vid, etc.), plantas teáceas (camelia, té, etc.), plantas poáceas (por ejemplo, planta de arroz, cebada, trigo, avena, centeno, maíz dulce, mijo menor, mijo japonés, kaoliang, caña de azúcar, bambú, avena, mijo de dedo, sorgo, arroz indio, lágrimas de Job, hierba de pasto, etc.), plantas moráceas (morera, lúpulo, kouzo o morera del papel, árbol del caucho, Cannabis, etc.), plantas rubiáceas (café árabe, gardenia, etc.), plantas fagáceas (roble, Buna o haya japonesa, roble daimio, etc.), plantas pedaliáceas (sésamo, etc.), plantas rutáceas (por ejemplo, naranja daidai, limón yuzu, citrus unshiu, fresno espinoso japonés), plantas brasicáceas (lombarda, col ornamental, rábano japonés, Arabidopsis, colza, repollo, brócoli, coliflor, etc.), y plantas lamiáceas (salvia, albahaca japonesa, lavanda, escutelaria, etc.). Ejemplos particularmente preferidos de la planta para transformación incluyen plantas que se sabe biosintetizan varios glucósidos usando esteviol como la aglucona. Tales plantas incluyen estevia, Rubus suauissimus, y similares.

La planta transformada por el polinucleótido como se define en las reivindicaciones (de aquí en adelante “ la planta de la presente invención” o “el cuerpo vegetal de la presente invención”) puede producir glucósidos de esteviol en una mayor cantidad, en comparación con su tipo salvaje, siempre que tenga un sustrato apropiado o cuando un sustrato apropiado se añade externamente.

La planta de la presente invención puede proporcionar fácilmente una planta completa cultivando las semillas, esquejes, bulbos, etc., de la planta de la presente invención.

Por consiguiente, la planta de la presente invención incluye cuerpos vegetales enteros, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, pétalos, tallos, raíces, semillas, bulbos, etc.), tejidos vegetales (por ejemplo, epidermis, floema, parénquima, xilema, haces vasculares, tejidos en empalizada, tejidos esponjosos, etc.), o células vegetales en cultivo, o varios tipos de células vegetales (por ejemplo, células en cultivo en suspensión), protoplastos, porciones de hojas, callos, y similares.

3. Extracto del transformante y uso del mismo

En una forma de realización aún adicional, la presente invención proporciona un extracto del transformante descrito anteriormente. Cuando tiene un sustrato apropiado o cuando un sustrato apropiado se añade externamente, se espera que el transformante de la presente invención tenga un alto contenido en glucósidos de esteviol en su extracto, en comparación con su tipo salvaje.

El transformante de la presente invención se puede obtener al romper el transformante usando bolas de vidrio, un homogenizador, un sonicador, etc., centrifugar el producto roto y después recuperar el sobrenadante. También se puede realizar una etapa adicional mediante los procedimientos de extraer los glucósidos de esteviol descritos anteriormente.

El extracto del transformante de la presente invención se puede usar para producir, por ejemplo, productos alimenticios, fármacos, materiales industriales, y similares.

En una forma de realización aún adicional, la presente invención proporciona alimentos, fármacos y materiales industriales (materias primas para alimento, etc.) que contienen el extracto del transformante de la presente invención. Los alimentos, fármacos y materiales industriales que contienen el extracto del transformante de la presente invención se pueden preparar de una manera convencional. Como tal, los productos alimenticios, fármacos, materiales industriales, etc., que contienen el extracto del transformante de la presente invención contienen el glucósido de esteviol producido usando el transformante de la presente invención.

El alimento de la presente invención incluye, por ejemplo, un suplemento nutricional, alimento sano, alimento funcional, producto alimenticio para niños pequeños, alimento geriátrico, etc. Como se usa en el presente documento, se pretende que el alimento o producto alimenticio signifique un material comestible.

El término suplemento nutricional se refiere a productos alimenticios enriquecidos con ingredientes nutricionales específicos. El término alimento sano se refiere a productos alimenticios que son saludables o buenos para la salud, y abarca suplementos nutricionales, alimentos naturales, alimentos dietéticos, etc. El término alimento funcional se refiere a un producto alimenticio para reponer ingredientes nutricionales que ayudan a funciones de control del cuerpo.

Los alimentos funcionales son sinónimos de alimentos para uso saludable especificado. El término alimento para niños pequeños se refiere a un producto alimenticio dado a niños de hasta aproximadamente 6 años de edad. El término alimento geriátrico se refiere a un producto alimenticio tratado para facilitar la digestión y absorción cuando se compara con alimentos sin tratar.

En el producto alimenticio de la presente invención, el glucósido de esteviol no calórico se usa como un edulcorante. Según esto, el producto alimenticio de la presente invención es bajo en calorías y tiene la ventaja de que contribuye al fomento de la salud o el mantenimiento de la salud.

La forma de estos productos alimenticios puede incluir, por ejemplo, pan, fideos, pasta, arroz, confites (tarta, helado, golosinas heladas, donut, galleta horneada, golosina, chicle, gominolas y tableta, así como confites japoneses tal como bolas de arroz, tarta de pasta de habas, etc.), alimentos agrícolas tal como tofu (cuajada de soja) y sus productos procesados, etc., alimentos fermentados tal como sake japonés (vino de arroz), licor medicinal, mirin (jerez dulce para cocinar), vinagre, salsa de soja, miso (pasta de habas), etc., productos alimenticios de ganado tal como yogur, jamón, beicon, salchicha, etc.; productos alimenticios marinos tal como kamaboko (pescado picado y al vapor), ageten (tarta de pescado frita), hanpen (tarta de pescado esponjosa), etc., así como bebidas de frutas, refrescos, bebidas deportivas, bebidas alcohólicas, té, condimentos. La forma de los productos alimenticios también puede incluir, por ejemplo, bebida baja en calorías, bebida sin azúcar, lata de fruta, bebida de leche, bebida en polvo, yogur, gelatina, aliño, men-tsuyu (liquido de aderezo basado en soja para fideos), pepinillo japonés, tsukudani (alimentos marinos hervidos en salsa de soja), salsa de soja, miso (pasta de habas), shiokara (tripas de pescado saladas), vinagre de Vermont, chalotas encurtidas en vinagre azucarado, jengibre encurtido dulce, raíces de loto encurtidas en vinagre, encurtidos japoneses, salsa dulce basada en soja para tempura y anguila kabayaki asada, salsa de carne a la parrilla, salsa, etc., goma, golosina y piruleta, pasta de dientes, satsuma-age (tarta de pescado frita), dashi-maki (tortilla enrollada), salsa para fideos fritos, salsa para fideos fríos, shimesaba (filete de caballa en vinagre), helados, sorbete, crema suave, productos de gelatina de pescado, refrescos, tarta de arroz, taza de cono, laver aderezado, tenkasu (trozos de tempura crujientes), furikake (aderezo de arroz), etc.

La forma posológica de la (composición) farmacéutica de la presente divulgación no está particularmente limitada y puede ser cualquier forma posológica que incluya el estado de una solución, pasta, gel, sólido o polvo. Además, la composición farmacéutica de la presente divulgación se puede usar como agentes tópicos para la piel, incluyendo un aceite, loción, crema, emulsión, gel, champú, enjuague para el pelo, acondicionador de pelo, esmalte, base de maquillaje, pintalabios, polvo facial, mascarilla facial, pomada, polvo, pasta de dientes, aerosol, espuma limpiadora, etc., agente de baño, tónico medicado, esencia de belleza de piel, protector solar, etc.

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede contener además otros componentes farmacéuticamente activos (por ejemplo, componentes antiinflamatorios) o componentes auxiliares (por ejemplo, componentes lubricantes o soporte).

4. Método para cribar una planta con un alto contenido de glucósidos de esteviol

La presente divulgación proporciona un método para cribar una planta con un alto contenido de glucósidos de esteviol. Específicamente, el método anterior comprende las etapas (1) a (3) a continuación:

(1) una etapa de extraer ARNm de una planta de prueba;

(2) una etapa de hibridar dicho ARNm o ADNc preparado a partir de dicho ARNm con un polinucleótido que hibrida en condiciones muy rigurosas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido de la presente divulgación; y

(3) una etapa de detectar dicha hibridación.

La etapa (1) descrita anteriormente se puede realizar al extraer el ARNm de una planta de prueba. El sitio de la planta de prueba, del que se va a extraer el ARNm, no está particularmente limitado y preferiblemente, pétalos. Cuando el ARNm se extrae, se puede preparar ADNc a partir del ARNm por transcripción inversa.

La etapa (2) se puede realizar hibridando el ARNm extraído anteriormente en condiciones muy rigurosas usando como sonda o cebador un polinucleótido u oligonucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido de la presente divulgación. Las condiciones muy rigurosas son como se han descrito anteriormente. El polinucleótido u oligonucleótido tiene una longitud de preferiblemente 5 a 500 pb, más preferiblemente de 10 a 200 pb, y lo más preferiblemente de 10 a 100 pb. El polinucleótido u oligonucleótido se puede sintetizar fácilmente usando varios sintetizadores automatizados (por ejemplo, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativamente, la síntesis también se puede encargar a una organización independiente (por ejemplo, Promega Inc., o Takara Co.), etc.

Cuando se usa el polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido de la presente divulgación como una sonda en la etapa (2), la etapa (3) se puede realizar por métodos normales para detectar hibridación incluyendo transferencia Southern, transferencia northern (Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), Micromatriz (Affymetrix Inc.; cf., patentes en los EE UU Nos. 6.045.996, 5.925.525 y 5.858.659), TaqMan PCR (Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), Hibridación In Situ fluorescente (FISH) (Sieben V.J. et al., (2007-06). IET Nanobiotechnology 1 (3): 27-35), etc. Por otra parte, cuando se usa el polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos complementaria al polinucleótido de la presente divulgación como un cebador en la etapa (2), la hibridación se puede detectar en la etapa 3 realizando amplificación por PCR y analizando el producto de amplificación resultante mediante electroforesis o secuenciación (Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2a Edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press), etc.

El cuerpo vegetal en el que se detecta hibridación a mayor nivel se considera que expresa la proteína que tiene la actividad de añadir la molécula de azúcar al carboxilo en la posición C19 del compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación, de forma más abundante que en otros cuerpos vegetales, y por tanto se espera que tenga un mayor contenido del glucósido de esteviol.

Ejemplos

[Ejemplo 1] Aislamiento de gen candidato para esteviolbiósido glucosiltransferasa

En la publicación anterior (documento no de patente 2), se describe que UGT85C2 (No. de registro de GENEBANK AY345978) tiene la actividad de transferir una molécula de glucosa al hidroxilo C-13 de esteviol para formar esteviolmonoglucósido. Con el fin de obtener el gen UGT85C2, se realizó PCR con el siguiente conjunto de cebadores (SEQ ID NO: 3 y 4) usando como molde ADNc preparado de hojas de estevia.

El ADNc de hojas de estevia se obtuvo al extraer ARN total de hojas de estevia usando un kit RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) y someter 0,5 |jg del ARN total a transcripción inversa (RT) con cebador oligo-dT aleatorio.

CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw (la parte subrayada es el sitio de reconocimiento de Ndel):

5'-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3' (SEQ ID NO: 3)

BglII-SrUGT85C2-Rv (la parte subrayada es el sitio de reconocimiento de BglII):

5'-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3' (SEQ ID NO: 4)

Una solución de PCR (50 jl) tenía la composición de 1 j l de ADNc de hojas de estevia, tampón ExTaq 1x (TaKaRaBio), dNTPs 0,2 mM, 0,4 pmol cada uno/jl de los cebadores y 2,5 U de ExTaq polimerasa. La PCR se realizó haciendo reaccionar a 94°C durante 3 minutos, y después amplificando durante un total de 30 ciclos de la reacción a 94°C durante 1 minuto, 50°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos. El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, seguido por tinción con bromuro de etidio. Como resultado, se detectó la banda amplificada a un tamaño de aproximadamente 1,4 kb, predicha de cada ADN molde.

Este producto de PCR se subclonó en un vector direccional pENTR-TOPO (Invitrogen) por el procedimiento recomendado por el fabricante. Usando un secuenciador de ADN modelo 3100 (Applied Biosystems), se realizó desplazamiento del cebador con un cebador oligonucleotídico sintético para determinar la secuencia.

Como resultado, la secuencia de ADN obtenida mostró la identidad de secuencia con el UGT85C2 descrito (documento no de patente 2) al 99% del nivel de ADN (diferente en 3 nucleótidos) y al 99% del nivel de aminoácido putativo (diferente en 3 aminoácidos) (secuencia CDS: SEQ ID NO: 1, secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 2).

[Ejemplo 2] Construcción de un vector de expresión

El fragmento ORF de aproximadamente 1,4 kb de UGT85C2 se cortó usando los sitios de enzimas de restricción NdeI y BglII (las partes subrayadas de SEQ ID NO: 3 y 4) añadidos al cebador, y se ligó en los sitios NdeI y BglII del vector de expresión de Escherichia coli pET15b (Novagen, Inc.) para dar un vector de expresión en Escherichia coli de este gen de enzima. La etiqueta His localizada antes del sitio NdeI del vector coincidía con el marco abierto de lectura del gen UGT85C2; se diseñó para expresar la proteína quimérica de UGT85C2 fusionada a la etiqueta His.

[Ejemplo 3] Expresión y purificación de la proteína recombinante

Para aclarar las funciones bioquímicas de la enzima, la enzima se expresó en Escherichia coli. Usando el plásmido de expresión de Escherichia coli de UGT85C2 obtenido anteriormente, se transformó Escherichia coli BL21 (DE3). Los transformantes resultantes se cultivaron con agitación en 4 ml de medio LB (triptona peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, y NaCl 1 g/l) que contenía 50 pg/ml de ampicilina a 37°C durante la noche. Cuando se alcanzó la fase estacionaria, 4 ml del caldo de cultivo se inocularon en 8o ml de un medio con la misma composición, seguido por cultivo con agitación a 37°C. Se añadió IPTG a una concentración final de 0,5 mM en el punto cuando la turbidez celular (DO600) alcanzó aproximadamente 0,5. El cultivo con agitación siguió a 18°C durante 20 horas.

Los siguientes procedimientos se realizaron todos a 4°C. Los transformantes cultivados se recogieron por centrifugación (5.000 x g, 10 min), y se resuspendieron añadiendo 1 ml/g de células de tampón S [tampón HEPES 20 mM (pH 7,5), imidazol 20 mM y p-mercaptoetanol 14 mM]. La suspensión se ultrasonicó después (15 segundos x 8 veces), seguido por centrifugación (15.000 x g, 15 min). El sobrenadante resultante se recuperó como una solución de enzima cruda. La solución de enzima cruda se cargó en una His SpinTrap (GE Healthcare), que se había equilibrado con tampón S, y después se centrifugó (70 x g, 30 seg). Después de lavar con el tampón, la proteína unida a la columna se eluyó por etapas con 5 ml cada una de tampón S que contenía imidazol 100 mM y 500 mM. En cada una de las fracciones eluídas, el tampón se sustituyó mediante un Microcon YM-30 (Amicon) por tampón HEPES 20 mM (pH 7,5) y p-mercaptoetanol 14 mM (aumento de diálisis, x1000).

Como resultado de la separación por SDS-PAGE seguida por tinción con CBB, se confirmó la proteína en la fracción eluída con imidazol 500 mM a aproximadamente 50 kDa del peso molecular estimado para la proteína quimérica UGT85C2 fusionada a la etiqueta His. Esta fracción se usó para el análisis de la enzima (Fig. 2).

[Ejemplo 4] Ensayo para la actividad enzimática de UGT85C2

Las condiciones estándar para la reacción enzimática fueron como sigue. Se preparó una solución de reacción (UDP-glucosa 2 mM, sustrato aceptor de glucosilo (esteviol) 0,1 mM, tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y 25 pl de solución de enzima UGT85C2 purificada) en agua destilada para ser 50 pl, y se hizo reaccionar a 30°C durante una hora. El análisis de LC-MS se realizó para 5 pl de la solución de reacción enzimática en las siguientes condiciones.

Condiciones de LC

Columna, Waters Sunfire C183.5 um, 2,0 mm D.I. x 20 mm

Fase móvil: A. Agua MiliQ (+ ácido fórmico al 0,05%), B: MeCN

Gradiente: gradiante lineal de B desde el 15% al 55% (20 min)

Velocidad de flujo: 0,2 ml/min

Horno de columna: 40°C

Condiciones de MS

ESI (modo negativo)

Seguimiento iónico seleccionado: m/z 317, 479, 641, 687, 803 y 849

UGT85C2 se hizo reaccionar con esteviol. Como resultado, se confirmó que el grupo hidroxilo en la posición C-13 de esteviol se glucosiló (Fig. 4, panel 1: pico A) para formar esteviolmonósido (Fig. 4, panel 1: pico B). También se confirmó que se formó además simultáneamente rubusósido (Fig. 4: panel 1: pico D) con el carboxilo en la posición C19 que se glucosila en la solución de reacción (Fig. 4: panel 1). Los dos productos no se detectaron en la solución de reacción con la proteína UGT85C2 que se había inactivado por desnaturalización térmica (Fig. 4: panel 2). Por tanto, se confirmó que ambos productos eran los productos de reacción con la enzima UGT85C2. También se confirmó que esteviolbiósido (Fig. 4: panel 3: pico C) y esteviósido (Fig. 4: panel 3: pico E) se formaron por la reacción simultánea de UGT85C2 y similar a u Gt 91D 3 (secuencia CDS: SEQ ID n O: 5, secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 6) (Fig.4: panel 3). Por tanto, hubo un nuevo hallazgo de que la proteína UGT85C2 glucosila el hidroxilo en la posición C13 de esteviol y al mismo tiempo, también glucosila el carboxilo en la posición C19 de esteviolbiósido. Estos resultados del análisis enzimático sugieren que, en estevia, esteviósido (Fig. 4: panel 3: pico E) tiene dos rutas para biosíntesis a través de esteviolbiósido (Fig. 4: panel 3: pico C) y rubusósido (Fig. 4: panel 1: pico D).

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, el carboxilo en la posición C19 de esteviolmonósido y esteviolbiósido se puede glucosilar usando el gen UGT85C2 y el dulzor y calidad de gusto de glucósidos de esteviol se puede mejorar. La presente invención ha aclarado la imagen completa de la ruta biosintética hasta rebaudiósido A, y proporciona una herramienta molecular para producir edulcorantes naturales no calóricos rebaudiósido A, esteviósido y otros compuestos análogos no solo en plantas, sino también en microorganismos.

[Lista de secuencia en texto libre]

Claims

REIVINDICACIONES

i. Un método para producir un glucósido de esteviol, que comprende la etapa de hacer reaccionar una proteína según cualquiera seleccionada del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación, con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

(a) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;

(b) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación; y

(c) una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

en donde R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.
2. El método según la reivindicación 1, en donde dicho azúcar en el UDP-azúcar es una hexosa.
3. El método según la reivindicación 1, en donde dicho azúcar en el UDP-azúcar es uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.
4. El método según la reivindicación 1, en donde dicho azúcar añadido al carboxilo en posición 19 es una hexosa.
5. El método según la reivindicación 1, en donde dicho azúcar añadido al carboxilo en posición 19 es uno seleccionado del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.
6. El método según la reivindicación 1, en donde dicho R1 es H o el residuo de azúcar que es un monómero de glucosa, un dímero de glucosa o un trímero de glucosa.
7. El método según la reivindicación 1, en donde dicho compuesto es esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol.
8. El método según la reivindicación 1, en donde dicho glucósido de esteviol es esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o una combinación de los mismos.
9. Un transformante no humano, en el que se introduce un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) a (c) a continuación:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

2; y

(c) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 2 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

en donde Ri representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de Ca-Ci8, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.
10. El transformante según la reivindicación 9, en donde dicha molécula de azúcar es una hexosa.
11. El transformante según la reivindicación 9, en donde dicha molécula de azúcar es una seleccionada del grupo que consiste en glucosa, manosa y galactosa.
12. El transformante según la reivindicación 9, en donde dicho R1 es H o el residuo de azúcar que es un monómero de glucosa, un dímero de glucosa o un trímero de glucosa.
13. El transformante según la reivindicación 9, en donde dicho compuesto es esteviolmonósido, esteviolbiósido o esteviol.
14. El transformante según la reivindicación 9, en donde dicho polinucleótido está insertado en un vector de expresión.
15. El transformante según la reivindicación 9, que es una planta.
16. Uso de un transformante no humano para producir un glucósido de esteviol en donde un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en (a) a (e) a continuación se introduce en el transformante no humano:

(a) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1;

(b) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:

2;

(c) un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en donde de 1 a 48 aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación;

(d) un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación; y

(e) un polinucleótido que hibrida en condiciones muy rigurosas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 y codifica una proteína que tiene una actividad de añadir una molécula de azúcar al carboxilo en la posición 19 de un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

en donde R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de Ca-C18, un alquilarilo de Ca-C20, un arilalquilo de Ca-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.
17. Un extracto del transformante según la reivindicación 9.
18. Un alimento, composición farmacéutica o material industrial que comprende el extracto según la reivindicación 17.
19. Un método para producir un glucósido de esteviol, que comprende usar el transformante no humano según la reivindicación 9.
20. El método según la reivindicación 19, en donde dicho glucósido de esteviol es esteviolbiósido, esteviósido, rebaudiósido A, rebaudiósido B, rebaudiósido C, rebaudiósido D, rebaudiósido E, rebaudiósido F, o una combinación de los mismos.
21. El método de la reivindicación 19 o 20, que comprende además obtener un extracto de dicho transformante.
22. El método de la reivindicación 21, que comprende además obtener un alimento, composición farmacéutica o material industrial que comprende dicho extracto.
23. Una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
24. Un polinucleótido que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
25. El polinucleótido según la reivindicación 24 que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.
26. Uso de una proteína como se define en la reivindicación 1 o un polinucleótido que codifica tal proteína para producir un glucósido de esteviol, en donde la proteína se hace reaccionar con un UDP-azúcar y un compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación:

en donde R1 representa H, un alquilo de C1-C20, un alquenilo de C2-C20, un alquinilo de C2-C20, un alquildienilo de C4-C20, un arilo de C6-C18, un alquilarilo de C6-C20, un arilalquilo de C6-C20, un cicloalquilo de C4-C20, un cicloalquenilo de C4-C20, un (ciloalquilo de C3-C10) alquilo de C1-C10, o un residuo de azúcar.