JP6177127B2 - ステビオールグリコシドの組換え生成 - Google Patents

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Description

配列表
本願はEFS-Webを通じてASCIIフォーマットで提出された配列表を含むものであり、その全文を引用をもってここに援用することとする。２０１１年６月２日に作製された前記ASCIIの謄本は
25933WO1.txt という名称であり、大きさは
483,406 バイトである。
技術分野
本開示は、ステビオール及びステビオールグリコシドの組換え生成に関する。具体的には本開示は、組換え微生物、植物、又は植物細胞などのホストによる、ルブソシド及び／又はレバウディオサイドＡなどのステビオール及びステビオールグリコシドの生成に関する。更に本開示は、ステビオールグリコシドを含有する組成物も提供する。
背景
甘味料は、食品業、飲料業、又は製菓業において最も普通に用いられる成分として公知である。甘味料は製造中に最終的な食品に取り込まれてもよく、又は、適当に希釈された場合には卓上用甘味料としてスタンドアローン型の使用に向けても、又は、製パン時の糖類の家庭用代替品としてもよい。甘味料には、ショ糖、高果糖コーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、及び蜂蜜などの天然の甘味料や、アスパルテーム、サッカリン及びスクラロースなどの人工甘味料がある。ステビア抽出物は、多年生の低木、ステビア-レバウジアナ（原語：Stevia
rebaudiana）から単離及び抽出することのできる天然の甘味料である。ステビアは通常、南アメリカ及びアジアで、ステビア抽出物の商業生産用に育てられている。多様な程度に精製されるステビア抽出物は、通常、卓上用甘味料として、混合又は単独で食品中の高濃度甘味料として用いられる。
ステビア植物の抽出物は、甘味に寄与するレバウディオサイド及び他のステビオールグリコシドを含有するが、各グリコシドの量はしばしば、異なる製品バッチ間で様々である。既存の商業製品は主にレバウディオサイドＡであり、レバウディオサイドＣ、Ｄ、及びＦなどの他のグリコシドの量はそれより少ない。ステビア抽出物はまた、異風味に寄与する植物由来化合物などの混入物質も含有することがある。これらの異風味は、食品体系又は選択用途に応じて問題となったり、ならなかったりする。潜在的な混入物質には、色素、脂質、タンパク質、フェノール類、サッカリド、スパスレノール及び他のセスキテルペン、ラブダンジテルペン、モノテルペン、デカン酸、8,11,14-エイコサトリエン酸、2-メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β-シトステロール、α-及びβ-アミリン、ルペオール、β-アミリンアセテート、５環式トリテルペン、センタウレジン、ケルシチン、エピ-α-カジノール、カロフィレン及び誘導体、ベータ-ピネン、β-シトステロール、並びにギベレリンがある。
概要
ここでは、発現させるとステビオール生成される一種以上の生合成遺伝子を含む、微生物などの組換えホストを提供する。このような遺伝子には、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、カウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子；及びステビオールシンターゼをコードする遺伝子がある。組換えホストには、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子の代わりに、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子を含めることができる。遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。いくつかの実施態様では、前記組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子を含む。組換えホストは更に、切断型HMG-CoA レダクターゼをコードする遺伝子 及び／又は CPRをコードする遺伝子を含むことができる。前記遺伝子のうちの一つ以上の発現は誘導性であってもよい。
ある局面では、本書類は、UGT91D2
ポリペプチド（例えばUGT91D2e 又は UGT91D2m ポリペプチド）をコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。UGT91D2 ポリペプチドは、SEQ ID
NO:5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性（例えば 95% 又は99% の同一性）を有することができる。UGT91D2 ポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換を、SEQ ID NO:5の残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は387-473に含むことができる。例えば、UGT91D2 ポリペプチドは、アミノ酸置換をSEQ ID NO:5の残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び 438 から成る群より選択される一個以上の残基に含むことができる。ある実施態様では、UGT91D2 ポリペプチドは、SEQ ID
NO:5においてアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343 に含む。ある実施態様では、UGT91D2
ポリペプチドは、SEQ ID NO:5においてフェニルアラニンを残基30に、 グルタミンを残基 93に、バリンを残基99に、フェニルアラニンを残基 122に、チロシンを残基140に、システインを残基 142に、スレオニンを残基148に、アラニンを残基 153に、セリンを残基 156に、メチオニンを残基195に、グルタミン酸を残基 196に、グルタミン酸を残基199に、メチオニンを残基 211に、フェニルアラニンを残基221に、アラニンを残基 286に、アスパラギンを残基 427に、又はアラニンを残基438に含む。当該ポリペプチドはSEQ ID NO:5 又はSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を有することができる。
ここで更に解説するホストは、
SEQ ID NO:3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するUGT85C ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。 例えば、UGT85C ポリペプチドは、一箇所以上のアミノ酸置換を、SEQ ID NO:3の 残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び 471 に含むことができる。
ここで更に解説するホストは、SEQ
ID NO:7に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むことができる。例えば、UGT76G ポリペプチドは、一箇所以上のアミノ酸置換を、SEQ ID NO:7の残基 29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び 346 に含むことができる。
本書類は更に、SEQ ID
NO:3に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQ ID NO:3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471 に有するUGT85Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。例えば該UGT85C ポリペプチド は、置換をSEQ ID NO:3の残基 13、15、60、270、289、及び 418 に含むことができる。例えば該UGT85C
ポリペプチドはａ）置換をSEQ ID NO:3の残基 13、60、及び 270に；ｂ）置換をSEQ ID NO:3の残基 60 及び 87に；ｃ）置換をSEQ ID
NO:3の残基 65、71、220、243、及び270 に；ｄ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65、71、220、243、270、及び 441 に； ｅ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65、71、220、389、及び394 に；ｆ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65、71、270、及び 289 に；ｇ）置換をSEQ ID NO:3の残基15 及び65 に；ｈ）置換をSEQ ID
NO:3の残基 65 及び 270 に；ｉ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65 及び440 に；ｊ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65 及び 441に；ｋ）置換をSEQ ID NO:3の残基 65 及び 418 に；ｌ）置換をSEQ ID NO:3の残基 220、243、270、及び334 に；又はｍ）置換をSEQ ID NO:3の残基 270 及び 289 に含むことができる。
別の局面では、本書類は、SEQ
ID NO:7に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有すると共に、一箇所以上のアミノ酸を残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有するUGT76Gポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換えホストを特徴とする。例えば該UGT76G ポリペプチドは、ａ）置換をアミノ酸残基 74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び 291に；ｂ）置換を残基 74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び 291に；又はｃ）置換を残基74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び 346に有することができる。
ここに解説されたホストはいずれも、更にUGT74G1 ポリペプチドをコードする遺伝子（例えばUGT74G1 ポリペプチドをコードする組換え遺伝子）を含むことができる。
ここで解説するホストのいずれも、更に（ｉ） ゲラニルゲラニル ジホスフェート シンターゼをコードする遺伝子；（ｉｉ）
二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレン シンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子；（ｉｉｉ）
カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子； （ｉｖ）ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子；（ｖ）
切断型HMG-CoAをコードする遺伝子；（ｖｉ）CPRをコードする遺伝子；（ｖｉｉ）ラムノースシンセターゼをコードする遺伝子；（ｖｉｉｉ）UDP-グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；及び（ｉｘ）UDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、のうちの一つ以上を含むことができる。
（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、（ｖｉｉｉ）、又は（ｉｘ） のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子であってよい。いくつかの実施態様では、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の遺伝子のそれぞれは組換え遺伝子である。
更に本書類は、SEQ ID
NO:5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば少なくとも９５％又は９９％の配列同一性）を有するポリペプチドをコードする単離核酸も特徴とする。該ポリペプチドは、少なくとも一箇所のアミノ酸置換を、SEQ ID NO:5の残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は 387-473に含むことができる。該ポリペプチドは、アミノ酸置換を、SEQ ID NO:5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438 から成る群より選択される一つ以上の残基に含むことができる。該ポリペプチドは、SEQ ID NO:5においてアルギニンを残基206に、システインを残基207に、そしてアルギニンを残基343 に含むことができる。いくつかの実施態様では、該ポリペプチドは、SEQ ID NO:5においてフェニルアラニンを残基30に、グルタミンを残基 93に、バリンを残基 99に、フェニルアラニンを残基
122に、チロシンを残基 140に、システインを残基 142に、スレオニン
を残基 148に、アラニンを 残基 153に、セリンを残基 156に、メチオニンを残基 195に、グルタミン酸を残基 196に、グルタミン酸を残基 199に、メチオニンを残基 211に、フェニルアラニンを残基 221に、アラニンを残基 286に、アスパラギンを残基 427に、又はアラニンを残基 438に含む。
別の局面では、本書類は、SEQ
ID NO:5のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を持つアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを特徴とする。
更に本書類は、（ｉ）ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子；（ｉｉ）二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリル
ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子；（ｉｉｉ）カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子；及び（ｉｖ）ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子；（但しこの場合、前記遺伝子のうちの少なくとも一つ）を含む組換えホストも特徴とする。該ホストは、遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにステビオールを産生することができ、また培養基中で少なくとも1mg/Lまで蓄積することができる。該ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼは、SEQ ID NO:121-128に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有することができる。コパリルジホスフェートシンターゼは、SEQ ID NO:129-131に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して９０％を超える配列同一性を有することができる。カウレンシンターゼは、132-135に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して９０％を超える配列同一性を有することができる。カウレンオキシダーゼは、138-141に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して９０％4を超える配列同一性を有することができる。ステビオールシンセターゼは、 SEQ ID NO:142-146に示すアミノ酸配列のうちの一つに対して９０％を超える配列同一性を有することができる。該ホストは更に、切断型HMG-CoA をコードする遺伝子及び／又はCPRをコードする遺伝子を含むことができる。
該組換えホストのいずれも、UGT74G1ポリペプチド、UGT85C2 ポリペプチド、UGT76G1 ポリペプチド、又はGT91D2 ポリペプチドをコードする遺伝子のうちの一つ以上を含むことができる。
該組換えホストのいずれも、遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該ステビオールグリコシドは、ステビオール-13-O-グルコシド、ステビオール-19-O-グルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、及びダルコシドＡから成る群より選択することができる。ステビオールグリコシドは、前記条件下で培養されたときに培養基中１少なくとも1mg／リットル（例えば少なくとも
10 mg/リットル又は20 mg/リットル） まで蓄積させることができる。組換えホストのいずれも更に、ｉ）デオキシキシルロース 5-ホスフェート シンターゼ (DXS)をコードする遺伝子；ｉｉ）D-1-デオキシキシルロース 5-ホスフェート
レダクトイソメラーゼ (DXR)をコードする遺伝子；ｉｉｉ）4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトールシンターゼ (CMS)をコードする遺伝子；ｉｖ）4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ (CMK)をコードする遺伝子；ｖ）4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール 2,4-シクロジホスフェート シンターゼ (MCS)をコードする遺伝子；ｖｉ）1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェート シンターゼ (HDS)をコードする遺伝子；又はｖｉｉ）1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェートレダクターゼ
(HDR)をコードする遺伝子のうちの一つ以上を含むことができる。
組換えホストはいずれも更に、ｉｘ）アセトアセチル-CoA チオラーゼをコードする遺伝子；ｘ）切断型HMG-CoA レダクターゼをコードする遺伝子；ｘｉ）メバロネート キナーゼをコードする遺伝子；ｘｉｉ）ホスホメバロネート キナーゼをコードする遺伝子；ｘｉｉｉ）メバロネートピロホスフェート
デカルボキシラーゼをコードする遺伝子のうちの一つを含むことができる。
ここで解説するホストのいずれにおいても、該遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導性とすることができる。
ここで解説するホストはいずれも微生物（例えばサッカロミセス-セレビジエなどのサッカロミセス属、又はエシェリヒア-コリ）、又は植物もしくは植物細胞（例えばステビア-レバウジアナ（原語：Stevia
rebaudiana）などのステビア、フィスコミトレラ（原語；Physcomitrella）、又はタバコ植物もしくは植物細胞）であってよい。
別の局面では、本書類は、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する方法を特徴とする。本方法は、遺伝子が発現するような条件下で、ここで解説するホストを培養基中で成長させるステップと；該ホストによって産生されたステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップとを含む。前記の成長させるステップは、当該遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導するステップを含むことができる。該ステビオール又はステビオールグリコシドは、ステビオール-13-O-グルコシド、ステビオール-19-O-グルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、バウディオサイド
Ｆ、及びダルコシドＡから成る群より選択される。
また、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する方法もここで提供する。本方法は、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ、コパリルジホスフェートシンターゼ、カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸 13-ヒドロキシラーゼ 遺伝子、及び選択的にUGT74G1 及び／又はUGT85C2 遺伝子が発現するような条件下で、微生物を培養基中で成長させるステップと、該微生物によって産生されたステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップとを含む。当該の微生物はサッカロミセス種であってよい。いくつかの実施態様では、前記の成長させるステップは、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ、コパリルジホスフェート
シンターゼ、カウレン シンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸 13-ヒドロキシラーゼ、UGT74G1及びUGT85C2 遺伝子のうちの一つ以上の発現を誘導するステップを含む。いくつかの実施態様では、前記の回収するステップは、HPLCによってステビオール又はステビオールグリコシドを培養基から精製するステップを含む。当該のステビオール又はステビオール
グリコシドはステビオール、ルブソシド、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイド Ｆ、又はダルコシドＡであってよい。
更にここでは、発現するとent-カウレンが産生される一種以上の生合成遺伝子を含む、組換えサッカロミセス株を提供する。該生合成遺伝子は、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又は、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子含む。当該の株は、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼを発現したときにent-カウレンを産生する。
別の局面では、本書類は、SEQ
ID NO: 18-25、34-36、4-43、48、49、52-55、60-64、70-72、77、又は 79に示すヌクレオチド配列の一つに対して９０％を超える配列同一性（例えば 95% 又は 99% を超える配列同一性）を有する単離された核酸を特徴とする。
更に本書類は、（ｉ）UGT74G1をコードする遺伝子；（ｉｉ） UGT85C2をコードする遺伝子；（ｉｉｉ） UGT76G1をコードする遺伝子；及び（ｉｖ）UGT91D2をコードする遺伝子を含み、但しこの場合、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子であるような組換えホストを特徴とする。いくつかの実施態様では、該遺伝子のそれぞれは組換え遺伝子である。該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該ホストは更に、（ａ）二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子；（ｂ）カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子；及び（ｄ）ゲラニルゲラニル
ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。当該のステビオールグリコシドはレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ又はレバウディオサイド
Ｅであってよい。本書類は更に、このようなホストによって産生されるステビオールグリコシド組成物も特徴とする。該組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で４％を超えるレバウディオサイドＤと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で４％を超えるレバウディオサイドＥと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。
更に、UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、UGT91D2e 及びUGT91D2mのアミノ酸配列に対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドや、UGT91D2mのアミノ酸配列を除き、
UGT91D2e 又は UGT91D2mのアミノ酸配列に対して９０％を超える配列同一性を有する単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸を、ここでは特徴とする。
本書類は更に、ここで解説するホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有する。
別の局面では、本書類は組換えホストを特徴とする。該ホストは、（ｉ）UGT91D2をコードする組換え遺伝子；（ｉｉ）UGT74G1をコードする組換え遺伝子；（ｉｉｉ）UGT85C2をコードする組換え遺伝子；（ｉｖ）UGT76G1をコードする組換え遺伝子；及び（ｖ）ラムノースシンセターゼをコードする遺伝子を含み、但しこの場合、該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオール
グリコシドを産生する。該ホストは更に、（ａ）二官能性の コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリル
ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子；（ｂ）カウレン オキシダーゼをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子；及び（ｄ）ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドＣ又はダルコシドＡであってよい。本書類は更に、このようなホストによって産生されるステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で１５％を超えるレバウディオサイドＣと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。このようなホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、重量で総ステビオール
グリコシドの１５％を超えるダルコシドと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。
本書類は更に組換えホストを特徴とする。該ホストは、（ｉ）UGT91D2をコードする組換え遺伝子；（ｉｉ）UGT74G1をコードする組換え遺伝子；（ｉｉｉ）UGT85C2をコードする組換え遺伝子；（ｉｖ）UGT76G1をコードする組換え遺伝子；（ｖ）UDP-グルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子；及び（ｖｉ）UDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、を含み、但しこの場合、該ホストは、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオール グリコシドを産生する。該ホストは更に、（ａ）二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ
及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子；（ｂ）カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子；（ｃ）ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子；及び（ｄ）ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、を含むことができる。該ステビオール
グリコシドはレバウディオサイドＦであってよい。 本書類は更に、このようなホストによって産生されたステビオールグリコシド組成物も特徴とする。本組成物は、総ステビオールグリコシドの重量で４％を超えるレバウディオサイドＦと、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。
別の局面では、本書類は、ステビオールグリコシド組成物を生成する方法を特徴とする。本方法は、当該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下でここに解説するホストを培養基中で成長させるステップと；該ホストによって産生されたステビオール
グリコシド 組成物を回収するステップとを含み、但しこの場合、該回収された組成物は、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ又はダルコシド
Ａについて、野生型のステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較して濃縮される。該ホスト（例えば微生物）によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア抽出物に比較して低いレベルのステビア植物由来混入物質を有することができる。
本書類は更に、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比較してレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ又はダルコシドＡが濃縮されたステビオールグリコシド組成物を含む食品を特徴とする。
別の局面では、本書類は、多型が形質におけるばらつきと関係するのかどうかを識別する方法を特徴とする。本方法は、ある植物集団中の一つ以上の遺伝子多型が、SEQ ID NO:5に示すポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座に関連するかどうかを判定するステップと；該集団中の植物の形質のばらつきと、該集団中の植物の一つ以上の遺伝子多型の存在との間の相関関係を測定することで、前記一つ以上の遺伝子多型が形質のばらつきと関連するかどうかを判定するステップとを含む。
更に別の局面では、本書類は、植物株を作製する方法を特徴とする。本方法は、植物集団中の一つ以上の遺伝子型が、SEQ ID NO:5に示すポリペプチド及びその機能的ホモログの遺伝子座と関連するかどうかを判定するステップと；遺伝子多型のうちの少なくとも一つの存在が形質のばらつきと関連するような一つ以上の植物を集団中で識別するステップと；識別された植物の一つ以上をそれ自体又は異なる植物と交配することで種子を作製するステップと；前記種子から成長させた少なくとも一つの後代植物を、それ自体又は異なる植物に交配するステップと；前記交配ステップを更に０−５世代、繰り返すことで、前記植物株を作製するステップであって、但し、遺伝子多型のうちの少なくとも一つが前記植物株中に存在する、ステップとを含む。
更に本書類は、第二の糖部分を、ステビオールグリコシド中のグルコースのC-2' に移動させる方法も特徴とする。本方法は、ステビオールグリコシドをUGT91D2 ポリペプチド及びUDP-糖に、前記第二の糖部分のステビオールグリコシドへの移動に適した反応条件下で接触させるステップを含む。該UGT91D2 ポリペプチドは、SEQ ID
NO:5に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば少なくとも９５％又は９９％）を有することができる。該UGT91D2 ポリペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸置換をSEQ ID NO:5の残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は387-473 に含むことができる。該UGT91D2
ポリペプチドはアミノ酸置換を、SEQ ID
NO:5の 残基 30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基に含むことができる。該ステビオールグリコシドはステビオール-13-O-グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、及びレバウディオサイドＡから成る群より選択することができる。該ステビオールグリコシドはルブソシドでよく、そして前記第二の糖部分はグルコースであり、そしてステビオシドは、前記第二の糖部分が移動したときに生成される。該ステビオールグリコシドはステビオシドであってよく、そして前記第二の糖部分はグルコースであってよく、そしてレバウディオサイドＥは、前記第二のグルコース部分が移動したときに生成される。該ステビオールグリコシドはステビオシドであってよく、但しこの場合、ステビオシドは、レバウディオサイドＤを生成するのに適した反応条件下で UGT91D2 ポリペプチド及びUGT76G1 ポリペプチドに接触させる。該ステビオールグリコシドはステビオール-13-O-グルコシドであってよく、そして前記第二のグルコース部分の移動したときにステビオール-1,2 ビオシドが生成される。該ステビオールグリコシドはステビオール-13-O-グルコシドであってよく、そして前記第二の糖部分が移動したときにステビオール-1,2-キシロビオシドが生成される。該ステビオールグリコシドはステビオール-13-O-グルコシドであってよく、そして前記第二の糖部分が移動したときにステビオール-1,2-ラムノビオシドを生成させることができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドＡであってよく、そして第二のグルコース部分が移動したときにレバウディオサイド
Ｄが生成される。
別の局面では、本書類は、ステビア植物中のポリヌクレオチドの存在を判定する方法を特徴とする。本方法は、少なくとも一種のプローブ又はプライマー・ペアをステビア植物由来の核酸に接触させるステップであって、但しこの場合の前記プローブ又はプライマー・ペアは、UGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的であり、該UGTポリペプチドは、SEQ ID
NO: 5、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3 又は SEQ ID NO:7 に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステップと、前記ポリヌクレオチドが前記植物中に存在するかどうかを判定するステップとを含む。
更に本書類は、ステビア生物試料を遺伝子型判定するためのキットも特徴とする。本キットは、SEQ
ID NO: 5、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3 又は SEQ ID NO:7に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマー・ペア、又は、同ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするプローブ、を含む。
更にここでは、その発現が一種以上のステビオールグリコシドの産生につながる一種以上の生合成遺伝子を含む組換え微生物を提供する。該生合成遺伝子は、ゲラニルゲラニル
ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子、コパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子、ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、並びにUGT74G1 及び／又はUGT85C2をコードする遺伝子を含む。前記遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該微生物は、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及び
カウレンシンターゼをコードする遺伝子を、コパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子の代わりに含むことができる。
前記組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生する。該ステビオールグリコシドは
ルブソシド、レバウディオサイドＣ、 レバウディオサイド Ｆ、ダルコシドＢ、又はダルコシドＡであってよい。
組換え微生物は、例えばサッカロミセス-セレビジエなどのサッカロミセス属であってよく、そしてEXG1 及び
EXG2 グリコシドヒドロラーゼ活性を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができ、そしてエルゴステロール生合成を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができる。該サッカロミセス属は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに
ルブソシドを産生する。該ルブソシドは、少なくとも10 mg/l培養基１リットルまで蓄積することができる。該サッカロミセス属は、CEY171、CEY191、又はCEY213と指名されたサッカロミセス-セレビジエ株であってよい。
該組換え微生物は更に、SM12UGTをコードする遺伝子及びUGT76G1をコードする遺伝子を含むことができ、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにステビオール グリコシドを産生することができる。該ステビオールグリコシドはレバウディオサイドＡであってよい。
更にここでは、その発現が少なくとも一種のステビオールグリコシドの産生につながるような一種以上の生合成遺伝子を含む組換え微生物を提供する。該生合成遺伝子は、SM12UGTをコードする遺伝子、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT76G1 をコードする遺伝子、及びUGT85C2をコードする遺伝子を含む。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときにレバウディオサイド Ａ又はレバウディオサイドＢを産生する。該レバウディオサイド Ａ又はレバウディオサイドＢは、培養基中で少なくとも 1 mg/L まで蓄積することができる。
更にここでは、組換えUGT91D2遺伝子など、UGT91D2 ポリペプチドをコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。
更にここでは、ゲラニルゲラニルジホスフェート シンターゼをコードする遺伝子、二官能性のコパリルジホスフェートシンターゼ及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子（又はコパリルジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子及びカウレンシンターゼをコードする遺伝子）、カウレンオキシダーゼをコードする遺伝子、ステビオールシンセターゼをコードする遺伝子、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT85C2をコードする遺伝子、UGT76G1をコードする遺伝子、及びUGT91D2をコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに、例えばレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、及び／又はレバウディオサイドＦなど、少なくとも一種のステビオールグリコシドを産生することができる。該組換え微生物は、このような条件下で培養されたときに培養基１リットル当り少なくとも20 mg のステビオールグリコシドを蓄積することができる。該組換え微生物は、サッカロミセス-セレビジエなどのサッカロミセス属であってよく、EXG1 及びEXG2 グリコシドヒドロラーゼ活性を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らすような一つ以上の遺伝子改変を有することができ、そしてエルゴステロール生合成を、遺伝子改変のないコントロール微生物に比較して減らす一つ以上の遺伝子改変を有することができる。
更にここでは、UGT74G1をコードする遺伝子、UGT85C2をコードする遺伝子、UGT76G1をコードする遺伝子、及びUGT91D2をコードする遺伝子を含む組換え微生物も特徴とする。該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子である。該組換え微生物は、該遺伝子のそれぞれが発現するような条件下で培養されたときに、例えばレバウディオサイド
Ａ又はレバウディオサイドＢなどのステビオールグリコシドを産生することができる。レバウディオサイドＡ又はレバウディオサイドＢは培養基中で少なくとも 15 mg/L まで蓄積することができる。
上記の組換え微生物は更に、デオキシキシルロース 5-ホスフェート シンターゼ (DXS)をコードする遺伝子、及び／又はD-1-デオキシキシルロース 5-ホスフェート
レダクトイソメラーゼ (DXR)をコードする遺伝子、及び／又は4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール シンターゼ (CMS)をコードする遺伝子、及び／又は4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ (CMK)をコードする遺伝子、及び／又は4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール 2,4-シクロジホスフェートシンターゼ
(MCS)をコードする遺伝子、及び／又は1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェート シンターゼ (HDS)をコードする遺伝子、及び／又は1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェートレダクターゼ (HDR)をコードする遺伝子を含むことができる。
上記の組換え微生物は更に、アセトアセチル-CoA チオラーゼをコードする遺伝子、及び／又は切断型HMG-CoA レダクターゼをコードする遺伝子、及び／又はメバロネート キナーゼをコードする遺伝子、及び／又はホスホメバロネートキナーゼをコードする遺伝子、及び／又はメバロネートピロホスフェートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むことができる。
他に定義しない限り、ここで用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。ここで解説するものと同様又は均等な方法及び材料を用いて本発明を実施することもできるが、適した方法及び材料を以下に解説する。ここで言及するすべての公開文献、特許出願、特許、及び他の参考文献の全文を、引用をもってここに援用することとする。矛盾する場合は、定義も含む本明細書を上位とする。加えて、該材料、方法、及び例は単に描写のみであり、限定を意図したものではない。本発明の他の特徴及び利点は以下の詳細な説明から明白であろう。出願人は、特許法における標準的な慣例に従って移行的な文言「含む」、「から基本的に成る」、又は「から成る」を用いることで、いずれかの開示された発明を代替的に請求の範囲とする権利を保持する。
図１は、ステビオールのゲラニルゲラニルジホスフェートからの生合成を示すスキームである。 図２Ａ−Ｄは、ステビオールグリコシドのステビオールからの生合成の概略的経路を示す。 図３は、多様なステビオールグリコシドの化学構造を示す。 図４は、サッカロミセス-セレビジエにおけるrebA産生の概略図である。 図５は、eYACを形成するための遺伝子の結合の概略図である。 図６は、多様な培養条件下での酵母株CEY13によるルブソシド産生を示す。 図７は、酵母株CEY213が先生する化合物の1H及び13C NMR 解析から得られたデータを、ルブソシドに関する文献での数値に比較して示す。 図８は、 UGT91D1 及びUGT91D2 アミノ酸配列（それぞれSEQ ID NO:14、16、12、 5、及び 10）のアライメントである。 図９は、２４及び９９時間の培養後の、プラスミドpMUS47を含有する酵母CEY213によるレバウディオサイドＡ、ステビオシド、及びルブソシド産生を示す。 図１０Ａは、上清中のRebA、ルブソシド及び19-SMG の濃度を示すグラフである。図１０Ｂは、酵母細胞に100μMのステビオールを与えた実験に関する、細胞ペレット中で測定された RebA、ルブソシド及び19-SMG の濃度のグラフである。両者のグラフにおいて、最初の組の棒は、タグのないコントロール株を表す；二番目の組の棒は、MDM2 タンパク質のN-末端側の158アミノ酸を各UGTに融合させたUGT74G1、UGT76G1、及びUGT91D2e 融合タンパク質と、合成PMIペプチドの四つの反復配列をインフレームで85C2のN末端に融合させた UGT85C2 融合タンパク質を表す。x軸はマイクロモル単位での濃度である。多様な図面における同様な参照記号は同様な要素を指す。
詳細な説明
二種のグリコシド、ステビオシド及びレバウディオサイドＡが、市販のステビア抽出物中の主な化合物である。ステビオシドＡ はレバウディオサイドＡよりも苦く、甘みが少ないと報告されているため、抽出物製剤中では レバウディオサイドＡが高率であることが好ましい。しかしながら、ステビア抽出物の組成はロット毎に、植物が成長した土壌及び気候に応じて様々である。原料となった植物、気候条件、及び抽出プロセスに応じて、市販の製品中のレバウディオサイドＡの量は、総ステビオール グリコシド含有量の ２０乃至９７％、典型的には５０−８０％であり、ときには総ステビオールグリコシドの９５−９７％を超えると報告されている。更に、他のステビオールグリコシドが、量は様々ではあるがステビア抽出物中に存在しており、これが、ステビア抽出物からの抽出及び精製により一貫した食味プロファイルを持つ甘味料を製造できるかどうかを更に複雑にしている。例えばレバウディオサイドＢは典型的には１−２％未満、存在するが、他方、レバウディオサイドＣは、７−１５％という高いレベルで存在する。レバウディオサイドＤは典型的には、総ステビオールグリコシドの２％未満のレベルで存在し、そしてレバウディオサイドＦは典型的には３．５％未満、組成物中に存在する。更に微量の副次的なステビオールグリコシドが、ステビア抽出物の香味プロファイルに影響することが報告鎖ｒている。加えて、ステビア植物の混入物質の中には、大変低濃度であっても、市販の植物抽出物のいくつかに異風味を提供しかねないものがあると考えられる。
本書類は、ステビオールの合成に有用なポリペプチドを発現する植物細胞、植物、又は微生物などの組換えホストを開発することができるという発見に基づく。更に、このようなホストは、ルブソシド 及びレバウディオサイドＡなどのステビオールグリコシドを生成するのに適したウリジン 5'-ジホスホ (UDP) グリコシルトランスフェラーゼを発現することができる。組換え微生物は特に有用なホストである。これらの生合成ポリペプチドを多様な微生物シャシスで発現させることにより、ステビオール及びそのグリコシドを、一貫した、再現可能な態様で、糖類、グリセロール、CO2、H2、及び日光などのエネルギー及び炭素源から生成することができる。組換えホストによって産生される各ステビオールグリコシドの比率は、予め選択された生合成酵素をホストに導入し、それらを適したレベルで発現させることで調節することができ、こうして一貫した食味プロファイルを持つ甘味料組成物を提供することができる。更に、組換えホストによって産生されるステビオールグリコシドの濃度は、ステビア植物中で産生されるステビオールグリコシドのレベルよりも高くなるため、下流の精製の効率を高めると予測される。このような甘味料組成物は、ステビア抽出物中に存在する混入物質量に比較して、植物ベースの混入物質をほとんど、又は全く含有しない。
該遺伝子のうちの少なくとも一つは組換え遺伝子、つまり、使用に向けて選択された種又は株に応じた特定の組換え遺伝子である。ステビオール及びグリコシド生成率を増加させる、エネルギー及び炭素源がステビオール及びグリコシドに転化される高率を高める、及び／又は、細胞培養株又は植物からの生産性を高めるために、更なる遺伝子又は生合成モジュールを含めることができる。このような更なる生合成モジュールには、テルペノイド前駆体、イソペンテニルジホスフェート 及びジメチルアリルジホスフェートの合成に関与する遺伝子がある。更なる生合成モジュールには、テルペン シンターゼ及びテルペンシクラーゼ遺伝子、例えばゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ及びコパリル ジホスフェートシンターゼをコードする遺伝子がある、これらの遺伝子は内因性の遺伝子でも、又は組換え遺伝子でもよい。
Ｉ． ステビオール及びステビオールグリコシド生合成ポリペプチド
Ａ． ステビオール生合成ポリペプチド
ジテルペンステビオール及び多様なステビオールグリコシドを含め、ステビア抽出物に見られる化合物のいくつかの化学構造を図３に示し、CAS番号を下の表Ａに示す。更にHarriet Wallin, Food Agric. Org. (2007)によって作製されたステビオールグリコシド化学及的及び技術的評価 69th JECFAも参照されたい。
Figure 0006177127
微生物などのホストで特定の遺伝子を発現させると、そのホストに対してステビオール合成能がもたらされることが発見されている。以下に更に詳細に論じるように、このような遺伝子のうちの一つ以上が、ホストには天然で存在するかも知れない。しかしながら典型的には、このような遺伝子の一つ以上は、それらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。
ステビオールを生成する生合成経路は、ゲラニルゲラニルジホスフェートの形成、 (-) コパリルジホスフェートへの環化、続く酸化及び水酸化によるステビオールの形成、を含む。図１を参照されたい。このように、組換え微生物におけるゲラニルゲラニルジホスフェートのステビオールへの転化は、カウレンシンターゼ (KS)をコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼ (KO)をコードする遺伝子、及びステビオール シンセターゼ (KAH)をコードする遺伝子の発現を含む。ステビオールシンセターゼはカウレン酸 13-ヒドロキシラーゼとしても知られる。
適したKS ポリペプチドが公知である。例えば、適したKS 酵素には、ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana）、ジー-メイス（原語：Zea mays ）及びポピュラス-トリコカルパ（原語：Populus trichocarpa）によって産生されるものがある。SEQ ID NO: 132-135を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳述する。例えば表３及び SEQ ID NO: 40-47を参照されたい。
適したKO ポリペプチドが公知である。例えば、適したKO酵素には、ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana）、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）、ギベレラ-フジコロイ（原語：Gibberella fujikoroi ）及びトラメテス-ヴェルシコロー（原語：Trametes versicolor）が産生するものがある。 SEQ ID NO: 138-141を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、以下により詳細に解説する。例えば表５及び SEQ ID NO: 52-59を参照されたい。
適したKAH ポリペプチドが公知である。例えば、適したKAH 酵素には、ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana）、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）、ヴィティス-ヴィニフェラ（原語：Vitis vinifera ）及びメディカゴ-トルンキュラタ（原語：Medicago trunculata）が産生するものがある。例えば SEQ ID NO: 142-146；米国特許公報 No. 2008-0271205；米国特許公報 No. 2008-0064063 及び Genbank 受託番号 No. gi 189098312を参照されたい。アラビドプシ-サリアナ由来の該ステビオールシンセターゼはCYP714A2と分類される。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳細に解説する。例えば表６及びSEQ ID NO: 60-69を参照されたい。
いくつかの実施態様では、組換え微生物は、KO及び／又はKAH ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有する。このような微生物は典型的には、チトクロームP450 レダクターゼ (CPR) ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有するが、それはなぜなら、KO及び／又はKAH ポリペプチドの特定の組合せには、外因性のCPRポリペプチドの発現が必要である。具体的には、植物由来のKO 及び／又はKAH ポリペプチドの活性は、外因性CPRポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有させることにより、著しく増加させることができる。適したCPR ポリペプチドが公知である。例えば、適した CPR 酵素には、ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana）、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）、及びギベレラ-フジクロイ（原語：Giberella fujikuroi）が産生するものがある。例えば SEQ ID NO: 147-149を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、以下により詳細に解説する。例えば表７及びSEQ ID NO: 70-75を参照されたい。
これらの遺伝子を組換え微生物で発現させると、ゲラニルゲラニルジホスフェートがステビオールに転化する。
Ｂ．ステビオール グリコシド生合成ポリペプチド
いくつかの実施態様では、ここで解説する組換えホストは、ステビオールをステビオール
グリコシドに転化させることができる。このようなホスト（例えば微生物）は、UGTとしても知られる一つ以上のUDP グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有する。UGTは単糖単位を活性化したヌクレオチドの糖が受容部分、この場合はステビオール又はステビオール誘導体上の−OH 又は−COOH部分に移動させる。UGTは、 配列ホモロジーに基づいてファミリー及びサブファミリーに分類されている。Li et al. J. Biol. Chem. 276:4338-4343
(2001).
B. 1 ルブソシド 生合成 ポリペプチド
ルブソシドの生合成は ステビオールの13-OH及び19-COOHのグリコシル化を含む。図２Ａを参照されたい。微生物などの組換えホストにおけるステビオールのルブソシドへの転化は、グルコース単位をそれぞれステビオールの13-OH 又は19-COOHに移動させる、UGT 85C2 及び74G1をコードする遺伝子の発現によって達成し得ることが発見された。
このように、適したUGT85C2 は、ウリジン5’-ジホスホグルコシル: ステビオール 13-OH トランスフェラーゼ及びウリジン5’-ジホスホグルコシル: ステビオール-19-O-グルコシド13-OH トランスフェラーゼとして機能する。機能的なUGT85C2 ポリペプチドは更に、ステビオール及びステビオール-19-O-グルコシド以外のステビオールグリコシド基質を用いるグルコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。
適したUGT74G1 ポリペプチドは、 ウリジン5’-ジホスホ グルコシル: ステビオール 19-COOHトランスフェラーゼ 及び ウリジン5’-ジホスホグルコシル: ステビオール-13-O-グルコシド19-COOHトランスフェラーゼとして機能する。機能的なUGT74G1 ポリペプチドは更に、ステビオール及びステビオール-13-O-グルコシドステビオール以外のグリコシド基質を利用する、又はウリジンジホスフェートグルコース以外のドナーから糖部分を移動させる、グリコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。
機能的UGT74G1及び機能的UGT85C2 を発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えたときにルブソシド及び両ステビオールモノシド（即ちステビオール 13-O-モノグルコシド及びステビオール
19-O-モノグルコシド) を産生することができる。このような遺伝子の一つ以上が、ホスト内に天然で存在するであろう。しかしながら典型的には、このような遺伝子は、天然ではそれらを持たないホスト（例えば微生物）内に導入された組換え遺伝子である。
ここで用いられる場合の組換えホストという用語は、そのゲノムが、少なくとも一つの導入されたDNA配列によって増強されたホストを言うものと意図されている。このようなDNA 配列には、限定はしないが、天然では存在しない遺伝子、通常はRNAに転写されたい、又はタンパク質に翻訳（発現）されないDNA配列、及び非組換えホストに導入したい他の遺伝子又はDNA配列が含まれる。典型的には、ここで解説される組換えホストのゲノムは、一つ以上の組換え遺伝子の安定な導入を通じて増強されると理解されよう。一般的には、導入されるDNAは、当該DNAのレシピエントであるホスト内には元々ないものであるが、ホストからDNA部分を単離した後、例えば遺伝子産物の生成を高めるため、又は、遺伝子の発現パターンを変えるためなど、同じホスト内にそのDNAの一つ以上の付加的なコピーを導入することも、本発明の範囲内にある。場合によっては、導入されたDNAは、例えば相同組換え又は部位指名変異誘発などにより、内因性の遺伝子又はDNA配列を修飾又は更には置換することとなろう。適した組換えホストには、微生物、植物細胞、及び植物がある。
用語「組換え遺伝子」とは、同じもしくは類似の遺伝子又はDNA配列がこのようなホスト内に既に存在しているかどうかに関係なく、レシピエントのホスト内に導入される遺伝子又はDNA配列を言う。この文脈での「導入された」又は「増強された」は当業では、人の手によって導入された又は増強されたことを意味するとして公知である。従って、組換え遺伝子は、別の種由来のDNA配列であってよく、あるいは、同じ種に由来する又は同じ種に存在するが、組換えホストを形成するために遺伝子操作法によってホストに導入されたDNA配列であってもよい。ホストに導入される組換え遺伝子は、形質転換させようとするホストに通常存在するDNA配列に同一であってよく、そして導入されると、当該DNAの一つ以上の更なるコピーを提供することで、そのDNAの遺伝子産物の過剰発現又は修飾された発現が可能になることは理解されよう。
適したUGT74G1 及びUGT85C2 ポリペプチドにはステビア-レバウディアナ（原語： Stevia rebaudiana）が産生するものがある。ステビア由来の機能的なUGT74G1及びUGT85C2 ポリペプチドをコードする遺伝子が、Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)で報告されている。Ｓ．レバウディアナ UGT74G1 及びUGT85C2 ポリペプチドのアミノ酸配列をそれぞれSEQ ID NO: 1 及び 3に示す。酵母での発現に至適化させてあるUGT74G1 及びUGT85C2 をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ SEQ ID NO: 2 及び 4に示す。更にそれぞれ実施例１７及び１８で解説されたUGT85C2 UGT74G1 バリアントを参照されたい。
いくつかの実施態様では、組換えホストは微生物である。ルブソシドを産生させるために、組換え微生物をステビオールを含有する培地上で成長させることができる。しかし他の実施態様では、該組換え微生物は、例えばCDPS遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及び／又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の組換え遺伝子を発現するものである。このように、UGT74G1 及び UGT85C2 遺伝子に加えてCDPS遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及びKAH 遺伝子を含有する微生物は、培養基中にステビオールを含める必要なく、ステビオールモノシド及びルブソシドの両方を産生することができる。
いくつかの実施態様では、組換え微生物は更に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ (GGPPS)をコードする組換え遺伝子を発現する。適したGGPPS ポリペプチドが公知である。例えば適したGGPPS 酵素には、ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana）、ギベレラ-フジクロイ（原語：Gibberella fujikuroi）、ムス-ムスカルス（原語：Mus musculus）、サラシオシラ-シュードナナ（原語：Thalassiosira pseudonana,）、ストレプトミセス-クラブリジェルス（原語：Streptomyces
clavuligerus）、スルフロブス-アシドカルダリウス（原語：Sulfulobus
acidocaldarius）、シネココッカス（原語：Synechococcus ）種及びアラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）が産生するものがある。 SEQ ID NO: 121-128を参照されたい。これらのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を以下により詳述する。表１及びSEQ ID NO:18-33を参照されたい。いくつかの実施態様では、組換え微生物は更に、例えば以下に論じるメチルエリスリトール 4-ホスフェート (MEP) 経路の遺伝子又はメバロネート (MEV) 経路の遺伝子など、ジテルペンの生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を発現する。
Ｂ．２ レバウディオサイドＡ生合成ポリペプチド
レバウディオサイドＡの生合成には、 アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドＡは、13-O-ステビオールモノシドを形成する、ステビオーモノシドの13-OHのグルコシル化、ステビオール-1,2-ビオシドを形成する、ステビオールモノシドの13-O-グルコース のC-2’のグルコシル化、ステビオシドを形成する、ステビオール-1,2-ビオシドのC-19カルボキシルのグルコシル化、及びステビオシドのC-13-O-グルコースのC-3’のグルコシル化によって形成することができる。各グルコシル化反応を行わせる順序は様々であってよい。図２Ａを参照されたい。
組換えホスト内でのステビオールのレバウディオサイドＡへの転化は、以下の機能的UGT: 74G1、85C2、76G1 及び91D2をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見された。このように、これら４つのUGTを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えられたときにレバウディオサイドＡを産生することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、天然ではそれらを持たない微生物に導入された組換え遺伝子である。更に、ここでSM12UGTと指名されたUGTはUGT91D2に置換することができることも発見されている。
適したUGT74G1 及びUGT85C2 ポリペプチドには、上に論じたものがある。適した UGT76G1 はグルコース部分を、受容側分子であるステビオール
1,2 グリコシドのC-13-O-グルコースのC-3'部分に加える。このように、UGT76G1 は、例えばウリジン 5’-ジホスホグルコシル: ステビオール 13-O-1,2
グルコシド C-3’ グルコシルトランスフェラーゼ 及びウリジン5’-ジホスホグルコシル: ステビオール-19-O-グルコース、13-O-1,2
ビオシドC-3’ グルコシルトランスフェラーゼなどとして機能する。機能的なUGT76G1 ポリペプチドはまた、例えばステビオールラムノシド及びステビオールキシロシドなど、グルコース以外の糖を含有する ステビオールグリコシド基質を利用するグルコシルトランスフェラーゼ反応も触媒するであろう。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ及び２Ｄを参照されたい。適したUGT76G1 ポリペプチドには、Ｓ．レバウディアナによって産生され、 Richman, et al. Plant J. 41: 56-67 (2005)に報告されたものがある。Ｓ．レバウディアナ UGT76G1 ポリペプチドのアミノ酸配列をSEQ ID NO:7に示す。SEQ ID NO:7のUGT76G1 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、酵母での発現に向けて至適化されており、 SEQ ID NO:8に示されている。更に実施例１８に示す
UGT76G1 バリアントも参照されたい。
適したUGT91D2 ポリペプチドは、ウリジン5’-ジホスホグルコシル: ステビオール-13-O-グルコシド トランスフェラーゼ （ステビオール-13-モノグルコシド1,2-グルコシラーゼとも言及される）として機能して、受容側分子であるステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2’ にグルコース部分を移す。典型的には、適したUGT91D2 ポリペプチド は、ウリジン5’-ジホスホ グルコシル: ルブソシドトランスフェラーゼ としても機能することで、受容側分子ルブソシドの13-O-グルコースのC-2’にグルコース部分を移す。
機能的なUGT91D2 ポリペプチドはまた、ステビオール-13-O-グルコシド 及びルブソシド以外のステビオールグリコシド基質を利用する反応も触媒するであろう。例えば機能的なUGT91D2 ポリペプチドはステビオシドを基質として利用して、グルコース部分を 19-O-グルコース 残基のC-2’に移すことでレバウディオサイドＥを生成するであろう。更に機能的な UGT91D2 ポリペプチドレバウディオサイドＡを基質として利用して、19-O-グルコース 残基のC-2’にグルコース部分を移してレバウディオサイドＤを生成するであろう。しかしながら、機能的なUGT91D2 ポリペプチドは典型的には、グルコース部分を、1,3-結合グルコースをC-13位に有するステビオール化合物には移さないであろう。即ち、グルコース部分の ステビオール 1,3-ビオシド及び1,3-ステビオシドへの移動は起きない。
機能的なUGT91D2 ポリペプチドは、ウリジンジホスフェートグルコース以外のドナーから糖部分を移動させることができる。例えば、機能的なUGT91D2 ポリペプチド はウリジン 5’-ジホスホ D-キシロシル: ステビオール-13-O-グルコシド トランスフェラーゼとして働き、キシロース部分を受容側分子ステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2’に移動させることができる。別の例として、機能的なUGT91D2 ポリペプチドはウリジン 5’-ジホスホ L-ラムノシル: ステビオール-13-O-グルコシドトランスフェラーゼとして働き、ラムノース部分を受容側分子ステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2'に移動させることができる。
適した機能的な UGT91D2 ポリペプチドには、例えばUGT91D2e 及びUGT91D2mと指名されたポリペプチドなど、ここに開示されたものがある。ステビア-レバウディアナ由来の例であるUGT91D2e ポリペプチドのアミノ酸配列 をSEQ ID NO: 5に示す。SEQ ID NO:6 は、酵母での発現に向けてコドンを至適化されたSEQ ID NO:5のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。SEQ ID NO:5 のポリペプチドをコードするＳ．レバウディアナヌクレオチド配列をSEQ ID NO:9に示す。Ｓ．レバウディアナ由来の例であるUGT91D2m ポリペプチドのアミノ酸配列をSEQ ID NO: 10 及び12に示すが、それぞれSEQ ID NO: 11 及び13に示す核酸配列にコードされている。更に、例えばアミノ酸残基 206、207、及び 343に置換を含有するバリアントなど、実施例１６のUGT91D2バリアントも参照されたい。
上に示したように、ここでSM12UGT と指名したUGTは、UGT91D2に置換することができる。適した機能的なSM12UGT ポリペプチドには、イプモエア-パープレラ（原語：Ipomoea
purpurea ）（日本の朝顔）が産生する、 Morita et al. Plant J. 42, 353-363
(2005)に記載されたものがある。Ｉ．パープレラ IP3GGT ポリペプチドをコードするアミノ酸配列をSEQ ID NO:76に示す。SEQ ID NO:77 は、酵母での発現に向けてコドン至適化されたSEQ ID NO:76 のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。もう一つの適した SM12UGT ポリペプチドは、R25S変異を有する Bp94B1 ポリペプチドである。Osmani et al. Plant Phys. 148: 1295-1308
(2008) 及びSawada et al. J. Biol. Chem. 280:899-906 (2005)を参照されたい。ベリス-ペレニス（原語：Bellis perennis ）赤色デージー）UGT94B1 ポリペプチドをコードするアミノ酸配列をSEQ ID NO:78に示す。SEQ ID NO:79 は、酵母での発現に向けてコドン至適化されたSEQ ID NO:78のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
いくつかの実施態様では、組換え微生物は、レバウディオサイドＡを産生させるためにステビオール-13-O-グルコシド 又はステビオール-19-O-グルコシドを含有する培地上で成長させる。このような実施態様では、該微生物は、機能的UGT91D2、機能的UGT74G1 及び機能的 UGT76G1をコードする遺伝子を含有及び発現し、その一方又は両者がステビオールモノシド又はルブソシドであるステビオールを培地に与えたときにレバウディオサイドＡを産生することができる。
他の実施態様では、組換え微生物は、レバウディオサイドＡを産生させるために、ルブソシドを含有する培地上で成長させる。このような実施態様では、当該の微生物は、機能的UGT91D2及び機能的UGT76G1をコードする遺伝子を含有及び発現し、培養基にルブソシドを与えたときにレバウディオサイドＡを産生することができる。
他の実施態様では、当該の組換え微生物は、例えばCDPS遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及び／又はKAH遺伝子など、ステビオールの生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及びKAH 遺伝子を、UGT74G1、UGT85C2、UGT91D2 遺伝子及びUGT76G1遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドＡを産生することができる。
いくつかの実施態様では、当該の組換え微生物は更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させ、レバウディオサイドＡ生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、当該の組換え微生物は更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。
Ｂ．３ ダルコシドＡ及びレバウディオサイドＣ生合成ポリペプチド
レバウディオサイドＣ及び／又はダルコシドＡ の生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化及びラムノシル化が関与する。具体的には、ダルコシドＡは、ステビオール-13-O-グルコシドを形成する、ステビオールの13-OHのグルコシル化と、1,2-ラムノビオシドを形成する、ステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2’のラムノシル化と、 1,2 ラムノビオシドのC-19カルボキシルのグルコシル化によって形成することができる。レバウディオサイドＣは、ダルコシドＡのC-13-O-グルコースのC-3’のグルコシル化によって形成することができる。各グリコシル化反応を起こさせる順序は様々であってよい。図２Ｂを参照されたい。
組換えホスト中でのステビオールのダルコシドＡへの転化は、以下の機能的なUGT： 85C2、91D2、及び74G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見された。このように、これら三つのUGT及びラムノースシンターゼを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えたときにダルコシドＡを産生することができる。代替的には、二つのUGT、91D2 及び74G1とラムノース シンセターゼを発現する組換え微生物は、モノシドであるステビオール-13-O-グルコシド又はステビオール-19-O-グルコシドを培地に加えたときにダルコシドＡを産生することができる。同様に、ステビオールのレバウディオサイドＣへの組換え微生物中での転化は、ステビオールを与えたときにUGTs 85C2、91D2、74G1、及び76G1 並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、ステビオール-13-O-グルコシドを与えたときにはUGTの91D2、74G1 及び76G1、並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、ステビオール-19-O-グルコシドを与えたときにはUGTの 85C2、91D2 及び76G1、並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、あるいはルブソシドを与えたときにはUGTの91D2 及び76G1 並びにラムノースシンセターゼをコードする遺伝子の発現により、達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、天然ではこれらを持たない微生物中に導入された組換え遺伝子である。
適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1 及びUGT85C2 ポリペプチドには、ここで論じる機能的UGT ポリペプチドがある。ラムノースシンセターゼにより、ステビオール化合物受容側のラムノシル化のためのUDPラムノース・ドナー量が植える。適したラムノースシンセターゼには、例えばＡ．サリアナ RHM2 遺伝子の産物など、アラビオドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis
thaliana）が産生するものがある。
いくつかの実施態様では、UGT79B3 ポリペプチドをUGT91D2 ポリペプチドに置換する。適したUGT79B3 ポリペプチドには、in vitroでステビオール 13-O-モノシドをラムノシル化することができる、アラビオドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis
thaliana）が産生するものがある。Ａ．サリアナ UGT79B3 はグルコシル化化合物をラムノシル化して1,2-ラムノシドを形成することができる。アラビドプシス-サリアナ（原語： Arabidopsis thaliana ）UGT79B3 のアミノ酸配列をSEQ ID NO:150に示す。SEQ ID NO:150 のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をSEQ ID NO:151に示す。
いくつかの実施態様では、レバウディオサイドＣを、in vitro 法を用い、適したUDP-糖又はUDP-糖再生のための無細胞系を提供しながら、生成することができる。例えばJewett MC, Calhoun KA, Voloshin A, Wuu JJ and
Swartz JR in Molecular Systems Biology,
4, article 220 (2008) による“An integrated cell-free metabolic platform for protein
production and synthetic biology” を参照されたい。反応は一緒に行われても、段階的に行われてもよい。例えば、レバウディオサイドＣは、ルブソシドから、 化学量論的量のUDP-ラムノース及びUGT91d2eを添加した後、UGT76G1 及び過剰もしくは化学量論的量のUDP-グルコースを添加することで生成できよう。いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を向上させる。
他の実施態様では、組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO 遺伝子及び／又はKAH 遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS 遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及びKAH 遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2 遺伝子及びUGT76G1 遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基中にステビオールを添加する必要なく、レバウディオサイドＣを産生することができる。加えて、当該の組換えホストは典型的にはラムノースシンセターゼをコードする内因性又は組換え遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ステビオール化合物受容側のラムノシル化のためのUDP-ラムノース・ドナー量を増加させるために有用である。 適したラムノース シンセターゼには、Ａ．サリアナRHM2遺伝子の産物など、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）が産生するものがある。
当業者であれば、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節したり、UDP-ラムノースの利用能を調節したりすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子、及びステビオール グリコシド生合成遺伝子の転写調節は、当業で公知の技術を用い、転写活性化及び抑制の組合せによって達成することができる。in vitro 反応の場合、当業者であれば、様々なレベルのUGT酵素を組み合わせて添加すること、あるいは、様々なUGTSを組み合わせた場合の相対的な活性に影響する条件下で添加することが、所望の比率の各ステビオールグリコシドに向けて合成を指向させることを認識することであろう。
いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル ジホスフェートのレベルを増加させるため、レバウディオサイドＡ合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPSを更に含有及び発現する。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、ent-カウレン酸又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにする又は減少させることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させるための遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスを、ERG9遺伝子の下方調節により減らしてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節すると、ent-カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させられよう。カロテノイド産生生物においては、ステビオールへのフラックスは、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させられよう。
いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。
いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、総ステビオールグリコシドの、例えば少なくとも２０％のレバウディオサイドＣ，３０−４０％のレバウディオサイドＣ、４０−５０％のレバウディオサイドＣ、５０−６０％のレバウディオサイドＣ、６０−７０％のレバウディオサイドＣ、７０−８０％のレバウディオサイドＣ、８０−９０％のレバウディオサイドＣなど、少なくとも１５％を超えるレバウディオサイドＣを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば９０−９９％のレバウディオサイドＣなど、少なくとも９０％のレバウディオサイドＣを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオール グリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、 ステビオールラムノビオシド、レバウディオサイドＡ、及びダルコシドＡなど、図２Ａ及びＢに示されたものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホストによって産生されるレバウディオサイドＣ濃縮組成物を更に精製することができ、こうして精製されたレバウディオサイドＣ又はダルコシドＡを、次に他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合して、所望の香味系又は甘味組成物を得てもよい。例えば、組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドＣ濃縮組成物を、異なる組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドＡ、Ｆ、又はＤ-濃縮組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドＡ、Ｆ、又はＤと、又はin vitroで生成された レバウディオサイドＡ、Ｆ、又はＤと配合することができる。
Ｂ．４ レバウディオサイドＥ及びレバウディオサイドＤ生合成ポリペプチド
レバウディオサイドＥ及び／又はレバウディオサイドＤ の生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドＥは、ステビオール-13-O-グルコシドを形成する、ステビオールの13-OHのグルコシル化、ステビオール-1,2-ビオシドを形成する、ステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2'のグルコシル化、 1,2-ステビオシドを形成する、1,2-ビオシドのC-19カルボキシルのグルコシル化、及び、レバウディオサイドＥを形成するために、1,2-ステビオシドの19-O-グルコースのC-2’ のグルコシル化によって形成することができる。レバウディオサイドＤは、レバウディオサイドＥのC-13-O-グルコースのC-3’のグルコシル化によって形成することができる。各グルコシル化反応を行う順序は様々であってよい。例えば、19-O-グルコースのC-2’のグルコシル化は経路の最後のステップであってよく、この場合レバウディオサイド Ａは経路の中間産物である。図２Ｃを参照されたい。
組換えホストにおけるステビオールのレバウディオサイドＤへの転化は、以下の機能的UGT：85C2、91D2、74G1 及び 76G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができることが発見されている。このように、これらの４つのUGTを発現する組換え微生物は、培地にステビオールを添加したときにレバウディオサイドＤを産生することができる。代替的には、二つの機能的なUGTである91D2及び76G1を発現する組換え微生物は、ルブソシド 又は 1,2-ステビオシドを培地に与えたときにレバウディオサイドＤを産生することができる。別の代替案として、 三つの機能的なUGTである74G1、91D2 及び76G1を発現する組換え微生物が、培地にモノシドであるステビオール-13-O-グルコシドを与えたときにレバウディオサイドＤを産生することができる。同様に、ステビオール-19-O-グルコシドのレバウディオサイドＤへの組換え微生物中での転化は、ステビオール-19-O-グルコシドを与えたときに、UGTである85C2、91D2 及び76G1をコードする遺伝子の発現により達成することができる。典型的には、これらの遺伝子のうちの一つ以上は、これらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。
適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1 及びUGT85C2 ポリペプチドには、ここで論じた機能的UGT ポリペプチドがある。いくつかの実施態様では、UGT79B3 ポリペプチドを上に論じたように UGT91に置換する。
いくつかの実施態様では、レバウディオサイドＤ又はレバウディオサイドＥを、適したUDP-糖又はUDP-糖再生のための無細胞系を提供しつつ、in vitro 法で生成することができる。例えば Jewett MC, et al. Molecular Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008)を参照されたい。複数の反応を有する転化を一緒に行っても、又は段階的に行ってもよい。レバウディオサイドＤは、市販の濃縮済み抽出物であるレバウディオサイドＡから生成しても、あるいは、化学量論的又は過剰量のUDP-グルコース及びUGT91D2eを添加することで生合成を通じて生成してもよい。いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を向上させる。
当業者であれば、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節することにより、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子及びステビオールグリコシド生合成遺伝子の転写調節は、当業者に公知の技術を用いて転写活性化及び抑制の組合せを行うことにより、達成することができる。in
vitro 反応の場合、当業者であれば、異なるレベルのUGTを組み合わせて、又は、様々なUGTSを組み合わせたときの相対的活性に影響を与える条件下で添加すると、各ステビオールグリコシドの所望の比率に向けて合成が指向されることを認識されよう。当業者であれば、13-O-グルコシド反応（基質レバウディオサイドＡ及びステビオシド）と比較したときに、19-O-グルコシド反応に対してより高い活性を有するジグリコシル化酵素を用いれば、より高率のレバウディオサイドＤ又はＥあるいはより効率的なレバウディオサイドＤ又はＥへの転化を得ることができることを認識されよう。
他の実施態様では、当該の組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS
遺伝子、KO 遺伝子及び／又はKAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS 遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子及びKAH 遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2 遺伝子及びUGT76G1 遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドＥ及びＤを産生することができる。
いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させ、ステビオール生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。 いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、ent-カウレン酸 又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させる遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスは、ERG9遺伝子の下方調節によって減少させてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節してent-カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させてもよい。カロテノイド産生生物では、ステビオールへのフラックスを、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させてもよい。いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP又はMEV経路の遺伝子など、ジテルペン生合成又はテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。
いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、重量で総ステビオールグリコシドの、例えば少なくとも４％のレバウディオサイドＤ、少なくとも５％のレバウディオサイドＤ、１０−２０％のレバウディオサイドＤ、２０−３０％のレバウディオサイドＤ、３０−４０％のレバウディオサイドＤ、４０−５０％のレバウディオサイドＤ、５０−６０％のレバウディオサイドＤ、６０−７０％のレバウディオサイドＤ、７０−８０％のレバウディオサイドＤなど、少なくとも３％を超えるレバウディオサイドＤを有するレバウディオサイドＤ濃縮ステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば９０−９９％のレバウディオサイドＤなど、少なくとも９０％のレバウディオサイドＤを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオールグリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオール グルコビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＥ及びステビオシドなど、図２Ｃに示すものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホスト（例えば微生物）によって産生されるレバウディオサイドＤ濃縮組成物を更に精製することができ、こうして精製されたレバウディオサイドＤ又はレバウディオサイドＥを次に、他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合して、所望の香味系又は甘味組成物を得ることができる。例えば、組換えホストによって産生されるレバウディオサイドＤ濃縮組成物を、異なる組換えホストによって産生されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、又はＦ-濃縮組成物に、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドＡ、Ｆ、又はＣに、又は in
vitroで生成されたレバウディオサイドＡ、Ｆ、又はＣに配合することができる。
Ｂ．５ レバウディオサイドＦ生合成ポリペプチド
レバウディオサイドＦの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化及びキシロシル化が関与する。具体的には、レバウディオサイドＦは、ステビオール-13-O-グルコシドを形成する、ステビオールの13-OHのグルコシル化、 ステビオール-1,2-キシロビオシドを形成する、ステビオール-13-O-グルコシドの13-O-グルコースのC-2’のキシロシル化、 1,2-ステビオキシルオシドを形成するための、1,2-キシロビオシドのC-19カルボキシルのグルコシル化、及び、レバウディオサイドＦを形成するための、1,2-ステビオキシルオシドのC-13-O-グルコースのC-3’のグルコシル化によって形成することができる。各グリコシル化反応を行わせる順序は様々であってよい。図２Ｄを参照されたい。
組換えホストでのステビオールのレバウディオサイドＦへの転化は、以下の機能的 UGTである85C2、91D2、74G1 及び76G1をコードする遺伝子と、内因性もしくは組換えにより発現されたUDP-グルコース デヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼにより達成することができることが発見されている。従って、これらのｓ４種のUGTを内因性もしくは組換えUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼと一緒に発現する組換え微生物は、培地にステビオールを与えるとレバウディオサイドＦを産生することができる。代替的には、二つの機能的なUGTである91D2 及び76G1を発現する組換え微生物には、培地にルブソシドを添加した場合にレバウディオサイドＦを産生させることができる。別の代替案として、機能的なUGT 76G1を発現する組換え微生物は、1,2 ステビオールハムノシドを与えたときにレバウディオサイドＦを産生することができる。別の代替案として、三つの機能的UGTである 74G1、91D2 及び76G1を発現する組換え微生物は、モノシドである ステビオール-13-O-グルコシドを培地に加えたときにレバウディオサイドＦを産生することができる。同様に、組換え微生物におけるステビオール-19-O-グルコシドのレバウディオサイドＦへの転化は、when fed ステビオール-19-O-グルコシドを与えたときに、UGTの85C2、91D2 及び 76G1をコードする遺伝子の発現によって達成することができる。典型的には、これらの遺伝子の一つ以上は、これらを天然では持たないホストに導入された組換え遺伝子である。
適したUGT91D2、UGT74G1、UGT76G1 及びUGT85C2 ポリペプチドには、ここで論じる機能的 UGT ポリペプチドがある。いくつかの実施態様では、UGT79B3 ポリペプチドを、上に論じたようにUGT91に置換する。UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼは、ステビオール化合物受容体側のキシロシル化のためのUDP-キシロースドナー量を増加させる。適したUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼには、アラビドプシス-サリアナ（原語： Arabidopsis thaliana ）又はクリプトコッカス-ネオフォルマンス（原語：Cryptococcus
neoformans） が産生するものがある。例えば、適したUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドは、それぞれＡ．サリアナUGD1 遺伝子及びUXS3 遺伝子にコードさせることができる。Oka and Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006)を参照されたい。
いくつかの実施態様では、 レバウディオサイドＦは、適切なUDP-糖、又はUDP-糖の再生用の無細胞系を提供しつつinvitro法を用いて生成させることができる。例えばJewett MC, et al. Molecular
Systems Biology, Vol. 4, article 220 (2008)を参照されたい。反応は一緒に行われても、又は段階的に行われてもよい。例えばレバウディオサイドＦは、化学量論量の UDP-キシロース及びUGT91D2eを添加した後、UGT76G1及び過剰又は化学量論量のUDP-グルコースを添加することによってルブソシドから生成されよう。 いくつかの実施態様では、ホスファターゼを用いて二次的産物を除去し、反応収率を高める。
他の実施態様では、当該の組換えホストは、例えばCDPS遺伝子、KS遺伝子、KO 遺伝子及び／又は KAH遺伝子など、ステビオール生合成に関与する一つ以上の遺伝子を発現する。このように、例えば、CDPS 遺伝子、KS 遺伝子、KO 遺伝子 及びKAH 遺伝子を、UGT85C2、UGT74G1、UGT91D2 遺伝子及びUGT76G1 遺伝子に加えて含有する微生物は、培養基にステビオールを含める必要なく、レバウディオサイドＦを産生することができる。加えて、当該の組換えホストは典型的には、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸 デカルボキシラーゼをコードする内因性又は組換え遺伝子を発現する。このような遺伝子は、ステビオール化合物受容側のキシロシル化のために提供されるUDP-キシロースドナー量を増加させるために有用である。適したUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼには、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana ）又はクリプトコッカス-ネオフォルマンス（原語：Cryptococcus
neoformans）が産生するものがある。例えば、適したUDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及びUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドを、それぞれＡ．サリアナUGD1 遺伝子 及びUXS3 遺伝子にコードさせることができる。 Oka and
Jigami, FEBS J. 273:2645-2657 (2006)を参照されたい。
当業者であれば、、様々なUGT遺伝子の相対的発現レベルを調節したり、UDP-キシロースの利用能を調節したりすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド産物を所望の比率で特異的に産生するように組換えホストを調節することができることは認識されよう。ステビオール生合成遺伝子の転写調節は、当業で公知の技術を用い、転写活性化及び抑制の組合せによって達成することができる。in vitro 反応の場合、当業者であれば、様々なレベルのUGT酵素を組み合わせて添加すること、あるいは、様々なUGTSを組み合わせた場合の相対的な活性に影響する条件下で添加することが、所望の比率の各ステビオールグリコシドに向けて合成を指向させることを認識することであろう。
いくつかの実施態様では、当該の組換えホストは更に、ジテルペン前駆体ゲラニルゲラニルジホスフェートのレベルを増加させるため、ステビオール生合成経路を通るフラックスを増加させるために、組換えGGPPS遺伝子を含有及び発現する。いくつかの実施態様では、該組換えホストは更に、ゲラニルゲラニルジホスフェート、ent-カウレン酸又はファルネシルピロホスフェートを消費する非ステビオール経路の発現をサイレントにすることで、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成経路を通るフラックスを増加させるための遺伝子コンストラクトを含有する。例えば、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスを、ERG9遺伝子の下方調節により減らしてもよい。ジベレリンを産生する細胞においては、ジベレリン合成を下方調節すると、ent-カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加させられよう。カロテノイド産生生物においては、ステビオールへのフラックスは、一つ以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方調節により増加させられよう。いくつかの実施態様では、該組換えホストは更に、例えば下に論じるMEP経路の遺伝子など、ジテルペン生合成に関与する組換え遺伝子を含有及び発現する。
いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば 少なくとも 5%のレバウディオサイドＦ、少なくとも 6% のレバウディオサイド Ｆ、10-20% のレバウディオサイドＦ、20-30% のレバウディオサイドＦ、30-40% のレバウディオサイドＦ、40-50%のレバウディオサイドＦ、50-60% のレバウディオサイド Ｆ、60-70% のレバウディオサイドＦ、70-80% のレバウディオサイドＦなど、重量で総ステビオールグリコシドの少なくとも 4%を超えるレバウディオサイドＦを有するレバウディオサイドＦ濃縮ステビオールグリコシド組成物を産生する。いくつかの実施態様では、微生物などの組換えホストは、例えば９０−９９％のレバウディオサイドＦなど、少なくとも 90% のレバウディオサイドＦを有するステビオールグリコシド組成物を産生する。存在する他のステビオールグリコシドには、例えばステビオールモノシド、ステビオールグルコビオシド、ステビオールキシロビオシド、レバウディオサイドＡ、ステビオキシロシド、ルブソシド 及びステビオシドなど、図２Ａ及びＤに示すものが含まれよう。いくつかの実施態様では、ホストによって産生される該レバウディオサイドＦ濃縮組成物を、他のステビオールグリコシド、香料、又は甘味料と混合することで所望に香味系又は甘味組成物を得ることができる。例えば、組換えホストによって産生されるレバウディオサイドＦ濃縮組成物を、異なる組換え微生物によって産生されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、又はＤ濃縮組成物と、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、又はＤと、又はin vitroで生成されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、又はＤと配合することができる。
Ｃ．他のポリペプチド
その発現が、ステビオール又はステビオールグリコシドのより効率的な又は大規模な生成を容易にする更なるポリペプチドの遺伝子も組換えホストに導入することができる。例えば、組換え微生物、植物、又は植物細胞に、ゲラニルゲラニルジホスフェートシンターゼ（GGPPS、GGDPSとも言及される）をコードする一つ以上の遺伝子を含有させることができる。別の例として、該組換えホストはラムノースシンセターゼをコードする一つ以上の遺伝子、又は、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はUDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする一つ以上の遺伝子を含有することができる。別の例として、組換えホストは更に、 チトクロームP450 レダクターゼ (CPR)をコードする一つ以上の遺伝子を含有することもできる。組換えCPRを発現させると、NADPHを再生するNADP+ の循環を促すが、このNADPHはテルペノイド生合成のためのコファクターとして用いられる。他の方法を用いてNADHP レベルを再生することもできる。NADPH に制限ができる状況では、株を更に改変して、外因性のトランスデヒドロゲナーゼ遺伝子を含めることができる。例えば Sauer et al., J. Biol. Chem. 279: 6613−6619 (2004)を参照されたい。所望のコファクターレベルが増加するようにNADH/NADPH の比を減少させる又は改変するための他の方法が当業者に公知である。
別の例として、該組換えホストは、MEP経路又はメバロネート経路中の一つ以上の酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有することができる。このような遺伝子は、ジテルペン生合成経路への炭素のフラックスを増やすことができ、こうして該経路で生成されたイソペンテニルジホスフェート及びジメチルアリル ジホスフェートからゲラニルゲラニル ジホスフェートを産生することができるため、有用である。こうして産生されたゲラニルゲラニルジホスフェートを、ステビオール及びステビオールグリコシドの生合成へ向けて、ステビオール生合成ポリペプチド及びステビオール グリコシド生合成ポリペプチドの発現のおかげで指向させることができる。
Ｃ．１ MEP生合成ポリペプチド
いくつかの実施態様では、組換えホストは、イソプレノイド生合成のためのメチルエリスリトール4-ホスフェート (MEP) 経路に関与する酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有する。MEP 経路の酵素には、デオキシキシルロース 5-ホスフェートシンターゼ
(DXS)、D-1-デオキシキシルロース5-ホスフェートレダクトイソメラーゼ (DXR)、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトールシンターゼ
(CMS)、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール キナーゼ (CMK)、4-ジホスホシチジル-2-C-メチル-D-エリスリトール 2,4-シクロジホスフェート シンターゼ (MCS)、1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェートシンターゼ (HDS) 及び1-ヒドロキシ-2-メチル-2(E)-ブテニル 4-ジホスフェート レダクターゼ (HDR)がある。一つ以上のDXS 遺伝子、DXR 遺伝子、CMS 遺伝子、CMK 遺伝子、MCS 遺伝子、HDS 遺伝子、及び／又はHDR 遺伝子を組換え微生物に導入することができる。Rodriguez−Concepcion and
Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002)を参照されたい。
DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDS 及び／又は HDR ポリペプチドをコードする適した遺伝子には、Ｅ．コリ（原語：E. coli）、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）及びシネココッカス-レオポリエンシス（原語：Synechococcus
leopoliensis）が産生するものがある。DXR ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば米国特許第7,335,815号に解説されている。
Ｃ．２ メバロネート 生合成 ポリペプチドs
いくつかの実施態様では、組換えホストは、イソプレノイド生合成のためのメバロネート経路に関与する酵素をコードする一つ以上の遺伝子を含有する。ホスト内に導入するのに適した遺伝子は、切断型3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル (HMG)-CoA レダクターゼ (tHMG)など、メバロネート経路中の酵素をコードする、 及び／又は メバロネート キナーゼ (MK)をコードする遺伝子、及び／又は ホスホメバロネート キナーゼ (PMK)をコードする遺伝子、及び／又は メバロネートピロホスフェート デカルボキシラーゼ (MPPD)をコードする遺伝子などである。このように、一つ以上のHMG-CoA レダクターゼ遺伝子、MK遺伝子、PMK遺伝子、及び／又は MPPD 遺伝子を、微生物などの組換えホストに導入することができる。
メバロネート経路ポリペプチドをコードする適した遺伝子が公知である。例えば、適したポリペプチドには、Ｅ．コリ（原語：E. coli）、パラコッカス-デニトリフィカンス（原語：Paracoccus denitrificans）、サッカロミセス-セレビジエ（原語：Saccharomyces
cerevisiae）、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana）、キタサトスポラ-グリセオーラ（原語：Kitasatospora griseola）、ホモ-サピエンス（原語：Homo sapiens）、ドゥロソフィラ-メラノガスター（原語：Drosophila
melanogaster）、ガルス-ガルス（原語：Gallus gallus）、ストレプトミセス種、KO-3988、ニコチアナ-アテヌアータ（原語： Nicotiana attenuata）、キタサトスポラ-グリセオーラ（原語：Kitasatospora griseola）、ヘヴェア-ブラジリエンシス（原語：Hevea brasiliensis）、エンテロコッカス-ファーシウム（原語：Enterococcus faecium ）及びハエモトコッカス-プルヴィアリス（原語：Haematococcus
pluvialis）が産生するものがある。例えば米国特許第7,183,089号、第5,460,949号、及び第5,306,862号を参照されたい。
Ｄ． 機能的ホモログ
上述したポリペプチドの機能的ホモログは、ステビオール又はステビオールグリコシドを組換えホストで産生させる使用にも適している。機能的ホモログとは、基準ポリペプチドに対して配列類似性を有すると共に、基準ポリペプチドの生化学的もしくは生理的機能のうちの一つ以上を持つポリペプチドである。機能的ホモログ及び基準ポリペプチドは天然発生型のポリペプチドであってよく、当該の配列類似性は収束又は発散進化事象を原因としてよい。従って、機能的ホモログは時には文献中ではホモログ又はオーソログ、又はパラログとして指名される。野生型コーディング配列の変異体にコードされたポリペプチドなど、天然発生型の機能的ホモログのバリアントはそれら自体、機能的なホモログである場合がある。機能的ホモログはまた、あるポリペプチドのコーディング配列の部位指定変異誘発法によって作ることも、又は、異なる天然発生型ポリペプチドのコーディング配列を由来とするドメインを組み合わせる（「ドメイン・スワッピング」）ことで作ることもできる。ここに解説する機能的UGTポリペプチドをコードする遺伝子を改変する技術は公知であり、その中には、とりわけ、指定進化技術、部位指定変異誘発技術及びランダム変異誘発技術があり、所望の態様でポリペプチドの特異性を増すため、基質特異性を変えるため、発現レベルを変えるため、細胞レベル化位置を変えるため、又はポリペプチド：ポリペプチド相互作用を修飾するために有用であろう。このような改変されたポリペプチドは機能的なホモログと見なされる。「機能的ホモログ」という用語は、時には、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される。
機能的なホモログは、ヌクレオチド及びポリペプチドの配列アライメントの解析によって同定することができる。例えばヌクレオチド又はポリペプチドのデータベースに対してクエリを行うと、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログを同定することができる。配列解析には、GGPPS、CDPS、KS、KO 又はKAH アミノ酸配列を基準配列として用いた非重複データベースのBLAST、レシプロカルBLAST、又はPSI-BLAST解析を含めることができる。場合によってはアミノ酸配列が該ヌクレオチオ配列から演繹される。データベース中で、４０％を超える配列同一性を有するポリペプチドは、ステビオール又はステビオールグリコシド 生合成ポリペプチドとしての適性について更なる評価を行う候補である。アミノ酸類似性は、例えば疎水性残基一つの別のものへの置換や、あるいは、一つの極性の残基の別のものへの置換など、保存的アミノ酸置換を許容する。必要であれば、更なる評価に向けた候補数を狭めるために、このような候補の手による検査を行うことができる。手による検査は、例えば保存された機能的ドメインなど、ステビオール生合成ポリペプチド中に存在するドメインを有するように見える候補を選抜することにより、行うことができる。
保存領域は、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成 ポリペプチドの一次アミノ酸配列内で、反復された配列であるか、何らかの二次構造（例えばらせん及びベータシート）を形成しているか、正又は負に帯電したドメインを確立しているか、あるいはタンパク質モチーフ又はドメインを表しているような領域を位置特定することにより、同定することができる。例えばワールド・ワイド・ウェブ上で多種のタンパク質モチーフ及びドメインについてコンセンサス配列を述べたPfam ウェブサイトを sanger.ac.uk/Software/Pfam/ and
pfam.janelia.org/. で参照されたい。Pfam データベースに含まれた情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res.,
26:320-322 (1998); Sonnhammer et al.,
Proteins, 28:405-420 (1997); 及びBateman et al., Nucl. Acids Res.,
27:260-262 (1999)に解説されている。保存領域は更に、環系の近い主を由来とする同じ又は関連するポリペプチドの配列をアライメントすることでも決定することができる。関係の近い種とは好ましくは、同じファミリーを起源とするとよい。いくつかの実施態様では、二つの異なる種を由来とする配列のアライメントが充分である。
典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存領域を同定するためには有用である。関連するポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％の% アミノ酸配列同一性（例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、 少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。 いくつかの実施態様では、保存領域は少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を示す。
例えば、組換えホストでステビオールグリコシドを産生させるのに適したポリペプチドには、 UGT91D2e、UGT91D2m、UGT85C、及びUGT76Gに機能的ホモログがある。このようなホモログは、.UGT91D2e (SEQ ID NO:5)、UGT91D2m (SEQ
ID NO:10)、UGT85C (SEQ ID NO:3)、又はUGT76G (SEQ ID NO:7)のアミノ酸配列に対して９０％を超える（例えば９５％又は９９％）配列同一性を有する。UGT91D2、UGT85C、及びUGT76G ポリペプチドのバリアントは、典型的には、例えば７か所以下のアミノ酸置換、５か所の又は保存的なアミノ酸置換、又は１乃至５か所の置換など、１０か所以下のアミノ酸置換を一次アミノ酸配列内に有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、UGT91D2、UGT85C、及びUGT76G ポリペプチドのバリアントは、１０か所以上のアミノ酸置換（例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、１０−２０、１０−３５、２０−３０、又は２５−３５か所のアミノ酸置換など）を有することができる。該置換は保存的であってよく、あるいはいくつかの実施態様では、非保存的置換であってもよい。UGT91D2e ポリペプチドの非保存的変更の非限定的な例には、グリシンのアルギニンへの変更、及びトリプトファンのアルギニンへの変更がある。UGT76G ポリペプチドの非保存的置換の非限定的な例には、バリンのグルタミン酸への置換、グリシンのグルタミン酸への置換、
グルタミンのアラニンへの置換、及びセリンのプロリンへの置換がある。UGT85C ポリペプチドへの変更の非限定的な例には、ヒスチジンのアスパラギン酸への変更、プロリンのセリンへの変更、リジンのスレオニンへの変更、及びスレオニンのアルギニンへの変更がある。
いくつかの実施態様では、有用なUGT91D2ホモログは、ポリペプチドのうちで予測されるループの外側にある領域にアミノ酸置換（例えば保存的アミノ酸置換）を有することができ、例えば残基 20-26、39-43、88-95、121-124、142-158、185-198、及び203-214 はSEQ ID NO:5のＮ末端ドメイン中の予測されるループであり、そして残基 381-386はＣ末端ドメイン中の予測されるループである。例えば有用なUGT91D2 ホモログは、g can include 少なくとも一箇所のアミノ酸置換をSEQ ID NO:5の残基 1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は387-473に含むことができる。いくつかの実施態様では、UGT91D2 ホモログはアミノ酸置換をSEQ ID NO:5の残基30、93、99、122、140、142、148、153、156、195、196、199、206、207、211、221、286、343、427、及び438 から成る群より選択される一つ以上の残基に有することができる。例えば、UGT91D2機能的ホモログはアミノ酸置換を、SEQ
ID NO:5の、例えば残基206のアルギニン、残基207のシステイン、及び残基343のアルギニンなど、残基206、207、及び343のうちの一つ以上に有することができる。SEQ ID NO:95を参照されたい。 UGT91D2 の他の機能的なホモログは、SEQ ID NO:5の以下：残基30のチロシン又はフェニルアラニン、残基93のプロリン又はグルタミン、残基99のセリン又はバリン、残基122のチロシン又はフェニルアラニン、残基140のヒスチジン又はチロシン、残基142のセリン又はシステイン、残基148のアラニン又はスレオニン、残基152のメチオニン、残基153のアラニン、残基156のアラニン又はセリン、残基162のグリシン、残基195のロイシン又はメチオニン、残基162のグルタミン酸、残基199のリジン又はグルタミン酸、残基211のロイシン又はメチオニン、残基213のロイシン、残基221のセリン又はフェニルアラニン、残基253のバリン又はイソロイシン、残基286のバリン又はアラニン、残基427のリジン又はアスパラギン、残基438のアラニン、残基462のアラニン又はスレオニンのいずれか のうちの一つ以上を有することができる。実施例１１及び１６、並びに表１２及び１４を参照されたい。有用なバリアントUGT91D2 ポリペプチドは、図８に示す通りのアライメントに基づいて構築することもできる。
いくつかの実施態様では、有用なUGT85Cホモログは、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQ ID NO:3の残基 9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471 に有することができる。有用なUGT85C
ホモログの非限定的な例には、残基65に；残基 15、270、418、440、又は 441と組み合わせて残基65に； 残基 13、15、60、270、289、及び418に； 残基 13、60、及び270の置換； 残基 60 及び87の置換； 残基 65、71、220、243、及び270の置換； 残基 65、71、220、243、270、及び441の置換；残基 65、71、220、389、及び394の置換；残基 65、71、270、及び289の置換；残基 220、243、270、及び334の置換；又は残基 270 及び289の置換（SEQ ID NO:3に対して）を有するポリペプチドがある。実施例１７及び表５を参照されたい。
いくつかの実施態様では、有用なUGT76Gホモログは、一箇所以上のアミノ酸置換をSEQ ID NO:7の 残基 29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に有することができる。有用なUGT76Gホモログの非限定的な例には、 （SEQ ID NO:7に対して）
残基 74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び291に；残基 74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び291に；又は 残基 74 、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に、置換を有するポリペプチドがある。実施例１８及び表１６を参照されたい。
UGT91D2eなどの基質特異性を改変するための方法は当業者には公知であり、その中には、限定はしないが、部位指定／合理的変異誘発法、ランダム指定進化法、及びランダム変異誘発法／飽和技術を酵素の活性部位近傍で行う組合せ法がある。例えば Sarah A. Osmani, et al. Phytochemistry
70 (2009) 325−347を参照されたい。
候補配列は典型的には、例えば基準配列の長さの、82、85、87、89、90、93、95、97、99、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、又は 200 パーセントなど、基準配列の長さの80パーセント乃至200パーセントである長さを有するものである。基準核酸又はポリペプチドの対するいずれかの候補核酸又はポリペプチドのパーセント同一性は以下の通りにして判断することができる。基準配列（例えば核酸又はアミノ酸配列）を一つ以上の候補配列に、核酸又はポリペプチド配列のアライメントをそれらの全長にわたってアライメントする（グローバル・アライメント）ことができるようにするコンピュータ・プログラム ClustalW（バージョン1.83、デフォルト・パラメータ） を用いてアライメントする。Chenna
et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003)。
ClustalW は、基準配列と一つ以上の候補配列との間のベストマッチを計算し、同一性、類似性、及び違いが判断できるように、それらをアライメントする。一つ以上の残基のギャップを、基準配列、候補配列、又は両者に挿入することで配列アライメントを最大にすることができる。核酸配列のペアワイズ・アライメントを高速で行うためには、以下のデフォルト・パラメータを用いる：ワードサイズ：２；ウィンドウ・サイズ：４採点方法：パーセンテージ；トップ・ダイアゴナル数：４；及びギャップ・ペナルティ：５。拡散配列の多重アライメントには以下のパラメータを用いる：ギャップ・オープニング・ペナルティ：10.0；ギャップ・エクステンション・ペナルティ： 5.0；及びウェイト遷移：イェス。 タンパク質配列を高速でペアワイズ・アライメントするには以下のパラメータを用いる：ワードサイズ：1；ウィンドウ・サイズ： 5；採点方法：パーセンテージ；トップ・ダイアゴナル数：5；ギャップ・ペナルティ：3。タンパク質配列の多重アライメントには以下のパラメータを用いる：ウェイト・マトリックス：blosum；ギャップ・オープニング・ペナルティ：10.0；ギャップ・エクステンション・ペナルティ：0.05；疎水性ギャップ：on；親水性残基: Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg、及びLys；残基特異的ギャップ・ペナルティ：on。ClustalW アウトプットは配列間の関係を反映する配列アライメントである。ClustalW はワールド・ワイド・ウェブ上の例えばベイラー・カレッジ・オブ・メディスン・サーチ・ローンチャー・サイト (searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html) 及びワールド・ワイド・ウェブ上のヨーロピアン・バイオインフォーマティックス・インスティテュート・サイト(ebi.ac.uk/clustalw)上で作動させることができる。
候補核酸又はアミノ酸配列の基準配列に対するパーセント同一性を判定するには、配列をClustalWを用いてアライメントし、アライメント中の同一なマッチ数を基準配列の長さで除算し、その結果に100を乗算する。パーセント同一性の数値は１０分の１で四捨五入することができることは留意されたい。例えば、78.11、78.12、78.13、及び78.14 は78.1に切り下げることができるが、78.15、78.16、78.17、78.18、及び78.19 は78.2に切り上げられる。
機能的UGT91D2 ポリペプチドには、UGT91D2により行われるグルコシル化又は他の酵素活性に関与しない付加的なアミノ酸を含めることができ、このようなポリペプチドは、本来よりも長く成り得ることは理解されよう。
例えば、UGT91D2 ポリペプチドには、アミノ又はカルボキシ末端に加えられた精製タグ、葉緑体通過ペプチド、ミトコンドリア通過ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、又は分泌タグを含めることができる。いくつかの実施態様では、UGT91D2 ポリペプチドには、例えば緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質など、レポーターとして機能するアミノ酸配列が含まれる。
ＩＩ． ステビオール及びステビオールグリコシド 生合成 核酸
ここで解説するポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、当該ポリペプチドのコーディング配列を、このポリペプチドを発現させるのに適した一つ以上の調節領域に、センス方向で作動可能に連結させて含む。数多くの微生物が、ポリシストロンmRNA由来の複数の遺伝子産物を発現することができるため、複数のポリペプチドを、必要であればそれらの微生物の単一の調節領域の制御下で発現させることができる。当該配列の転写又は翻訳の調節にとって調節領域が有効であるような位置に調節領域及びコーディング配列があるときに、コーディング配列及び調節領域は作動可能に連結しているとみなされる。典型的には、モノシストロン遺伝子の場合、コーディング配列の翻訳読み取り枠の翻訳開始部位は、調節領域の１ヌクレオチド下流と約５０ヌクレオチド下流との間に位置する。
多くの場合、ここで解説するポリペプチドのコーディング配列は、組換えホスト以外の種で特定され、即ち異種の核酸である。このように、当該の組換えホストが微生物である場合、コーディング配列は、他の原核もしくは真核微生物由来、植物由来又は動物由来であってよい。しかしながら、場合によっては、コーディング配列はホストにとって生来的な配列であり、その生物に再導入されるものである。生来的な配列はしばしば、例えば組換え核酸コンストラクト中で生来的な配列をフランクする非天然の調節配列など、外因性の核酸に連結された非天然配列の存在によって、天然発生型の配列から区別することができる。加えて、安定に形質転換した外因性の核酸は、典型的には、生来的な配列が見られる位置以外の位置に組み込まれる。
「調節領域」とは、転写もしくは翻訳開始及び速度、並びに転写又は翻訳産物の安定性及び／又は移動度に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を言う。調節領域には、限定はしないが、プロモータ配列、エンハンサ配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、5´ 及び3´ 非翻訳領域(UTR)、転写開始部位、終了配列、ポリアデニル化配列、イントロン、及びこれらの組合せがある。調節配列は典型的には、少なくともコア（基礎）プロモータを含む。調節領域には更に、少なくとも一つの制御エレメント、例えばエンハンサ配列、上流エレメント又は上流活性化領域 （UAR）が含まれよう。調節領域は、当該配列の転写又は翻訳を調節するために調節領域が有効であるように調節領域及びコーディング配列を配置することにより、コーディング配列に作動可能に連結される。例えば、コーディング配列及びプロモータ配列を作動可能に連結するためには、コーディング配列の翻訳読み取り枠の翻訳開始部位は、典型的には、プロモータの１ヌクレオチド下流と約５０ヌクレオチド下流との間に配置される。しかしながら、調節領域は、翻訳開始部位の約5,000ヌクレオチド上流か、又は、翻訳開始部位の約2,000ヌクレオチド上流に配置することができる。
含めようとする調節領域の選択は、限定はしないが、特定の培養段階の間の効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、及び優先的な発現を含め、複数の因子に依る。当業者にとっては、コーディング配列に対して調節領域を適宜、選択及び配置することにより、コーディング配列の発現を調節することは慣例的な問題である。例えばイントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写終了因子、及び誘導性エレメントなど、二つ以上の調節領域が存在してもよいことは理解されよう。
一つ以上の遺伝子を、別個の局面でステビオール 及び／又は ステビオールグリコシドを生成させるために有用な「モジュール」にして、組換え核酸コンストラクトで組み合わせることができる。複数の遺伝子をモジュール、特にポリシストロン・モジュールにして組み合わせると、多様な種で該モジュールを使用することが容易になる。適した調節領域の挿入後にモジュールを幅広い種に導入することができるように、例えばステビオール生合成遺伝子クラスター又はUGT遺伝子クラスターをポリシストロン・モジュールに組み合わせることができる。別の例として、各UGTコーディング配列が別々の調節領域に作動可能に連結してUGTモジュールを形成するように、UGT遺伝子クラスターを組み合わせることができる。このようなモジュールは、モノシストロン性の発現が必要であるか、又は好ましいような種で用いることができる。ステビオール又はステビオールグリコシド生成に有用な遺伝子に加え、組換えコンストラクトは典型的には複製開始点と、コンストラクトを適した種内で維持するための一つ以上の選択マーカーを含有する。
遺伝子コードの縮重のために、数多くの核酸が、特定のポリペプチドを、即ち数多くのアミノ酸を、コードすることができ、当該アミノ酸のコドンとして役立つ二種以上のヌクレオチド・トリプレットがあることは理解されよう。従って、特定のホストで最適な発現が得られるように、あるポリペプチドのコーディング配列中のコドンをそのホスト（例えば微生物）にとって最適なコドン・バイアス表を用いて改変することができる。SEQ ID NO:18-25、34-36、40-43、48-49、52-55、60-64、及び70-72 は、酵母での発現が増加するように改変された、ステビオール及びステビオールグリコシド生合成のための特定の酵素をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。単離された核酸として、これらの改変された配列は精製済みの分子として存在することができ、そして組換え核酸コンストラクト用のモジュールを構築する際の使用に向けてベクタ又はウィルス中に導入することができる。
場合によっては、ステビオール又はステビオール グリコシド 生合成に向けて代謝中間産物を転用するために、内因性ポリペプチドの一つ以上の機能を阻害することが好ましい。例えば、スクアレンエポキシダーゼを下方調節するなどによりステビオール又はステビオールグリコシド生成を更に増加させるために、酵母でのステロール合成を下方調節することが好ましいことがある。別の例として、例えば二次代謝産物からグルコース部分を取り除くグリコヒドロラーゼなど、特定の内因性の遺伝子産物の分解機能を阻害することが好ましい場合もある。別の例として、グリコシル化ステビオシドの分泌が阻害されるように、ステビオールグリコシドの輸送に関与する膜トランスポーターの発現を阻害することができる。このような調節は、微生物の培養中の所望の期間、ステビオールグリコシドの分泌を阻害することでグリコシド生成物収穫時の収率を上げることができるという点で、有益であろう。このような場合、ポリペプチド又は遺伝子産物の発現を阻害する核酸を、株に導入する組換えコンストラクトに含めてもよい。代替的には、変異誘発法を用いて、その機能を阻害したい遺伝子の変異体を作ることができる。
ＩＩＩ． ホスト
Ａ． 微生物
例えばグラム陰性細菌、酵母及び真菌など、数多くの原核生物及び真核生物が、ここで解説する組換え微生物を構築する際の使用に適している。ステビオール又はステビオール グリコシド産生株としての使用に選抜された種及び株をまず分析して、どの生成遺伝子がその株にとって内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを判断する。内因性の相対物が当該株中に存在しない遺伝子を一つ以上の組換えコンストラクトで集合させた後、欠失している機能を提供するために、該コンストラクトを株に導入する。
原核生物及び真核生物種の例を下に更に詳述する。しかしながら、他の種も適するであろうことは理解されよう。例えば、適した種はアガリクス（原語：Agaricus）、アスペルギルス（原語：Aspergillus）、バシルス（原語：Bacillus）、カンジダ（原語：Candida）、コリネバクテリウム（原語：Corynebacterium）、エシェリヒア（原語：Escherichia）、フサリウム／ジベレラ（原語：Fusarium/Gibberella）、クルイヴェロミセス（原語：
Kluyveromyces）、レーティポルス（原語：Laetiporus）、レンティヌス（原語：Lentinus）、ファッフィア（原語：Phaffia）、ファネロカエテ（原語：Phanerochaete）、ピチア（原語：Pichia）、フィスコミトレラ（原語：Physcomitrella）、ロードツルラ（原語：Rhodoturula）、サッカロミセス（原語：Saccharomyces）、スキゾサッカロミセス（原語：
Schizosaccharomyces）、スファセロマ（原語：Sphaceloma）、キサントフィロミセス（原語：Xanthophyllomyces）及びヤロウィア（原語：Yarrowia）から選択される属であろう。このような属からの種の例には、レンチヌス-チグリヌス（原語：Lentinus tigrinus）、レーティポルス-スルフレウス（原語：Laetiporus
sulphureus）、ファネロカエテ-クリソスポリウム（原語：Phanerochaete chrysosporium）、ピチア-パストリス（原語：Pichia
pastoris）、フィスコミトレラ-パテンス（原語：Physcomitrella patens）、ロードツルラ-グルティニス32（原語：Rhodoturula
glutinis 32）、ロードツルラ-ムチラギノサ（原語：Rhodoturula mucilaginosa）、ファフィア-ロードジマUBV-AX（原語；Phaffia
rhodozyma UBV-AX）、キサントフィロミセス-デンドローホウス（原語：Xanthophyllomyces dendrorhous）、フサリウム-フジクロイ／ジベレラ-フジクロイ（原語：Fusarium
fujikuroi/Gibberella fujikuroi）、カンジダ-ユティリス（原語：Candida utilis ）及びヤロウィア-リポリティカ（原語：Yarrowia
lipolytica）から成る群より選択される属の中にあるであろう。 いくつかの実施態様では、微生物はジベレラ-フジクロイ、クルイベロミセス-ラクティス（原語：Kluyveromyces
lactis）、スキゾサッカロミセス-ポンベ（原語：Schizosaccharomyces pombe）、アスペルギルス-ニゲール（原語：Aspergillus niger）、又はサッカロミセス-セレビジエ（原語：Saccharomyces cerevisiae）などのアスコミセートであってよい。いくつかの実施態様では、微生物はエシェリヒア-コリ（原語：Escherichia coli）、ロードバクター-スファロイデス（原語：Rhodobacter
sphaeroides）、又はロードバクター-カプスラトゥス（原語：Rhodobacter capsulatus）などの原核生物であってよい。特定の微生物を用いると目的の遺伝子を高スループットでスクリーニング及び検査することができ、他方、所望の生産性又は成長上の特徴を持つ他の微生物をステビオールグリコシドの大規模生産に用いることができることは理解されよう。
サッカロミセス-セレビジエ
サッカロミセス-セレビジエは、合成生物学で幅広く用いられているシャシー生物であり、組換え微生物のプラットフォームとして用いることができる。Ｓ．セレビジエについて利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータ・モデル、及び他の情報があるため、生成物の収率を高めるために多様なモジュールの合理的にデザインすることができる。組換え微生物を作製する方法は公知である。
ステビオール生合成遺伝子クラスターは、数多くの公知のプロモータのいずれかを用いて酵母で発現させることができる。テルペンを過剰産生する株が公知であり、ステビオール及びステビオール グリコシド生成で利用できるゲラニルゲラニルジホスフェートの量を増すために用いることができる。
アスペルギルス種
Ａ．オリゼー（原語：A. oryzae）、Ａ．ニジェール（原語：A. niger ）及びＡ．ソジェー（原語：A. sojae ）などのアスペルギルス種は食品生産において幅広く用いられている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。ヌクレオチド配列はＡ．ニドゥランス（原語：A.
nidulans）、Ａ．フミガトゥス（原語：A. fumigatus）、Ａ．オリザ（原語：A. oryzae）、Ａ．クラバトゥス（原語：A.
clavatus）、Ａ．フラヴス（原語：A. flavus）、Ａ．ニジェール（原語：A. niger）及びＡ．テレウス（原語：A. terreus） のゲノムについて入手可能であり、フラックスを高め、生成物の収率を増加させるべく内因性経路の合理的なデザイン及び改変が可能である。アスペルギルスについては代謝モデルや、転写研究及びプロテオミクス研究が進んでいる。Ａ．ニジェールは、クエン酸及びグルコン酸などの数多くの食物成分の工業生産に向けて培養されており、従ってＡ．ニジェールなどの種は、ステビオール及びステビオールグリコシドなどの食物成分の生産にとって概して適している。実施例２３は、アスペルギルス-ニドゥランスでのステビオール グリコシドの産生に関するクローニング法を解説している。
エシェリヒア-コリ
合成生物学で幅広く用いられているもう一つのプラットフォーム生物であるエシェリヒア-コリも、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。サッカロミセスと同様に、Ｅ．コリでも利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝についての詳細なコンピュータ・モデル及び他の情報があるため、生成物収率を高めるために多様なモジュールを合理的にデザインすることができる。サッカロミセスについて上述したものと同様な方法を用いて、組換えＥ．コリ微生物を作ることができる。
アガリクス、ジベレラ、及びファネロケーテ種
アガリクス、ジベレラ、及びファネロケーテ種は、培養で大量のジベレリンを産生することが知られているため、有用である。従って、大量のステビオール及びステビオールグリコシドを産生させるためのテルペン前駆体は、内因性遺伝子によって既に産生されている。このように、ステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの組換え遺伝子を含有するモジュールを、このような属の種に、メバロネート又はMEP経路遺伝子を導入する必要なく、導入することができる。
ロードバクター種
ロードバクターを、組換え微生物プラットフォームとして用いることができる。Ｅ．コリと同様に、利用可能な変異体ライブラリーや適したプラスミド・ベクターがあるため、生成物の収率を高めるべく多様なモジュールを合理的にデザインすることができる。イソプレノイド経路は、カロテノイド及びCoQ10の産生増加のために、膜性細菌種のロードバクターに操作により導入されてきた。米国特許公報第20050003474 号及び第20040078846号を参照されたい。Ｅ．コリについて解説したのと同様な方法を用いて組換えロードバクター微生物を作ることができる。
フィスコミトレラ種
フィスコミトレラコケは、懸濁培養で成長させたときに酵母又は他の真菌培養株に似た特徴を有する。この属は、他の細胞種では産生させるのが難しい植物二次代謝産物の産生のために重要な細胞種になりつつある。実施例２２は、Ｐ．パテンス（原語：P. patens）での、ステビオールグリコシド経路中の活性UGT酵素の産生を解説する。
Ａ． 植物細胞又は植物
いくつかの実施態様では、ここで解説する核酸及びポリペプチドを、全体的ステビオールグリコシド産生を増加させる、あるいは、他のものに対して特定のステビオールグリコシドの産生の比率を濃縮するために、植物又は植物細胞に導入する。従って、ホストは、ここで解説した少なくとも一つの組換え遺伝子を含む植物又は植物細胞であってよい。植物又は植物細胞は、そのゲノムに組換え遺伝子を組み込ませることにより形質転換させることができ、即ち安定に形質転換させることができる。安定に形質転換した細胞は典型的には、導入された核酸を各細胞分裂で保持する。植物又は植物細胞はまた、組換え遺伝子がそのゲノムに組み込まれないように、一過性に形質転換させることもできる。一過性で形質転換した細胞は典型的には、導入された核酸の全部又は一部を各細胞分裂で失うため、導入された核酸は、充分な回数の細胞分裂後には娘細胞では検出され得ない。一過性で形質転換したトランスジェニック植物及び植物細胞と、安定に形質転換したトランスジェニック植物及び植物細胞は両者とも、ここで解説する方法において有用であろう。
ここで解説する方法で用いられたトランスジェニック植物細胞は、植物全体の一部を成すものでも、又は全部を成すものでもよい。このような植物は、考慮された成長チャンバー、温室、又はフィールドのいずれかで、種にとって適した態様で成長させることができる。トランスジェニック植物は、例えば組換え核酸を他の株に導入する、組換え核酸を他の種に移す、又は他の望ましい形質を更に選択するためなど、特定の目的に好ましい通りに育種することができる。代替的には、トランスジェニック植物は、このような技術になじむ種のために栄養的に繁殖させることができる。ここで用いられる場合のトランスジェニック植物とは更に、後代が導入遺伝子を受け継ぐことを条件に、ある最初のトランスジェニック植物の後代を言う。トランスジェニック植物が産生した種子を成長させた後、自家受粉（又は外部交雑自家受粉）させると、核酸コンストラクトについてホモ接合型の種子を得ることができる。
トランスジェニック植物は懸濁培養、又は組織もしくは器官培養で成長させることができる。本発明の目的のためには、固体及び／又は液体組織培養技術を用いることができる。固体の媒質を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を媒質中に直接配置するか、又は、フィルタ上に配置してから、媒質と接触するように配置することもできる。液体の媒質を用いる場合、トランスジェニック植物細胞を、例えば液体の媒質と接触する多孔質のメンブレンなど、浮上させるデバイス上に配置することができる。
一過性形質転換植物細胞を用いる場合、レポータ活性を有するレポータポリペプチドをコードするレポータ配列を形質転換手法に含め、レポータ活性又は発現に関する検定を、形質転換後の適した時点で行うことができる。検定を行うのに適した時間は、典型的には、例えば約１乃至１４日後、約１乃至７日後、又は約１乃至３日後など、形質転換から約１乃至２１日後である。 一過性検定の使用は、様々な種において高速分析を行ったり、あるいはその発現が特定のレシピエント細胞で前もって確認されているような異種ポリペプチドの発現を確認したりするためには特に便利である。
核酸を単子葉及び双子葉植物に導入する技術が当業で公知であり、その中には、限定はしないが、アグロバクテリウム媒介性形質転換、ウィルス・ベクター媒介性形質転換、エレクトロポレーション、及び、粒子ガン形質転換法、米国特許第5,538,880号；第5,204,253号；第6,329,571号；及び第6,013,863号がある。細胞又は培養組織を形質転換用のレシピエント組織として用いる場合、必要であれば、当業者に公知の技術により、形質転換後の培養株から植物を再生させることができる。
一集団のトランスジェニック植物を、導入遺伝子の発現によってもたらされた形質又は表現型を有する集団のメンバーを求めて、スクリーニング及び／又は選抜することができる。例えば、単一の形質転換事象の後代集団を、所望の発現レベルのステビオール又はステビオールグリコシド生合成ポリペプチド又は核酸を有する植物を求めてスクリーニングすることができる。物理的及び生化学的方法を用いて発現レベルを明らかにすることができる。これらには、ポリヌクレオチドの検出用の関するサザン解析又はＰＣＲ増幅法；RNA転写産物を検出するためのノーザン・ブロット、S1 RNase 保護、プライマー伸長法、又はRT-PCR
増幅；ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素検定；及びペプチドを検出するためのタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降法、及び酵素結合免疫検定法がある。インシツー・ハイブリダイゼーション、酵素染色法、及び免疫染色法などの他の技術も、ポリペプチド及び／又は核酸の存在又は発現を検出するために用いることができる。参照した技術の全てを行う方法は公知である。代替法としては、独立した形質転換事象を含む植物集団を、ステビオールグリコシドの産生、又はステビオール
グリコシドの修飾された生合成など、所望の形質を有する植物を求めて、スクリーニングすることができる。選抜及び／又はスクリーニングは、一世代以上にわたって、及び／又は
二か所以上の地理的位置にわたって行うことができる。場合によっては、トランスジェニック植物を、トランスジェニック植物で所望の表現型を誘導する条件下、あるいは、所望の表現型を生じさせるのに必要な条件下で、成長させ、選抜することができる。加えて、選抜及び／又はスクリーニングは、当該植物によって当該表現型が呈されると予測される特定の発生段階で応用することができる。選抜及び／又はスクリーニングを行って、導入遺伝子のないコントロール植物に比べてステビオールグリコシドレベルに統計上有意な違いを有するトランスジェニック植物を選抜することができる。
ここで解説する核酸、組換え遺伝子、及びコンストラクトを用いて、数多くの単子葉及び双子葉植物及び植物細胞系を形質転換させることができる。適した単子葉植物の非限定的な例には、例えば、米、ライ麦、モロコシ類、アワの類、小麦、トウモロコシ、及びオオムギなどの禾穀類がある。植物はアスパラガス、バナナ、又は玉ねぎなど、穀類以外の単子葉植物でもよい。また当該植物は、ステビア（ステビア-レバウディアナ（原語：Stevia rebaudiana））、大豆、綿、ひまわり、マメ、ゼラニウム、ホウレンソウ、又はタバコなどの双子葉類でもよい。場合によっては、当該植物は、細胞質及びミトコンドリア内に典型的に見られる、メバロネート経路などのフェニルホスフェート産生のための前駆体経路を含有してもよい。非メバロネート経路は植物色素体ではより頻繁に見られる [Dubey, et al., 2003 J.
Biosci. 28 637−646]。当業者であれば、ステビオールグリコシド生合成が植物細胞の所望の位置で起きるように、リーダ配列を用いてステビオールグリコシド
生合成ポリペプチドの発現を適したオルガネルに標的設定できよう。当業者であれば、例えば必要であれば植物の葉に向けてなど、合成を命令するために適したプロモータを用いるであろう。発現は、所望であればカルス培養又は毛根培養などの組織培養で起こさせてもよい。
ある実施態様では、ここで解説する一種以上の核酸又はポリペプチドをステビア（例えばステビア-レバウディアナ）に導入することで、全体的なステビオール グリコシド生合成が増加するようにするか、又は、全体的なステビオールグリコシド組成を、一種以上の特定のステビオールグリコシドについて選択的に濃縮されているようにする。例えば、以下のうちの一つ以上が発現するように、一種以上の組換え遺伝子をステビアに導入することができる：UGT91D 酵素、例えばUGT91D2e （例えば SEQ ID NO:5 又は機能的なそのホモログ）、UGT91D2m （例えば SEQ ID NO:10）；UGT85C 酵素、例えば表１５に挙げたバリアント、又はUGT76G1酵素、例えば実施例１８に挙げたバリアント。核酸コンストラクトは典型的には、UGTポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結させた適したプロモーター（例えば35S、e35S、又は ssRUBISCO プロモータ）がある。核酸はステビアに
アグロバクテリウム媒介性形質転換；プロトプラストへのエレクトロポレーション媒介性遺伝子移動；又は微粒子銃により導入することができる。例えば Singh, et al., Compendium of Transgenic Crop Plants: Transgenic
Sugar, Tuber and Fiber, Edited by Chittaranjan Kole and Timothy C. Hall,
Blackwell Publishing Ltd. (2008), pp. 97-115を参照されたい。ステビア葉由来の微粒子銃の場合、パラメータは以下の通りであってよい：6 cm の距離、1100 psi Heの圧力、金粒子、及び一個の銃撃。
ステビア植物は、上記のSingh et al., 2008が解説したように体細胞胚発生によって再生させることができる。具体的には、葉部分（ほぼ 1-2cm 長）を5乃至6週齢の in vitro 培養植物から除去し、B5 ビタミン、30 g ショ糖及び3 g Gelriteを添加したMS培地上でインキュベート（向軸性を下）することができる。2,4-ジクロロフェノキシ酢酸 (2,4-D) を6-ベンジルアデニン (BA)、キネチン (KN)、又はゼアチンと組み合わせて用いることができる。植え継ぎ培養８週間後に前胚の塊が現れる。植え継ぎ培養２乃至３週間以内に体細胞胚が培養株表面上に表れるであろう。胚は、BAを2,4-D、a-ナフタレン酢酸 (NAA)、又はインドール酪酸 (IBA)と組み合わせて含有する培地で成熟させることができる。発芽して小植物を形成する成熟体細胞胚をカルスから切り出すことができる。小植物が３乃至４週齢に達した後、小植物をバーミキュライトを入れたポットに移し、６乃至８週間、馴化用成長チャンバー内で成長させ、温室に移動させることができる。
ある実施態様では、ステビオールグリコシドをコメで産生させる。コメ及びトウモロコシは、アグロバクテリウム媒介性形質転換などの技術を用いて容易に形質転換させることができる。バイナリ・ベクター系は、単子葉植物へのアグロバクテリウム外因性遺伝子導入に通常、用いられる。例えば米国特許第6,215,051号及び第6,329,571号を参照されたい。バイナリー・ベクター系においては、一つのベクターは目的の遺伝子（例えばここで解説するUGT）を含むT-DNA 領域を含有し、他方のベクターはvir領域を含有する非武装のTiプラスミドである。同時組み込みされるベクター及び移動可能なベクターも用いることができる。形質転換させる組織の種類及び予備処置、用いるアグロバクテリウムの株、播種の持続時間、アグロバクテリウムの過剰成長及び壊死の防止は、当業者であれば容易に調節することができる。コメの未熟胚細胞は、バイナリー・ベクターを用いて、アグロバクテリウムによる形質転換に向けて調製することができる。用いる培養基にはフェノール化合物を添加する。代替的には、真空浸潤法を用いて形質転換をプランタ内で行うことができる。例えば WO 2000037663、WO 2000063400、及びWO 2001012828を参照されたい。
ＩＶ． ステビオール及びステビオールグリコシドの生成法
ここで解説する組換えホストを、ステビオール又はステビオールグリコシドの生成法で用いることができる。例えば、組換えホストが微生物である場合、当該方法には、ステビオール及び／又はステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現するような条件下で組換え微生物を培養基中で成長させるステップを含めることができる。当該組換え微生物を、供給バッチ又は連続プロセスで成長させてもよい。典型的には、組換え微生物を所望の温度で所望の時間、発酵槽内で成長させる。当該方法で用いられる特定の微生物に応じ、イソペンテニル生合成遺伝子及びテルペンシンターゼ及びシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子も存在してよく、発現させてもよい。基質や、例えばイソペンテニルジホスフェート、ジメチルアリルジホスフェート、ゲラニルゲラニルジホスフェート、カウレン及びカウレン酸などの中間生成物のレベルは、公開された方法に従って、培養基から分子起用の試料を抽出することにより、判定することができる。
組換え微生物を所望の時間、培養で成長させた後、ステビオール及び／又は一種以上のステビオールグリコシドを、当業で公知の多様な技術を用いて培養株から回収することができる。組換えホストが植物又は植物細胞である場合、ステビオール又はステビオールグリコシドは、当業で公知の多様な技術を用いて、植物組織から抽出することができる。例えば、培養微生物又は植物組織の粗ライセートを遠心分離して上清を得ることができる。その結果得られた上清を次に、例えばC-18カラムなどのクロマトグラフィー・カラムに入れ、水で洗浄して親水性化合物を取り除いた後、目的の化合物をメタノールなどの溶媒で溶離させることができる。次に、この化合物を更に調整用HPLCで精製することができる。またWO 2009/140394を参照されたい。
生成されるステビオール又はステビオールグリコシドの量は、例えば 約 1 乃至約 10 mg/l、約 3 乃至約 10 mg/l、約 5 乃至約 20 mg/l、約 10 乃至約 50 mg/l、約 10 乃至約 100 mg/l、約 25 乃至約 500 mg/l、約 100 乃至約 1,500 mg/l、又は 約 200 乃至約 1,000 mg/lなど、約 1 mg/l 乃至約 1,500 mg/lであってよい。概して、培養時間が長いと生成量が多くなるであろう。従って、組換え微生物を１乃至７日間、１乃至５日間、３乃至５日間、約３日間、約４日間、又は約５日間、培養することができる。
ここで論じる多様な遺伝子及びモジュールは、一種の微生物でなく、二種以上の組換え微生物中にあってもよいことは理解されよう。複数の組換え微生物を用いる場合、それらを混合培養で成長させてステビオール及び／又はステビオールグリコシドを産生させることができる。例えば、第一の微生物はステビオールを産生するために一種以上の生合成遺伝子を含むことができ、他方、第二の微生物はステビオールグリコシド生合成遺伝子を含む。代替的には、それぞれ二種以上の微生物を別々の培養基中で成長させ、ステビオールなど、第一の培養基の生成物を第二の培養基中に導入して、次の中間生成物に、又はレバウディオサイドＡなどの最終生成物に、転化させることができる。次に、第二の、又は最終的な微生物によって産生された生成物を回収する。いくつかの実施態様では、培養基以外の栄養源を用い、発酵槽以外の系を用いて組換え微生物を成長させることは認識されよう。
ステビオールグリコシドは、異なる食品系で同等な性能を必ずしも有するわけではない。従って、選択されたステビオールグリコシド組成に合成を指向させる能力があることが好ましい。ここで解説する組換えホストは、特定のステビオールグリコシドについて選択的に濃縮され、一貫した食味プロファイルを有する組成物を生じることができる。従って、ここで解説する組換え微生物、植物、及び植物細胞により、ある食品に好ましい甘味プロファイルに合致するように調整されると共に、バッチ間で一貫した各ステビオールグリコシドの比率を有する組成物の生成が容易になる。ここで解説する微生物は、ステビア抽出物に見られる、望ましくない植物副産物を生じない。従って、ここで解説する組換え微生物によって産生されるステビオールグリコシド組成物は、ステビア植物を由来とする組成物から識別可能である。
Ｖ． 食品
ここで開示する方法で得られるステビオール及びステビオールグリコシドを用いて、食品製品、ダイエット補助食品、及び甘味料組成物を作製することができる。例えば、レバウディオサイドＡなどの実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、例えばアイスクリーム、炭酸飲料、果汁ジュース、ヨーグルト、焼成品、チューイングガム、硬質及び軟質キャンディー、及びソースなどの食品に含めることができる。実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、医薬製品、薬品、ダイエット補助食品及び栄養補助食品などの非食品製品にも含めることができる。実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、農業及びペット業の両方のための動物飼料にも含められよう。代替的には、ステビオール及び／又はステビオールグリコシドの混合物は、組換え微生物を別々に培養する、あるいは、それぞれが特異的ステビオール又はステビオール グリコシドを産生する異なる植物／植物細胞を成長させるステップと、各微生物又は植物／植物細胞から実質的に純粋な形でステビオール又はステビオール グリコシドを回収した後、該化合物を配合して、各化合物を所望の比率で含有する混合物を得るステップとにより、作製することができる。ここで解説する組換え微生物、植物、及び植物細胞により、現在のステビア製品に比較して、より精確かつ一貫した混合物を得ることができる。別の代替案では、実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、例えばサッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、又はアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に食品に取り入れることができる。他の甘味料に対するステビオール又はステビオールグリコシドの重量比は、最終的な食品中で満足な食味を達成できるように必要に応じて変えることができる。例えば米国特許公報第 2007/0128311号を参照されたい。いくつかの実施態様では、該ステビオール又はステビオールグリコシドに、甘味修飾剤などの甘味（例えば柑橘系）を提供してもよい。例えば、食品中の糖分量を減少させられるように、特に糖質ベースの甘味料用に、レバウディオサイドＣを甘味促進剤又は甘味修飾剤として用いることができる。
ここで解説する組換え微生物、植物、又は植物細胞により作製された組成物を食品に取り入れることができる。例えば、組換え微生物、植物、又は植物細胞により作製されたステビオールグリコシド組成物を、ステビオールグリコシド及び食品の種類に応じて、乾燥重量を基本に、約 20 mg ステビオール グリコシド/kg の食品、乃至約 1800 mg ステビオールグリコシド/kgの食品、の範囲の量で、食品中に取り入れることができる。例えば、食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大500mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をデザート、低温菓子（例えばアイスクリーム）、乳製品（例えばヨーグルト）、又は飲料（例えば炭酸飲料）に取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大300mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を焼成品（例えばビスケット）に取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大1000mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をソース（例えばチョコレート・シロップ）又は植物製品（例えばピクルス）に取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大160mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物をパンに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大1600mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を硬質又は軟質キャンディーに取り入れることができる。食品が乾燥重量ベースで食品１kg当り最大1000mgのステビオールグリコシドを有するように、組換え微生物、植物、又は植物細胞によって作製されるステビオールグリコシド組成物を加工果実製品（例えばフルーツジュース、フルーツ・フィリング、ジャム、及びゼリー）に取り入れることができる。
例えば、このようなステビオールグリコシド組成物は、90-99% のレバウディオサイド Ａと、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する可能性があるが、乾燥重量ベースで、例えば100-500 mg/kg、25-100 mg/kg、250-1000
mg/kg、50-500 mg/kg 又は 500-1000 mg/kg など、25-1600mg/kgを食品に取り入れることができる。
このようなステビオールグリコシド組成物は、3%を超えるレバウディオサイドＢを有するレバウディオサイドＢ濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドＢ量が、 乾燥重量ベースで例えば 100-500 mg/kg、25-100 mg/kg、250-1000
mg/kg、50-500 mg/kg 又は500-1000 mg/kg など、25-1600 mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドＢ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
このようなステビオールグリコシド組成物は、15%を超えるレバウディオサイドＣを有するレバウディオサイドＣ濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドＣ量が、 乾燥重量ベースで例えば 100-600 mg/kg、20-100 mg/kg、20-95 mg/kg、20-250 mg/kg、50-75 mg/kg、又は50-95 mg/kg
など、20-600 mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドＣ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
このようなステビオールグリコシド組成物は、3%を超えるレバウディオサイドＤを有するレバウディオサイドＤ濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドＤ量が、 乾燥重量ベースで例えば 100-500 mg/kg、25-100 mg/kg、250-1000
mg/kg、50-500 mg/kg 又は500-1000 mg/kg など、25-1600 mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドＤ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
このようなステビオールグリコシド組成物は、3%を超えるレバウディオサイドＥを有するレバウディオサイドＥ濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドＥ量が、 乾燥重量ベースで例えば 100-500 mg/kg、25-100 mg/kg、250-1000
mg/kg、50-500 mg/kg 又は500-1000 mg/kg など、25-1600 mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドＥ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
このようなステビオールグリコシド組成物は、4%を超えるレバウディオサイドＦを有するレバウディオサイドＦ濃縮組成物であってよく、製品中のレバウディオサイドＦ量が、 乾燥重量ベースで例えば 100-600 mg/kg、25-100 mg/kg、25-95 mg/kg、50-75 mg/kg 又は50-95 mg/kg など、25-1000
mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のレバウディオサイドＦ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
このようなステビオールグリコシド組成物は、4%を超えるダルコシドＡを有するダルコシドＡ濃縮組成物であってよく、製品中のダルコシドＡ量が、乾燥重量ベースで例えば 100-600 mg/kg、25-100 mg/kg、25-95 mg/kg、50-75 mg/kg 又は50-95 mg/kg など、25-1000
mg/kgであるように食品に取り入れることができる。典型的には、当該のダルコシドＡ濃縮組成物は、検出不能な量のステビア植物由来混入物質を有する。
いくつかの実施態様では、実質的に純粋なステビオール又はステビオールグリコシドを、
卓上用甘味料又は「カップ−フォー−カップ」製品中に取り入れる。このような製品は典型的には、例えばマルトデキストリンなど、とうぎょうしゃに公知の一種以上の増量剤で適した甘味レベルまで希釈される。レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、又はダルコシドについて濃縮されたステビオールグリコシド組成物は、卓上用に例えば乾燥重量ベースで製品1kg当り10,000を30,000 mgのステビオールグリコシドなどにして、小袋中に梱包することができる。
ＶＩ． 植物の育種
Ａ． 多型
ここで解説する核酸（例えばUGT91D2 核酸）間の多型を、植物遺伝子マッピング及び植物育種プログラムのマーカーとしてステビアで用いることができる。例えば Yao et al., Genome, 1999, 42:657-661を参照されたい。従って、ここで解説する多型を、その多型が形質変化に関係するかどうかを明らかにする方法で用いることができる。当該方法は、ステビア株又は集団中の形質変化と、それらの植物中の一つ以上の遺伝子多型との間の相関関係を測定することにより、その遺伝子多型が形質変化に関係するかどうかを明らかにするステップを含む。典型的には、当該の形質は、植物中に存在するステビオールグリコシドの総量であるが、当該の形質は特定のステビオール
グリコシド、例えばレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、 レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、又はダルコシド Ａの量であってもよい。
いくつかの実施態様では、該形質はステビオールの量、又はイソプレノイド前駆体の量である。形質と、多型マーカーの存在との間の統計上有意な相関関係は、例えばChi-平方検定、スチューデントのt検定法、マン-ホイットニー検定、又はF-検定などの適したパラメーター又は非パラメータ統計学を用いて判定される。例えばある植物中のレバウディオサイドＡの量と、多型マーカーの存在との間の統計上有意な相関関係は、当該マーカーが、変化したレバウディオサイドＡレベルの選抜のためのマーカー支援育種プログラムにおいて有用かも知れないことの指標となる。
多型は、限定はしないが、制限断片長多型(RFLP)、無作為増幅多型DNA検出(RAPD)、増幅断片長多型 (AFLP)、単一配列反復 (SSR) 又はマイクロサテライトを含め、当業で公知の手段により検出できよう。多型の発見、検出、及び遺伝子型決定は文献に解説されている。例えば Henry, ed. (2001) Plant
Genotyping. The DNA Fingerprinting of Plants Wallingford: CABI Publishing; and
Phillips and Vasil, eds. (2001) DNA-based Markers in Plants Dordrecht: Kluwer
Academic Publishersを参照されたい。例えば、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、又は SEQ ID NO:96に示す核酸配列又はその相補配列を由来とするプライマー又はプローブを用いて、所望のステビオールグリコシド組成物に相関する多型アレルを持つ一種以上の独立した植物を同定することができる。次にこれらの植物を、所望のステビオールグリコシド組成物に相関する他の位置で、多型アレルと複数の他のアレルとを組み合わせる育種プログラムで用いることができる。当業者にとっては明らかであるように、必要なマーカーの数及び種類は、選抜する形質や、各マーカーの相関の程度に応じて異なる。従って本方法は、いくつかの実施態様では、植物のゲノム中に複数の多型を検出することを含む。本方法は、前記の複数の多型を検出するステップの結果を、コンピュータで読み取り可能な媒体上に記憶するステップを更に含むであろうことは理解されよう。
従って、いくつかの実施態様では、ステビア植物株又は集団を同定するための方法は、ステビア植物のための核酸試料を提供するステップと、試料中に存在する、SEQ ID NO: 1、3、5、又は7に示すポリペプチドをコードする核酸に９０％以上の配列同一性を有するUGT遺伝子に相当する、ステビア植物の一領域を増幅するための増幅プライマーを提供するステップと、前記領域の増幅が起きるように、前記核酸試料に対して増幅プライマーを応用するステップと、増幅後の核酸試料中で、当該形質と相関する一つ以上の多型の存在に基づいて所望の形質を有する植物を同定するステップとを含む。
いくつかの実施態様では、ステビア植物中でポリヌクレオチドの存在を判定するための方法は、少なくとも一つのプローブ又はプライマー・ペアを植物由来の核酸に接触させるステップを含む。該プローブ又はプライマー・ペアは、SEQ ID NO: 1、3、5、又は7に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的である。次に、ポリヌクレオチドの存在又は不在を判定する。
ステビア植物の多型を検出し、遺伝子型を判定する方法に加え、本方法を行うのに適したキットや、本方法で作製されたデータを含有する、このような方法で作製されたコンピュータ読み取り可能な媒体も解説されている。ステビア植物試料を遺伝子型決定するためのキットは、SEQ ID NO: 1、3、5、又は7に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するUGTポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマー・ペア、又は、同ポリヌクレオチドを特異的にハイブリダイズするプライマー、を含む。このようなキットは、典型的には、適した梱包材料内に容れられたプライマー又はプローブを有する。
ここで解説する方法及びキットのいくつかの実施態様では、それぞれが特異的かつ規定されたゲノム位置の有無を認識することができる一つ以上の組のオリゴヌクレオチドを用いる。多倍数体ステビア株又は集団の場合、オリゴヌクレオチドの数が多い方が好ましい。下限は一方のオリゴヌクレオチド・ペアであり、上限は、本方法及び検査キットの所望の分解能によって設定される。ステビア植物由来のDNAへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、例えば末端トランスフェラーゼ及び従来の記録可能な標識などを適用して、いずれかの従来の標識系により、インシツーで記録されることが好ましい。インシツー標識付けの代わりとして、ハイブリダイズ後の試料DNAを固体の支持体から遊離させた後、固体の支持体に付着させた元のオリゴヌクレオチド配列のそれぞれに対応する標識済みポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせてもよい。ハイブリダイゼーションは選択的には可逆的であり、固体の支持体は、再使用に向けてその元の状態に戻すことができるものでもよい。当該オリゴヌクレオチドがゲノムDNAにテンプレートとしてハイブリダイズしていることを条件に、標識後のジデオキシヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドの末端に取り入れることができる。該オリゴヌクレオチドに適合する領域近傍のゲノム位置にあるヌクレオチド配列は既知であるため、取り入れられることになるその特定のヌクレオチド（A、C、G、T 又はU）は既知である。共優性採点は、対になった、即ち二つ、又はパラレルの、即ち三つのフランキング・オリゴヌクレオチド配列を用いて達成される。こうして得られる結果を、完全、空、失敗、又はヌル・アレルとして記録し、ヘテロ接合型及び／又はホモ接合型遺伝子型間で区別するために用いることができる。例えば標識付け前又は標識付け後に、固体の支持体に付着したオリゴヌクレオチド配列に完全にハイブリダイズしていない試料DNAを取り除くために、洗浄及び消化を含む、選択的なハイブリダイゼーション後処置を提供する。ハイブリダイゼーションの有無は、典型的にはコンピュータ読み取り可能な媒体上へのハイブリダイゼーション状態の記録を可能にする方法を用いて記録される。
Ｂ． 育種プログラム
ステビアは典型的には外部交雑種であるが、自家受粉も時に観察される。従って、ステビア植物の育種プログラムは、典型的には、反復的選抜大量選抜、バルク選抜、及び異種交雑：のうちの一つ以上の使用を含む。これらの技術を育種プログラムで単独で用いることも、あるいは、一つ以上の他の技術と組み合わせて用いることもできる。Yadav et al., Can. J. Plant Sci. 91: 1-27 (2011)を参照されたい。それぞれ同定された植物を異なる植物に交雑して種子を作ることができ、この種子をその後、発芽させて後代植物を形成する。所望の表現型及び所望の多型を持つ一つ以上の後代植物から採った種子を合わせた後、無作為に交配させて、次に後代世代を形成する。多型アレルの残った結果的な植物集団で所望の安定性を達成するために、育種プログラムはこれらのステップを適宜０乃至５世代、繰り返すことができる。大半の育種プログラムにおいては、特定の多型アレルに関する解析を各世代で行うことになるであろうが、解析は、必要に応じて交互の世代で行うこともできる。後代植物の自家受粉は、自家受粉が実現可能なステビア株や集団で行ってよい。
反復選抜は、植物集団を向上させるために植物育種プログラムで用いられる方法である。該方法は、個々の植物を互いに交差受粉させて後代を形成することを伴う。後代を成長させ、優れた後代を、個々の植物、半同胞後代、全同胞後代及び自家受粉後代を含む、いずれかの数の選抜法で選抜する。選抜された後代を互いに自家受粉又は交差受粉させて、別の集団のための後代を形成する。この集団を植え付け、再度、優れた植物を選抜して互いに自家受粉又は交差受粉させる。反復選抜は周期的プロセスであるため、必要に応じて何回も反復することができる。反復選抜の目的は集団の形質を向上させることである。こうして、向上した集団を、人工品種の作製を含め、商業用又は育種での使用に向けて新しい品種を得るための育種材料の源として用いることができる。人工品種は、複数の選択された品種を相互交配することで形成された後代である。人工種を作製するために用いられる親植物品種、集団、野生獲得物、生態型等の数は、少なくて１０から多くて５００まで、様々であろう。典型的には約１００乃至３００品種、集団等を、人工品種の親として用いる。人工品種の親種子作成区画から得た種子を農家に販売することができる。代替的には、親種子作成区画から得た種子を、親区画で作製された種子量及び種子の需要に応じて、１世代又は二世代の増殖を行わせることができる。
大量選抜は、分子マーカー関連選抜法と組み合わせて用いると有用な技術である。大量選抜においては、個体から得た種子を、表現型又は遺伝子型に基づいて選抜する。その後これらの選抜された種子をバルクにし、次の世代を成長させるために用いた。バルク選抜には、植物集団をバルク区画で成長させて植物を自家受粉できるようにすることと、種子をバルクで収穫し、その後、バルクで収穫された種子試料を用いて次の世代を播種することが必要である。更に、自家受粉の代わりに、指向された受粉を育種プログラムの一部として用いることもできよう。
このように、いくつかの実施態様では、ステビア植物株又は集団を作製する方法は、SEQ ID NO: 1、3、5、又は7 に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する位置にある多型の存在が目的の形質の変異に関係するような一つ以上の植物を当該株又は集団で同定することを含む。次に、同定された植物をそれ自体又は異なるステビア植物と交配して種子を作り、該種子から成長させた少なくとも一つの後代植物を再度、それ自体又は異なるステビア植物と、更に０−５世代、交配して、多型を持つ株又は集団を作る。
場合によっては、例えば疾患耐性についての選抜など、他の有用な形質についての選抜も行う。このような他の形質に関する選抜は、所望の多型アレルを持つ個々の植物の同定前、同定中、又は同定後に行うことができる。
マーカー支援育種技術を他の種類の同定技術に加えて、又はその代替法として用いてもよい。
本発明を更に、請求項に記載した本発明の範囲を限定しない以下の例で解説する。
ＶＩ． 実施例
実施例１． カウレン生合成経路遺伝子の構築
切断型パン酵母HMG CoA レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を、酵母高コピー数エピソーム性プラスミド・ベクターに、コーディング配列が、アミノ酸メチオニンによって抑制され得るプロモーターに作動可能に連結すると共に、同プロモーターの転写制御下にあるようにクローニングした。米国特許第 5,460,949 号及び第5,306,862号を参照されたい。
表１に示すGGPPS酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現用に改変し（SEQ ID NO:18-25）、コーディング配列が、アミノ酸メチオニンによって抑制され得るプロモーターに作動可能に連結すると共に、同プロモーターの転写制御下にあるようにＥ．ｃｏｌｉベクター内にクローニングした。各発現カセット含有プラスミド（「進入ベクター」）の名称も、表１に示されている。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 26-33に示す。他の進入ベクターは、カサランサス-ロゼウス（原語：Catharanthus roseus ）由来のEV270と指定される未改変のヌクレオチド配列、アスペルギルス-ニドゥランス（原語：Aspergillus nidulans ）由来のC301 と指定される未改変のヌクレオチド配列、及びキサントロフィロマイセス-デンドロロウス（原語：Xanthophyllomyces dendrorhous ）由来のC413と指定される未改変のヌクレオチド配列によって発現させたGGPPS酵素を用いて構築された。
Figure 0006177127
表２に示すCDPS酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変し（SEQ ID NO: 34-36を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 37-39に示す。他の進入ベクターは、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana ）由来のEV64と指定された未改変のヌクレオチド配列、ゼア-メイス（原語：Zea mays）由来のEV65と指定された未改変のヌクレオチド配列、及び、ライコペルシコン-エスキュレンタム（原語：Lycopersicon esculentum ）由来のEV66と指定された未改変のヌクレオチド配列によって発現させたCDPS酵素を用いて構築された。
Figure 0006177127
表３に示すKS酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変し（SEQ ID NO: 40-43を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。当該ポリペプチドが元々同定された元のソース生物由来のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 44-47に示す。他の進入ベクターは、アラビドプシス-サリアナ（原語：Arabidopsis thaliana ）由来のEV70と指定された未改変のヌクレオチド配列、ククルビタ-マキシマ（原語：Cucurbita maxima）由来のEV71と指定された未改変のヌクレオチド配列、及び、ククミス-サティブス（原語：Cucumis sativus）由来のEV72と指定された未改変のヌクレオチド配列によって発現させたKS酵素を用いて構築された。
Figure 0006177127
表４に示すCDPS-KS融合酵素をコードするヌクレオチド配列を、酵母での発現用に改変して（SEQ ID NO: 48 及び49を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 50 及び51に示す。
Figure 0006177127
表５に示すKO酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変して（SEQ ID NO: 52-55を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 56-59に示す。
Figure 0006177127
表６に示すKAH酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変して（SEQ ID NO: 60-64を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 65-69に示す。
Figure 0006177127
* = 配列は米国特許公報No. 2008-0064063に示されている。
表７に示すCPR酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変して（SEQ ID NO: 70-72を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。ポリペプチドがもともと同定されたソース生物のヌクレオチド配列をSEQ ID NO: 73-75に示す。
Figure 0006177127
実施例２――ステビオールグリコシド経路遺伝子の構築
表８に挙げたUGT85C2及びUGT74G1酵素をコードするヌクレオチド配列を含有する組込みベクターを酵母中に形質転換した。ゲノムにUGT85C2、又はUGT85C2 及びUGT74G1が組み込まれた形質転換体が得られた。
Figure 0006177127
IP3GGT 及びUGT94B1 R25S 酵素をコードするヌクレオチド配列を酵母での発現用に改変し（SEQ ID NO: 77 及び79を参照されたい）、酵母進入ベクター内にクローニングした。IP3GGT 及びUGT94B1 R25S のアミノ酸配列をそれぞれSEQ ID NO: 76 及び 78に挙げる。改変後のIP3GGT ヌクレオチド配列を含有する高コピー数のエピソーム・ベクターをpEF1155と指名した。改変後のUGT94B1
R25S ヌクレオチド配列を含有する高コピー数のエピソーム・ベクターを pEF1156と示した。
実施例３ ―― 酵母株の構築
EFSC301
と指名された酵母株を内因性 ERG9 プロモーターを銅誘導性CUP1 プロモーターと置換することで改変した。株EFSC301 はEUROSCARF 収集酵母株 BY4742の誘導株である。ワールド・ワイド・ウェブuni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/by.htmlを参照されたい。標準的な酵母成長培地においては、ERG9 遺伝子は大変低いレベルでしか転写されないが、それは、このような培地での銅の濃度が低いからである。この株でエルゴステロール生成が減少すると、ステビオール生合成のために利用できるイソプレン単位量が増加する。該酵母株を更に、それぞれ強力な構成的GPD1プロモータの転写制御下に置かれたステビア UGT85C2 及びUGT74G1 遺伝子をゲノム組込みすることで改変した。表８を参照されたい。該株は、ステビアUGT85C2 及びUGT74G1 遺伝子のそれぞれ一つのコピーを
MUS1241 株ゲノムに組み込んだ状態で有する。
実施例４ ―― 酵母におけるステビオールグリコシド経路遺伝子発現の解析
酵母でのステビオール グリコシド 生合成を調べるために、表１−７及び実施例１の３６種の進入ベクターの発現カセットを連結反応で無作為に連鎖状にして、人工的な酵母染色体(「eYACs」)を作った。このプロセスを概略的に図５に示す。
二つの異なる組の連結を行った。Ａ組の連結は、表１−７に挙げた全ての遺伝子を含んだが、例外として二官能性の CDPS-KS 遺伝子（表４）は全く含めなかった。Ｂ組の連結は、表１−７に挙げた遺伝子を全て含んだが、例外として一官能性のCDPS 及びKS 遺伝子（表２−３）を全く含めなかった。
３０乃至２００μgのDNAをカセット含有ベクターのそれぞれから調製した。遺伝子発現カセットを、制限酵素AscIによる消化で各ベクターから遊離させた。次に、カセットをT4リガーゼによる３時間の連結反応によりeYAC中に無作為に連鎖状にした。連鎖状化反応の成功は、反応混合物の粘度により評価した。なぜなら連鎖状化したDNAは粘度が高いからである。セントロメア、二つのテロメア、並びにLEU2及びTRP1選択マーカーを含有するDNAフラグメント（「アーム」）を、連鎖状化した発現カセットの末端に加えることで、機能的eYACを作製した。
酵母細胞壁をチモリアーゼ（原語：zymoliase）消化した後、CaCl2/PEG 緩衝液をで処理してeYACなどの大型分子にスフェロプラストを透過性にすることにより、eYACs をコンピテント酵母株MUS1243
のスフェロプラスト中に形質転換した。形質転換後、酵母スフェロプラストを、細胞壁の再生が起き得る不活性の寒天ベースの固体培養基に包埋した。コロニーは接種から４乃至８日後に現れた。再生培地はアミノ酸ロイシン及びトリプトファンに欠けたため、酵母細胞中の二重武装eYACの存在について選択された。
約 3,000 の形質転換体が各組毎に得られた。各形質転換体を再画線し、酵母株マーカーと、eYACの両方の腕の遺伝子学的存在、即ち LEU2 及びTRP1 マーカーの存在について検査した。形質転換体のうちの９７％を超えるものが正しい遺伝子型を有していた。各形質転換体に CEY 指定番号が与えられた。
まず、メチオニンなしで2mlの合成完全培地（SC）中で各組の２４個のCEYを２４時間成長させて、eYACからの遺伝子発現を誘導した。２４時間後、各培養株からの上清を採集し、 LC-MS（液体クロマトグラフィ−結合質量分析法）(Triple Quadropole)) 解析にかけてルブソシドの存在を調べた。ステビア UGT74G1 及びUGT85C2 遺伝子は各CEY形質転換体では同時発現するため、ステビオールが生成されたときの予想される最終生成物は
ルブソシド (ステビオール-(13-β-D-グルコピラノシルオキシ)-β-D-グルコピラノシルエステル)である。
Ｂ組のSEYのいずれも、検出可能なレベルのルブソシドを生成しなかったが、他方、Ａ組のCEYのうちの７個は生成した。株 CEY19が最高の生成株だった。CEY19 は、ルブソシドのナトリウム付加物に相当するであろう、質量665.2の化合物を生成した。質量 643.2 の化合物も見られたが、これはおそらくはプロトン化したルブソシドに相当するであろう。665.2の質量化合物をMS-MSベースで分子分画したところ、ナトリウム付加物としてのステビオールモノシドに相当する503.2の部分的質量が得られた。この化合物の質量、分画パターン、HPLCスペクトル、及び保持標準が、ステビア酵素 85C2 及び 74G1を用いてステビオールのグルコシル化によりin vitroで生成されたルブソシド標準のそれにまさに相当したため、CEYで生成された化合物をルブソシドと判定した。
ルブソシド生成に関する更なるスクリーニング
Ａ組の更なる９５クローンと、Ｂ組の９５クローンとをメチオニンなしで1mlのSC培地を入れた９６深皿ウェル・トレイで成長させた。これらの培養株のそれぞれから採った上清を二つのクローンのプールに配合し、LC-MSで解析し、MS シグナル／ノイズ比を判定した。MS s/n 比は、相対的ルブソシド含有量の大体の尺度である。２種のCEYのプールがルブソシドを生成すると見出されたら、そのプールの各クローンを別々に解析した。その結果は、Ｂ組のCEYはいずれもルブソシドを生成せず、他方、Ａ組の 少なくとも 28 種のCEYが検出可能なレベルのルブソシドを生成したことを示した。
ルブソシド生成CEYクローンに存在する遺伝子の同定
eYACの遺伝子含有量とルブソシド生成とを相関づけるために、全ての可能なeYAC生成遺伝子の同様な大きさの断片（0.5kb）を増幅することができるPCRプロトコルを開発した。20-25ntの内側プライマーを、同様なアニーリング温度を用いて全ての遺伝子を増幅できるように配置した。eYAC DNAを含むゲノムDNAが、ルブソシド生成なし、ルブソシド生成率の低い、及びルブソシド生成率が高い乃至大変高いという、４種類のCEYから調製された。等モル量のこれらの14 DNA プレパラートを用いて、分析的PCR
を全ての３７種の遺伝子について、これら14 種のCEYや陽性及び陰性のコントロールに対して行った。全ての遺伝子が増幅されたが、例外として一つは、明らかにプライマーの失敗のために増幅されなかった。
６種の高ルブソシド生成CEY株中に存在する遺伝子を表９に示す。８種の低又は無ルブソシド生成CEY株中に存在する遺伝子を表１０に示す。
Figure 0006177127
Figure 0006177127
実施例５ ―― 酵母株条件の改変
最大のルブソシド生成を誘導する培養条件を判定するために、株CEY213で実験を行った。開始材料は、CEY213のグリセロール冷凍ストック (-80℃) だった。凍結細胞をまず、SC酵母培地をトリプトファン、ロイシン及びヒスチジン（SC-TLH）なしで含有すると共に2mMのメチオニンを含有する寒天プレートから採った。2mMのメチオニンを含有する5mlの液体SC-TLH 培地2 mM メチオニンに、CEY213酵母細胞の凍結ストックをループ・フルに播種した。CEY213でのeYAC発現をこれらの条件下で抑制した。細胞を３０℃で一晩、ゆっくりと振盪 (170 rpm) しながら成長させ、「予備培養株」と指名した。
CEY 213予備培養株を用いてメチオニンなしの25-50 ml のSC 培地に播種したが、該培地においては、下に示すパラメータを変更した。成長条件のそれぞれの下でのルブソシド生成は、各培養基の500μlを遠心分離し、250μlの上清を新しい試験管に移し、250μlのメタノールを加え、完全に振盪し、１０分間、最高速で遠心分離することで測定した。上清の一アリクォートをルブソシド生成についてLC-MSで解析した。
銅レベル
CEY213予備培養株を、50μMのバトクプロインジスルホン酸を加えたSC 培地で成長させた。バトクプロインジスルホン酸は成長培地中で銅をキレートする。CEY213中のERG9遺伝子は、発現がCUP1プロモーターによって制御されるように改変されている。培地中で銅レベルが減少すると、ERG9活性が更に低下することで、ステビオール生合成に利用できるイソプレン単位量が増加するであろう。
成長培地中の銅イオンのキレート化は酵母培養株の成長に対して悪影響を有し、ルブソシド生成が比例して減少した。これらの結果は、銅のキレート化なしでも株CEY213はエルゴステロール生合成についてその最低速度状態にあり、それ以上のイソプレン単位があってもエルゴステロール生合成をステビオールグリコシド生成に向かわせることはできないことを示唆していた。
グルコース
利用可能なグルコースを２から４％に二倍にすると、ルブソシド生成に効果があり、ルブソシド生成が約５乃至１０％、増加した。
利用可能な窒素の制限
CEY213予備培養株を、利用可能な窒素を制限した条件下で成長させた。培養酵母株の成長中の窒素を制限すると、エルゴステロールの生成が増加することが知られている。NH4SO4 の濃度を4g/l から2、又は0.4 g/lに減少させると、CEY213 の成長速度は窒素量に比例して減少した。ルブソシド生成は成長の低下に比例して減少した。
株の曝気
CEY213をバッフル有又は無しのエルレンマイヤー・フラスコ内で成長させた。その結果は、バッフルを用いて曝気を増加させたときでもせいぜい周辺的な効果しかなかったことを示していた。あったとしても、バッフルなしの曝気なしで生成が増加したことだった。
開始時の光学密度、発酵時間及び成長温度
培養は、予備培養株CEY213を OD600=0.1 又はOD600=1.0 にした二種の異なる光学密度で開始した。次に発酵を24、48、72 又は144 時間、 20、25 又は30℃の温度で行わせた。図６に示すように、発酵開始時のバッチ培養の密度、発酵における、培養温度及び時間的長さは、組合せとなって、CEY213により生成されるルブソシドの量に著しい影響を与えた。このように、OD600=1.0の開始密度で30℃で１４４時間、培養株を成長させたところ、8.5 mgs/リットル以上のルブソシドが生成された。
実施例６ ―― ルブソシドの大規模生成
CEY213を用いた一連の実験を、播種密度を様々にし、eYAC遺伝子カセット発現のタイミングを変えながら、３種類の酵母培地（リッチ培地及び二種類の合成培地）を用いて行った。
バッチ発酵条件
バッチ発酵を、CEY213 予備培養株を遠心分離し、上清を廃棄し、 100μM メチオニン及び4% グルコースを含有する６リットルのSC-TLH培地中に細胞を再懸濁させることにより、行った。OD600 を 1.0 にバッフルなしの100 ml エルレンマイヤー・フラスコ内で調節し、細胞をゆっくり振盪しながら30℃
で１４４時間、成長させた。
ルブソシドの回収
発酵後、培養株を遠心分離し、上清を等量のメタノールと混合し、完全に振盪し、遠心分離して沈殿した物質を取り除いた。その結果の上清を、メタノールを溶出剤としたフラッシュC18-シリカ・カラム・クロマトグラフィで精製した後、調整用HPLCを行って、一つの主要な化合物を得、他方、更に一種の重要ではない化合物を検出した。
精製済みの化合物を1H 及び13C NMRで解析し、そのデータを図７に示す。化合物は、ルブソシドに関する 1H 及び13C NMR 文献値との比較に基づき、ルブソシドであることが確認された。定量的分析では、CEY213 発酵で 12.8 mgs/リットルのルブソシドが生じたことが示された。
実施例７ ―― IP3GGT活性
１． In vitroでのイポメア-パープレア3GGT グリコシルトランスフェラーゼ の酵素活性
イポメア-パープレア3GGT グリコシルトランスフェラーゼ
(IP3GGT) の、ステビオールを基質として用いたときの酵素活性をin vitroで判定した。ステビア-レバウディアナUGT85C2 及びIP3GGT グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子をそれぞれ E. coli で発現させ、各酵素を精製した。
酵素反応は二段階で行わせた。まず、0.5 mM ステビオール（合計9.55 mgs ）をほぼ 0.5μgの UGT85C2 酵素と一緒に１６時間、30 °C で反応緩衝液（1 mM UDP-グルコース、100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5 mM MgCl2、1 mM KCl、0.1 U/ul ウシ小腸ホスファターゼを含有する）中でインキュベートした。次に、ほぼ 0.5μgの IP3GGT 酵素を加え、反応混合液を更に２０時間、30°Cでインキュベートした。
反応生成物を分析したところ、ステビオールのステビオール-13-O-モノシドへの１００％の転化が示され、そのうちの25%が更にグリコシル化してステビオ-13-O-1,2-ビオシドとなっていた。理論上のステビオール-13-O-1,2-ビオシド収率は 約 4.8 mgだった。その後、反応混合液を調整用HPLCにかけると、 2.5 mg のステビオール-13-O-1,2-ビオシド (52% 精製収率)が生成した。LC-MSを用いると、精製済み化合物の質量はルブソシド及びステビオール-13-O-1,3-ビオシドとは異なる保持時間を有していた。精製済みの化合物を 1H NMR、異核単一量子コヒーランス
(HSQC)-NMR 及び異核多重結合相関関係 (HMBC)-NMR 解析にかけると、当該化合物がステビオール-13-O-1,2-ビオシドであることが確認された。
２． ステビオール又はステビオールモノシド-供給酵母中のIP3GGTのin vivo発現
IP3GGT が酵母で活性かどうかを判定するために、2μの高コピー数（エピソーム性）プラスミド、未改変のIP3GGT コーディング配列を強力なGPD1 プロモータに作動可能に連結して含有するpMUS10を酵母株MUS1245中に導入した。MUS1245 はUGT85C2 発現カセットをゲノムに組み込ませて含有する。その結果の酵母株をヒスチジンなしの SC 培地で成長させて、開始密度をOD600=0.2として、IP3GGT発現プラスミドの継続的な存在について選抜した。ステビオール又はステビオールモノシドを培地に 3 mM、加えた。７２時間、30°Cで成長させた後、培養上清をステビオール及びステビオールグルコシドの存在についてHPLCで検定した。
LC-MS解析では、ステビオールを供給した後では1,2-グルコシル化ステビオール-13-O-グルコシド は検出されなかったことを示したが、ステビオール-13-O-モノシドは検出できたかも知れない。対照的に、低い、しかし検出可能な量のステビオール 1,2-ビオシドがMUS1245 担持 pMUS10 によって、ステビオール-13-O-モノシド供給後に生成された。これらの結果は、天然イポメア-パープレア 3GGT コーディング配列はステビオールモノシドのステビオール 1,2-ビオシドのin vivoでの検出可能な転化を得るのに充分なレベルで酵母において発現することを示している。
実施例８ ―― 酵母株の改変
EXG1 及びEXG2
S. セレビジエはステビオール 1,2- 及びステビオール 1,3-ビオシド中の1,2又は1,3糖結合を分解する酵素を含有していると考えられる。この可能性を検査するために、酵母株
CEY213 を３日間、30° Cで、二種のビオシドのそれぞれを0.1 mM 含有する培地上で成長させた。培養株のLC-MS分析では、1,2-ビオシドのレベルは安定しており、他方、1,3-ビオシド中の1,3-結合は検定の検出限界内では完全に加水分解しているように見えた。
それぞれが一つの公知の又は推定上のグリコシドヒドロラーゼ遺伝子を破壊している２５種のＳ．セレビジエ変異株を、それらのステビオールビオシド分解能について調べた。
各酵母変異株の培養株を上に記載した通りに、ステビオール 1,3-ビオシドを含有する培地上で成長させ、LC-MSで分析した。EXG1 （エキソ-1,3-β-グルカナーゼ）遺伝子に変異を持つ酵母株は、1,3-ビオシド加水分解活性の大半を失っていることが見出された。酵母EXG1 遺伝子のヌクレオチド配列はVazquez
de Aldana et al. Gene 97:173-182 (1991)で報告されている。EXG2 遺伝子 （別のエキソ-1,3-β-グルカナーゼ）に変異を持つ酵母株は加水分解活性に小さな減少を示していた。Correa, et
al., Current Genetics 22:283-288 (1992)。
二重変異酵母株（exg1 exg2) を作った。この二重変異株をステビオール 1,3-ビオシドを含有する培地上で成長させたところ、ビオシドの加水分解は何も検出されなかった。
実施例9 − ステビオール 生合成の力価増加
実施例４（及び表１１）で検査された異なる酵素クラスのそれぞれから採った個々のクローンをeYAC技術を用いて調べて、イソペンテニルピロホスフェート及びファルネシルピロホスフェートからのステビオールの最大の生成を示した特定のクローンを同定した。GGPPS、KO 及びKAH 酵素は、eYACs上で個別に、又はGGPPS 酵素の場合、個別又は二種のプール中（例えばシネココッカス種 + Ｓ．アシドカルダリウス GGPPS 又はアスペルギルス-ニドゥランス GGPPS のみ）で、Ｓ．セレビジエ株にステビオール経路中の残った酵素ステップの全てを発現させた状態で検査した。その結果は、シネココッカス種 GGPPS クローン MM-7 （SEQ ID NO:24にコードされている）が最も効率的であったことを示した。アスペルギルス-ニドゥランス及びスルフロブス-アシドカルダリウスからのGGPPSクローンもまた大変活性であった。その結果は更に、KO 及びKAHクローンの中では、ステビアKO クローン MM-18 （SEQ ID NO:52にコードされている）
及びＡ．サリアナKAH クローン MM-24 （SEQ ID NO:62にコードされている) でステビオール生成が最大であったことを示していた。
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* 米国特許公報第20080064063号
実施例４に記載したＳ．セレビジエ株CEY213を、強力なGPD1プロモータに作動可能に連結させた、表１１に示すCDPS又はKS遺伝子の一つを持つ高コピー数プラスミドで形質転換させた。予備実験では、CEY213でステビア-レバウディアナCDPS (CDPS-1、SEQ ID NO:34にコードされている) を過剰発現させると、ルブソシド生成が、高コピー数CDPS-1過剰発現プラスミドを欠く
CEY213に比較して増加することが示された。該実験では更に、ステビア-レバウディアナ KO (KO-1、SEQ ID NO:52にコードされている) は検査された二種では最も活性なKOであることが示された。
一貫して高レベルのステビオールグリコシド生成を見せる酵母株を構築するために、GGPPS-10 クローン、KO-1クローン (SEQ ID NO:52) 及び KAH-3クローン (SEQ ID
NO:62) を含有する発現カセットをＳ．セレビジエ株CEN.PK 111-61Aのゲノムに安定に組み込んだ。これらのカセットの発現を構成的 GPD1 及びTPI1 プロモータで惹起した。加えて、 KS-1 (SEQ ID NO:40)、CDPS-1 (SEQ
ID NO:34) 及び UGT74G1 (SEQ ID NO:2) を含有する発現カセットを該ゲノムに安定に組み込んだ。しかし、その結果できた酵母株EFSC1751は、実施例６で解説した条件下で研究室規模で成長させたときにはいずれのステビオール-19-O-モノシドも生成しなかった。
EFSC1751におけるステビオールグリコシド生成の欠如の基盤を調べるために、CDPS-3、CDPS -4、CDPS -5 及びCPR-1 遺伝子を単独又は組合せで株EFSC1751で発現させた。CPR-1はステビア-レバウディアナ由来であり、その配列はGenbank受託番号 DQ269454.4に見られる。その結果は、CPR-1を、CDPS-3、CDPS-4 又はCDPS-5のいずれかと一緒に発現させた場合には、ステビオール-19-O-モノシドがEFSC1751で生成された。同じ株でこれらの遺伝子単独ではいずれもいずれの生成も起きなかった。これらの結果は、ステビア酵素CDPS-1のゲノム組込みされたコピーはこの酵母コンストラクトでは非機能的であり、他方、ブラジリゾビウム、アラビドプシス又はゼア CDPS クローンはこのコンストラクトで機能的であることを示している。加えて、このコンストラクト用の染色体中に組み込まれた該植物由来KAH 及び／又は KO遺伝子は活性のために外因性のCPRを要したように思われる。ジベレラ-フジクロイ由来のCPR (MM-29) もまた、該植物由来
KAH 及び／又は KO ポリペプチドと一緒に作用できるように思われる。
二つの主なGGPPS 候補であるGGPPS-6 (SEQ ID NO:23にコードされている) 及び GGPPS-7
(SEQ ID NO:24にコードされている)を更に個別に、機能的ステビオールグリコシド経路(UGT74G1を含む)を有するがGGPPS遺伝子を持たないＳ．セレビジエ株で調べた。次に形質転換体を19-SMG の生成について、50% DMSO で５分間沸騰させ、16000 相対遠心分離力 (RCF) で５分間遠心分離した培養株試料のLC-MS分析で分析した。GGPPS-6-発現プラスミドを含有する数多くの形質転換体が19-SMGを生成していなかったことが見出された。
GGPPS-7を含有する形質転換体はほとんど得られなかったことから、GGPPS-7 (シネココッカス種) は二種の酵素のより活性のものであり、そしてこの活性は毒性をもたらすに十分であり得ることも示された。例えば、GGPP 生成における劇的な増加は、エルゴステロール生成などの下流の経路の枯渇と成り得るかも知れない。この仮説を検査するために、UPC2-1 遺伝子をGGPPS-7と同時発現させて、これらの細胞のエルゴステロール供給を試みることで、これが細胞成長を救助するかどうかを調べた。しかし細胞成長は救助されなかった。
細胞毒性は更に、GGPP 又はGGPP代謝産物の蓄積が原因かも知れない。この仮説を検査するために、CDPS-5 を更にGGPPS-7-発現酵母株で過剰発現させて、毒性がGGPP 使用率増加で軽減されるかどうかを見た。CDPS5 過剰発現はある程度は成長を救助するように思われた。なぜなら、この酵素をGGPPS-7 と一緒に過剰発現するプラスミドを持つ形質転換体が僅かなコロニーを生じたからである。形質転換体の数はそれでも低かった。同様な、しかしGGPPS-7の代わりにGGPPS-10を持つ株でCDPS-5 を過剰発現させたところ、ステビオールグリコシド生成が二倍になり、これらの結果をまとめると、 CDPSは導入されたステビオールグリコシド生合成経路において制限的なボトルネックであることが示唆されているのかも知れない。
要約すると、酵母培地+ 2% グルコースを加えた、３０℃での試験管細胞培養株での２４乃至７２時間にわたる19-SMG又はルブソシドの生成に基づくと、以下の結論がeYACコンストラクトで導かれた： KS-1（ステビア-レバウディアナ、SEQ ID NO:40にコードされている）、KO-1（Ｓ．レバウディアナ、SEQ
ID NO:52にコードされている）及び KAH-1 （Ｓ．レバウディアナ）又は KAH-3 （アラビドプシス-サリアナ、SEQ ID NO:62にコードされている） はステビオール経路にとって最良の組合せであるようである。GGPPS-7 （シネココッカス種）はこのステップで最高量の活性を示すようであるが、下流のボトルネックが起きれば、過剰発現の結果、更に毒性にもつながり、ステビオール グリコシドの全体的な更なる低レベルにもつながり得る。CDPS 及びCPR 遺伝子アナログの全ての組合せを検査したところ、表１１の３つのCPR全てが活性であったこと、そしてCPR-1 (Ｓ．レバウディアナ、SEQ ID NO:70にコードされている) 又は CPR-3 (ジベレラ-フジクロイ、SEQ ID
NO:72にコードされている) と CDPS-5 (ゼア-メイス) 又は CDPS-4 (Ａ．サリアナ) との組合せが特に有用であることが見出された。CDPS-5 は、経路中で最適なCDPSであるようである。ステロール経路へのフラックスを減少させたレポータ株で組合せを更に検査することができる。
ゼア-メイス由来のCDPS（CDPS-5）の活性を更に高くできるか、その可能性を調べるために、この遺伝子を、プラスチド・シグナル・ペプチド有り又は無しにしたGPDプロモーターを用いて２ミクロン複数コピー・プラスミドから発現させて、標的決定配列を取り除いたときに細胞質内で活性が高くなるかどうかを判定した。ゼア-メイス由来の、葉緑体シグナルペプチドを含有するCDPS-5のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を、それぞれSEQ ID NO:80 及び81に挙げる。葉緑体シグナルペプチドは SEQ ID NO:80のヌクレオチド1-150にコードされており、SEQ ID NO:81のアミノ酸1乃至50に相当する。プラスミドを、GGPPS-10、CDPS-5、KS-1、KO-1、KAH-3、CPR-1 及びUGT74G1
(SEQ ID NO:2) をゲノムに組み込んで有する安定なルブソシド・プロデューサ株 (EFSC1859) に導入し、強力な構成的 GPD 及びTPI プロモーターから発現させた。更に、株EFSC1859において、ERG9にコードされたスクアレンシンターゼの発現を、内因性プロモーターをCUP1誘導性プロモーターに置換することにより下方調節した。これらの遺伝子に加え、株EFSC1859は、2ミクロンの複数コピーベクター由来のUGT85C2 (SEQ ID NO:3)を GPD1 プロモータを用いて発現する。ルブソシド 及び19-SMG の生成を、LC-MS で測定して生成レベルを推定した。プラスチド・リーダー配列を除去してもステビオール グリコシド生成は野生型配列に比較して増加しなかった。しかしながら、この研究ではリーダー配列はステビオール経路機能を失わせることなく除去することができることが実証されている。
同様に、プラスミドを、膜アンカー配列（即ちSEQ ID NO:72のヌクレオチド4-63；SEQ ID NO:62のヌクレオチド4-87；及びSEQ ID NO:52のヌクレオチド1-117)なしのCPR-3、KAH-3及びKO-1 のために構築し、株EFSC1859 内に、UGT85C2 をプラスミドではなく染色体上に組み込んだ状態で導入した。これらの酵素はアンカー配列なしでも機能的であろうと予測される。
実施例１０ − ステビオール-1,3-O-モノグルコシド 1,2-グルコシルトランスフェラーゼ配列の同定
ステビアEST分析
ステビア（ステビア-レバウディアナ）葉 EST (発現配列タグ) データベース (Brandle et al., Plant Mol.
Biol. 50:613-622, 2002)のtBLASTN 検索を、完全イポメア（イポメア-パープレア） UGT79 タイプ UGT (IP3GGT)、ベリス (ベリス-ペレニス) UGT94B1、ステビア UGT79A2、ステビア UGT76G1 及びステビア UGT91D1 アミノ酸配列をクエリーとすることで、グリコシルトランスフェラーゼを主に含有することが公知の全てのファミリー１グリコシルトランスフェラーゼ・サブファミリ由来のUGTを表させるように用いて行った。以前には未解説のUGT遺伝子のための部分配列を同定した。該部分配列の一つはUGT 79サブファミリー (「79-EV1」)由来であり、一つはUGT 76 サブファミリー (「76-EV1」) 由来であり、そして二つは UGT 91 サブファミリー (「91-EV-1」及び「91-EV2」)由来、そしてUGT 71、72、78、84 及び 88 サブファミリーのメンバーである。部分配列のうちの７つをステビア cDNA 又は cDNA ライブラリーを単離用のPCRテンプレートとして用いて単離した。加えて、UGT 76 サブファミリー の二つのステビア・メンバーである GenBank 受託番号ACT33422.1 の、76G1 サブファミリー (Mohankumar)のメンバーと、GenBank 受託番号 ACM47734.1 の、76G2 (Yang) サブファミリーのメンバーとを単離した。
ピロ配列決定
更なるUGTクローンを同定し、ステビアcDNA を以下の通りに用いてピロ配列決定を行うことで単離した。ステビアmRNA をステビアの葉からAmbion（登録商標） Micro Poly Purist（登録商標） mRNA 調製キットを用いて調製した。各配列の5’及び3’-末端にある２１ヌクレオチドに同一なオリゴヌクレオチド・プライマーによる分析的PCRを利用することで、品質コントロールとして逆転写 mRNA をステビアレバウディオサイドＡ経路UGT 遺伝子 85C2、74G1 及び 76G1の存在について検査した。その後、増幅後の完全長mRNA をピロ配列決定及びコンティグ検定 (米国ミズーリ州、セントルイス、MOgene社製)に用いた。平均長393ヌクレオチドの 約 3.4 百万読み取りを行い、その結果の生配列を用いて25907配列コンティグを得た。合計ほぼ1,500UGTの公共で入手可能なアミノ酸配列を含有するデータベースを構築した。配列決定されたUGTのうちの約150は、多種のサブファミリーから完全にアノテートされたUGTであった。残りの配列決定済みUGTは、これらのうちの部分的にアノテートされたホモログであった。BLASTX 検索を (ドイツ、ミュールタール、CLC Genomics社)、作製されたUGT データベース (遺伝子コード = 1、低複雑度 = Yes、予測値 = 10.0、ワード・サイズ = 3、プロセッサーのNo = 2、マトリックス =
BLOSUM62、ギャップ・コスト (開放) = 11、ギャップ・コスト (伸長)= 1)に対するクエリーとして25907ステビアEST コンティグを用いて行った。その結果は、ステビア由来の９０を超える未知のUGTの配列が、ピロ配列決定データベース中に存在することを示唆していた。
この他には、UGT 79 サブファミリー又はUGT 94
サブファミリーのいずれもピロ配列決定データベース中で同定されなかった。しかし、当該分析では、UGT 76 及び91 サブファミリーの新しいメンバーが示された。当該遺伝子のうちの１、２に関して、完全長配列データじゃピロ配列決定ESTデータからすぐに入手できた。以前に構築されたステビア・プラスミドcDNA ライブラリーを用いて、部分的配列データを得ていたメンバーの完全長配列を得た。各特異的部分UGT配列に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーを、ライブラリ・プラスミド・ベクター配列に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーに組み合わせた。これらのプライマーをPCRで用いて完全長生成物を得、この生成物をその後、配列決定した。該完全長配列に基づき、反応のテンプレートとしてステビアcDNAライブラリー由来の完全長UGT遺伝子を増幅するためにプルーフ・リーディングPCRポリメラーゼ酵素を用いて第二のPCRを用いて行った。この戦略を用い、UGT 76
サブファミリーの５つのメンバー、UGT 91 サブファミリーの６つのメンバーや、他のUGT サブファミリーの１０のメンバーが単離された。
ステビアESTデータベースから同定された7UGT、２つの公共から入手可能なステビアUGT76配列、及びピロ配列決定で同定された21のUGTのそれぞれをＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター
pET30A+ 又は pETDuet (精製目的には HIS-tag を利用した) 内にクローニングして、自己分解プローンＥ．ｃｏｌｉ株 XjA 及び XjBで発現させた。これらのUGtの多数については、UGTタンパク質の発現の結果、封入体の形成が起きた。これらの封入体の形成を克服するために、これらのUGTのいくつかを低温発現株「アークティック・エキスプレス」(Agilent
Technologies社)で発現させた。この系の発現に失敗したものについては、PCR生成物の共役 in vitro 転写−翻訳（PCR
DNA キット用のTNT（登録商標）T7 Quick、Promega社) を試みて、残ったUGTを成功裏に発現できた。反応の効率は、35S-メチオニンで標識付け、SDS-PAGE上での分離、及び、問題のUGTタンパク質の予測されるサイズのタンパク質バンドをホスホイメージング検出することで確認された。
各クローン由来で、上述の通りに発現させたUGT ポリペプチドを1,2-グリコシル化活性について、ステビオール-13-O-モノグルコシドを基質として用いて検査した。25μLの反応で形成される全タンパク質のほぼ５分の１に相当する、In
vitro で転写／翻訳されたタンパク質が in vitro 反応で、0.5 mM ステビオール-13-O-モノグルコシド (SMG)
を基質として、反応緩衝液（1 mM UDP-グルコース、100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、5 mM MgCl2、1 mM KCl, 0.1 U/μlのウシ小腸ホスファターゼを含有する）中で用いられた。反応混合液は３０℃で２０時間、インキュベートされた。次に反応混合液をLC-MS 分析でステビオール-1,2-ビオシドの存在について分析した。LC-MS 分析は、Phenomenex（登録商標）
Synergy Hydro-RP カラム(250 x 3 mm, 3μm粒子、80 Åのポア・サイズ) を取り付け、電子スプレー電離によりTSQ クオンタム(ThermoFisher
Scientific社) トリプル四極子質量分析計でハイフン付（原語：hyphenated）された
Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent Technologies社) を用いて行われた。溶離は、MeCN
(0.01% ギ酸) 及びH2O (0.01% ギ酸) を含有する移動相（３０℃）を用い、 0.6→0.4 ml/分、5%
MeCN を４分間；0.4 ml/分、5→40% MeCN
を２分間；0.4 ml/分、40→55% MeCN
を１１分間；0.4→1.0 ml/分、55→100% MeCNを３分間から成る勾配を印加することで行われた。 ステビオールビオシドは SIM (Single Ion Monitoring) を Mw
665.2 [M+Na+]で用いて検出された。検査された30 UGT 酵素のいずれも検出可能なステビオール-13-O-モノグルコシドグリコシル化活性を示さなかった。
ピロ配列決定で同定された６つのUGT91 メンバーのヌクレオチド配列を
Genbank 受託番号No. AY345980のステビアUGT91D1配列と比較した。ピロ配列決定で同定された６つの配列に比較して、このGenBank
配列は１２個の更なるアミノ酸をN末端にコードしているように見えた。UGT91D1ファミリーメンバーを活性について再検査するために、UGT91D1
配列をステビア葉cDNAのPCR増幅により再単離した。その結果のPCR産物をプラスミド・ベクター内にクローニングし、各産物の酵素活性を上述した通り、：Ｅ．ｃｏｌｉ内でのGST-タグ付け発現、共役 in
vitro 転写／翻訳、及び／又は 酵母でのin vivo 発現により測定した。ステビオール 1,2-グルコシル化活性は、三つの方法のすべてにより一つのクローンから検出された。このクローンはUGT91D2eと指名された。UGT91D2e
のアミノ酸配列を SEQ ID NO:5に挙げる。対照的に1,2-グルコシル化活性は、受託番号
AY345980 (タンパク質受託番号 AAR06918)と同じ配列を有するが、アミノ末端の１２個のアミノ酸を欠くクローンからは検出されなかった。
実施例１１ − UGT91D2e 配列の分析
UGT91D2eの配列バリアント
図１９Ｂに証左されるように、僅かな数のアミノ酸修飾が活性 (91D2e) バリアントと、最も近い不活性のホモログ (91D1)との間には存在する。Ma et
al., Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 2003 36(2):123-9 (タンパク質受託番号 AAM53963、GI:21435782 ) 及び Brandle et al., 上記 (タンパク質受託番号 AAR06918、GI:37993665) がクローニングした91D1遺伝子は、RebA 生合成に必要な1,2-グリコシル化活性を示さなかった。どのアミノ酸が活性に必要なのかを確認するために、21 個の単一部位指定変異体を、UGT91D2e
(SEQ ID NO:5)中のアミノ酸が不活性なホモログ中の対応するアミノ酸に変化しているように、作製した。表１２を参照されたい。加えて、位置 364 (S→P) も変化しているように部位指定変異を作製した。変異体は QuikChange（登録商標） II 部位指定変異誘発キットをメーカーのプロトコル（カリフォルニア州サンタクララ、Agilent Technologies社）に従って用いて作製され、pGEX-4TI ベクターを XJb 自己分解Ｅ．ｃｏｌｉ株（カリフォルニア州オレンジ、ZymoResearch社）中に導入した。ある変異体は、残基 162 がグリシンからアスパラギン酸には変化しないように作られた。
変異酵素の活性を評価するために、基質供給実験を in vitro でＥ．ｃｏｌｉで産生される単一のタンパク質を用いて行った。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を一晩、３０℃で成長させた後、3 mM アラビノース及び0.1 mM
IPTGで誘導し、更に２０℃でインキュベートした。in
vitro 検定については、細胞を一晩、20℃で誘導し、凍結／解凍サイクルで溶解させ、粗細胞抽出物を、基質が 5 mM ステビオール-13-O-グルコシド 及び 0.5 mM ルブソシドである酵素反応で用いた。
その結果を、ステビオールモノグルコシド (SMG) 及びルブソシド (Rub) 基質について表１２で示す。「+」はジグリコシル化活性が検出されたことを示し、「-」は活性が検出されなかったことを示し、そして「NA」は、検定が行われなかったことを示す。記載された変異は91D2e 配列 (SEQ ID NO:5)の番号付けに基づく。
遺伝子のいくつかはＥ．ｃｏｌｉの封入体中で発現する傾向を有するため、Ｅ．ｃｏｌｉ実験で活性を示さなかったコーディング配列も、上記実施例１０の通り、PCR産物の共役 in vitro 転写−翻訳 により、作製された (PCR DNA キット用のTNT（登録商標）T7
Quick、 Promega社) 。簡単に説明すると、５個の単一変異体のPCR増幅で得た2μLのDNA と野生型酵素を９０分間、３０℃で、キットのマスター混合液及び1μLのL-[35S]-メチオニンと一緒にして合計25μLの反応液にしてインキュベートした。各試料については、体積2μLの最終反応液をSDS-PAGE ゲルで泳動させた。SDS-PAGEゲルの視覚的観察で判断したところ、６種のタンパク質すべてが同様なレベルの可溶性組換えタンパク質を示した。in vitro-翻訳タンパク質に関する結果は表１２の右側に示されている。この表のパーセンテージは、基質及び生成物の相対的ピーク面積に基づく、基質から生成物への大体の転化量を示す。
Figure 0006177127
UGT91D2e (SEQ ID NO:5) に比較したときのジグリコシル化活性の大体の量は： T144Sは6.1%、M152Lは26.2%、L213Fは30.7%、S364Pは4.3%、そしてG384Cは14.7% であることが、13-SMGを基質として用いて見出された。ルブソシドの場合、 UGT91D2eに比較したときのジグリコシル化活性の大体の量は、T144S、M152L、L213F、S364P、及びG384Cについて、それぞれ1.4%、23.4%、43.7%、10.9% 及び35.2%であることが見出された。
これらの結果は、２２のアミノ酸変異のうちの５つが、単独で行われたときには活性にとって甚だしく有害であることを示している。また、他の１７の変異の組合せも、不活性又は活性消失につながる可能性もある。
91D2e 配列及び上述のバリアントを、At72B1、Mt85H2、VvGT1 及びMt71G1 (Osmani
et al (2009) Phytochemistry 70, 325-347)と呼ばれるタンパク質とアライメントし、予想される三次構造（アルファ-へリックス、ベータ-シート、及びコイル領域）を分析することにより、変異の結果、ジグリコシル化活性が失われる可能性が高い領域を特定することができる。有害な最初の三つの変異は、ループであると考えられる領域にあるN末端ドメインに見られる。このＮ末端ドメイン（アミノ酸残基 1-240）、特にＮ末端ドメインの予測されるループ領域（アミノ酸20-26、39-43、88-95、121-124、142-158、185-198、及び203-214）は、グルコース受容体分子基質の結合を主に担うと考えられている。活性にとって有害だと思われる４番目の変異は（アミノ酸381-386に相当する）C5ループと考えられる領域であるＣ末端ドメインに見られる。このループもまた、グルコース受容体基質特異性にとって重要だと考えられる。不活性、対、活性なルブソシドジグリコシラーゼ酵素を分かつ２２個の変異の１９個が、91D2eの予測される受容体基質結合領域の５つのアミノ酸内に位置する。従って、公開された91D1 酵素は、UDP-グルコースと代替的な受容体基質との間のグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒している可能性が高い。
実施例１２ −− 酵母でのレバウディオサイドＡの生成
ステビオール供給酵母におけるレバウディオサイドＡの生成
ステビア UGTs 91D2e (SEQ ID NO:5)、85C2 (SEQ ID NO:3)、及び76G1 (SEQ ID NO:7)の同時発現に向けて、ゲノム組込みされたUGT74G1 発現カセットを含有する酵母株EFSC1580を３つの異なる2μ高コピー（エピソーム）プラスミドに導入した。pMUS44、pMUS7 及びpMUS9と指名された、この３つのプラスミドは、それぞれUGT91D2e、UGT85C2 及びUGT76G1のコーディング配列を、強力なGPD1プロモーターに作動可能に連結させて含有する。その結果の酵母株を ＳＣ培地でウラシル、ヒスチジン、及びロイシンなしで成長させて、pMUS44、pMUS7 及びpMUS9 発現プラスミドの継続的な存在について選抜した。ステビオールを培地に最終濃度250μMまで加え、 この株を３０℃で培養した。培養の１８時間目及び７２時間目に数アリクォートの上清及び細胞ペレットを、レバウディオサイドＡの存在についてLC-MSで分析した。LC-MS 分析は、Phenomenex（登録商標）
Synergy Hydro-RPカラム (250 x 3 mm、3μm粒子、80オングストロームのポア・サイズ） を取り付け、電子スプレー電離によりTSQ
Quantum (ThermoFisher Scientific) トリプル４極子質量分析計にハイフン化したAgilent 1100 シリーズ HPLC システム（米国デラウェア州、ウィルミントン、Agilent
Technologies社）を用いて行われた。溶離は、MeCN（0.01% ギ酸）及び H2O (0.01% ギ酸)を含有する移動相 (30℃) を用い、0.6→0.4 ml/分、5% MeCN を４分；0.4 ml/分、40% MeCN
を２分；0.4 ml/分、40→55% MeCN
を１１分； 0.4→1.0 ml/分、55→100% MeCN を３分、から成る勾配を印加することで行われた。ステビオールビオシドは SIM (Single Ion Monitoring)を用いて検出された。
LC-MS では、pMUS44、pMUS7 及び pMUS9 を含有する株EFSC1580をステビオールの存在下で成長させたときに、検出可能な量のレバウディオサイドＡが培養の１８及び７２時間目の上清で見られたことを示した。この生成物はレバウディオサイドＡ標準でで同時溶離し、予測される質量は [M+Na]+ = 989と確認された。生成物の吸光度を、10μMのレバウディオサイドＡ標準の吸光度を比較することにより、細胞培養の上清中の蓄積が１８時間目では6mg/L 超、そして７２時間目では15 mg/L超と推定された。
グルコース供給酵母でのレバウディオサイドＡ及びレバウディオサイドＤ の生成
実施例４で解説した酵母株CEY213は、eYACから発現するステビオール生合成経路や、ゲノムに組み込まれたUGT74G1 及びUGT85C2発現カセットを含有する。株
CEY213 は実施例６で解説した通り、ルブソシドを生成する。
UGT91D2e (SEQ ID NO:5) 及びUGT76G1 (SEQ ID
NO:7)の同時発現に向けて、株CEY213を2μ高コピー（エピソーム性）二重発現プラスミドのpMUS47で形質転換した。pMUS47プラスミドは、一つは UGT91D2e のコーディング配列を有し、他方は UGT76G1のコーディング配列を有する、２つの発現カセットを含有する。両方のコーディング配列は、強力な構成的GPD1 プロモーターに作動可能に連結している。その結果の酵母株を、eYACの存在に関する選抜を維持するためにヒスチジン、ロイシン及びトリプトファンなしの、pMUS47の存在に関する選抜を維持するためにはウラシルなしの、そして最後にeYAC上に存在するプロモーターを抑制するためにメチオニン (2mM) 有りの、ＳＣ培地上で３０℃で一晩、予備培養した。
翌日、細胞を洗浄し、eYACプロモーターの同様のために、同一ではあるがメチオニンなしの培地に移した。２４時間及び９９時間のインキュベーション後に試料を採集し、上清及び細胞ペレットを、レバウディオサイドＡ及び レバウディオサイドＤの存在についてLC-MS を上述した通りに用いて分析した。
その結果は、検出可能な量のレバウディオサイドＡが２４時間目及び９９時間目の上清の両者に見られたことを示していた。生成物はレバウディオサイドＡ標準で同時溶離し、 予想される質量は [M+Na]+ = 989であると確認された。生成物の吸光度を10μMのレバウディオサイドＡ標準に比較することにより、レバウディオサイドＡの上清中への蓄積を、２４時間目では 3mg/L 超、そして９９時間目では 6 mg/L 超と推定した。図９を参照されたい。その結果も、少量のステビオシド及びルブソシドが酵母細胞ペレット中に存在し、そして検出可能な量のステビオシド及びルブソシドが培養上清中に存在することを示していた。図９を参照されたい。
その結果もまた、少量ではあるが検出可能な量のレバウディオサイドＤが生成されたことを示しており、UGT91D2e は更なるグルコースをステビオシド生成性レバウディオサイドＥの19-O グルコース に、又は、レバウディオサイドＡの19-O グルコースに直接結合させることができることを示唆している。これらの結果はまた、UGT76G1
はレバウディオサイドＥを基質として受容することで、 レバウディオサイドＤを生成し得ることができることを示唆している。図２Ｃを参照されたい。
実施例１３ −− UGT配列のためのコドン最適化配列を持つレバウディオサイドＡの生成
GeneArt (ドイツ、ローゼンブルグ) (それぞれSEQ ID
NO: 6、2、8、及び4) 又は DNA 2.0 (カリフォルニア州メンローパーク) (それぞれSEQ ID
NO: 84、83、85、及び 82)により提供された２つの方法を用いて、UGT 91d2e、74G1、76G1、及び85C2 の最適コーディング配列をデザインし、 酵母での発現用に合成した。UGT 91d2e、74G1、76G1、及び85C2 (それぞれSEQ ID NO: 5、1、7、及び3) のアミノ酸配列は変えなかった。
４つの最適化UGT全てを持つ発現カセットを含有する高コピー数プラスミドを構築及び発現させ、それらの活性を、野生型配列を含有する同様な構築物の発現生成物に比較した。該プラスミドを汎用ウォッチメーカー株 EFSC301 (実施例３に解説)に導入した。 UGTを高コピー（2μ）ベクターに入れて挿入し、強力な構成的プロモーター (GPD1) (ベクター
P423-GPD、P424-GPD、P425-GPD、及びP426-GPD)から発現させた。一晩成長させ、OD600
が0.25になるように新鮮な培地に再播種した後、培養基(SC -leu-trp-ura-his) に25μMのステビオール (最終濃度)を添加し、ルブソシド (Rub), 19-SMG (19SMG) 及びRebA (RebA)
の生成を培地中で２４時間後に測定した。この実験を繰り返したが、それは部分的には、 19-SMG が一番目の試料の一つでは検出不能だったからである。
下の表１３に示す、２つの別々の実験結果は、コドン最適化UGTの８種すべてが活性であったことを示している。しかしながら、各戦略においてコドン最適化UGTの少なくとも一つのための酵素発現は、当該コンストラクトを作製するのに用いた新しんコドン最適化アルゴリズムで減少していた。GeneArt 改変コンストラクト (SEQ ID NO: 6、2、8、及び4）において、ルブソシドとRebAとの間でボトルネックが潜在的に作り出されたようである。酵母株で発現したこれらのコーディング配列の個別の酵素活性決定及び発現解析により、経路におけるUGT遺伝子の最適に組み合わせることができるようになることが期待されている。
Figure 0006177127
 nd
= 検出限界未満
実施例１４ − 配列タグのあるUGTを用いたレバウディオサイドＡの生成
小型ペプチド又はタンパク質結合ドメインと UGT タンパク質 85C2、91D2e、74G1、及び76G1との融合により、UGT間の相互作用を促進し（チャネリング）又は、UGTを酵母細胞の特異的成分にターゲティング／アンカリングする助けとすることができる。
RebA経路中のUGTのスカフォールディングの結果、経路の酵素が活性になるのかどうかを評価するために、DNA 2.0 コドン最適化UGT 85C2 及び74G1をインフレームで、p53タンパク質モチーフに似た 4 高親和性短鎖 (PMIとしても公知) ペプチドの鎖に融合した。p53 タンパク質モチーフはヒトではMDM2 タンパク質と相互作用する（Li
et al., J Mol Biol. 2010, 398(2):200-13を参照されたい）。DNA 2.0 コドン最適化UGT 85C2、91D2e、74G1 及び 76G1 (それぞれSEQ ID NO: 82、84、83、及び85) をインフレームでヒトタンパク質MDM2（遺伝子受託番号
ABT17086）の最初の158アミノ酸に融合した。小型のGS-リッチなリンカー領域もUGTのＮ末端メチオニンの直前に融合した。未融合の、PMI/MDM2 結合の親和性は、高親和結合を表す低nM 範囲にある。上記のコンストラクトで形質転換させた酵母細胞は、Ｎ末端で85C2タンパク質に融合された4
X PMI (P53様) ペプチド反復配列近傍にUGTタンパク質(85C2_P53と指定)スカフォールドを生成することが期待される
TRP1を欠失させた研究室用酵母株 BY4741を、ヒトMDM2タンパク質の最初の１５８アミノ酸のインフレーム融合をＮ末端に持つステビア-レバウディアナUGT 74G1、76G1 及び91D2e を発現し、そして合成PMIペプチドの４反復配列(4 X TSFAEYWNLLSP、SEQ ID NO:86)のＮ末端インフレーム融合を持つステビア-レバウディアナ UGT85C2を発現する発現プラスミド p423-426 GPD
(Mumberg et al, Gene, 156
(1995), 119-122)で形質転換した。 85C2、74G1、91D2e、及び 76G1 融合タンパク質のアミノ酸配列については、それぞれ SEQ ID NO: 88、90、92、及び 94 を参照されたい。該融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列については、SEQ ID NO: 89、92、93、及び 95 を参照されたい。この酵母株及びコントロール株（いずれの融合もなしで４種のUGTを発現する）を一晩、プラスミドの存在について選抜する合成酵母培地で成長させ、その翌日、合成酵母培地を含有する９６深皿トレイに細胞密度が OD600 で1になるように移した。最終濃度100μMのステビオールを加えた。７２時間後、試料を採取し、実施例１２で解説したようにLC-MSで分析した。図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、多様な融合タグと一緒に発現させた場合、UGTは酵母で活性であった。
実施例１５ − UGT91D2e
活性
更なるサブファミリー 91 UGT を、遺伝子バックグラウンドの異なる３種類のステビア源から作製したcDNA/ライブラリー製剤を用いてクローニングした。
UGT91D1/91D2e に同一なオリゴヌクレオチド・プライマーをcDNA 製剤のPCR増幅に用い、その結果得られた、サイズの正しいPCR 産物を、適したプラスミド・ベクター内にクローニングした。各実験から得た多くのクローンを配列決定すると、その配列決定の結果は、配列に僅かな変更を持つUGT91D核酸も増幅可能であろうことを示していた。UGT91D2eに対して配列の違いが最も大きい２０種のUGT91Dバリアントを in
vitro 転写−翻訳で発現させた後、ステビオール-13-O-モノグルコシド-1,2-グルコシル化活性について酵素検査した。バリアントのうちの一つが弱い1,2-ビオシドグルコシル化活性を示し、残りのものは何の検出可能なグルコシル化活性も示さなかった。従って、UGT91D2
ポリペプチドはステビアにおいて主なステビオール-13-O-モノグルコシド-1,2-グルコシル化酵素であるようである。
UGT91D2eの酵素活性
共役in
vitro転写−翻訳で作製されたUGT91D2e (SEQ ID NO:5)をin
vitro酵素検定でステビオール-13-O-モノグルコシドのキシロシル化及びラムノシル化能について、UDP-キシロース又はUDP-ラムノースをUDP-グルコースではなく糖供与体として用いて検査した。
キシロシル化検定は以下の通りに行われた：3 mM
UDP-グルクロン酸をほぼ1μgのアラビドプシス-サリアナにコードされたUDP-グルクロン酸 デカルボキシラーゼ UXS3
(Ｅ．ｃｏｌｉで産生された後、精製）、100 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM
DTT、6μg BSA、1 mM MgCl2、及び1% ウシ小腸ホスファターゼと混合した。この反応混合液を３０分間、３０℃でインキュベートして、UDP-グルクロン酸がUDP-キシロースに転化するようにした。その後、1.5 mM
ステビオール-13-O-モノグルコシド基質及びほぼ0.5μgの、実施例９に解説した通りに作製された
UGT91D2e 酵素を混合液に添加し、この混合液を３０℃で更に２０時間、インキュベートした。
ラムノシル化検定は以下の方法で行われた：3 mM
UDP-グルコース を、それぞれ0.6 μgの、アラビドプシス-サリアナにコードされたRHM2 ラムノース シンセターゼ (Ｅ．ｃｏｌｉで産生された後、精製)のＮ末端及びＣ末端部分、 100
mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM DTT、1.5 mM NADPH、1.5 mM NAD+、6μgのBSA、1 mM MgCl2、及び1% ウシ小腸ホスファターゼと混合した。この反応混合液を３０分間、３０℃でインキュベートして、 UDP-グルコースが UDP-ラムノースに転化するようにした。次に、1.5 mM
のステビオール-13-O-モノグルコシド基質及びほぼ0.5μgのUGT91D2e
酵素を混合液に添加し、この混合液を３０℃で更に２０時間、インキュベートした。
その結果は、UGT91D2e
はステビオール-13-O-モノグルコシド基質のキシロシル化をUDP-グルコースで観察される速度の約半分から３分の１の速度で行うことができ、こうしてレバウディオサイドＦの前駆体である1,2-キシロシル化ステビオール-13-O-モノシドを形成することができることを示していた。UGT91D2e
は ステビオール-13-O-モノグルコシド基質のラムノシル化を、 UDP-グルコースで観察されるのとほぼ同じ速度で行うことができ、こうしてレバウディオサイドＣ（ダルコシドＢ）の前駆体である1,2-ラムノシル化ステビオール-13-O-モノシドを形成することができた。これらの結果は、適した前駆体分子の合成され、そして適したUGTがin
vivoで発現されれば、レバウディオサイド Ｆ及びＣがin vivoで生成されるはずであることを示している。図２Ｂ及び２Ｄを参照されたい。
UGT91D2e
を更に、ステビオール-13-O-モノグルコシド以外の基質、即ちルブソシド, ステビオール-1,3-ビオシド及び1,3-ステビオシドの1,2-グルコシル化能についてin
vitroで検査した。その結果は、 UGT 91D2e は、1,3-結合グルコースが存在するとき（例えば ステビオール 1,3-ビオシド及び1,3-ステビオシド）には活性ではなかったが、 UGT
91D2e は19-O 位置の一次グルコシル化に関係なく活性であることを示していた。これらの結果は、ステビオール 1,3-ビオシド及び1,3-ステビオシド はrebA形成のためにin
vivoステビア経路に存在している訳ではない可能性が高いことを示唆している。図２Ａ及び３を参照されたい。
実施例１６ − UGT91D ホモログ
様々な生態型のＳ．レバウディアナは遺伝的に多様である。様々なステビアRNA 受託株から採った91Dの９６クローンを調査すると、SEQ ID NO:9に示した91D2eのヌクレオチド配列を参照して番号付けすると、調査された６つの生態型間で多くのアミノ酸変化が判明した（例えばヌクレオチド 74 (アミノ酸がG からDに変わる)、89 (Y から Fに)、131 (V からAに)、137 (F から S)、278 (PからQに)、295 (S から V 又は Pに)、331 (E からQに)、365 (Y からFに)、395 (A から Vに)、418 (H からYに)、425 (S から Gに)、431 (T からIに)、442 (A から Tに)、454 (M から Lに)、458 (G から Aに)、466 (A から Sに)、485 (G からDに)、583 (Lから Mに)、587 (V からEに)、595 (K から Eに)、614 (D からGに)、616 (G から Rに)、631 (L から Mに)、637 (L から Fに)、662 (S からFに)、664 (K から Eに)、671 (Yから Cに)、857 (V からAに)、867 (S から Rに)、919 (F から Lに)、989 (V から Aに)、1000 (R からCに)、1090 (S から Pに)、1150 (G から Cに)、1232 (L からSに)、1281 (K から Nに)、1313 (E から Aに)、1354 (Q からRに)、そして1369 (V からIに))。これらの多型からのいくつかの更なる変化が認められたが、それらは配列決定又はPCRエラーが原因である可能性が高く、特に多型が一回しか見られなかった場合はそうである。２０種類のコーディング領域を更なる分析に向けて選んだ。単離されたクローンの解説については表１４を参照されたい。表１４のアミノ酸の番号付けはSEQ ID NO:5に記載したUGT91D2eのアミノ酸配列に基づく。
Figure 0006177127
表１４のクローンの全てを、13-SMGを基質として用いて活性について検査した。クローン５は弱い1,2-グリコシル化活性を有していたが、他方、残りの１９種は検査条件下では活性を有さないようだった。クローン５の配列はSEQ ID NO:95 に記載した通りであり、以下の変異を野生型UGT92D2e (SEQ ID NO:5): G206R、Y207C、及びW343Rに対して持つ。
実施例１７ − UGT85C ホモログ
６つの異なるＳ．レバウディアナ生態型由来のUGT85C の遺伝的多様性を調べて、ステビオール グリコシド生成経路において同じ又は亢進した活性を有するホモログを同定した。UGT85C遺伝子に特異的なPCRプライマーをデザインし、PCR反応をcDNA (いくつかはcDNA ライブラリーに対してなされ、いくつかはcDNA 製剤に対してなされた)に対して行った。その結果得られたPCR 産物をクローニングし、９６個のクローンを配列決定した。アミノ酸多型をマッピングし、多様な共通の多型表示を持つ16個の UGT 85C クローンを選んだ。表１５を参照されたい。更なる改変がいくつかのクローンでは認められたが、PCRエラーが原因かも知れず、あるいは共通の多型ではないかも知れない。多型は、受託番号
AY345978.1 (表８を参照されたい)に記載された野生型Ｓ．レバウディアナUGT85Cヌクレオチド配列のヌクレオチド及びアミノ酸番号付けで解説されている。
Figure 0006177127
Figure 0006177127

クローンはPCR産物の共役in
vitro 転写−翻訳 (PCR DNA キット用TNT（登録商標）T7 Quick 、Promega社) を通じて発現させ、基質ステビオール及びステビオール-19-O-グルコシド (0.5 mM)に対しるグリコシル化能について、前の実施例で解説した通りに検定した。クローン1、4、16、17、19、20、21、26、29、30、31、37、及び39 から生まれたUGT85Cは可溶性であり、９０分検定で19-SMG
をルブソシドに転化させることができた。 クローン27から生じたUGT85Cは不溶性とみなされた。クローン2及び33から生じたUGT85Cは不溶性とみなされたが、微量のルブソシドが、タンパク質バンドが見えなかったにも関わらず、生成された。これらの実験は個別に３回、行われた。この実験では、以下のアミノ酸変異では活性消失につながらなかったことを示している：V13F、F15L、H60D、A65S、E71Q、I87F、K220T、R243W、T270M、T270R、Q289H、L334S、A389V、I394V、P397S、E418V、G440D、及びH441N。活性なクローンで見られた更なる変異には、クローン37のK9E、クローン26のK10R、クローン2のQ21H、クローン30のM27V 、クローン4のL91P、クローン31のY298C、クローン37のK350T、クローン1のH368R、クローン19のG420R、クローン4のL431P 、クローン16のR444G、及びクローン30のM471T がある。
検査されなかった唯一の共通の多型は、両者ともかなり保存的な置換である T270A 及び I336Tであった。クローン17はUGT85Cに比較して6/480 アミノ酸分という最大の変化を起こしていた。変化可能と思われる17-20 アミノ酸はアミノ酸レベルではほぼ4% の違いとなる。
一般的には、85C間の遺伝子多様性は低く、表１５に記載した共通の多型を持つ85Cホモログの全てが活性である可能性が高い。
実施例１８ − UGT76Gホモログ
６つの異なるＳ．レバウディアナ生態型由来のUGT76G の遺伝的多様性を調べて、ステビオール グリコシド生成経路において同じ又は亢進した活性を有するホモログを同定した。UGT76G遺伝子に特異的なPCRプライマーをデザインし、PCR反応をcDNA (いくつかはcDNA ライブラリー又はDNA 製剤)に対して行った。その結果得られたPCR フラグメントをクローニングし、９６個のクローンを配列決定した。共通のアミノ酸多型をマッピングし、, （アミノ酸番号で）: R10S、I16L、F22V、M29I、K52S、V74K/E、P80S、L85A、V87S/G、L91P、I92F、I93F、H96Y、G97R、L108V、E113D、G116E、A123T、Q125A、I126L、Y128H、T130A、L142I、V145M、S147N、N151T、F152I、H153L、H155Y、V156D、Q160L、E163D、L167F、P169L、K188N、K191Q、C192S/F、S193G/A、F194Y、M196N、K198Q、K199(I、V、Q)、Y200(L、A、G)、Y203I、F204L、E205G、N206K、I207M、T208I、V217I/F、E226Q、S228P、L230V、V233I、I234T、E236D、I237F、S253P、P266Q、S273P、R274S、G284T/A、T285S、287-3 bp 欠失、R298H、P326A、L330V、G331A、P341L、L346I、S376L、D377A、G379A、L380F、S438P、及び K441Nを含め、多様な共通の多型表示を持つ16個の UGT 76G クローンを選んだ。概して、76G間には大変高い多様性があった。
クローンをin vitro翻訳を通じて発現させ、前の実施例で解説した通りにグリコシル化活性について0.5 mM ステビオール-13-O-グルコシド 及び0.5 mM ステビオシドを基質として用いて検定した。反応は９０分間、３０℃で行わせた。ステビオール-13-O-グルコシドを基質として用いたときに、天然の76G1 活性が、76G_C4、76G_G7 及び 76G_H12と指名された三つの新しい76Gに、1,3-ビオシドの形成によって見られた。この場合の活性は機能的76G1である陽性コントロールに匹敵すると判定された。クローン 76G_G7 及び 76G_H12 は、コントロールよりも僅かに高いレベルの Reb A を生成したが、76G_C4 はコントロールよりも僅かに少ない Reb Aを有していた。これらのクローン中の変化数は、コントロール酵素に比べるとアミノ酸レベルでは
約 7% の違いとなる。SEQ ID NO: 98、100、及び102 はそれぞれアミノ酸配列で76G_C4、76G_G7、及び76G_H12と記載されている。 SEQ ID NO: 97、99、及び101 はそれぞれ76G_C4、76G_G7、及び76G_H12をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。
SEQ ID NO: 98、100、及び102 はそれぞれ76G_C4、76G_G7、及び76G_H12のアミノ酸配列を記載したものである。SEQ ID NO: 97、99、及び101 は、それぞれ76G_C4、76G_G7、及び76G_H12をコードするヌクレオチド配列を記載したものである。
表１６は、活性を有する76Gクローンのアミノ酸変化を野生型酵素に比較して要約したものである。活性クローンには数多くの重複する多型があるため、これらの多型は酵素の活性消失を引き起こさないと予測される。例えば位置80でのP→S 変異、又は位置22での F→V 変異など、特定の変異は不活性なクローンには頻繁にあるようである。
Figure 0006177127
実施例１９ − 切断型酵母HMG-CoA レダクターゼ及び他のHMG-CoA レダクターゼの発現
Ｓ．セレビジエにおいては、メバロネート経路は、例えば 酵素3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル−コエンザイムA (HMG-CoA) レダクターゼのレベルなどで大きな調節を受けている。切断型HMG-CoA レダクターゼ (tHMG1、分解から安定させた酵素をコードしている) を発現させることは、PPP生成に向かうフラックスを酵母で増加させることのできる方法の一つである。例えば、酵母でtHMG1を発現させるとβ-カロテンの劇的な過剰産生が起きた。Verwaal et al., 2007, Appl. Environ. Microbiol. 73:4342を参照されたい。興味深いことに、このような酵母は、予測されたような固体成長培地上での暗いオレンジ色の着色は示さず、おそらくは中間生成物のフィトエンが更に高い過剰産生したために、強い黄色を示した。
HMG-CoA レダクターゼの発現を用いてステビオール及びステビオールグリコシド経路へのフラックスを亢進し得るかどうかを調べるために、イソプレノイド・フラックスを検査するための酵母レポーター株を、ERG9 遺伝子の固有のプロモーターをCUP1 プロモーターに置換することで調製した。２０１０年５月２０日の出願の米国特許出願No. 61/346853号を参照されたい。
酵母株を作製するのに用いた遺伝子を表１７に示す。ソース生物由来の遺伝子は、DNA 2.0 Inc（登録商標）に従って最適化されたコドンだった。細胞内プレニルホスフェート利用能を観察する目的で、プレニルホスフェートをβ-カロテンに転化させるために必要な三つの酵素（キサントフィロミセス-デンドロロウス由来のGGPP シンターゼ、Ｘ．デンドロロウス由来のフィトエンシンターゼ及びベータカロテンシンターゼ、並びにニューロスポラ-クラッサ由来のゼータカロテンシンターゼ及びデルタカロテンシンターゼ）のための遺伝子を持つ遺伝子発現カセット（メチオニン抑制性プロモーター）を含有する高コピー数プラスミドを有するコンストラクトを作製した。Verwaal et al., 2007 上記；及び米国特許出願第61/346853号を参照されたい。
Figure 0006177127
酵母tHMG1を、β-カロテンを生成するCEN.PKベースの酵母株で発現させることで、オレンジから明るい黄色に色を変化させた。興味深いことに、アルテミシア-アヌア、トリパノソーマ-クルジ、及びスタフィロコッカス-アウレウス由来の完全長HMGや、シュードモナス-メヴァロニ及びアルケオグロブス-フルギドゥス由来のNADH依存的HMGを発現させると同様な結果が生じたことから、これらの遺伝子は酵母でメバロネート経路を通じたフラックスも向上させることが示された (ボス-タウルスHMG を同様に過剰発現させてもこのような効果はなかった)。最後に、同じ色の変化はリーシュマニア-インファンツムアセチル-CoA C-アセチルトランスフェラーゼ （表１７に記載されたメバロネート経路の一番目の酵素）又は天然Ｓ．セレビジエ (CAB1、YDR531W) 又はＢ．サチィリス（受託番号
YP004204141）パントテン酸塩キナーゼ（アセチル-CoA
生成を増加させることが公知)の過剰発現後で見られた。
これらの実験での色の変化が実際に高GGPP利用能が原因かどうかを検査するために、酵母tHMG1、P. メバロニ及びＳ．アウレウスHMG、又はＢ．サティリスパントテン酸キナーゼ
を安定な19-SMGプロデューサー株で発現させた。これらのコンストラクトのいずれも、検査条件下では19-SMG 又はルブソシド生成
(UGT85C2 同時発現) の増加をもたらさないようだった。 メバロネートを酵母レポータ株に供給しても、ルブソシド生成は増加しなかった。 しかし、ルブソシドレポーター株はERG9-にコードされた、エルゴステロール生合成に向かうフラックスを減らすようには遺伝子改変されていなかった。ベータ-カロテン生成にとって有益であることが見出されたHMGレダクターゼ遺伝子及び他のメバロネート経路遺伝子を用いてエルゴステロール生成に向かうフラックスを制御すると、ステビオールグリコシド生成が増加するであろうと予測される。
実施例２０ − RebC のin vivoでの生成
前駆体分子からのレバウディオサイドＣ、ステビオール-13-O-グルコピラノシル-1,2-ラムノシドへの合成はin vitro で実施例１５で示された。この実施例では、ステビオール-13-O-モノグルコシドを UDP-グルコース及びアラビドプシス-サリアナRHM2 酵素（位置タグ
AT1G53500) 及びUGT91D2eと一緒に、基質として用いた。図２Ｂに示す経路を更に実証するために、ステビオールからのレバウディオサイドＣの生成を in vivoで達成した。
レバウディオサイドＣを生成することができる酵母株を構築し、レバウディオサイドＣ及びレバウディオサイドＡの生成をLC-MSで検定した。改変されたサッカロミセス-セレビジエ株BY4742を構築し、EYS583-7Aと指名した。BY4742 の使用はNaesby et
al., Microb Cell Fact. 8:45 (2009)によって解説済みである。４種類のUGT全て (91D2d、76G1、74G1、及び 85C2) GPDプロモーターを持つiin プラスミドで構成的に発現させた。この種類の株は Naesby et. Al, Microb Cell Fact.
8:45 (2009)によって解説済みである。UGT85C2
をプラスミドP423 GPD
(ATCC#87355)に挿入し、UGT74G1を P424 GPD (ATCC#87357) 中にクローニングし、 UGT91D2e 及びUGT76G1 の両者を P425-GPD (ATCC#87359) 中にクローニングしたが、91D2e は元の多重クローニング部位
(MCS)に配置し、 76G1 は更なるGPD プロモーター及びCYC ターミネーターと一緒に挿入した。その結果の株を、CPDプロモーターから発現するRHM2遺伝子を含有するプラスミドP426 GPD (ATCC#87361) で形質転換した。この株を、ヒスチジン、ロイシン、トリプトファン及びウラシルを各SC培地上で２４時間、成長させた。次に、培養株をOD600 が0.4 になるように、25μMのステビオールを含有する新鮮な培地上に再播種し、酵母を更に７２時間、成長させてから、レバウディオサイドＣが上清及び細胞ペレット上に存在するかどうかを検出した。レバウディオサイドＣは本物のレバウディオサイドＣ標準 (カリフォルニア州アーヴィン、Chromadex社)を用いて定量された。合計で1.27μM ± 0.36μMのRebC を上清中に検出した。同様に、3.17μM ± 1.09μMの RebA を細胞ペレット中に検出した。当業者であれば、RebC 対 RebA の様々な比を、RHM2酵素の活性の調節 及び／又は UDP-ラムノース反応にとってより高い活性を持つUGT91D2e又はUGT76G1-様酵素の使用によって得ることができることを認識されよう。代替的なUGTは野生型酵素の変異誘発型であっても、又は、発見イニシアティブを通じて得られた特有の酵素であってもよい。
当業者であれば、レバウディオサイドＡをグルコースから生成することのできる酵母株、例えば実施例１２でUGT91D2e 及びUGT76G1 を含有するプラスミドで形質転換させた株CEY213 など、は、ベクターを通じて、又は染色体内に組み込むなどして、RHM2遺伝子を追加することにより、レバウディオサイドＣを生成するであろうことを認識されよう。
実施例２１ ―― エシェリヒア−コリで発現されるUGTを用いたステビオールグリコシドの生成
グラム陰性細菌でのUGT酵素の活性
UGTs 91D2e、74G1、76G1、及び85C2 の野生型遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ XjB-自己分解BL21(DE3)
細胞に、Novagen社のpET30 ベクター系 (ウィスコンシン州マジソン、EMD4
バイオサイエンセズ社)を用いて個々にクローニングし、例外としては UGT91D2eは pGEX 4T-1 (スウェーデン、ウプサラ、GE
Healthcare社)ベクター内にクローニングされた。同様なクローニングを実施例７及び１０に記載する。ベクターは全て、IPTG-誘導性プロモーターを用いている。プラスミドDNAを業者の解説通りに化学的コンピテント細胞内に導入した。
所望の抗生物質耐性を示す形質転換体を一晩、３０℃で、NZCYM-培地及び抗生物質を用いた2mL培養株にして成長させた。in
vivo 供給については、５つの培養株を成長させた：UGT 91d2e、74G1、76G1、及び85C2を個別に、そして４種クローンのすべての混合物である。翌日、培養株を誘導して最終濃度を 0.3 mM IPTG 及び3 mM アラビノースにし、２日間、２０℃で、50μMのステビオール (UGT74G1、UGT85C2 及び４つの混合物) 又は５０μM ルブソシド (UGT91D2e 及び UGT76G1)の存在下で成長させた。温度を３０℃まで上昇させ、細胞を更に１日、成長させた。次に細胞を4000 rpm で５分間の遠心分離で採集し、上清をLC-MS 分析に向けて取り除いた。細胞を 50% DMSO中に再懸濁させ、８０℃で５分間、溶解させ、そのライセートをLC-MSで分析した。
in vitro検定では、所望の抗生物質耐性を示す形質転換体を一晩、３０℃で、NZCYM- 培地及び抗生物質を用いて2mLの培養株にして成長させた。翌日、培養株を誘導して最終濃度を 0.3 mM IPTG 及び3 mM アラビノースにし、２４時間、２０℃で成長させた。次に、細胞を4000 rpm で５分間、遠心分離して採集し、200LのGT-緩衝液 (RBC Bioscience社) 及び3 錠/100ml の完全 mini、プロテアーゼ阻害剤 (Roche社)中に再懸濁させ、エッペンドルフ試験管に移し、過流し、 -80℃ で１．５時間、凍結させた。細胞を氷上で解凍し、室温に３分間、放置した。適宜半分解糖したときに、15μlの0.14 mg/ml H2O DNase 溶液 + 30μlの0.05M MgCl2 を各試験官に加え、試料をほぼ５分間、室温でインキュベートした。細胞を最高速で５分間、遠心分離した。100μLの上清（ライセート）を新鮮なマイクロ遠心管に移し、１００μＬのグリセロールを加えた。
15.15μLの H2O、7.5μLの 4X 緩衝液 (400mM
Tris、20mM MgCl2、4mM KCl)、0.3μLのFermentas社製FastAPTM (1u/μL) 、0.45μLの 100 mM ストックのUDP-グルコース、0.6μLの基質（ステビオール又はルブソシド）及び6μLの上記の粗酵素製剤を加えることで酵素検定を行った。UGT74G1、UGT85C2や、全４種のUGT混合物をステビオールと一緒にインキュベートした。UGT 76G1及び85C2 をルブソシドと一緒にインキュベートした。該酵素検定を一晩、３７℃でインキュベートした。4000 rpm で５分間、遠心分離した後、30μLの試料を、新鮮な96 ウェル・プレートに移し、30μLの DMSO を添加した。次に試料を LC-MS 分析にかけた。同様な
in vitro 実験を、更にステビオール 1,2-ビオシド（UGT76G1 及びUGT74G1に）又はレバウディオサイドＢ（UGT74G1に) を基質として用いて行った。
in vivo 供給では何の活性も検出されなかった。表１８は、in vitro 検定の結果を示す。
Figure 0006177127
これらの結果は、UGT酵素はすべてＥ．ｃｏｌｉ細胞で活性であることを示している。しかし、基質は容易には細胞質内に輸入されないのかも知れない。ステビオールが前駆体経路からＥ．ｃｏｌｉ内で生成されるのであれば、多様なステビオールグリコシド生成物の生成がグルコースから実現可能であろうと予測される。僅かに重複する基質特異性を有する74G1 及び85G1 UGTはステビオールから単独でルブソシドを生成することができるとは予測されない。４種の粗酵素製剤の混合物は大変低レベルのモノシドを生じたが、このことは、ジ-及びトリ-グリコシドへの転化が効率的であることを示している。UGT91D2eについては、用いられた製剤は、長期間の保存後にその元の活性のいくらかを失っていた。当該酵素の新鮮な製剤であれば高レベルのレバウディオサイドＡを生じたであろうと予測される。
実施例２２ − フィスコミトレラ-パテンスにおけるステビオールグリコシドの生成
コケ類細胞での供給実験
UGT 91d2e、74G1、76G1、及び 85C2 の遺伝子をフィスコミトレラ-パテンスに、米国特許公報No. 20100297722 に解説された pTHUbi:Gateway ベクター系を用いてクローニングした。このベクターは強力なトウモロコシユビキチンプロモーターを用いている。PCrプライマーは、開始コドンの上流に「CACC」を付加して、前記の例（天然配列）中のコーディング領域を増幅するようにデザインされた。プラスミドDNAを SwaI で消化し、プロトプラストへの導入に用いた（一般的にはほぼ0.5x106
のプロトプラスト）。所望の耐性を示す形質転換体を１日、10 mL の培養株にして成長させた後、ステビオール、ルブソシド、又は緩衝液 + DMSO のいずれかを、表１９に示すように供給した。基質を含有する緩衝液を0.5 mL、10 mL の培養株毎に加え、最終濃度 0.1% のDMSO、50μMのステビオール又は ルブソシド、及び0.125 mM
のホスフェート緩衝液を培養株に加えた。陽性コントロールでは、e YFP (黄色蛍光タンパク質) をステビオール 又は緩衝液のみ及び DMSOの存在下で発現させた。培養株を更に２日間、成長させてから細胞を分離し、更なる分析まで液体窒素中で凍結させた。いくつかの場合では複数のUGT-含有プラスミドを同じプロトプラスト細胞中に導入して、コケ細胞内で複数のステップの転化を描き出した。
Figure 0006177127
蛍光シグナル観察で測定したところ、発現はコントロール（試験管１及び２）で陽性であった。実験で得た上清をLC-MSで分析した；200μLの各上清試料を等容の50 パーセントDMSOと混合した。試料を過流し（15,700 相対遠心力、１０分間）、100 マイクロリットルのその結果の上清をLC-MSで分析した。
プロトプラスト・ペレットを氷上で解凍し、3 錠/100 ml の完全Miniプロテアーゼ阻害剤 (Roche社) を含有する10 mM Tris-HCl pH 8 を最終容積150μLに達するまで加えた。溶液を二つに分割した：75μLを新しい試験管に移し、プロトプラストをペレットにした（15,700 相対遠心力、１分間）。ペレットを75μLのMilli-Q 水で解凍してから、150μLの DMSO (50 パーセント)に再懸濁させた。次に試料を加熱し(摂氏８０℃、１０分間)、過流し、遠心分離した（15,700 相対遠心力、１０分間）。50μLのその結果の上清をLC-MSで分析した。
上清にもペレットにもステビオール グリコシド生成は全く検出できなかった。ステビオール及びルブソシドがコケ細胞内に輸送され得るかどうかは不明である。
ペレット抽出物のin vitro
供給
In vitro 供給実験を試料1、3、4、5、6、11、13 及び 17)で行った。ガラス製ビーズ
(425-600 ミクロン) を残った75μLの元の再懸濁液に加え、プロトプラストを、それぞれ２分間の３回、摂氏４度で過流させ、過流間な氷上に保存することで機械的に溶解させた。試料を過流 (15,700 相対遠心力、１０分間、摂氏４度)
し、6μLの結果的な上清を in vitro 酵素反応で用いた。酵素反応については、FastAPTM ホスファターゼ（Fermentas社）を用い（0.3 U/反応）、UDP-グルコース：基質比は５だった。試料にステビオール又はルブソシドを表２０に従って供給した。
Figure 0006177127
反応液を３０℃で一晩、インキュベートした。インキュベート後、等量のDMSO (100 パーセント)を試料に加え、混合した後、試料を過流 (15,700 相対遠心力、１０分間) し、30μLのその結果の上清をLC-MSで分析した。
LC-MS 分析では、UGT76G1によるルブソシドの1,3-ステビオシドへの転化が示された。他のステビオール
グリコシドはどれも、検出不能だった。UGTの可溶性の発現がフィスコミトレラで起きたかどうかは不明である。一つのUGT がコケ細胞で活性であれば、発現が起きれば、他も活性であろうと予測される。加えて、クローニングを一過性の態様で行った。遺伝子が安定に組み込まれれば、検査した場合にUGT活性について活性な更なるクローンが生じるであろうと期待される。
組換えタンパク質の可溶性の発現を増加させるための方法が当業者に公知である。代替的なプロモーター、リボゾーム結合部位、コドン使用率、シャペロンとの同時発現、及び、温度変化が、組換えタンパク質の可溶性発現を増加させる方法の非限定的な例である。
実施例２３ ―― アスペルギルス-ニドゥランスでのステビオールグリコシドの生成
真菌細胞におけるUGT酵素の活性
UGT 91D2e、74G1、76G1、及び85C2 の天然遺伝子をアスペルギルス-ニドゥランス中に、PCR-作成発現カセット及びUSERベクター系を用いてクローニングした。クローニング法は Hansen et al.、Appl. Environ. Microbiol. 77: 3044-3051 (2011)に解説されている。簡単に説明すると、各UGTをコードするヌクレオチド配列を、構成的PgpdAプロモーターとTtrpCターミネーターとの間に、ゲノム組込みのために付加的な二つの標的決定配列と、選択マーカーとしてのargBとを含有するベクターに入れて挿入した。プラスミドDNAをＡ．ニドゥランス・プロトプラスト内に Nielsen et al., Fungal Genet.
Biol. 43:54−64 (2006) 及び Johnstone et al., EMBO J. 4:1307-1311
(1985)に従って導入した。所望の耐性を示す形質転換体を４８時間、最小培地（1% グルコース; 10 mM
NaNO3; 鉱物混合物).を用いた150 mL 培養株にして成長させた。
菌糸体をガラス製ビーズで潰して調製した細胞ライセートを用いて、個々のUGTの活性をin vitroで判定した。74G1 及び 85C2 を発現する株の細胞ライセートを
0.5 mM ステビオールと一緒にインキュベートし、 76G1
及び91D2e を発現する株を0.5 mM ステビオール-13-O-グルコシド と一緒に２４時間、インキュベートし、その上清を更に LC/MSを用いて分析した。ステビオール グリコシドは全く検出されなかった。
UGT酵素の可溶性の発現が達成されたかどうかは不明である。なぜならこれらの生成物は典型的にはSDS-PAGE上では不可視だからである。アスペルギルス及びサッカロミセスは両者とも真菌であるため、更なる実験で活性なクローンができると予測される。組換えタンパク質の可溶性の発現を増加させる方法は当業者に公知である。代替的なプロモーター、誘導物質レベル、リボゾーム結合部位、コドン使用率、シャペロンとの同時発現、及び、温度変化が、組換えタンパク質の可溶性発現を増加させる方法の非限定的な例である。
他の実施態様
本発明をその詳細な説明と併せて解説してきたが、前述の記載は本発明の描写するものであって、限定するものとは意図されておらず、本発明の範囲は付属の請求項の範囲によって規定される。他の態様、長所、及び改変は以下の請求項の範囲内にある。

Claims (25)

  1. 細胞培養基中でステビオールグリコシド組成物を生成可能な組換えホスト細胞であって、
    （ａ）SEQ ID NO:5に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び一つ以上の；
    （ｂ）SEQ ID NO:3に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC-13ヒドロキシル基においてグリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／又は
    （ｃ）SEQ ID NO:7に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／又は
    （ｄ）SEQ ID NO:1に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC-19カルボキシル基においてグリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、
    （ｅ）SEQ ID NO:121-128に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ファルネシルジホスフェート（FPP）及びイソペンテニルジホスフェート（IPP）からゲラニルゲラニルジホスフェート（GGPP）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｆ）SEQ ID NO: 129-131に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、GGPPからent-コパリルジホスフェートを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｇ）SEQ ID NO: 132-135に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-コパリルジホスフェートからent-カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｈ）SEQ ID NO: 138-141に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレンからent-カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｉ）SEQ ID NO: 142-146に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び
    （ｊ）SEQ ID NO: 147-149に示すアミノ酸配列の一つを有するポリペプチドを含む、NADPHをNADP+に変換可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子であり、
    前記ステビオールグリコシドがステビオール-13-O-グルコシド、ステビオール-19-O-グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、1,2-ビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ又はレバウディオサイドＥを含み；及び
    前記ステビオールグリコシド組成物がステビオール-13-O-グルコシド、ステビオール-19-O-グルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ，レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ又はダルコシドＡを含む、組換えホスト細胞。
  2. （ａ）前記ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC-13ヒドロキシル基においてグリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:3の残基9、10、13、15、21、27、60、65、71、87、91、220、243、270、289、298、334、336、350、368、389、394、397、418、420、440、441、444、及び471に一つ以上のアミノ酸置換を含むか、または
    （ｂ）前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又は前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に一つ以上のアミノ酸置換を含むか、または
    （ｃ）前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:5に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する、
    請求項１に記載の組換えホスト細胞。
  3. 前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが：
    （ａ）SEQ ID NO:5の残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は387-473に少なくとも一つのアミノ酸置換；
    （ｂ）SEQ ID NO:5の残基30、93、99、122、140、142、144、148、152、153、156、195、196、199、206、207、211、213、221、286、343、364、384、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基にアミノ酸置換；
    （ｃ）SEQ ID NO:5の残基206にアルギニン、残基207にシステイン、及び残基343にアルギニン；
    （ｄ）SEQ ID NO:5の残基30にフェニルアラニン、残基93にグルタミン、残基99にバリン、残基122にフェニルアラニン、残基140にチロシン、残基142にシステイン、残基144にイソロイシン、残基148にスレオニン、残基152にロイシン、残基153にアラニン、残基156にセリン、残基195にメチオニン、残基196にグルタミン酸、残基199にグルタミン酸、残基211にメチオニン、残基213にフェニルアラニン、残基221にフェニルアラニン、残基286にアラニン、残基364にプロリン、残基384にシステイン、残基427にアスパラギン、又は残基438にアラニン；
    （ｅ）SEQ ID NO:95のアミノ酸配列；
    （ｆ）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列；又は
    （ｇ）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列
    を備えたポリペプチドを含む、請求項１または２に記載の組換えホスト細胞。
  4. 前記ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのC-13ヒドロキシル基においてグリコシル化可能なポリペプチドが：
    （ａ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基13、60、及び270のうちの一つ以上に置換；
    （ｂ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基60及び87のうちの一つ以上に置換；
    （ｃ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65、71、220、243、及び270のうちの一つ以上に置換；
    （ｄ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65、71、220、243、270、及び441のうちの一つ以上に置換；
    （ｅ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65、71、220、389、及び394のうちの一つ以上に置換；
    （ｆ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65、71、270、及び289のうちの一つ以上に置換；
    （ｇ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基15及び65のうちの一つ以上に置換；
    （ｈ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65及び270のうちの一つ以上に置換；
    （ｉ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65及び440のうちの一つ以上に置換；
    （ｊ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65及び441のうちの一つ以上に置換；
    （ｋ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基65及び418のうちの一つ以上に置換；
    （ｌ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基220、243、270、及び334のうちの一つ以上に置換；
    （ｍ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基270及び289のうちの一つ以上に置換；又は
    （ｎ）SEQ ID NO:3の以下のアミノ酸残基13、15、60、270、289、及び418のうちの一つ以上に置換
    を含む、請求項１に記載の組換えホスト細胞。
  5. 前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又は前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが：
    （ａ）SEQ ID NO:7の以下のアミノ酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、及び291のうちの一つ以上に置換；
    （ｂ）SEQ ID NO:7の以下のアミノ酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、及び291のうちの一つ以上に置換；又は
    （ｃ）SEQ ID NO:7の以下のアミノ酸残基74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346のうちの一つ以上に置換；
    を含む、請求項１に記載の組換えホスト細胞。
  6. 前記ホスト細胞が更に以下：
    （ａ）GGPPからent-コパリルジホスフェートを合成可能及びent-コパリルジホスフェートからent-カウレンを合成可能な二官能性のポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｂ）切断型HMG-CoAポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｃ）ラムノースシンセターゼポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｄ）UDP-グルコースデヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする遺伝子；及び
    （ｅ）UDP-グルクロン酸デカルボキシラーゼポリペプチドをコードする遺伝子
    を含む、請求項１乃至５のいずれか一つに記載の組換えホスト細胞。
  7. (a)、(b)、(c)、又は(d)の遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子である、請求項６に記載の組換えホスト細胞。
  8. 請求項１−７のいずれか一つに記載の組換えホスト細胞を使用する、ステビオールグリコシド組成物を製造する方法であって、前記組成物が、
    （ａ）重量で総ステビオールグリコシドの４％を超えるレバウディオサイドＤと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；
    （ｂ）重量で総ステビオールグリコシドの４％を超えるレバウディオサイドＥと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；
    （ｃ）重量で総ステビオールグリコシドの１５％を超えるレバウディオサイドＣと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；
    （ｄ）重量で総ステビオールグリコシドの１５％を超えるダルコシドＡと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；
    （ｅ）重量で総ステビオールグリコシドの４％を超えるレバウディオサイドＦと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；又は
    （ｆ）重量で総ステビオールグリコシドの３％を超えるレバウディオサイドＢと、植物由来ステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分；
    を含む方法。
  9. （ａ）一つ以上の遺伝子が発現する条件下で請求項１乃至７のいずれか一つに記載の組換えホスト細胞を培養基中で成長させるステップであって、該成長が前記遺伝子の発現を誘導することができる、ステップと；
    （ｂ）（ｉ）前記組換えホスト細胞が産生したステビオール又はステビオールグリコシドを回収するステップであって、前記ステビオールグリコシドが、ステビオール-13-O-グルコシド、ステビオール-19-Oグルコシド、ルブソシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、又はダルコシドＡを含む、ステップ；又は
    （ｂ）（ｉｉ）前記組換えホスト細胞が産生したステビオール又はステビオールグリコシド組成物を回収するステップであって、前記組成物が、野生型ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比べてレバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＢ、レバウディオサイドＣ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＦ、又はダルコシドＡを濃縮されており、植物由来ステビア抽出物に対して減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分を有する、ステップ；
    を含む、ステビオール、ステビオールグリコシド、又はステビオールグリコシド組成物を調製する方法。
  10. 細胞培養基中でステビオールグリコシド組成物を生成可能な組換えホスト細胞であって、
    （ａ）ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドであって、前記ステビオールグリコシドで第二の糖部分をグルコースのC-2’に移すポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｂ）ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドであって、前記ステビオールグリコシドで第二の糖部分をグルコースのC-2’に移すポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｃ）ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／又は
    （ｄ）ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、
    （ｅ）SEQ ID NO:121-128に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ファルネシルジホスフェート（FPP）及びイソペンテニルジホスフェート（IPP）からゲラニルゲラニルジホスフェート（GGPP）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｆ）SEQ ID NO: 129-131に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、GGPPからent-コパリルジホスフェートを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｇ）SEQ ID NO: 132-135に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-コパリルジホスフェートからent-カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｈ）SEQ ID NO: 138-141に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレンからent-カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｉ）SEQ ID NO: 142-146に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び
    （ｊ）SEQ ID NO: 147-149に示すアミノ酸配列の一つを有するポリペプチドを含む、NADPHをNADP+に変換可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子であり、
    前記ステビオールグリコシドがステビオール-13-O-グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、又はレバウディオサイドＡを含み；及び
    前記ステビオールグリコシド組成物がステビオシド、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＤ、ステビオール-1,2ビオシド、ステビオール-1,2-キシロビオシド、及び／又はステビオール-1,2-ラムノビオシドを含む、組換えホスト細胞。
  11. （ａ）前記ステビオールグリコシドがルブソシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにステビオシドが生成され、
    （ｂ）前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＥが生成され、
    （ｃ）前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、前記ステビオシドがステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及びステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドに接触され、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＤが生成され、
    （ｄ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにステビオール-1,2ビオシドが生成され、
    （ｅ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がキシロースであり、そして第二の糖部分が移動するときにステビオール-1,2-キシロビオシドが生成され、
    （ｆ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がラムノースであり、そして第二の糖部分が移動するときにステビオール-1,2-ラムノビオシドが生成され、又は、
    （ｇ）前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドＡであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＤが生成される、請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
  12. （ａ）前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:5,76,78又は150に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または
    （ｂ）前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:7に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または
    （ｃ）前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に一つ以上のアミノ酸置換を含む、
    請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
  13. 前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが、
    （ａ）SEQ ID NO:5の残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は 387-473に少なくとも一つのアミノ酸置換；
    （ｂ）SEQ ID NO:5の残基30、93、99、122、140、142、144、148、152、153、156、195、196、199、206、207、211、213、221、286、343、364、384、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基にアミノ酸置換；
    （ｃ）SEQ ID NO:5の残基206にアルギニン、残基207にシステイン、及び残基343にアルギニン；
    （ｄ）SEQ ID NO:5の残基30にフェニルアラニン、残基93にプロリン又はグルタミン、残基99にセリン又はバリン、残基122にチロシン又はフェニルアラニン、残基140にヒスチジン又はチロシン、残基142にセリン又はシステイン、残基148にアラニン又はスレオニン、残基152にメチオニン、残基153にアラニン、残基156にアラニン又はセリン、残基162にグリシン、残基195にロイシン又はメチオニン、残基196にグルタミン酸、残基199にリシン又はグルタミン酸、残基211にロイシン又はメチオニン、残基213にロイシン、残基221にセリン又はフェニルアラニン、残基253にバリン又はイソロイシン、残基286にバリン又はアラニン、残基427にアスパラギン又はリシン、又は残基438にアラニン、及び残基462にアラニン又はスレオニン；
    （ｅ）SEQ ID NO:95のアミノ酸配列；
    （ｆ）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列；又は
    （ｇ）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列
    を含む、請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
  14. 前記細胞培養基が、
    （ａ）前記組換えホスト細胞により生成された前記ステビオールグリコシド組成物であって、ステビオシド、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＤ、ステビオール-1,2ビオシド、ステビオール-1,2-キシロビオシド、及び／又はステビオール-1,2-ラムノビオシドを含むステビオールグリコシド組成物；
    （ｂ）グルコース、ウリジンジホスフェート（UDP）-グルコース、UDPラムノース、UDP-キシロース、及び／又はN-アセチル-グルコサミン；及び／又は
    （ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原基礎培地(YNB)及び／又はアミノ酸を含む補助栄養素
    を含む、請求項１０に記載の組換えホスト細胞。
  15. 細胞培養基中でステビオールグリコシド組成物を生成する方法であって、組換えホスト細胞を成長させる段階を含み、前記組換えホスト細胞が、
    （ａ）ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドであって、前記ステビオールグリコシドで第二の糖部分をグルコースのC-2’に移すポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｂ）ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドであって、前記ステビオールグリコシドで第二の糖部分をグルコースのC-2’に移すポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｃ）ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び／又は
    （ｄ）ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、
    （ｅ）SEQ ID NO:121-128に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ファルネシルジホスフェート（FPP）及びイソペンテニルジホスフェート（IPP）からゲラニルゲラニルジホスフェート（GGPP）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｆ）SEQ ID NO: 129-131に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、GGPPからent-コパリルジホスフェートを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｇ）SEQ ID NO: 132-135に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-コパリルジホスフェートからent-カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｈ）SEQ ID NO: 138-141に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレンからent-カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    （ｉ）SEQ ID NO: 142-146に示すアミノ酸配列の一つに対して９０％を超える配列同一性を有するポリペプチドを含む、ent-カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子；及び
    （ｊ）SEQ ID NO: 147-149に示すアミノ酸配列の一つを有するポリペプチドを含む、NADPHをNADP+に変換可能なポリペプチドをコードする遺伝子；
    を含み、前記遺伝子のうちの少なくとも一つが組換え遺伝子であり、
    一つ以上の遺伝子（ａ）〜（ｄ）およびすべての遺伝子（ｅ）〜（ｊ）が発現される条件の下で、前記ステビオールグリコシド組成物が前記ホスト細胞によって生成され、
    前記ステビオールグリコシドがステビオール-13-O-グルコシド、ルブソシド、ステビオシド、又はレバウディオサイドＡを含み；及び
    前記ステビオールグリコシド組成物がステビオシド、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＤ、ステビオール-1,2ビオシド、ステビオール-1,2-キシロビオシド、及び／又はステビオール-1,2-ラムノビオシドを含む、方法。
  16. 前記組換えホスト細胞を成長させる段階が、一つ以上の遺伝子の発現を誘導すること、又は一つ以上の遺伝子を恒常的に発現させることを含む、請求項１５に記載の方法。
  17. （ａ）前記ステビオールグリコシドがルブソシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにステビオシドが生成され、
    （ｂ）前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＥが生成され、
    （ｃ）前記ステビオールグリコシドがステビオシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、前記ステビオシドがステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及びステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドに接触され、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＤが生成され、
    （ｄ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにステビオール-1,2ビオシドが生成され、
    （ｅ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がキシロースであり、そして第二の糖部分が移動するときにステビオール-1,2-キシロビオシドが生成され、
    （ｆ）前記ステビオールグリコシドがステビオール13-O-グルコシドであり、前記第二の糖部分がラムノースであり、そして第二の糖部分が移動するときにステビオール-1,2-ラムノビオシドが生成され、又は、
    （ｇ）前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドＡであり、前記第二の糖部分がグルコースであり、そして第二のグルコース部分が移動するときにレバウディオサイドＤが生成される、請求項１５に記載の方法。
  18. （ａ）前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:5,76,78又は150に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または
    （ｂ）前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:7に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むか、または
    （ｃ）前記ステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC3’のベータ1,3グリコシル化可能なポリペプチドが、SEQ ID NO:7の残基29、74、87、91、116、123、125、126、130、145、192、193、194、196、198、199、200、203、204、205、206、207、208、266、273、274、284、285、291、330、331、及び346に一つ以上のアミノ酸置換を含む、
    請求項１５に記載の方法。
  19. 前記ステビオールグリコシドの13-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチド及び／又はステビオールグリコシドの19-O-グルコースのC2’のベータ1,2グリコシル化可能なポリペプチドが、
    （ａ）SEQ ID NO:5の残基1-19、27-38、44-87、96-120、125-141、159-184、199-202、215-380、又は387-473に少なくとも一つのアミノ酸置換；
    （ｂ）SEQ ID NO:5の残基30、93、99、122、140、142、144、148、152、153、156、195、196、199、206、207、211、213、221、286、343、364、384、427、及び438から成る群より選択される一つ以上の残基にアミノ酸置換；
    （ｃ）SEQ ID NO:5の残基206にアルギニン、残基207にシステイン、及び残基343にアルギニン；
    （ｄ）SEQ ID NO:5の残基30にフェニルアラニン、残基93にプロリン又はグルタミン、残基99にセリン又はバリン、残基122にチロシン又はフェニルアラニン、残基140にヒスチジン又はチロシン、残基142にセリン又はシステイン、残基148にアラニン又はスレオニン、残基152にメチオニン、残基153にアラニン、残基156にアラニン又はセリン、残基162にグリシン、残基195にロイシン又はメチオニン、残基196にグルタミン酸、残基199にリシン又はグルタミン酸、残基211にロイシン又はメチオニン、残基213にロイシン、残基221にセリン又はフェニルアラニン、残基253にバリン又はイソロイシン、残基286にバリン又はアラニン、残基427にアスパラギン又はリシン、又は残基438にアラニン、及び残基462にアラニン又はスレオニン；
    （ｅ）SEQ ID NO:95のアミノ酸配列；
    （ｆ）SEQ ID NO:5のアミノ酸配列；又は
    （ｇ）SEQ ID NO:10のアミノ酸配列
    を含む、請求項１５に記載の方法。
  20. 前記レバウディオサイドＤを単独又は少なくとも一つの他の前記ステビオールグリコシドと一緒に前記細胞培養基から分離する段階をさらに含み、
    前記分離する段階が、
    （ａ）前記レバウディオサイドＤを単独又は少なくとも一つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む細胞培養基を用意するステップ；
    （ｂ）固相の細胞培養基から液相の細胞培養基を分離し、レバウディオサイドＤを単独又は少なくとも一つの他のステビオールグリコシドと一緒に含む上清を取得するステップ；
    （ｃ）充填塔内の吸収性樹脂の提供を含む、一つ以上の吸収性樹脂を提供するステップ；及び
    （ｄ）レバウディオサイドＤの少なくとも一部を単独又は少なくとも一つの他のステビオールグリコシドと一緒に取得するために、ステップ（ｂ）の前記上清を前記一つ以上の吸収性樹脂に接触させることによって、レバウディオサイドＤを単独又は少なくとも一つの他のステビオールグリコシドと一緒に分離するステップ；
    を含む、請求項１５に記載の方法。
  21. レバウディオサイドＤを含む前記ステビオールグリコシドを単独又は少なくとも一つの他のステビオールグリコシドと一緒に前記細胞培養基から回収する段階をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
  22. 前記ステビオールグリコシド組成物が、レバウディオサイドＤのためにステビア植物のステビオールグリコシド組成物に比べて濃縮されるとともに、植物由来のステビア抽出物に比べて減少したレベルの非ステビオールグリコシドステビア植物由来成分を有する、請求項８、９および１５〜２１のいずれか一つに記載の方法。
  23. 前記細胞培養基が、
    （ａ）組換えホスト細胞により生成されたステビオールグリコシド組成物であって、ステビオシド、レバウディオサイドＥ、レバウディオサイドＤ、ステビオール-1,2ビオシド、ステビオール-1,2-キシロビオシド、及び／又はステビオール-1,2-ラムノビオシドを含むステビオールグリコシド組成物；
    （ｂ）グルコース、フルクトース、及び／又はスクロース；及び／又は
    （ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素原基礎培地(YNB)及び／又はアミノ酸を含む補助栄養素；
    を含む、請求項９および１５〜２１のいずれか一つに記載の方法。
  24. 前記組換えホスト細胞が酵母細胞であり、ここで、
    前記酵母細胞が、サッカロミセス-セレビジエ、スキゾサッカロミセス-ポンベ、ヤロウィア-リポリティカ、カンジダ-グラブラタ、アシュビア-ゴシピー、サイバリンドネレラ-ジャディニー、ピチア-パストリス、クルイベロミセス-ラクティス、ハンセニュラ-ポリモルファ、カンジダ-ボイディニー、アクスラ-アデニニボランス、キサントフィロミセス-デンドローホウス、又はカンジダ-アルビカンス種から選択される酵母細胞であるか、または
    前記酵母細胞が、サッカロミセス属であるか、または
    前記酵母細胞が、サッカロミセス-セレビジエ種から選択される細胞である、
    請求項９および１５〜２１のいずれか一つに記載の方法。
  25. 前記組換えホスト細胞を所望の温度で所望の時間、発酵槽内で成長させ、前記温度及び時間がステビオールグリコシド組成物の生成を促進する、請求項８、９および１５〜２１のいずれか一つに記載の方法。
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