DE60036477T2

DE60036477T2 - Isoprenoid biosynthese

Info

Publication number: DE60036477T2
Application number: DE60036477T
Authority: DE
Inventors: Adelbert Bacher; Meinhart H. Saint Louis ZENK; Wolfgang Eisenreich; Monika Fellermeier; Markus Fischer; Stefan Hecht; Stefan Herz; Klaus Kis; Holger LÜTTGEN; Felix Rohdich; Silvia Sagner; Christoph A. Schuhr; Juraithip Wungsintaweekul
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-04
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2008-06-12
Anticipated expiration: 2020-08-04
Also published as: US7122331B1; AU6280300A; EP1198575A1; WO2001011055A1; EP1198575B1; ATE373715T1; US20070015216A1; DE60036477D1; US7534742B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Isoprenoidbiosynthese und insbesondere auf Intermediate, die in der Isoprenoidbiosynthese involviert sind, sowie auf Screeningmethoden zum Affinden von Inhibitoren von Enzymen in der Isoprenoidbiosynthese.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Durch die klassischen Untersuchungen von Bloch, Cornforth, Lynen und Mitarbeitern wurden Isopentenylpyrophosphat (IPP) und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) als Schlüsselintermediate der Biosynthese von Isoprenoiden über Mevalonsäure nachgewiesen. Bakterien, Pflanzen und das Protozoon Plasmodium falciparum synthetisieren Isoprenoide auf einem alternativen Biosyntheseweg über 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat. Dieser Biosyntheseweg wurde bisher erst teilweise erforscht (1), aber seine Abwesenheit in tierischen Zellen macht ihn zu einem idealen Ziel für Pestizide oder für medizinische Zwecke. Weiterhin reduziert die idiosynkratische Natur der Reaktionen in diesem Biosyntheseweg das Risiko von Kreuzhemmungen anderer Enzyme, insbesondere von Säugetierenzymen. Für ein genaueres Verständnis dieser Erfindungsaspekte wird der Biosyntheseweg im folgenden kurz erklärt. Er beginnt mit der Kondensation von Pyruvat (1) mit Glyceraldehyd-3-phosphat (2) zu 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat (DXP, 3). Anschließend wird DXP in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (4) umgewandelt durch eine Zweistufenreaktion, die eine Umlagerung und eine Reduktion umfasst. Die anschließenden Schritte zu Isoprenoiden sind bisher nicht erforscht worden. Es kann aber angenommen werden, dass der Biosyntheseweg Intermediate vom Typus des IPP und DMAPP enthält. Auf jeden Fall sind der Biosyntheseweg und insbesondere die nachfolgenden enzymatischen Reaktionsschritte ideale Ziele für das Screening von Inhibitoren in chemischen Bibliotheken.
Der Mevalonat-unabhängige Biosyntheseweg (alternativer Isoprenoidbiosyntheseweg), mit dem sich die vorliegende Erfindung befasst, erzeugt die zentrale C₅-Verbindung (IPP und/oder DMAPP oder eine äquivalente Verbindung), von welcher sich alle höheren, durch stromab gelegene Biosynthesewege Isoprenoide ableiten. Höhere Isoprenoide werden Terpenoide genannt. Darum ist jeder Inhibitor eines Enzyms des Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweges auch gleichzeitig ein Inhibitor aller sich anschließenden Isoprenoidbiosynthesewege, d.h. ein Inhibitor der Terpenoidbiosynthesewege.
Wo immer eine phosphorylierte Verbindung oder eine Carbonsäureverbindung erwähnt ist, kann diese als freie Säure oder als Salz, wobei mindestens ein Proton durch ein Ammonium- oder ein Metallion oder ein organisches Kation ersetzt ist, vorliegen. Das Metallion kann ein Alkalimetall- oder ein Erdalkalimetallion sein. Das organische Kation kann von einem Amin abgeleitet sein. Es mag ein Sulfonium-, oder ein Guanidinium- oder ein Heteroaromatenion sein. Solch eine phosphorylierte Verbindung wird in wässriger Lösung im Dissoziationsgleichgewicht vorliegen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung funktioneller Enzyme zum Screening chemischer Bibliotheken nach Inhibitoren des Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-MethylD-erythritol-4-phosphat. Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Verwndung gemäß den Ansprüchen 1 bis 6.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren für das Screening in chemischen Bibliotheken nach Inhibitoren eines Enzyms im alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Screening-Verfahren gemäß den Ansprüchen 7 bis 9.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Intermediaten im alternativen Isoprenoidbiosyntheseweg, welche Produkte der Enzyme sind, die in den Ansprüchen 1 bis 6 definiert sind. Diese Aufgabe wird erreicht durch die chemischen Verbindungen entsprechend den Ansprüchen 10 bis 12 und durch die Herstellungsmethoden unter Verwendung der entsprechenden Enzyme. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Intermediate als Substrat für das Screening von Inhibitoren des Isoprenoidbiosynthesewegs. Diese Aufgabe wird gelöst gemäß Anspruch 13.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer ökonomischen Methode für die effiziente Herstellung der Intermediate ausgehend von leicht zugänglichem Ausgangsmaterial.
Diese Aufgabe ist durch das Verfahren nach Anspruch 14 gelöst. Das Verfahren kann für die Herstellung des benötigten Produktes mit jeder benötigten Isotopenmarkierung benutzt werden.
Mit den Erkenntnissen dieser Erfindung wird das Gesamtschema des Mevalonat-unabhängigen alternativen Isoprenoidbiosyntheseweges erkennbar, welches aus 3 Segmenten besteht. Das erste Segment bis zu 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphat (bereits früher bekannt) umfasst die Bildung des Isoprenoidkohlenstoffskeletts. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit dem zweiten Segment, in welchem alle drei Phosphorylierungsschritte der Aktivierung in der Form des 2,4-Cyclopyroposphats dienen, die für das sich anschließende Segment notwendig ist. Dies zeigt die funktionelle Kohärenz und Einheitlichkeit dieser Erfindung. Das dritte Segment betrifft die unbekannten Reduktions- und Eliminierungsschritte für die Bildung von IPP, DMAPP oder einer äquivalenten Verbindung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN UND ANNEXES
1 zeigt den bereits früher bekannten Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg.
2 zeigt die enzymatischen Schritte, aufgrund von YgbP und YchB, stromab vom bereits früher bekannten Mevalonat-unabhängigen Biosyntheseweg in 1.
3 zeigt den dritten enzymatischen Schritt, aufgrund YgbB, stromab vom Biosyntheseweg in 2.
Annex A zeigt ein Alignment von YgbP und YgbB aus verschiedenen Organismen.
Annex B zeigt ein Alignment von YchB aus verschiedenen Organismen.
Annex C zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenz der klonierten cDNA von YgbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz) und der Aminosäuresequenz des YgbP-Genproduktes gefunden in der Datenbank (siehe Tabelle 1).
Annex Da zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von YgbP aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Db zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von YgbP aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ea zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (ohne Leadersequenz).
Annex Eb zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von ychB aus A. thaliana (mit Leadersequenz).
Annex Ec zeigt ein Alignment der Wildtypen Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum (ohne Leadersequenz) und der Nukleotidsequenz von ychB aus L. esculentum adaptiert für E. coli Codongebrauch für hochexprimierte Gene (ohne Leadersequenz).
Annex F1 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO113.
Annex F2 zeigt die Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO-SB-H6-ACYC184.
Annex G zeigt die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz von YgbB aus P. falciparum.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Biosyntheseweg
Wir haben überraschenderweise entdeckt, daß das nächste Intermediat stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat das 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (5) (2) ist. Auf der Grundlage dieses Befunds haben wir gezeigt, dass dieses Intermediat aus 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und CTP biosynthetisiert wird. Wir haben außerdem ein Escherichia coli Protein in enzymatisch funktioneller Form für diese Umwandlung produziert. Dieses Enzym wird als 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase bezeichnet. Die Aminosäuresequenz dieses Enzyms und die korrespondierende DNA-Sequenz sind als nicht annotierter, offener Leserahmen enthalten im Genom von E. coli unter der Bezeichnung ygbP (Accessions-Nr. gb AE000358). Die DNA entsprechend diesem offenen Leserahmen (ORF) wurde isoliert und in einen Vektor hoher Kopienzahl kloniert, und mit diesem Vektorkonstrukt wurden E. coli Zellen transformiert. Überraschenderweise wurde das korrespondierende Genprodukt in 12 getesteten rekombinanten E. coli Klonen in löslicher Form exprimiert in einer Menge entsprechend etwa 10 % des gesamten löslichen Zellproteins. Dies wurde durch SDS-PAGE festgestellt. Weiterhin zeigten Zellextrakte von 4 geprüften rekombinanten Klonen Aktivität entsprechend der Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aus CTP und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Diese spezifische Aktivität war mindestens 100-fach höher im Vergleich mit Extrakten von E. coli Wildtyp-Zellen.
Wir haben weiterhin Sequenzen mit hoher Homologie zu ygbP in einer Anzahl von Bakterien, in Arabidopsis thaliana sowie in Plasmodium falciparum nachgewiesen durch BLAST Search in GenBank sowie in der Datenbank kompletter und inkompletter Genome. Wir haben dadurch einen Weg eröffnet für die Expression funktioneller Formen des YgbP Proteins in jedem der genannten oder in anderen Organismen. Insbesondere wurde die cDNA entsprechend dem ORF von Arabidopsis thaliana (siehe Tabelle 1) isoliert und in einen Expressionsvektor hoher Kopienzahl kloniert und das korrespondierende Genprodukt wurde in enzymatisch aktiver Form heterolog in E. coli exprimiert.
Wir haben weiterhin gezeigt, dass ygbP in Bakterien häufig in einem Operon enthalten ist, dem direkt anschließend ein offener Leserahmen (bezeichnet als ygbB in E. coli) in kurzem Abstand oder sogar überlappend nachfolgt. Wir haben weiterhin gezeigt, dass die Proteine YgbP und YgbB in einigen Bakterien fusioniert sind unter Ausbildung eines bifunktionellen Enzyms. Ein enzymatisch bifunktionelles Protein kann eine N-terminale Domäne mit der Funktion der Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aus Cytidintriphosphat und 2C-methyl-D-erythritol 4-phosphat sowie eine C-terminale Domäne mit der Funktion der Umwandlung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder der Funktion der Umwandlung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphat in 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclopyrophosphat und CMP aufweisen. In Übereinstimmung mit diesen Befunden haben wir festgestellt, dass YgbB als Enzym wirksam wird im alternativen Terpenoidbiosyntheseweg unmittelbar stromab von YgbP, wobei es 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol umsetzt (2). Die DNA entsprechend dem ORF ygbB im Genom von E. coli wurde isoliert, in einen Vektor hoher Kopienzahl kloniert und das entsprechende Genprodukt wurde in E. coli in enzymatisch aktiver Form exprimiert.
Die Bezeichnungen YgbP und YgbB im E. coli Genom werden im Folgenden auch für die homologen Enzyme in anderen Organismen gebraucht. Eine Gruppe von zu ygbB und YgbP homologen offenen Leserahmen in anderen Organismen ist in Tabelle 1 aufgeführt. Ein Alignment der Aminosäuresequenzen des korrespondierenden Genprodukts zeigt Annex A. Das Alignment wurde mit dem Pileup Programm konstruiert unter Benutzung der Standardeinstellung (Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin). Es wurde editiert mit dem GeneDoc Programm (http://www.com/~ketchup/genedoc.shtml). Die Namen der Organismen stehen abgekürzt auf der linken Seite des Alignments entsprechend Tabelle 1. Aminosäurereste sind im IUPAC Einbuchstabencode geschrieben und sind für Referenzzwecke fortlaufend nummeriert am oberen Ende jeder Alignmentseite. Die funktionelle YgbP Domäne erstreckt sich von Rest 1 bis ungefähr Rest 360, und die funktionelle YgbB Domäne erstreckt sich ungefähr von Rest 360 bis zum Ende. Die fortlaufende Gesamtzahl für jede Aminosäuren ist in der rechten Kolonne des Alignments für jede Zeile angegeben. Lücken im Alignment werden durch einen Bindestrich (–) symbolisiert. Die Symbole < und > bezeichnen ein Fragment. Das Symbol \\ bezeichnet einen C-Terminus. Das Symbol * bezeichnet ein Stopcodon resultierend aus einer Leserasterverschiebung. Im Falle eines Fragmentes sind die Sequenzen zu Beginn und am Ende unvollständig aufgrund der Tatsache, dass diese durch das BLAST Programm zum Auffinden der Sequenzen aus der Datenbank unkompletter Genome ignoriert werden. Sie können vollständig ausgehend von der entsprechenden Nucleotidsequenz erhalten werden, indem man bis zum Startcodon ATG (oder GTG oder CTG) vorwärtsschreitet und rückwärts bis zum Stopcodon geht.
Wir haben überraschenderweise entdeckt, daß die nächsten Intermediate stromab von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol das 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (6) (2) und das 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (7) (3) sind. Auf der Grundlage dieses Befunds haben wir bewiesen, dass 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aus 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und ATP biosynthetisiert wird. Wir haben außerdem ein Escherichia coli Protein in einer enzymatisch funktioneller Form für diese Umwandlung produziert. Dieses Enzym wird als 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Kinase bezeichnet. Wir haben ebenso gefunden, dass das oben erwähnte YgbB-Protein 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und CMP (7) (3) umwandelt. Die Aminosäuresequenz des YchB-Enzyms und die korrespondierende DNA-Sequenz sind als unannotierter, offener Leserahmen enthalten im Genom von E. coli unter der Bezeichnung ychB (Accessions-Nr. gb AE000219). Die DNA entsprechend diesem offenen Leserahmen (ORF) wurde isoliert und in einen Vektor hoher Kopienzahl kloniert, und mit diesem Vektorkonstrukt wurden E. coli Zellen transformiert. Überraschenderweise wurde das korrespondierende Genprodukt in 6 getesteten rekombinanten E. coli Klonen in löslicher Form exprimiert in einer Menge entsprechend etwa 10 % des gesamten löslichen Zellproteins. Dies wurde durch SDS-PAGE festgestellt. Weiterhin zeigten Zellextrakte von 4 geprüften rekombinanten Klonen Aktivität entsprechend der Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aus ATP und 4-Diphosphocytidyl-2C-Methyl-D-erythritol. Diese spezifische Aktivität war mindestens 100fach höher im Vergleich mit Extrakten von E. coli Wildtyp-Zellen.
Wir haben weiterhin Sequenzen mit hoher Homologie zu ychB in einer Anzahl von Bakterien, in Arabidopsis thaliana sowie in Lycopersicon esculentum (Tomate) nachgewiesen durch BLAST Search in GenBank sowie in der Datenbank kompletter und inkompletter Genome. Die orthologe cDNA-Sequenz pTOM41 aus Tomate (gb Accessions-Nr. U62773) wurde als reifungsassoziiertes Transkriptionsprodukt beschrieben.
Wir haben dadurch einen Weg eröffnet für die Expression funktioneller Formen des YchB-Proteins in jedem der genannten oder in anderen Organismen. Insbesondere wurde die cDNA entsprechend dem ORF von Arabidopsis thaliana (gb Accessions-Nr. AC005168) isoliert und in einen Expressionsvektor hoher Kopienzahl kloniert.
Die Bezeichnung YchB im E. coli Genom wird im Folgenden auch für die orthologen Enzyme in anderen Organismen gebraucht. Die Gruppe an zu ychB homologen Leserahmen in anderen Organismen ist in Tabelle 2 aufgeführt. Ein Alignment der Aminosäuresequenzen des korrespondierenden Genprodukts zeigt Annex B. Das Alignment wurde mit dem Pileup Programm konstruiert unter Benutzung der Standardeinstellung (Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin). Es wurde editiert mit dem GeneDoc Programm (http://www.com/~ketchup/genedoc.shtml). Die Namen der Organismen stehen abgekürzt auf der linken Seite des Alignments entsprechend Tabelle 2. Aminosäurereste sind im IUPAC Einbuchstabencode geschrieben und sind für Referenzzwecke fortlaufend nummeriert am oberen Ende jeder Alignmentseite. Die fortlaufende Gesamtzahl für jede Aminosäuren ist in der rechten Kolonne des Alignments für jede Zeile angegeben. Lücken im Alignment werden durch einen Bindestrich (–) symbolisiert. Die Symbole < und > bezeichnen ein Fragment. Das Symbol \\ bezeichnet einen C-Terminus. Das Symbol * bezeichnet ein Stopcodon resultierend aus einer Leserasterverschiebung. Im Falle eines Fragmentes sind die Sequenzen zu Beginn und am Ende unvollständig aufgrund der Tatsache, dass diese durch das BLAST Programm zum Auffinden der Sequenzen aus der Datenbank unkompletter Genome ignoriert werden. Sie können vollständig ausgehend von der entsprechenden Nucleotidsequenz erhalten werden, indem man bis zum Startcodon ATG (oder GTG oder CTG) vorwärtsschreitet und rückwärts bis zum Stopcodon geht.
Mit diesen funktionellen Zuordnungen von YgbP, YchB und YgbB und mit der Herstellung von Proteinen mit enzymatisch aktiven Faltungsstrukturen haben wir diese Proteine sowie die gereinigte, isolierte für diese Proteine codierende DNA erstmals in den Bestand der technischen Kenntnis für technische und kommerzielle Nutzung als neue Verbindungen eingeführt. Gleichzeitig werden damit Wege eröffnet für die Herstellung der Produkte der enzymatischen Reaktion von YgbP, YchB und YgbB, nämlich 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-cyclopyrophosphat oder deren Salze, insbesondere Salze mit Alkalimetallen, wie Li, K, Na, oder Ammoniak oder Amine, und für deren Nutzung in verschiedenen in vitro Reaktionen des einem nachfolgenden Reaktionsschritt im alternativen Weg der Isoprenoidbiosynthese.
Auf der Grundlage dieser Fortschritte haben wir neue Wege eröffnet für die Hemmung des alternativen Terpenoidwegs in Pflanzen ebenso wie in Bakterien und in Protozoen, wie z.B. Plasmodium.
Die Enzyme YgbP und YgbB und ebenso YchB oder größere Kernfragmente dieser Enzyme aus unterschiedlichen Organismen sind im Annex A und Annex B kompiliert. Auf der Grundlage dieses Alignments kann eine große, aber endliche Klasse von Enzymsequenzen mit den Funktionen von YgbP, YgbB und YchB definiert werden auf der Grundlage der Aminosäurevariabilität, die für jede Position im Alignment angegeben wird. Für ein beliebiges Protein dieser Klasse kann die Menge der möglichen äquivalenten Aminosäuren an jeder Position unmittelbar eindeutig und individuell aus Annex A und Annex B entnommen werden. Damit wird die ausreichende Funktionsfähigkeit mit hoher Wahrscheinlichkeit abgesichert.
Alternativ wird für jedes Gen eine orthologe Sequenzklasse mittels Nucleinsäurehybridisierung von cDNA oder genomischer DNA oder RNA unter Bedingungen mittlerer Stringenz (wie eine wässrige Lösung von 2 × SSC bei 65 °C) festgelegt.
Vorzugsweise sind die in den Ansprüchen 1 bis 6 definierten Proteine und die entsprechenden Nukleinsäuren pflanzlichen Ursprungs, insbesondere aus Arabidopsis thaliana oder Lycopersicon esculentum. Alternativ können sie bakteriellen Ursprungs sein. Alternativ können sie aus Protozoen, insbesondere aus Plasmodium, stammen.
Wir haben festgestellt, dass in Pflanzen, insbesondere Arabidopsis thaliana die zu YgbP, YchB und YgbB homologen Enzyme ein Signalpeptid besitzen, welche in bakteriellen Enzymen nicht vorkommt. Dieses Signalpeptid dient dem Transport des Enzyms in Plastiden. Diese spezifische Signalsequenz kann ersetzt werden durch irgendeine andere Signalsequenz aus Arabidopsis thaliana oder aus einer anderen Pflanze. Alternativ kann die Signalsequenz eliminiert werden.
Die Arabidopsis thaliana YgbP-Sequenz in Tabelle 1 und im Alignment von Annex A wurde durch Genomsequenzierung erhalten. Wir haben das Gen YgbP von A. thaliana sequenziert, durch Isolierung von RNA aus Zellen von A. thaliana, Produktion von sogenannter RNA-komplementären cDNAs durch RT-PCR, anschließende Amplifikation der codierenden Region für YgbP mit geeigneten, genspezifischen Primern durch PCR und schließlich Klonierung der erhaltenen DNA. Die Signalsequenz wurde zuerst nicht kloniert und sequenziert. Aber später wurde das vollständige Gen ausgehend von RNA kloniert.
Die cDNA-Sequenz des klonierten YgbP Gens von A. thaliana unterschied sich von der in der Datenbank aufgefundenen DNA-Sequenz (gb AC004136) aufgrund von Introns. Die Aminosäuresequenz, die zu dieser cDNA gehört, ist auch verschieden von der Aminosäuresequenz aus der Datenbank (gb AC004136). Dies scheint zurückführbar auf fehlerhaftes rechnerisches Intronspleißen aus chromosomaler DNA. Dieser Befund wird gezeigt in einem Alignment der Aminosäuresequenzen von klonierter cDNA und YgbP-Genprodukt aus der Datenbank (Annex C). Die Aminosäuresequenzen sind auf der rechten Seite des Alignments nummeriert. Nummer 1: klonierte Sequenz von YgbP aus A. thaliana ohne Signalsequenz; Nummer 2: gb AC004136. Identische Reste sind eingerahmt. Die cDNA-Sequenz und die zugehörige Proteinsequenz von YgbP von A. thaliana sind in Annex Da gezeigt. Die cDNA Leadersequenz war identisch zur Datenbankvorhersage (Annex Db).
Die Gene YgbP, ygbB und ychB von E. coli wurden durch PCR erhalten unter Benutzung von Primern mit spezifischen Restriktionsschnittstellen. In dieser PCR-Reaktion werden zwei Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme eingeführt am 5'-Ende und am 3'-Ende. Die bevorzugte Erkennungsstelle ist NcoI oder EcoRI am 5'-Ende und PstI am 3'-Ende. Das amplifizierte PCR-Fragment und der Expressionsvektor werden mit denselben Restriktionsenzymen verdaut und zusammen ligiert mit T4-Ligase. Dabei wird ein rekombinantes Plasmid erhalten, welches zur autonomen Replikation im Wirtsorganismus befähigt ist. Das rekombinante Plasmid wird benutzt, um den Wirtsmikroorganismus zu transformieren. Der bevorzugte Wirtsorganismus ist E. coli. Die gleiche Methode wurde benutzt für die Gene YgbP, ygbB und ychB von Arabidopsis thaliana und für ychB aus Tomate, wobei die Nukleotidsequenz für die Codonbenutzung von E. coli für hoch exprimierte Gene modifiziert wurde (ohne Leader-Sequenz).
Der offene Leserahmen des ygbB Gens von E. coli wurde auch in den pQE30 Expressionsvektor hoher Kopienzahl von Qiagen (Hilden, Deutschland) kloniert. Dieser Vektor erlaubt die Expression von Proteinen in E. coli mit hoher Ausbeute, die am N-terminalen Ende einen Schwanz bestehend aus 6 Histidinresten tragen. Das rekombinante "6-His-Protein" konnte dann leicht in einem Schritt mittels immobilisierender Metallchelat-Affintitätschromatographie zur Homogenität gereinigt werden.
Die Klonierung des ygbB Gens von E. coli in den pQE30 Vektor führte zur Expression von löslichem, enzymatisch aktivem YgbB-Genprodukt, welches N-terminal His-beladen war. Rekombinante E. coli Zellen, die überexprimiertes His-beladenes Fusionsprotein enthielten, zeigten eine spezifische Aktivität in der Umsetzung insbesondere von 4-Diphosphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, die mindestens 80 mal höher als die in E. coli XL1-Blue Wildtyp Zellen war. Das Enzym wurde gemäß Ni²⁺-Chelat-Affinitätschromatographie zur Homogenität gereinigt. Die Reinheit des Enzyms wurde mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese festgestellt.
Dieselbe Methode wurde für ygbB aus Plasmodium falciparum, um das Fusionsprotein 6xHis-YgbB zu erhalten, verwendet.
Die korrespondierende Proteinsequenz des klonierten ychB Gens aus A. thaliana war identisch zur Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz aus der Datenbank (gb AC005168). Die DNA-Sequenz und die korrespondierende Proteinsequenz ohne Leadersequenz ist in Annex Ea gezeigt. Das vollständige ychB Gen aus A. thaliana wurde zusätzlich kloniert ausgehend von RNA. Die Sequenz ist in Annex Eb gezeigt.
Die Stämme, welche die rekombinanten Plasmide enthalten, können in gewöhnlichen Kulturmedien bei 15 bis 40 °C kultiviert werden. Die bevorzugte Temperatur ist 37 °C. Die E. coli Stämme werden mit 0,5 bis 2 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid induziert bei einer optischen Dichte von 0,5 bis 0,8 bei 600 nm. Die Zellen werden 2 bis 12 Stunden inkubiert, vorzugsweise 5 Stunden. Die Zellen werden mit Lysozym lysiert und mit einem Sonifier aufgebrochen. Der Zellextrakt mit rekombinantem YgbP-, YgbB- oder YchB-Protein wird gereinigt mittels Chromatographie, insbesondere durch Anionenaustausch-chromatographie und Affinitätschromatographie. Die erhaltenen Proteine, insbesondere die aus E. coli, A. thaliana, L. esculentum und P. falciparum, haben die geeignete Faltungsstruktur für die Erzielung der gewünschten Enzymaktivität.
Screening
Die Enzyme YgbP, YgbB und YchB kommen in Tieren nicht vor. Deshalb haben Inhibitoren geben YgbP, YgbB und YchB großen Wert als (a) Herbizide gegen Unkraut, Pflanzen oder Algen; (b) antibiotische Wirkstoffe gegen pathogene Bakterien; (c) Wirkstoffe gegen Protozoen wie z.B. Plasmodium falciparum, den Verursacher der Malaria.
Mit der Entdeckung, dass 4-Phosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 4-Phosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und 2C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclopyrophosphat Intermediate sind, haben wir auch wesentliche Determinanten für Strukturen von Inhibitoren ermittelt, d.h., die Strukturen einer Untermenge von Inhibitoren sollten Ähnlichkeit zeigen zu mindestens einem Teil der Ausgangsverbindungen oder des Produkts oder des Übergangszustands (bzw. der Übergangszustände) zwischen der Ausgangsverbindung (2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und CTP) und den Produkten (Pyrophosphat und 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol). Auf der Grundlage dieser Determinanten wurden Ribitol-5-phosphat und Erythritol-4-phosphat synthetisiert als mögliche Inhibitoren für YgbP.
Wir haben auch Methoden erstellt zum Screening nach Inhibitoren von YgbP, YgbB und YchB. Bei diesen Methoden kann eines der Enzyme YgbP, YgbB oder YchB aus der oben definierten Enzymklasse benutzt werden. Es kann ein monofunktionelles oder ein bifunktionelles Enzym benützt werden. Die Reaktion sollte vorzugsweise bei pH 5,5 bis 9, insbesondere 7 bis 8,5 ausgeführt werden. Sie sollte ausgeführt werden in Anwesenheit eines divalenten Metallsalzes, vorzugsweise Mg²⁺ im Fall von YgbP und YchB und Mg²⁺ oder Mn²⁺ im Fall von YgbB. Die Temperatur ist vorzugsweise im Bereich von ±10° von der optimalen Temperatur. Mindestens 2 aufeinanderfolgende Enzyme der Enzymklassen YgbP, YgbB und YchB können auch gemeinsam in einem kombinierten Screeningtest benutzt werden. Oder YgbP kann kombiniert werden mit einem oder mehreren Enzymen stromauf von YgbP mit den geeigneten Substraten und Cofaktoren.
Das für den Test ausgewählte Enzym sollte vorzugsweise identisch sein mit dem Enzym des Zielorganismus. Im Fall einer Zielgruppe von Organismen (z.B. Pflanzen oder Bakterien), wie z.B. alle mono- und dicotyledonen Pflanzen, kann irgendein Wildtypenzym eines spezifischen Organismus aus der besagten Gruppe ausgewählt werden oder aber ein Enzym, dessen Sequenz die größte Gemeinsamkeit mit einigen oder allen relevanten pflanzlichen (bakteriellen) Enzymsequenzen aus dieser Gruppe aufweist, welche bekannt sind und derart repräsentativ sind für die gesamte pflanzliche (bakterielle) Gruppe. Im Fall von Pflanzenenzymen kann die Signalsequenz eliminiert werden.
Die Reaktion kann gestartet werden durch Hinzufügen von mindestens einer essentiellen Komponente. Die Reaktion kann gestoppt werden mit Methanol, Chelatoren wie z.B. EDTA oder Säuren wie z.B. Trichloressigsäure.
Im Fall von YgbP kann die Enzymaktivität nachgewiesen werden (in Gegenwart oder Abwesenheit eines potentiellen Inhibitors) durch Messung der Produktbildung, nämlich Pyrophosphat oder 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder den Verbrauch des Startmaterials, nämlich CTP oder 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat.
Entsprechend kann im Fall von YgbB der Nachweis erfolgen durch Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und/oder die Bildung von 2C-methyl-D-erythritol 3,4-cyclophosphat; oder alternativ den Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphat und/oder die Bildung von 2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclopyrophosphat oder Cytidylmonophosphat. Im Fall von YchB kann der Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder Adenosin-5'-triphosphat (ATP) oder die Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat oder Adenosin-5'-diphosphat (ADP) gemessen werden. Die Messungen können entweder direkt in der Reaktionsmischung oder nach Trennung der Reaktionsmischung durch Chromatographie, z.B. HPLC erfolgen.
Die Rate der Pyrophosphatbildung kann bestimmt werden durch Kopplung mit UDP-Glukosepyrophosphorylase, Phosphoglukomutase und Glukosedehydrogenase. Die Bildung von Pyrophosphat ist äquivalent zur Bildung von NADPH, welche spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt werden kann. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kann auch direkt beobachtet werden durch Benutzung ¹⁴C-markierter Substrate und Detektion der Produkte mit einem Radiomonitor. Der Verbrauch von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (unmarkiert, ¹³C- oder ¹⁴C-markiert) und die Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol kann auch bestimmt werden während der Reaktion oder nach der Reaktion durch ³¹P- oder ¹³C-NMR-Spektroskopie bzw. Detektion mit einem Radiomonitor. Die selben Methoden können benutzt werden zum Screening nach einem Enzym, welches gegen einen spezifischen Inhibitor resistent ist.
Die Rate der ADP-Bildung kann mittels UV bestimmt werden. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat kann auch direkt beobachtet werden durch Benutzung ¹⁴C-markierter Substrate und Detektion des Produktes mit einem Radiomonitor. Der Verbrauch von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (unmarkiert, ¹³C- oder ¹⁴C-markiert) und die Bildung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat können auch bestimmt werden während der Reaktion oder nach der Reaktion durch ³¹P- oder ¹³C-NMR-Spektroskopie bzw. Detektion mit einem Radiomonitor.
Wir haben festgestellt, daß YgbB 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (6) in 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (7) überführen kann. Die Struktur des Produktes wurde ermittelt. Das erhaltene 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist eine wertvolle Verbindung für Screeningverfahren. Es kann als Referenzsubstanz in Screeningverfahren, in welchen die Effektivität von prospektiven Inhibitoren gegen YgbB mittels der Effektivität von YgbB, 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat zu bilden, detektiert wird.
Unsere Entdeckung eröffnet einen Weg für neuartige Screeningverfahren zum Auffinden von Inhibitoren gegen YgbB. Als eine Alternative zur Messung des Verschwindens von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol-2-phosphat können wir nun das Erscheinen von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat messen. Die Messung kann entweder direkt mit der Reaktionsmischung oder nach Auftrennung der Reaktionsmischung mittels Chromatographie, wie HPLC durchgeführt werden. Die Detektion kann mittels NMR oder mit einem Radiodetektor durchgeführt werden.
Dieselbe Methode kann für das Screening nach mutierten Enzymen, welche resistent gegen einen spezifischen Inhibitor sind, durchgeführt werden.
Herstellung im Großmaßstab
Die Ausgangsmaterialien für die umfassende Großherstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol im Großmaßstab sind Dihydroxyacetonphosphat und Pyruvat, wobei diese Ausgangsmaterialien als freie Säuren oder als Salze mit einem monovalenten oder divalenten Kation, bevorzugt Natrium oder Kalium, benützt werden können. Sie können in äquimolaren Mengen oder in einem molaren Verhältnis zwischen 10:1 und 1:10 von Dihydroxyacetonphosphat zu Pyruvat benützt werden.
Glyceraldehyd-3-phosphat ist das Substrat für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase. Es ist äquivalent zu Dihydroxyacetonphosphat, welches in Verbindung mit Triosephosphatisomerase als dessen Quelle dient. Dihydroxyacetonphosphat wird wegen seiner Stabilität bevorzugt. Weiterhin ist Glukose in Gegenwart von ATP und der glykolytischen Enzyme Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase und Triosephosphatisomerase äquivalent.
Die benützten Enzyme können alle aus dem selben Organismus sein, z.B. E. coli, oder aus verschiedenen Organismen. Sie werden benützt in katalytischen Mengen im molaren Verhältnis von 0,00001 zu 0,1, bevorzugt 0,001 zu 0,1 von Dihydroxyacetonphosphat oder Pyruvat.
Das Magnesiumsalz kann bevorzugt Magnesiumchlorid oder -sulfat und das Mn²⁺-Salz kann Mn²⁺-Sazz kann Chlorid oder Sulfat sein. Thiaminpyrophosphat kann als freie Säure oder als Salz benützt werden, bevorzugt als Natrium- oder Kaliumsatz.
Jeder enzymatisch geeignete Puffer kann benützt werden. Tris-Hydrochlorid ist ein bevorzugter Puffer. Der pH-Wert liegt bevorzugt zwischen 7 und 9 und im speziellen zwischen 7,5 und 8,5, meistens bei 8,0. NADP⁺ kann in stöchiometrischen Mengen benützt werden. Es kann auch in situ regeneriert werden. Für diesen Zweck können Glukose und Glukosedehydrogenase benützt werden. Das molare Verhältnis von Glukose oder Dihydroxyacetonphosphat zu Pyruvat ist bevorzugt 1 zu 10, speziell 1 zu 3.
Die Reaktionstemperatur sollte in Übereinstimmung mit dem Temperaturoptimum der Enzyme gewählt werden. Bevorzugt sollten alle Enzyme so gewählt werden, dass ihr Temperaturoptimum das selbe ist oder in einem engen Bereich von 10 °C, bevorzugt 5 °C liegt. Ein bevorzugter Temperaturbereich ist 30 bis 45 °C und besonders 35 bis 40 °C.
Die im Anspruch 14 definierten Reaktionsschritte können getrennt voneinander ausgeführt werden, jeder mit seinen optimalen Bedingungen. Die intermediären Reaktionsmischungen können in einer Gefriertruhe gelagert werden, bevorzugt bei –30 °C bis –10 °C, besonders bei –20 °C. Vor dem Einfrieren kann die Reaktion gestoppt werden durch Zugabe von Säure, wie HCl, um den pH-Wert herabzusenken auf 2 bis 4, besonders auf 2.5 bis 3,5, bevorzugt auf 3,0. Die drei Reaktionsschritte können auch als Eintopfreaktion durchgeführt werden. Es wird bevorzugt, jegliches während der Schritte entstandenes Präzipitat durch Zentrifugation zu entfernen.
Markierung
Die markierten Substrate können mit ³²Phosphor, ¹⁴Kohlenstoff, ¹³Kohlenstoff, Deuterium oder Tritium markiert sein. Diese Markierungstypen können allein oder in einer beliebigen Kombination benützt werden, beispielsweise mit der Kombination ¹³C und Deuterium.
Die Markierung mit ¹⁴C oder ¹³C kann ein einzelnes Kohlenstoffatom betreffen, wobei jede der Kohlenstoffpositionen markiert werden kann. Alternativ können die Substrate mehrfach markiert sein, z.B. zweifach, dreifach, vierfach oder fünffach. Die totale ¹³C-Markierung ist besonders bevorzugt im Fall der ¹³C-Markierung.
Die Markierung mit Deuterium oder Tritium kann einfach oder mehrfach erfolgen. 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat kann mit Deuterium oder Tritium markiert werden in Position 1, 3, 4 oder 5, vorzugsweise in Position 3, 4 oder 5; und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat kann Deuterium- oder Tritium-markiert werden in Position 1, 3, 4 oder der Methylgruppe.
Andere Intermediate stromab von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat mit korrespondierender Markierung können benützt werden.
Die markierten Substrate können enzymatisch oder chemisch hergestellt werden.
Enzymatisch kann tritiiertes 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat hergestellt werden aus [3-³H]Pyruvat für die Tritiierung in Position 1; oder aus [1-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat oder [1-³H]Dihydroxyaceton-3-phosphat für Tritiierung in Position 3 oder aus [2-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat für Tritiierung in Position 4 oder aus [3-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat für Tritiierung in Position 5; und anschließend können die tritiierten 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enzymatisch erhalten werden aus den korrespondierenden tritiierten 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphaten.
Insbesondere kann [1-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat synthetisiert werden aus [3-³H]Glukose durch enzymatische Einwirkung von Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase und Triosephosphatisomerase. Die Reaktionsmischung mit einem Gehalt an [1-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat kann direkt benützt werden für die Synthese von [3-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat. [3-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat kann synthetisiert werden aus [1-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat und Pyruvat durch enzymatische Einwirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase.
[1-³H]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat kann synthetisiert werden aus [3-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat durch katalytische Einwirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktosiomerase.
[2-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat kann synthetisiert werden aus [2-³H]Glukose durch enzymatische Wirkung von Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase und Aldolase. Die Reaktionsmischung mit einem Gehalt an [2-³H]Glyceraldehyd-3-phosphat kann direkt benützt werden für die Synthese von [4-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat wie oben für [3-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5- phosphat beschrieben. [3-³H]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat kann aus [4-³H]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat synthetisiert werden durch katalytische Wirkung von 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase.
Deuterium-markierte ¹³C-markierte oder ¹⁴C-markierte Substrate können analog hergestellt werden.
Die grundlegenden enzymatischen Prozesse sind bekannt aus G. A. Sprenger et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 94, 12857-12862 (1997); und Kuzuyama et al., Tetrahedron Lett. 39, 44509-44512 (1998).
Alternativ können die markierten 1-Desoxy-D-xylulose-Verbindungen hergestellt werden durch Benutzung der entsprechend markierten Ausgangsmaterialien in dem Prozess der beschrieben wurde durch Yokota, A. und Sasajima, K. in Agric. Biol. Chem. 48, 149-158 (1984) und ibid. 50, 2517-2524 (1986).
Die markierten 2C-Methyl-D-erythritol-Verbindungen können chemisch erhalten werden durch den folgenden Prozess unter Benutzung entsprechend markierter Ausgangsverbindungen:

a) Reaktion von 1,2,5,6-Di-O-isopropyliden-D-mannitol mit Bleitetraacetat zu Isopropylidenglyceraldehyd; welcher
b) anschließend umgesetzt wird zu 1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol durch Reaktion mit Methylmagnesiumiodid;
c) Bildung von 3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon aus dem Produkt Schritt b) durch Oxidation, vorzugsweise mit Natriumperiodat in Anwesenheit von Rutheniumdioxid;
d) Bildung von 1,2-O-Isopropyliden-3-O-trimethyl-(2R,3RS)-1,2,3-trihydroxy-3-cyanobutan durch Reaktion des Produkts von Schritt c) mit Trimethylsilylcyanid;
e) Umwandlung des Produkts von Schritt d) in eine Mischung von 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton durch Hydrolyse mit einer Säure;
f) Herstellung von 2,3-O-Isopropyliden-2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton durch Reaktion der Produkte von Schritt e) mit Aceton in Anwesenheit von wasserfreiem Zinkchlorid;
g) Umwandlung des Produkts von Schritt f) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrofuranose durch Reaktion mit einem Hydriddonor, vorzugsweise Diisobutylaluminiumhydrid;
h) Umwandlung des Produkts von Schritt g) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim durch Reaktion mit O-Benzylhydroxylamin;
i) Reaktion des Produkts aus Schritt h) mit Tribenzylphosphit und Iod um 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat zu erhalten;
j) Umwandlung des Produkts von Schritt i) in 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4- dibenzylphosphat durch Ozonisierung;
k) Umwandlung des Produkts von Schritt j) zu 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat durch Reaktion mit Natriumborhydrid;
l) Umwandlung des Produkts von Schritt k) in 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure durch Hydrierung, vorzugsweise in Anwesenheit von Palladium.

Tritiierung in Position 1 ist dadurch möglich, dass Schritt k) ausgeführt wird mit tritiiertem Natriumborhydrid, wobei die Bedingungen für den folgenden Schritt l) im übrigen identisch sind. Tritiierung in Position 2' ist dadurch möglich, dass Schritt b) mit tritiiertem Methylmagnesiumiodid ausgeführt wird, welches hergestellt wurde aus tritiiertem Methyliodid und Magnesium. Die anschließenden Schritte c) bis l) bleiben unverändert. Die Kombination der Tritiierungsschritte ist möglich und liefert 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure mit Tritiierung in Position 1 und/oder 2.
Deuterium-markierte, ¹³C-markierte oder ¹⁴C-markierte Substrate können analog hergestellt werden.
Totale C-Markierung kann vorteilhaft ausgeführt werden indem man von [U-¹³C₆]Glukose und [U-¹³C₃]Natriumpyruvat oder [2,3-¹³C₂]Pyruvat ausgeht. In Anwesenheit von Thiaminpyrophosphat, ATP und MgCl₂ werden die folgenden Enzyme benützt für die Herstellung von [U-¹³C]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat: Triosephosphatisomerase, Hexokinase, Phosphoglukoseisomerase, Phosphofruktokinase, Aldolase, 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase. Anschließend können die Produkte umgewandelt werden zu [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat mit 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase, Glukosedehydrogenase und Glukose, NADP⁺ und MgCl₂.
Weiterhin kann [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol in [U-¹³C₅]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, [U-¹³C₅]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat und [U-¹³C₅]2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat unter Benützung der Enzyme YgbP, YchB und YgbB in Gegenwart von CTP, ATP, MgCl₂ und MnCl₂ umgesetzt werden. Für die Regeneration von ATP ist es auch möglich, Pyruvatkinase in Gegenwart von Phosphoenolpyruvat zu benützen.
Nukleinsäuren, Vektoren, Expressionssysteme und Polypeptide
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden zahlreiche Techniken in Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanter DNA und Proteinbiochemie benützt, welche z.B. ausführlich beschrieben sind in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M. L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in EnzyMology (Academic Press, Inc.); and Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, NY.).
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuresequenzen, welche Pflanzenenzyme, daraus abgeleitete enzymatisch aktive Fragmente und verwandte abgeleitete Sequenzen aus anderen Pflanzenarten umfassen. Erfindungsgemäss bezieht sich eine Nukleinsäure, welche "abgeleitet ist" von einer Sequenz, auf eine Nukleinsäuresequenz entsprechend einer Region der Sequenz, auf homologe Sequenzen oder komplementäre zu der Sequenz und auf "sequenzkonservative Varianten" und "funktionskonservativen Varianten". Sequenzkonservative Varianten sind die, in denen die Änderung in einem oder mehreren Nukleotiden in einer gegebenen Kodonposition keine Änderung in der Aminosäurecodierung dieser Position bewirkt. Funktionskonservative sind die, in welchen ein gegebener Aminosäurerest geändert wurde ohne die Gesamtkonformation und Funktion des Polypeptids zu ändern unter Einschluß aber nicht unter Begrenzung auf den Ersatz von Aminosäuren durch eine solche mit ähnlichen physikalischchemischen Eigenschaften (so wie z.B. sauer, hydrophob usw.). Enzymfragmente, welche enzymatische Aktivität behalten, können identifiziert werden entsprechend den hier beschriebenen Methoden, z.B. Expression in E. coli mit anschließender enzymatischer Untersuchung des Zellextrakts.
Sequenzen, die sich von anderen Pflanzen als Arabidopsis thaliana ableiten, können isoliert werden durch Routineexperimente unter Benutzung der hier zur Verfügung gestellten Methoden und Zusammensetzungen. Z.B. kann die Identifizierung von Homologen erfolgen durch Hybridisierung einer Nukleinsäure, welche die Gesamtheit oder Teile einer Arabidopsis Sequenz enthält, unter Bedingungen mittlerer Stringenz (wie z.B. eine wässrige Lösung von 2 × SSC bei 65 °C) an cDNA oder genomische DNA, welche von anderen Pflanzenarten abgeleitet wurden. Von verschiedenen Pflanzenarten abgeleitete cDNA-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (Clontech, Palto Alto, CA; Stratagene, La Jolla, CA). Alternativ können PCR-basierte Methoden benutzt werden, um verwandte Sequenzen zu amplifizieren aus cDNA oder genomischer DNA, welche aus anderen Pflanzen abgeleitet wurde.
Die Expression der identifizierten Sequenz, beispielsweise in E. coli, unter Benutzung von Methoden, die hier im Detail beschrieben werden wird dann durchgeführt, um die enzymatische Aktivität des von der Sequenz codierten Polypeptids zu bestätigen. Dementsprechend fallen Sequenzen, welche von dicotyledonen und monocotyledonen Pflanzen abgeleitet sind, in den Bereich der Erfindung.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung umfassen Purin- und Pyrimidin-enthaltende Polymere von beliebiger Länge, entweder Polyribonukleotide oder Polydesoxyribonukleotide oder gemischte Polyribo-Polydesoxyribonukleotide. Diese umfassen einzel- und doppelsträngige Moleküle, z.B. DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA Hybride ebenso wie Proteinnukleinsäuren (PNA), welche gebildet sind durch Konjugation von Basen an ein Aminosäurerückgrat. Dies schließt auch Nukleinsäuren mit modifizierten Basen ein. Die Nukleinsäuren können direkt aus Zellen isoliert werden. Alternativ kann PCR benützt werden zur Herstellung der Nukleinsäuren der Erfindung unter Benutzung von chemisch synthetisierten Strängen oder genomischem Material als Matrize. Für die PCR benützte Primer können synthetisiert werden unter der Benutzung der hier bereitgestellten Sequenzinformation und können weiterhin so konstruiert werden, dass nach Bedarf neue Restriktionsstellen eingeführt werden um den Einbau in einen gegebenen Vektor für die rekombinante Expression zu erleichtern.
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung können flankiert sein durch natürliche Arabidopsis Regulationssequenzen oder können assoziiert sein mit heterologen Sequenzen, einschließlich Promotoren, Enhancern, Responselementen, Signalsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Introns, 5'- und 3'-nichtcodierende Regionen und ähnliches. Die Nukleinsäuren können auch modifiziert sein durch viele Maßnahmen entsprechend dem Stand der Forschung. Nicht-limitierende Beispiele für solche Modifikationen sind u.a. Methylierung, "Caps", Substitution einer oder mehrerer der natürlich vorkommenden Nukleotide mit einem Analogon, und Internukleotidmodifikationen, wie z.B. diejenigen mit ungeladenen Verknüpfungen, (z.B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, etc.) und mit geladenen Verknüpfungen (z.B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, etc.). Nukleinsäuren können eine oder mehrere zusätzliche kovalent verknüpfte Einheiten enthalten wie z.B. Proteine (z.B. Nukleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, etc.), Intercalatoren (z.B., Acridin, Psoralen, etc.), Chelatoren (z.B. Metalle, radioaktive Metalle, Eisen, oxidative Metalle, etc.) und Alkylatoren. Die Nukleinsäuren können abgeleitet werden durch Bildung einer Methyl- oder Ethylphosphotriesterbindung oder einer Alkylphosphoramidatbindung. Weiterhin können die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung auch modifiziert werden mit einer Markierung, welche ein direkt oder indirekt detektierbares Signal liefert. Exemplarische Markierungen schließen Radioisotope, fluoreszierende Moleküle, Biotin und weiteres ein.
Die Erfindung stellt auch Nukleinsäurevektoren bereit, welche die offen gelegten HPPD-Sequenzen oder Derivate oder Fragmente davon umfassen. Eine große Zahl von Vektoren, einschließlich Plasmid und Pilzvektoren sind beschrieben worden für die Replikation und/oder Expression in einer Vielfalt von eukaryotischen und prokaryotischen Wirten. Nicht-limitierende Beispiele umfassen pKK Plasmide (Clontech), pUC Plasmide, pET Plasmide (Novagen, Inc., Madison, WI) oder pRSET oder pREP (Invitrogen, San Diego, CA) und viele geeignete Wirtszellen unter Benutzung von Methoden, die hier offengelegt oder zitiert werden oder die dem Fachmann anderweitig bekannt sind. Rekombinante Klonierungsvektoren umfassen oft ein oder mehrere Replikationssysteme für die Klonierung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z.B. Antibiotikaresistenz und ein oder mehrere Expressionskassetten. Geeignete Wirtszellen können transformiert/transfiziert/infiziert werden je nach Bedarf durch eine geeignete Methode unter Einschluß von Elektroporation, CaCl₂-vermittelten DNA-Aufnahme, tungae Infektion, Mikroinjektion, Mikroprojektil oder andere etablierte Methoden.
Geeignete Wirte schließen Bakterien, Archaebakterien, Pilze, insbesondere Hefe, Pflanzen und tierische Zellen, insbesondere Säugerzellen ein. Von besonderer Bedeutung sind E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Schizosaccharomyces pombi, SF9 Zellen, C129 Zellen, 293 Zellen, Neurospora, und CHO Zellen, COS Zellen, HeLa Zellen und immortalisierte myeloide und lymphoide Säugetierzellen. Bevorzugte Replikationssysteme schließen M13, ColE1, SV40, Baculovirus, Lamda, Adenovirus und ähnliches ein. Eine große Anzahl von Transkriptions-, Initiations- und Terminationsregulationsregionen sind isoliert worden, und ihre Wirksamkeit in der Transkription und Translation heterologer Proteine in den verschiedenen Wirten ist gezeigt worden. Beispiele für diese Regionen, Methoden für die Isolierung, Art der Handhabung, etc. sind dem Fachmann bekannt. Unter geeigneten Expressionsbedingungen können Wirtszellen benützt werden als Quelle für rekombinant produzierte Enzym-abgeleitete Peptide und Polypeptide.
Vorteilhafterweise können Vektoren ein Transkriptionsregulationselement (d.h. einen Promoter) einschließen, der operational verknüpft ist mit dem Enzymanteil. Der Promoter kann nach Bedarf Operatorportionen und/oder Ribosomenbindungsstellen enthalten. Nicht-limitierende Beispiele für bakterielle Promotoren, welche mit E. coli kompatibel sind schließen ein: trc Promotor, β-Lactamase (Penicillinase)-Promotor, Lactosepromoter, Tryptophan (trp)-Promotor, Arabinose BAD Operon-Promotor, lambda-abgeleiteter P1-Promotor und N Gen Ribosomenbindungsstelle und den Hybriden Tac Promotor, der abgeleitet ist aus Sequenzen von trp und lac UV5 Promotoren. Nicht-limitierende Beispiele für Hefepromotoren umfassen 3-Phosphoglyceratkinasepromoter, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) Promotor, Galactokinase (GALT) Promoter, Galactoepimerase Promotor und Alkoholdehydrogenase (ADH) Promotor. Geeignete Promotoren für Säugerzellen umfassen ohne Limitierung virale Promotoren wie z.B. solche aus Simian Virus 40 (SV40), Rous sarcoma Virus (RSV), Adenovirus (ADV) und Rinderpapilloma Virus (BPV). Säugerzellen können auch Terminatorsequenzen und Poly A Additionssequenzen benötigen und Enhancersequenzen, welche die Expression erhöhen, können eingeschlossen werden. Sequenzen, welche die Amplifizierung von Genen verursachen, können ebenfalls wünschenswert sein. Weiterhin können Sequenzen eingeschlossen werden, welche die Sekretion des rekombinanten Proteins aus der Zelle erleichtern unter Einschluß aber ohne Begrenzung auf Bakterien, Hefen und tierische Zellen, wie z.B. sekretorische Signalsequenzen und/oder Prohormon pro Region-Sequenzen.
Nukleinsäuren, welche Wildtyp oder Variantenenzympolypeptide codieren, können in Zellen auch durch Rekombinationsereignisse eingeführt werden. Z.B. kann eine Sequenz in eine Zelle eingeführt werden und dadurch homologe Rekombination am Ort des endogenen Gens oder einer Sequenz mit substantieller Identität mit dem Gen bewirken. Andere rekombinationsbasierte Methoden, wie z.B. nicht-homologe Rekombination oder Deletion endogener Gene durch homologe Rekombination kann ebenfalls benützt werden.
Enzym-abgeleitete Polypeptide entsprechend der vorliegenden Erfindung unter Einschluss funktionskonservativer Enzymvarianten können aus Wildtyp oder Mutanten Arabidopsis Zellen oder aus heterologen Organismen oder Zellen (unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen- und Säugetier-Zellen) isoliert werden, in welche eine Enzym-abgeleitete Protein-codierende Sequenz eingeführt und exprimiert worden ist. Weiterhin können die Polypeptide Teile rekombinanter Fusionsproteine sein. Alternativ können Polypeptide chemisch synthetisiert werden durch kommerziell verfügbare, automatisierte Verfahren unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf ausschließliche Festphasensynthese, partielle Festphasenmethoden, Fragmentkondensation oder klassische Lösungssynthese.
"Reinigung" eines Enzympolypeptids bezieht sich auf die Isolierung des Enzympolypeptids in einer Form, welche es erlaubt, seine enzymatische Aktivität zu messen ohne Beeinträchtigung durch andere Komponenten der Zelle, in welcher das Polypeptid exprimiert wird. Methoden zur Polypeptidreinigung unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf präparative Disc-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, reverse Phase HPLC, Gelfiltration, Ionenaustausch- und Partitionschromatographie und Gegenstromverteilung sind dem Fachmann wohlbekannt. Für bestimmte Zwecke ist es vorzuziehen, das Polypeptid in einem rekombinanten System zu produzieren, in welchem das Protein einen zusätzlichen Sequenzabschnitt ("sequence tag"), wie z.B. aber nicht ausschließlich eine Polyhistidinsequenz, enthält, welche die Reinigung erleichtert. Das Polypeptid kann dann aus einem Rohlysat der Wirtszelle gereinigt werden durch Chromatographie an einer geeigneten Festphasenmatrix. Alternativ können gegen das Enzym oder gegen davon abgeleitete Peptide produzierte Antikörper als Reinigungsreagenz benützt werden. Andere Reinigungsmethoden sind möglich.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Derivate und Homologe der Enzympolypeptide. Für bestimmte Zwecke können Peptid-codierende Nukleotidsequenzen geändert werden durch Substitution, Addition oder Deletion, welche funktionell äquivalente Moleküle, z.B. funktionskonservative Varianten, liefern. Z.B. kann ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz substituiert werden durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Eigenschaften, wie z.B. positiv geladene Aminosäuren (Arginin, Lysin und Histidin); negativ geladene Aminosäuren (Aspartat und Glutamat); polare, neutrale Aminosäuren; und nicht-polare Aminosäuren.
Die isolierten Polypeptide können z.B. modifiziert werden durch Phosphorylierung, Sulfatisierung, Acylierung oder andere Proteinmodifikationen. Sie können auch modifiziert werden mit einer Markierung, welche ein detektierbares Signal liefern kann, und zwar entweder direkt oder indirekt unter Einschluss aber nicht unter Beschränkung auf Radioisotope und fluoreszierende Verbindungen.
Gene, welche YgbP (oder YgbB) oder YchB aus irgendeiner Pflanze entsprechen, können isoliert werden durch gut bekannte Techniken, wie z.B. Southern-Hybridisierung oder PCR unter Benutzung entarteter Primer. Insbesondere kann eine cDNA-Bank dieser fraglichen Pflanze gescreent werden unter Benutzung des Nukleinsäure-Direktmarkierungs- und Detektionssystemkits, welches geliefert wird von Amersham Pharmacia Biotech (Heidelberg, Deutschland). Hybridisierungsbedingungen sind z.B. 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5. Positiv hybridisierende Plaques werden detektiert durch Lumineszenzdetektion (oder in anderen Systemen durch Autoradiographie). Nach Reinigung zu einzelnen Plaques werden cDNAs isoliert, und ihre Sequenz wird bestimmt durch die Kettenabbruchmethode unter Benützung von Dideoxyterminatoren, welche mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Dieses experimentelle Protokoll kann vom Fachmann benützt werden, um Gene mit substantieller Ähnlichkeit zum Arabidopsis Gen aus irgendeiner Pflanze zu erhalten.
Screening-Methoden zur Identifizierung von Enzyminhibitoren/Herbiziden
Die Methoden und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können benützt werden zur Identifizierung von Verbindungen, welche die Funktion von Enzymen hemmen und dadurch z.B. nützlich sind als Herbizide oder als Leitverbindungen für die Entwicklung von nützlichen Herbiziden. Dies kann erreicht werden durch Bereitstellung einer Zelle, welches das Enzym exprimiert und dadurch Zellkulturen produziert, welche das Enzym exprimieren, und Inkubation besagter Zelllinien in Gegenwart von Testverbindungen um Testkulturen zu bilden und in Abwesenheit von Testverbindungen um Kontrollkulturen zu bilden. Man lässt die Inkubation über eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen erfolgen, damit die Einwirkung auf die Enzymfunktion eintreten kann. Zu einer vorbestimmten Zeit nach dem Start der Inkubation mit einer Testverbindung wird ein Test ausgeführt, um die Enzymaktivität zu bestimmen. In einer Ausführungsform wird die Enzymaktivität in ganzen Zellen bestimmt. Alternativ kann die Enzymaktivität bestimmt werden in Zellextrakten oder Medien, welche das isolierte Enzym enthalten unter Benutzung von Methoden so wie die unten Beschriebenen. Zusätzliche Kontrollen, sowohl im Hinblick auf Kulturproben und Testproben, werden ebenfalls eingeschlossen, wie z.B. eine Wirtszelle, welche das Enzym nicht exprimiert (z.B. eine Wirtszelle, welche transformiert ist mit einem Expressionsplasmid, welche das Enzymgen in reverser Orientierung enthält oder welche kein Insert enthält). Enzymhemmende Verbindungen werden als solche identifiziert, welche die Enzymaktivität in den Testkulturen relativ zu den Kontrollkulturen verringern.
Wirtszellen, die benützt werden können, um die vorliegende Erfindung auszuüben, umfassen ohne Einschränkung Bakterien-, Pilz-, Insekten-, Säuger- und Pflanzenzellen. Vorzugsweise werden bakterielle Zellen benützt. Am meisten bevorzugt werden bakterielle Zellvarianten (wie z.B. die imp Mutante von E. coli), welche erhöhte Membranpermeabilität für Testverbindungen im Vergleich mit der Wildtypwirtszelle zeigen.
Vorzugsweise werden die Methoden der gegenwärtigen Erfindung angepasst für einen "highthroughput screen", welcher es erlaubt, eine Vielfalt von Verbindungen in einem einzigen Test zu prüfen. Solche hemmenden Verbindungen können z.B. gefunden werden in Bibliotheken von Naturprodukten, Fermentationsbibliotheken (welche Pflanzen und Mikroorganismen umfassen), kombinatorischen Bibliotheken, Verbindungsdatenbanken und synthetischen Verbindungsbibliotheken. Z.B. sind synthetische Verbindungsbibliotheken kommerziell erhältlich von Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), und Microsource (New Milford, CT). Eine seltene chemische Bibliothek ist verfügbar von Aldrich Chemical Company, Inc. (Milwaukee, WI). Alternativ sind Bibliotheken von Naturstoffen in Form von Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tierextrakten verfügbar, z.B. von Pan Laboratories (Bothell, WA) oder MycoSearch (NC), oder können leicht hergestellt werden. Außerdem können natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen leicht modifiziert werden durch konventionelle chemische, physikalische und biochemische Mittel (Blondell et al., TibTech 14: 60, 1996). Hemmtests entsprechend der vorliegenden Erfindung sind vorteilhaft insofern, als sie viele unterschiedliche Lösungsmitteltypen zulassen und dadurch die Testung von Verbindungen aus vielen Quellen erlauben.
Nachdem eine Verbindung durch die Methoden der vorliegenden Erfindung als Inhibitor identifiziert wurde, können in vivo und in vitro Tests durchgeführt werden, um die Natur und den Mechanismus der Hemmwirkung weiter zu charakterisieren. Der Effekt einer identifizierten Verbindung auf eine in vitro Enzymaktivität eines gereinigten oder partiell gereinigten Enzyms kann bestimmt werden und Enzymkinetikplots können benützt werden um z.B. zwischen kompetitiven und nicht-kompetitiven Inhibitoren zu unterscheiden.
Verbindungen, welche als Inhibitoren identifiziert wurden unter Benutzung der Methoden der vorliegenden Erfindung, können modifiziert werden, um die Potenz, Wirksamkeit, Aufnahme, Stabilität und Brauchbarkeit für die Benutzung in kommerziellen Herbizidapplikationen etc. modifiziert werden. Diese Modifikationen werden erreicht und getestet unter Benutzung von Methoden, welche dem Fachmann wohlbekannt sind.
Isolierung von Herbizid-resistenten Enzymvarianten
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Isolierung von Enzymvarianten oder Varianten der entsprechenden Nukleinsäuren oder Vektoren (in einer Zelle, insbesondere einer Bakterien-, Pilz-, Pflanzen-, Insekten- oder Säugerzelle), welche resistent sind gegen die Wirkung von Enzyminhibitoren/Herbiziden. Die Enzymvarianten können natürlich vorkommen oder können erhalten werden durch zufällige oder ortsgerichtete Mutagenese.
Ein Verfahren zur Identifizierung inhibitorresistenter Varianten von Pflanzenproteinen, wie z.B. aus Arabidopsis thaliana oder Lycopersicon esculentum wird beschrieben, umfassend

(a) Bereitstellen einer Zellpopulation, die eines der Pflanzenproteine exprimiert,
(b) Mutagenisieren der Zellpopulation,
(c) Kontaktieren der mutagenisierten Zellpopulation mit einem Herbizid unter Bedingungen, die für die Funktion eines der Proteine der nicht-mutagenisierten Zellen inhibierend sind,
(d) Gewinnen von Zellen, die gegen die inhibierende Wirkung des Herbizids inhibierend sind, und
(e) Isolierung, und wahlweise Sequenzierung von Nukleinsäuren, die für herbizidresistentes Protein kodieren, von den gewonnenen Zellen, um herbizidresistente Proteinvarianten bereitzustellen und zu identifizieren.

Eine Population von Zellen oder Organismen, welche das Enzym exprimieren, kann mutagenisiert werden unter Benutzung von dem Fachmann wohlbekannten Methoden, wonach die Zellen oder Organismen einem Auswahlverfahren unterworfen werden, um diejenigen zu Identifizieren, welche resistent sind gegen die toxischen Effekte von Inhibitoren. Das Variantenenzym wird dann aus den resistenten Zellen oder Organismen isoliert, beispielsweise unter Benutzung von PCR-Techniken.
Ein isoliertes Enzymgen kann der stochastischen oder ortsspezifischen Mutagenese in vitro unterworfen werden, wonach mutagenisierte Versionen des Gens in eine geeignete Zelle, wie z.B. E. coli zurückübertragen werden können, und die Zellen können einer Selektions- oder Auswahlprozedur unterworfen werden wie oben beschrieben.
Die Variantengene werden in geeigneten Wirtszellen exprimiert und die enzymatischen Eigenschaften von Variantenenzympolypeptiden werden mit dem Wildtypenzym verglichen. Vorzugsweise führt eine gegebene Mutation zu einem Enzymvariantenpolypeptid, welches in vitro Aktivität behält, während es katalytische Aktivität zeigt, die relativ resistenter ist gegen das (die) ausgewählte(n) Herbizid(e) als das Wildtypenzym. Vorzugsweise hat das Variantenenzym ausreichende katalytische Aktivität, um die Lebensfähigkeit der Zelle, in der es exprimiert wird, zu unterhalten, wenn es in einer Zelle exprimiert wird, welche Enzymaktivität zur Überlebensfähigkeit benötigt; oder katalytische Aktivität in Kombination mit anderen Herbizid-resistenten Enzymvariantenproteinen, die ebenfalls in der Zelle exprimiert werden, welche die selbe oder verschieden vom ersten Enzymprotein sein können, die ausreichend sind, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten in der es exprimiert wird; und (ii) katalytische Aktivität, die resistenter ist gegen das Herbizid als das Wildtypenzym.
Es ist deshalb nicht unbedingt erforderlich, dass ein bestimmtes Enzymvariantenprotein die gesamte katalytische Aktivität hat, die notwendig ist, um die Lebensfähigkeit der Zelle aufrecht zu erhalten, sondern es muss eine gewisse katalytische Aktivität in einem Ausmaß haben, allein oder in Kombination mit der katalytischen Aktivität zusätzlicher Kopien der gleichen Enzymvariante und/oder der katalytischen Aktivität anderer Enzymvariantenproteine, die ausreichend ist, um die Lebensfähigkeit der Zelle zu erhalten, die die Enzymaktivität zum Überleben benötigt. Z.B. kann die katalytische Aktivität erhöht werden bis zu minimal akzeptablen Niveaus durch Einführen multipler Kopien eines Varianten-codierenden Gens in die Zelle oder durch Einführen des Gens, welches weiterhin einen relativ starken Promoter einschließt um die Produktion der Variante zu erhöhen.
Resistenter bedeutet, dass die katalytische Aktivität der Variante durch das Herbizid wenn überhaupt, zu einem geringeren Grad als die katalytische Aktivität des Wildtyps durch das Herbizid (die Herbizide) verringert wird. Eine bevorzugte resistentere Enzymvariante hält ausreichend katalytische Aktivität, um die Lebensfähigkeit einer Zelle oder einer Pflanze oder eines Organismus, in dem bei der gleichen Konzentration des gleichen Herbizids (der gleichen Herbizide) das Wildtypenzym keine ausreichende katalytische Aktivität behalten würde, um die Lebensfähigkeit der Zelle der Pflanze oder des Organismus zu erhalten.
Vorzugsweise beträgt die katalytische Aktivität in Abwesenheit des Herbizids mindestens 5 % und vorzugsweise mehr als 20 % der katalytischen Aktivität des Wildtypenzyms in Abwesenheit des Herbizids (der Herbizide).
Herbizid-resistente Enzymvarianten können als genetische Marker in jeglicher Zelle benützt werden, welche unter normalen Umständen empfindlich bezüglich inhibitorischer Effekte, welche von Herbiziden ausgebildet werden, sind. In dieser Darstellung wird DNA, welche für eine herbizid-resistente Enzymvariante codiert, in ein Plasmid unter der Kontrolle eines geeigneten Promoters inkorporiert. Jegliche, benötigte DNA kann dann in ein Plasmid inkorporiert werden, und das letztliche rekombinante Plasmid kann in eine herbizid-empfindliche Zelle eingeführt werden. Zellen, welche mit dem Plasmid transformiert wurden, werden dann selektiert oder gescreent durch Inkubieren in Gegenwart einer ausreichenden Konzentration an Herbizid, um das Wachstum und/oder die Pigmentbildung zu inhibieren.
Chemisch-resistente Pflanzen und Pflanzen, die Gene von Enzymvarianten enthalten

Die gegenwärtige Erfindung beschreibt transgene Zellen, eingeschlossen, aber nicht begrenzt auf, Samen, Organismen und Pflanzen, in welche Gene, welche für herbizid-resistente Enzymvarianten codieren, eingeführt wurden. Nicht-limitierende Beispiele für geeignete Empfängerpflanzen sind in Tabelle 3 unten aufgeführt: TABELLE 3 EMPFÄNGERPFLANZEN

ÜBLICHER NAME	FAMILIE	LATEINISCHER NAME
Mais	Gramineae	Zea mays
Mais; Zahn-(Dent)	Gramineae	Zea mays dentiformis
Mais, Hart-(Flint)	Gramineae	Zea mays vulgaris
Mais, Puff-(Pop)	Gramineae	Zea mays microsperma
Mais, Weich-(Soft)	Gramineae	Zea mays amylacea
Mais, Zucker-(Sweet)	Gramineae	Zea mays amyleasaccharata
Mais, Zucker-(Sweet)	Gramineae	Zea mays saccharate
Mais, Wachs-(Waxy)	Gramineae	Zea mays ceratina

Weizen, Dinkel	Pooideae	Triticum spelta
Weizen, Hartweizen (Durum)	Pooideae	Triticum durum
Weizen, Rau-(English)	Pooideae	Triticum turgidum
Weizen, Spelz-	Pooideae	Triticum spelta
Weizen, polnisch (Polish)	Pooideae	Triticum polonicum
Weizen, Rau-(Poulard)	Pooideae	Triticum turgidum
Weizen, Einkorn (singlegrained)	Pooideae	Triticum monococcum
Weizen, Einkorn (Small Spelt)	Pooideae	Triticum monococcum
Weizen, Weichweizen (Soft)	Pooideae	Triticum aestivum

Reis	Gramineae	Oryza sativa
Reis, Amerikan. Wild-	Gramineae	Zizania aquatica
Reis, Australisch	Gramineae	Oryza australiensis
Reis, Indisch (indian)	Gramineae	Zizania aquatica
Reis, Anka (Red Rice)	Gramineae	Oryza glaberrima
Reis, Wilder Reis (Tuscarora)	Gramineae	Zizana aquatica
Reis, Westafrikanisch	Gramineae	Oryza glaberrima

Gerste	Pooideae	Hordeum vulgare
Gerste, Abessinisch intermediate, auch unregelmäßig (Irregular)	Pooideae	Hordeum irregulare
Gerste, Ur-, zweizeilig. (ancestral tworow)	Pooideae	Hordeum spontaneum
Gerste, haarlos (Beardless)	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Gerste, Ägyptisch	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Gerste, vierzeilig (fourrowed)	Pooideae	Hordeum vulgare polystichon
Gerste, sechszeilig (sixrowed)	Pooideae	Hordeum vulgare hexastichon
Gerste, zweizeilig (Tworrowed)	Pooideae	Hordeum distichon

Baumwolle, Abroma	Dicotyledoneae	Abroma augusta
Baumwolle, Amerikan. Hochland (American Upland)	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Baumwolle, Asiatische (asiatice tree auch Indian Tree)	Malvaceae	Gossypium arboreum
Baumwolle, brasilianisch, auch Kidney-, und Pernambuco	Malvaceae	Gossypium barbadense brasiliense
Baumwolle, Levant	Malvaceae	Gossypium herbaceum
Baumwolle langfasrig (Long Silk), auch Long Staple, Sea Island	Malvaceae	Gossypium barbadense
Baumwolle, Mexikanische, auch Short Staple	Malvaveae	Gossypium hirsutum

Sojabohnen, Soja	Leguminosae	Glycine max

Zuckerrübe	Chenopodiaceae	Beta vulgaris altissima

Zuckerrohr	Woody-plant	Arenga pinnata

Tomate	Solanaceae	Lycopersicon esculentum
Tomate, Kirsch-(Cherry)	Solanaceae	Lycopersicon esculentum cerasiforme
Tomate, gewöhnliche (Common)	Solanaceae	Lycopersicon esculentum commune
Tomate, Johannisbeer-(Currant)	Solanaceae	Lycopersicon pimpinellifolium
Tomate, Hüllen-(Husk)	Solanaceae	Physalis ixocarpa
Tomate, Hyänen-(Hyenas)	Solanaceae	Solanum incanum
Tomate, Birnen-(Pear)	Solanaceae	Lycopersicon esculentum pyriforme
Tomate, Baum-(Tree)	Solanaceae	Cyphomandra betacea

Kartoffel	Solanaceae	Solanum tuberosum

Kartoffel, Spanische, Süßkartoffel	Convolvulaceae	Ipormoca batatas

Roggen, gewöhnlicher (Common)	Pooideae	Secale cereale
Roggen, Berg-(Mountain)	Pooideae	Secale montanum

Paprika, Großer-(Bell)	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Paprika, Cayenne-, (Bird, Guinea)	Solanaceae	Capsicum annuum minimum
Paprika, chinesischer-(Bonnet)	Solanaceae	Capsicum sinense
Paprika, Großer-(Bullnose), auch Sweet (süß)	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Paprika, kirschförmig (Cherry)	Solanaceae	Capiscum annuum cerasiforme
Paprika (pepper), Cluster, auch Red Cluster	Solanaceae	Capsicum annuum fasciculatum
Paprika (pepper), kegelförmig	Solanaceae	Capsicum annuum conoides
Paprika (pepper, Goat, auch Spur)	Solanaceae	Capsicum frutescens
Paprika (pepper), lang	Solanaceae	Capsicum frutescens longum
Paprika (pepper), Zier-(Ornamental Red), auch Wrinkled	Solanaceae	Capsicum annuum abbreviatum
Paprika (pepper), roter Tabasco-	Solanaceae	Capsicum annuum conoides

Salat, Garten-	Compositae	Lactuca sativa
Salat, Spargel-(Asparagus), auch Sellerie-	Compositae	Lactuca sativa asparagina
Salat, blau (Blue)	Compositae	Lactuca perennis
Salat, blau (Blue), auch Zichorie	Compositae	Lactuca pulchella
Salat, Kopf-, auch Head	Compositae	Lactuca satica capitata
Salat, Romanasalat, auch Longleaf,	Compositae	Lactuca sativa longifolia
Salat, Schnitt-(Crinkle, auch Curled, Cutting, Leaf)	Compositae	Lactuca sativa crispa

Sellerie	Umbelliferae	Apium graveolens dulce
Sellerie, Blanching, auch Garten-	Umbelliferae	Apium graveolens dulce
Sellerie, Wurzel-, auch Turniproote	Umbelliferae	Apium graveolens rapaceum

Aubergine, Garten-	Solanaceae	Solanum melongena

Sorghum	Sorghum	All crop specie

Alfalfa	Leguminosae	Medicago sativum

Karrotte	Umbelliferae	Daucus carota sativa

Bohne, Kletter-(Climbing)	Leguminosae	Phaseolus vulgaris vulgaris
Bohne, Mungobohne-(Sprouts)	Leguminosae	Phaseolus aureus
Bohne, Brasil. breit (Brazilian Broad)	Leguminosae	Canavalia ensiformis
Bohne, Sau-, Puff-, Acker-(Broad)	Leguminosae	Vicia faba
Bohne, Garten-(Common, auch französ., weiße, Kidney-Bohne)	Leguminosae	Phaseolus vulgaris
Bohne, Ägyptische	Leguminosae	Dolichos lablab
Bohne, Spargel-, auch Yardlong	Leguminosae	Vigna sesquipedalis
Bohne, Flügel-(Winged)	Leguminosae	Psophocarpus teragonolobus

Hafer, Saat- auch gewöhnl.	Avena	Sativa
Hafer, Sand-, auch Bristle, Lopsided	Avena	Strigosa
Hafer, Borsten-(Bristle)	Avena

Erbse, auch Gartenerbse (Garden), grün (Green), Shelling	Leguminosae	Pisum, sativum sativum
Erbse,	Leguminosae	Vigna sinensis
Erbse, Zucker-(Edible Podded)	Leguminosae	Pisum sativum axipluum
Erbse, Acker-(Grey)	Leguminosae	Pisum sativum speciosum
Erbse, Flügel-(Winged)	Leguminosae	Tetragonolobus purpureus
Erbse, Mark-(Wrinkled)	Leguminosae	Pisum sativum meduilare

Sonnenblume	Compositae	Helianthus annuus
Kürbis (Squash, Autumn, Winter)	Dicotyledoneae	Cucurbita maxima
Kürbis (Squash, Bush, auch Summer)	Dicotyledoneae	Cucurbita pepo melopepo
Kürbis (Squash, Turban)	Dicotyledoneae	Cucurbita maxima turbaniformis

Gurke	Dicotyledoneae	Cucumis sativus
Gurke, Afrikan., auch Bitter		Momordica charantia
Gurke, wilde-(Squirting, auch Wild)		Ecbalium elaterium
Gurke, Igel-(Wild)		Cucumis anguria

Pappel, Kalifornische	Holzpfl. (Woody-Plant)	Populus trichocarpa
Pappel, Europäische Schwarz-		Populus nigra
Pappel, Gray		Populus canescens
Pappel, lombardische		Populus italica
Pappel, Silber-(Silverleaf), auch weiß		Populus alba
Pappel, Balsam-		Populus trichocarpa
Tabak	Solanaceae	Nicotiana

Arabidopsis thaliana	Cruciferae	Arabidopsis thaliana

Rasen (Turfgrass)	Lolium
Rasen (Turfgrass)	Agrostis
	andere Rasenfamilien
Klee	Leguminosae

Expression von den Polypeptidvarianten in transgenen Pflanzen überträgt ein hohes Maß von Resistenz gegen Herbizide, was den Gebrauch dieser Herbizide während der Kultivierung der transgenen Pflanzen erlaubt.
Methoden für die Einführung von Fremdgenen in Pflanzen sind allgemein bekannt. Nicht-limitierende Beispiele dieser Methoden schließen die Agrobakterium-Infektion, Partikelbombardierung, Polyethylenglykol-(PEG) Behandlung von Protoplasten, Elektroporation von Protoplasten, Mikroinjektion, Makroinjektion, Ähreninjektion, Pollenschlauch-Weg, Trockensameneinsaugung, Laserperforation und Elektrophorese ein. Diese Methoden sind z.B. in B. Jenes et al., und S. W. Ritchie et al. In Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, Ed. S.-D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; und L. Mannonen et al., Critical Reviews in Biotechnology, 14, 287-310, 1994 beschrieben.
In einer bevorzugten Darstellung wird die DNA, die für eine Enzymvariante codiert, in einen DNA-Vektor kloniert, welcher ein Antibiotika-Resistenz-Markergen enthält, und das DNA für das rekombinante Enzym enthaltende Plasmid wird in Agrobakterium tumefaciens, welches ein Ti-Plasmid enthält, eingeführt. Dieses "binäre Vektor-System" wird z.B. in U.S. Patent Nr. 4,490,838 , und in An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3; 1-19 (1988) beschrieben. Das transformierte Agrobakterium wird dann ko-kultiviert mit Blattscheiben der Empfängerpflanze, um eine Infektion und Transformation der Pflanzenzellen zu erlauben. Transformierte Pflanzenzellen werden dann in Regenerationsmedium kultiviert, welches die Bildung von Schösslingen fördert, zuerst in Gegenwart eines geeigneten Antibiotikum für das Selektionieren von transformierten Zellen, dann in Gegenwart von Herbiziden. In Pflanzenzellen, welche erfolgreich mit für herbizid-resistenten Enzymen codierender DNA transformiert wurden, findet Schösslingbildung sogar in Gegenwart von Herbizidmengen statt, welche die Schösslingbildung aus nicht transformierten Zellen inhibierten. Nach Bestätigung des Vorhandenseins von DNA für die Enzymvariante, unter Benützung, zum Beispiel, der Polymerase-Kettenreaktions-(PCR) Analyse, werden die transformierten Pflanzen auf ihre Fähigkeit, der Herbizidspritzung zu widerstehen, und auf ihr Vermögen zur Samenkeimung und Wurzelbildung und Gedeihung in Gegenwart von Herbiziden getestet.
Die Methoden und Zubereitungen der gegenwärtigen Erfindung können für die Herstellung von herbizid-resistenten Enzymvarianten benützt werden, welche in Pflanzen eingeführt werden können, um selektive Herbizid-Resistenz auf Pflanzen zu übertragen. Intermediäre Enzymvarianten (zum Beispiel Varianten, die nicht ganz optimale spezifische Aktivität, aber hohe Herbizid-Resistenz zeigen, oder das Gegenteil) sind nützlich als Muster für den Entwurf von Enzymvarianten der zweiten Generation, welche adäquate spezifische Aktivität und hohe Resistenz behalten.
Gene für Herbizid-Resistenz-Enzyme können in einer oder mehreren Kopien in Spezies von Feldfrüchten transformiert werden, um die Herbizid-Resistenz zu übertragen. Die allgemeine großtechnische Produktion von Nutzpflanzenspezies mit einer reduzierten Empfindlichkeit gegen Herbizide kann:

(1) Das Spektrum und die Flexibilität der Verabreichung von spezifisch wirksamen und umweltfreundlichen Herbiziden erhöhen;
(2) Den kommerziellen Wert dieser Herbizide verstärken;
(3) Den Unkrautanteil in Nutzpflanzenfeldern durch die effektive Nutzung von Herbiziden bei herbizid-resistenten Nutzpflanzenspezies zu reduzieren und den entsprechenden Ernteertrag erhöhen;
(4) Den Verkauf von Samen für herbizid-resistente Pflanzen erhöhen;
(5) Die Resistenz gegenüber der Nutzpflanzenvernichtung wegen des Übertrags von Herbiziden, welche in früherer Pflanzung verabreicht wurden, erhöhen;
(6) Die Anfälligkeit gegenüber Veränderungen der Herbizideigenschaften, resultierend aus ungünstigen klimatischen Bedingungen verringern und
(7) Die Toleranz gegenüber ungleichmässig falsch angewendeten Herbiziden erhöhen.

Zum Beispiel können die transgenen Protein der Enzymvariante enthaltenden Pflanzen kultiviert werden. Die Nutzpflanze kann mit für Unkraut wachstumkontrollierend ausreichender Menge an Herbiziden behandelt werden, gegen welches die transgene Pflanze mit der Enzymvariante resistent ist, resultierend in der Wachstumskontrolle für Unkraut im Nutzpflanzenfeld ohne die kultivierte Nutzpflanze dramatisch zu beeinflussen.
Die Verbindungen, welche durch die oben genannten Screeningmethoden als Inhibitoren entdeckt wurde, können eingesetzt werden als Reinsubstanzen oder als Mischung gemeinsam mit geeigneten Additiven zur Hemmung der Enzyme in Pflanzen, Bakterien oder in Protozoen. Gebräuchliche Additive im Bereich der Herbizide, antibakteriellen Agentien oder Antiprotozoenwirkstoffe können benutzt werden.
Die Erfindung wird nun beschrieben im Hinblick auf spezifische Beispiele.
Beispiel 1
Konstruktion von Expressionsvektoren
(a) pNCO113
2,0 μg des Vektors pQE30 (Qiagen. Hilden, Deutschland) wird mit 30 E (unit) NcoI (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland (NEB)) in einem Gesamtvolumen von 60 μl, das 6 μl NEB4 Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 33 μM jedes dNTP's (NEB) und 5 E Klenow-Fragment der Polymerase I aus E. coli (NEB) wird die Reaktionsmischung für weitere 30 min. bei 25 °C inkubiert. Die Vektor DNA wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 μl des Puffers PB (Qiagen) werden zu 98 μl der PCR-Reaktions-Mischung gegeben und auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wir ein weiteres Mal für 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß gesteckt. 50 μl H₂O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt 1,5 μg gereinigte Vektor DNA.
20 ng Vektor-DNA werden religiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pQE_noNco. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert (Bullock, W. O., Fernandez, J. M., and Short, J. M. (1987). XL1-Blue: a high efficieny Plasmid transforming recA Escherichia coli with β-galactosidase selection. BioTechniques 5, 376-379).
Herstellung elektrokompetenter Zellen: 1 Liter LB-Medium wird im Verhältnis 1:100 beimpft mit einer frischen Übernacht-Kultur. Die Zellen werden bei 37 °C unter Schütteln bei 220 UpM inkubiert bis eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht ist. Die Zellen werden 20 Min. auf Eis gekühlt und 15 Min. bei 4.000 UpM und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird resuspendiert in 1 eiskaltem, sterilem 10 % (v/v) Glycerol. Die Zellen werden ein weiteres mal wie vorher beschrieben zentrifugiert und in 0,5 l bzw. 20 ml 10 % eiskaltem, sterilem Glycerol resuspendiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und das Pellet wird resuspendiert in 2 ml eiskaltem 10 % (v/v) Glycerol. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 μl eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
Elektrotransformation mit dem Gene Pulser Apparat von BioRad (München, Deutschland): Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 μl der Zellsuspension werden mit 2 μl der Ligationsmixtur gemischt und in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Küvette (BioRad) eingefüllt. Die Suspension wird durch Schütteln auf den Küvettenboden gebracht und die Küvette wird in den vorgekühlten Schlitten eingesetzt. Der Schlitten wird in die Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,50 kV, 25 μF und Pulse Controller Stellung 200 Ω gepulst. Die Küvette wird aus dem Schlitten entfernt und die Zellen werden suspendiert in 1 ml SOC-Medium (2 % (w/v) Casein Hydrolysat, 0,5 % (w/v), Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ und 20 mM Glukose). Die Sus pension wird 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt. 100 μl der Suspension werden auf LB-Platten mit einem Gehalt von 150 mg Ampicillin/Liter plattiert zwecks Erhaltung des Plasmids pQE_noNco.
Escherichia coli XL1-Blue Zellen welche den Expressionsvektor pQE_noNco enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 Min. bei 5.000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pQE_noNco mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 30 μg RNase A werden zugefügt. 0,3 ml einer 1 % SDS-Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 Min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 Min. bei 14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit einer Lösung von 750 mM NaCl, 15 % (v/v) Ethanol und 0,15 % (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1250 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 μl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt 8,3 μg Vektor-DNA pQE_noNco.
Die DNA-Sequenz des Plasmids pQE_noNco wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode sequenziert (Sanger, F., S. Nicklen, und A. R. Coulson. (1977). DNA sequence analysis with chain terminating inhibitors. Proc. Acad. Natl. Sci. USA 74, 5463-5468) unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer (Norwalk, USA) mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions (Foster City, USA) sequenziert. Die DNA-Sequenz stimmt mit der erwarteten überein.
2,0 μg des Vektors pQE-noNco werden mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl, das 6 μl EcoRI-Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Std. bei 37 °C inkubiert. Die Vektor-DNA wird unter Benützung des PCR-Reinigungskit gereinigt. 25 pMol der Oligonukleotide 5'-CACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGGAGGATCCGTCGACCTGCAGCC-3' und 5'-GGCTGCAGGTCGACGGATCCTCCCATGGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATTCTGTGTG-3' werden in 6 μl EcoRI-Puffer (NEB) und 54 μl H₂O gelöst. Die Lösung wird 2 Min. bei 96 °C erhitzt und innerhalb 12 Std. auf 10 °C abgekühlt, um den DNA-Linker zu hybridisieren. Die Reaktionsmischung wird mit 30 E EcoRI und 30 E SalI (NEB) versetzt und 3 Std. bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionsmischung wird 30 Min. bei 65 °C erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren, und innerhalb 12 Std. auf 10 °C zur Hybridisierung abgekühlt. Die Reaktionsmischung enthält ungefähr 730 ng des DNA-Linkers.
20 ng der verdauten pQE_noNco Vektor-DNA (siehe oben) und 300 pg des DNA-Linkers werden ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCO113. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
5 μg DNA des Plasmids pNCO113 werden isoliert und die DNA-Sequenz des Vektors pNCO113 wird sequenziert wir oben beschrieben. Die DNA-Sequenz ist in Anhang F gezeigt. Die Kultur wurde als Patenthinterlegung bei ATCC unter dem Titel "Escherichia coli strain XL1-Blue harbouring plasmid pNCO113" hinterlegt, zugewiesen PTA-852, Datum der Hinterlegung 14. Oktober 1999.
(b) pNCO-SB-H₆ACYC184 (Expression von His₆-X Fusionsproteinen)
5,0 μg des Vektors pACYC184 (New England Biolabs (NEB), Schwalbach, Deutschland) wird mit 30 E (unit) NcoI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl, das 6 μl NEB4 Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Stunden bei 37 °C inkubiert und auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt. Ein 2,2 kB NcoI/BamHI DNA-Fragment wird aus dem Gel entnommen und mit dem QIAquick Gelextraktionskit von Qiagen (Hilden, Deutschland) gereinigt. Zu 500 mg Gelstückchen werden 1500 μl QG-Puffer gegeben, und die Mischung wird bei 50 °C 10 Minuten inkubiert. 500 μl Isopropanol werden zugegeben, und die Mischung wird auf eine Qiaquick-Säule aufgetragen und 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wir ein weiteres Mal für 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß gesteckt. 50 μl H₂O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt 1,5 μg gereinigtes DNA-Fragment NB-ACYC184.
3 μg des Vektors pNCO113 wird mit 30 E NcoI (NEB) und 40 E BamHI (NEB) in einem Volumen von 70 μl enthaltend 7 μl NEB4-Puffer verdaut. Die Reaktionsmischung wird 3 h bei 37 °C inkubiert. Der NcoI/BamHI-verdaute pNCO113-Vektor wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen verdaut. 210 μl PB-Puffer werden zu den 70 μl der Restriktionsmischung gegeben, und die Mischung wird auf eine Quiaquick-Spinsäule aufgetragen und 1 Minute bei 14000 U/min zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml des Puffers PE (Qiagen) werden auf die Säule gegeben und wie oben zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die Säule wird ein weiteres Mal für 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird in ein sauberes Eppendorf-Gefäß gesteckt. 50 μl H₂O (bidestilliert, steril) werden auf die Säule gegeben und sie wird 1 min. bei 14000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf enthielt 1,4 μg des gereinigten NcoI/BamHI-verdauten Vektors pNCO113.
20 ng Vektor-DNA und 10 ng des NB-ACYC184 DNA-Fragments werden ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco-BRL) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCO-NB-ACYC184. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert (Bullock, W. O., Fernandez, J. M., and Short, J. M. (1987). XL1-Blue: a high efficieny Plasmid transforming recA Escherichia coli with β-galactosidase selection. BioTechniques 5, 376-379).
Herstellung elektrokompetenter Zellen: 1 Liter LB-Medium wird im Verhältnis 1:100 beimpft mit einer frischen Übernacht-Kultur. Die Zellen werden bei 37 °C unter Schütteln bei 220 UpM inkubiert bis eine optische Dichte von 0,5 bei 600 nm erreicht ist. Die Zellen werden 20 Min. auf Eis gekühlt und 15 Min. bei 4.000 UpM und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird resuspendiert in 11 eiskaltem, sterilem 10 % (v/v) Glycerol. Die Zellen werden ein weiteres mal wie vorher beschrieben zentrifugiert und in 0,5 l bzw. 20 ml 10 % eiskaltem, sterilem Glycerol resuspendiert. Die Zellen werden erneut zentrifugiert und das Pellet wird resuspendiert in 2 ml eiskaltem 10 % (v/v) Glycerol. Diese Suspension wird in Aliquots von 80 μl eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert.
Elektrotransformation mit dem Gene Pulser Apparat von BioRad (München, Deutschland): Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut. 40 μl der Zellsuspension werden mit 2 μl der Ligationsmixtur gemischt und in eine vorgekühlte, sterile 0,2 cm Küvette (BioRad) eingefüllt. Die Suspension wird durch Schütteln auf den Küvettenboden gebracht und die Küvette wird in den vorgekühlten Schlitten eingesetzt. Der Schlitten wird in die Kammer geschoben und die Zellen werden bei 2,50 kV, 25 μF und Pulse Controller Stellung 200 Ω gepulst. Die Küvette wird aus dem Schlitten entfernt und die Zellen werden suspendiert in 1 ml SOC-Medium (2 % (w/v) Casein Hydrolysat, 0,5 % (w/v), Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ und 20 mM Glukose). Die Suspension wird 1 Stunde bei 37 °C geschüttelt. 100 μl der Suspension werden auf LB-Platten mit einem Gehalt von 150 mg Ampicillin/Liter plattiert zwecks Erhaltung des Plasmids pNCO-NB-ACYC184.
Escherichia coli XL1-Blue Zellen welche den Expressionsvektor pNCO-NB-ACYC184 enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 Min. bei 5.000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pNCO-NB-ACYC184 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 30 μg RNase A werden zugefügt. 0,3 ml einer 1 % SDS-Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben und die Mischung wird 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 Min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 Min. bei 14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit einer Lösung von 750 mM NaCl, 15 % (v/v) Ethanol und 0,15 % (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1250 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 μl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthält 7,5 μg der Vektors-DNA pNCO-NB-ACYC184.
Die DNA-Sequenz des Plasmids pNCO-NB-ACYC184 wird nach der automatischen Dideoxynukleotid-Methode sequenziert (Sanger, F., S. Nicklen, und A. R. Coulson. (1977). DNA sequence analysis with chain terminating inhibitors. Proc. Acad. Natl. Sci USA 74, 5463-5468) unter Benutzung eines ABI Prism 377 DNA-Sequenators von Perkin Elmer (Norwalk, USA) mit der ABI Prism Sequencing Analysis Software von Applied Biosystems Divisions (Foster City, USA) sequenziert. Die DNA-Sequenz stimmt mit der erwarteten überein.
4,0 μg des Vektors pNCO-NB-ACYC184 werden mit 30 E NcoI und 30 E SalI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl, das 6 μl EcoRI-Puffer enthält, verdaut. Die Reaktionsmischung wird für 3 Std. bei 37 °C inkubiert. Die Vektor-DNA wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und unter Benützung des PCR-Reinigungskit gereinigt. 2,1 μg DNA werden erhalten.
Je 1 nmol der Oligonukleotide 5'-CATGCACCACCCCACCACCACGCGTCCATGGCCGC-3' und 5'-GGCCATGGACGCGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3' werden in 15 μl 66 mM MgCl2, 0,5 mM NaCl, 10 mM DTT und 66 mM Tris-hydrochlorid pH 7,6 gelöst. Wasser wird bis auf ein Endvolumen von 100 μl zugegeben, und die Reaktionsmischung wird auf 94 °C 15 Minuten erhitzt. Nach Erhitzen für weitere 15 Minuten auf 60 °C, wird die Reaktionsmischung innerhalb von 1 Std. auf Raumtemperatur zur Hybridisierung des His-tag DNA-Linkers abgekühlt.
20 ng der verdauten Vektor-DNA (siehe oben) und 300 pg des DNA-Linkers werden ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco-BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco-BRL) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCO-SB-H6-ACYC184. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
4,5 μg DNA des Plasmids pNCO-SB-H6-ACYC184 werden isoliert, und die DNA-Sequenz des Vektors pNCO-SB-H6-ACYC184 wird sequenziert wie oben beschrieben. Die DNA-Sequenz ist in Annex F2 gezeigt.
Beispiel 2
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektor für ygbP von E. coli
Escherichia coli XL1-Blue Zellen, welche den Expressionsvektor pNCO113 enthalten, werden über Nacht in Luria Bertani (LB) Medium kultiviert. Das Medium enthält 180 mg/Liter Ampicillin um den Verlust des Plasmids aus den Wirtszellen zu verhindern. 7 ml Kultur werden 20 Min. bei 5.000 UpM zentrifugiert. Das Zellpellet wird zur Isolierung des Plasmids pNCO113 mit dem Miniplasmidisolation-Kit von Qiagen (Hilden, Deutschland) benutzt. Das Zellpellet wird resuspendiert in 0,3 ml 10 mM EDTA in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0. 30 μg RNase werden zugefügt. 0,3 ml einer 1 % SDS-Lösung (w/v) in 200 mM Natriumhydroxid werden zugegeben, und die Mischung wird 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. 0,3 ml einer gekühlten 3,0 M Natriumacetat-Lösung, pH 5,5 werden zugefügt und die Mischung wird 10 Min. auf Eis inkubiert. Die Mischung wird 15 Min. bei 14.000 UpM in einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wird auf ein Qiagensäulchen gegeben, das vorher äquilibriert wurde mit 1 ml einer Lösung von 750 mM NaCl, 15 % (v/v) Ethanol und 0,15 % (v/v) Triton X-100 in 50 mM MOPS, pH 7,0. Das Qiagensäulchen wird vier mal gewaschen mit 1 ml einer Lösung von 1000 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM MOPS, pH 7,0. Die DNA wird mit 0,8 ml einer Lösung von 1250 mM NaCl und 15 % (v/v) Ethanol in 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,5 eluiert. Die DNA wird mit 0,56 ml Isopropanol gefällt, 30 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert und mit 1 ml eiskaltem 70 % (v/v) Ethanol gewaschen. Nach 5-minütiger Trocknung in einer Vakuumzentrifuge wird die DNA in 50 μl bidestilliertem Wasser gelöst. Die Lösung enthielt 8,3 μg DNA.
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird nach einer von Meade et al., (Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, C. B., Brown, S. E., und Auswald, F. M. (1982). Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122) beschriebenen Methode isoliert. Der E. coli ORF ygbP (Accession Nr. gb AE000358) von Basenpaar (bp) Position 6754 bis 7464 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers AAATTAACCATGGCAACCACTCATTTGG, 25 pMol des Primers TTGGGCCTGCAGCGCCAAAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen für jeweils 30 Sek. bei 94 °C, 30 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 7 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reingungskit von Qiagen gereinigt. 500 μl Puffer PB (Qiagen) werden zu 98 μl der PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule geladen und wie vorher zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gestellt. 50 μl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule aufgetragen, die anschließend 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss enthielt 1,5 μg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 μg des Vektors pNCO113 und 1,5 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Produkte mit überlappenden Enden herzustellen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 μl NEB3 Puffer (NEB), 7 μg BSA, 40 E NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischung wird 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA und PCR-Produkte werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 16 ng PCR-Produkt werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCOygbP. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert, mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert.
Das Plasmid pNCOygbP wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert.
Das DNA-Insert des Plasmids pNCOygbP wird wie in Beispiel 1 beschrieben, sequenziert.
Beispiel 3a
Konstruktion eines Expressionsvektor für ygbP aus A. thaliana ohne Leadersequenz
1 g 2 Wochen alte Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stengel und Blätter) werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. 8 ml einer sterilen Lösung, die pro Liter 600 g Guanidinthiocyanat, 5 g Natrium-N-laurylsarcosin, 50 mM Trinatriumcitrat und 5 ml 2-Mercaptoethanol enthält, werden zugefügt. Die Mischung wird vorsichtig zu 3 ml einer autoklavierten Lösung mit einem Gehalt (pro Liter) von 959 g CsCl₂ und 37,2 g EDTA zugefügt. Die Mischung wird bei 33.000 UpM und 18 °C 24 Stunden zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird 10 Min. an der Luft getrocknet. Das trockene Pellet wird in 360 μl sterilem, bidestilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wird bei 14.000 UpM 10 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird mit 40 μl 3 M Natriumacetat und 1 ml Ethanol gemischt. RNA wird über Nacht bei –20 °C gefällt, bei 14.000 UpM und 4 °C 15 Min. zentrifugiert und zwei mal mit 500 μl 75 % Ethanol gewaschen. Der Niederschlag wird luftgetrocknet und in 200 μl bidestilliertem, sterilem Wasser aufgenommen. 500 μg RNA werden erhalten.
Eine Mischung mit einem Gehalt von 2,75 μg RNA, 50 nMol dNTP's, 1 μg hexamere Randomprimer, 1 μg T₁₅-Primer und 20 % first strand 5 × Puffer (Promega) in einem Gesamtvolumen von 50 μl wird bei 95 °C 5 Min. inkubiert und auf Eis gekühlt. 500 E M-MLV reverse Transkriptase (Promega) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 42 °C inkubiert. Nach Inkubation bei 92 °C für 5 Min. werden 20 E RNase A und 2 E RNase H zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert. Die resultierende cDNA (1 μl dieser Mixtur) wird für die PCR-Amplifizierung von ygbP benutzt.
Der Expressionsvektor pNCO113 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben. Der A. thaliana ORF ygbP (Accession Nr. gb AL004136) ohne die codierende Region für die vermutete Signalsequenz wird von Basenpaar (bp) Position 79845 bis 81915 durch PCR amplifiziert unter Verwendung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers TTGTTGTGAAGGAGAAGAGTG, 25 pMol des Primers CATGCATACCCTTGACACGTC, 1 μg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 1,5 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
Das PCR-Amplifikat wird als Matrize für eine zweite PCR Reaktion benützt. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol Primer CAATGTTGTTGCCATGGAGAAG, 25 pMol Primer ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG, 2 μl des ersten PCR-Amplifikats, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8.8 und 0.1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben. Dabei werden 1,2 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten. 2,0 μg des Vektors pNCO113 (isoliert wie in Beispiel 2 beschrieben) und 1,5 μg des gereinigten PCR Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco) und 2 μl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCOygbPara erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. 2 μl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pNCOygbPara wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Ergebnis ist in Annex Da gezeigt.
Beispiel 3b
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für das vollständige ygbP aus Arabidopsis thaliana
1 g 2 Wochen alte Arabidopsis thaliana var. Columbia Pflanzen (Stengel und Blätter) werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und homogenisiert. 8 ml einer sterilen Lösung, die pro Liter 600 g Guanidinthiocyanat, 5 g Natrium-N-laurylsarcosin, 50 mM Trinatriumcitrat und 5 ml 2-Mercaptoethanol enthält werden zugefügt. Die Mischung wird vorsichtig zu 3 ml einer autoklavierten Lösung mit einem Gehalt (pro Liter) von 959 g CsCl₂ und 37,2 g EDTA zugefügt. Die Mischung wird bei 33.000 UpM und 18 °C 24 Stunden zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und der Niederschlag wird 10 Min. an der Luft getrocknet. Das trockene Pellet wird in 360 μl sterilem, bidestilliertem Wasser aufgenommen. Die Lösung wird bei 14.000 UpM 10 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird mit 40 μl 3 M Natriumacetat und 1 ml Ethanol gemischt. RNA wird über Nacht bei –20 °C gefällt, bei 14.000 UpM und 4 °C 15 Min. zentrifugiert und zwei mal mit 500 μl 75 % Ethanol gewaschen. Der Niederschlag wird luftgetrocknet und in 200 μl bidestilliertem, sterilem Wasser aufgenommen. 500 μg RNA werden erhalten.
Eine Mischung mit einem Gehalt von 2,75 μg RNA, 50 nMol dNTP's, 1 μg hexamere Randomprimer, 1 μg T₁₅-Primer und 20 % first strand 5 × Puffer (Promega) in einem Gesamtvolumen von 50 μl wird bei 95 °C 5 Min. inkubiert und auf Eis gekühlt. 500 E M-MLV reverse Transkriptase (Promega) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 42 °C inkubiert. Nach Inkubation bei 92 °C für 5 Min. werden 20 E RNase A und 2 E RNase H zugefügt. Die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert. Die resultierende cDNA (1 μl dieser Mixtur) wird für die PCR-Amplifizierung von ygbP benutzt.
Der Expressionsvektor pQE30 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben. Der vollständige A. thaliana ORF ygbP (Accession Nr. gb AL004136) ohne die codierende Region für die vermutete Signalsequenz wird von Basenpaar (bp) Position 19412 bis 21482 durch PCR amplifiziert unter Verwendung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-CTTCTCTCAGGCGAGATAAAACATGG-3', 25 pMol des Primers 5'-CATGCATACCCTTGACACGTC-3', 1 μg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 1,7 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
Das PCR-Amplifikat wird als Matrize für eine zweite PCR Reaktion benützt. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol Primer 5'-GGCGAGAGGATCCATGGCGATGTCTCAGACG-3', 25 pMol Primer 5'-ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG-3', 2 μl des ersten PCR-Amplifikats, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einer Lösung mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8.8 und 0.1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben. Dabei werden 1,2 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten. 2,0 μg des Vektors pQE30 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 1,5 μg des gereinigten PCR Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco) und 2 μl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pQEygbParakom erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. 2 μl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbParakom wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben und ist nicht identisch mit der kalkulierten cDNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AC004136). Die DNA- und die zugehörige Aminosäuresequenz des kompletten ygbP-Gens aus A. thaliana sind in Annex Db gezeigt.
Beispiel 4
Herstellung und Reinigung von rekombinanter YgbP-Protein aus E. coli
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCOygbP enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37 °C bebrütet. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000 UpM, 4 °C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentrifugiert wie oben beschrieben und bei –20 °C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt von 1 mM Dithioerythritol und 0,02 % Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg Lysozym pro ml und 10 μg DNaseI pro ml. Die Mischung wird bei 37 °C 1 Stunde inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15.000 UpM und 4 °C 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (4,6 × 24 cm, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit 200 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird bei 280 nm photometriert. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird von der Säule mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 26 kDa. Fraktionen mit diese Proteinbande werden gesammelt und gegen Puffer A über Nacht dialysiert. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule aus Red Sepharose CL-6B (2,6 × 10 cm, Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer A äquilibriert wurde. Nach Durchgang durch die Säule wird das Enzym auf eine Source 15Q-Säule (Volumen, 20 ml; Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Das Enzym wird eluiert mit einem Gradienten aus 0-0,5 M Natriumchlorid in 250 ml Puffer A.
Die Homogenität von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Beispiel 5
Herstellung und Reinigung von rekombinantem YgbP-Protein aus A. thaliana ohne Leadersequenz
Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pNCOygbPara werden kultiviert, induziert und geerntet wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Zellen (2 g) werden in 30 ml Puffer A (50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM DTE, 0,02 % Natriumazid) suspendiert in Anwesenheit von 12 mg Lysozym und 1,2 mg DNaseI. Die Suspension wird bei 37 °C 30 Min. inkubiert. Die Extraktion erfolgt durch Ultraschallbehandlung wie in Beispiel 4 beschrieben. Zelltrümmer werden entfernt durch Zentrifugation bei 15.000 UpM für 30 Min. Der zellfreie Extrakt wird auf eine Sepharose QFF Säule (2,6 × 10 cm) aufgebracht, welche äquilibriert wurde mit Puffer A bei einer Flussrate von 3 ml/min. Die Säule wird mit Puffer A gewaschen. Das Eluat wird bei 280 nm photometriert. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase aus A. thaliana wird mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M NaCl in Puffer A eluiert. Fraktionen, die das Enzym enthalten werden vereinigt. Das Volumen der vereinigten Fraktionen wird durch Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) auf ca. 2 ml eingeengt. Die konzentrierte 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase von A. thaliana wird auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule bei einer Flussrate von 2 ml aufgebracht. Puffer A mit einem Gehalt von 100 mM NaCl dient als Laufpuffer. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Das Elutionsvolumen von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase von A. thaliana ist 140 ml. Die Homogenität von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase von A. thaliana wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese beurteilt.
Beispiel 6
Herstellung von D-Erythritol-4-phosphat
Das Natriumsalz von D-Erythose-4-phosphat (14,6 mg, 65,7 μMol) wird in 600 μl 40 % (v/v) Methanol gelöst. Natriumborhydrid wird zugefügt. Der Reaktionsfortschritt wird überprüft durch Aldehydnachweis nach der Methode von Stahl (Bollinger, H. R., Brenner, M., Gänshirt, H., Mangold, H. K., Seiler, H., Stahl, E. und Waldi, D. (1962) In: Dünnschicht-Chromatographie; Ein Laboratoriumshandbuch (ed. Stahl, E.) Springer Verlag, Berlin, Göttingen, Heidelberg). Nach Verbrauch des Aldehyds wird der pH-Wert der Lösung mit Essigsäure auf 4-5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird lyophilisiert, dabei wird D-Erythritol-4-phosphat in fester Form erhalten.
¹H-NMR (500 MHz, D₂O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,20-3,55 (m, 1H), 3,60-3,67 (m, 2H), 3,68-3,71 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 1H), 3,88-3,92 (m, 1H).
Beispiel 7
Herstellung von D-Ribitol-5-phosphat
Das Natriumsalz von D-Ribose-5-phosphat (18,5 mg, 67,5 μMol) wird in 600 μl 40 % (v/v) Methanol gelöst. Natriumborhydrid wird zugefügt. Der Reaktionsfortschritt wird durch Aldehydnachweis nach der Methode von Stahl (Bollinger, H. R., Brenner, M., Gänshirt, H., Mangold, H. K., Seiler, H., Stahl, E. und Waldi, D. (1962) In: Dünnschicht-Chromatographie; Ein Laboratoriumshandbuch (ed. Stahl, E.) Springer Verlag, Berlin, Göttingen, Heidelberg) ermittelt. Nach Verbrauch des Aldehyds wird der pH-Wert der Lösung mit Essigsäure auf 4-5 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird lyophilisiert und liefert D-Ribitol-5-phosphat als Festsubstanz.
¹H-NMR (500 MHz, D₂O, pH 7) d (ppm) 1,81 (s, Acetat), 3,54 (dd, J = 11,9 Hz, J = 7,1 Hz, 1H), 3,63 (t, J = 3,3 Hz, 1H), 3,69 (dd, J = 11,9 Hz, J = 3,0 Hz, 1H), 3,73-3,76 (m, 1H), 3,80-3,87 (m, 2H), 3,93 (ddd, J = 2,9 Hz, J = 5,8 Hz, J = 8,6 Hz, 1H).
Beispiel 8
Screening der 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase
8.1 Mittels spektrophotometrischer Methode

Rekombinante 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-Synthase wird bestimmt durch einen spektralphotometrischen Test bei 340 nm. Dabei wird das anorganische Pyrophosphat, welches aus der Reaktion von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und CTP gebildet wird, verbraucht in einer Kaskade von Folgereaktionen, welche zur Reduktion von NADP⁺ führen. Reaktionsmischungen enthielten 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 200 μM 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 200 μM CTP, 5 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 1 μM Glukose-1,6-bisphosphat, 500 μM UDP-Glukose, 174 μM NADP⁺, 0,125 E UDP-Glukosepyrophosphorylase, 0,16 E Phosphoglukomutase und 1 E Glukose-6-phosphatdehydrogenase, verschiedene Konzentrationen von D-Erythritol-4-phosphat bzw. D-Ribitol-5-phosphat entsprechend Tabelle 4 und 10 μl Enzym in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Eine Enzymeinheit ist definiert als die Enzymmenge, welche die Umwandlung von 1 μMol Substrat pro Minute bei 37 °C katalysiert. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 4. Tabelle 4. Hemmung von YgbP durch D-Erythritol-4-phosphat und D-Ribitol-5-phosphat

Test Komponente Konzentration (mM)	D-Erythritol-4-phosphat Spezifische Aktivität (μMolmin^–1mg^–1)	D-Ribitol-5-phosphat Spezifische Aktivität (μMolmin^–1mg^–1)
0	17,2 (100 %)	16,1 (100 %)
0,2	15,9 (92 %)	16,5 (102 %)
0,4	15,9 (92 %)	n.d.^a
0,8	12,9 (75 %)	n.d.
1,6	5,9 (34 %)	16,9 (105)
3,2	0 (0 %)	n.d.

^a nicht bestimmt

8.2 Mittels radiochemischer Screeningmethode
Reaktionsmischungen mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 20 mM Natriumfluorid, 10 mM MgCl₂, 100 μM CTP, 10 nCi [2-¹⁴C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, verschiedene Konzentrationen von D-Erythritol-4-phosphat bzw. D-Ribitol-5-phosphat entsprechend Tabelle 4 und YgbP Protein werden bei 37 °C 20 Min. inkubiert. Die Reaktion wird beendet durch Zugabe von 20 μl Methanol. Nach Zentrifugation werden Aliquots auf Polygram Sil-NHR Dünnschichtplatten (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) aufgetragen. Diese werden mit einer Mischung von n-Propanol/Ethylacetat/Wasser (6:1:3, v/v) entwickelt. Radioaktivität wird mit einem Phosphor (mager (Storm 860, Molecular Dynamics, USA) ermittelt. Der R_f-Wert des Produkts ist 0,36. Es werden ähnlich Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 8.1.
8.3 Mittels kernmagnetischen Resonanz (NMR) Messungen
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 5 mM CTP, 5 mM 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, verschiedene Konzentrationen von D-Erythritol-4-phosphat bzw. D-Ribitol-5-phosphat entsprechend Tabelle 4 und 0,1 mg YgbP Protein aus rekombinantem E. coli wird bei 37 °C 1 Stunde inkubiert. Der Reaktionsfortschritt wird durch ³¹P-NMR-Messung festgestellt. ³¹P NMR-Spektren werden gemessen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85 % H₃PO₄. Das Produkt zeigte zwei ³¹P NMR Dubletts bei –7,2 ppm und –7,8 ppm. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten wie in Beispiel 8.1.
Beispiel 9
Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 mM CTP, 0,12 μCi [2-¹⁴C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, 46 mM 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat und 225 μg YgbP Protein aus rekombinanten E. coli Zellen wird 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch ³¹P NMR-Messung verfolgt. Das Produkt, welches zwei ³¹P NMR Dubletts bei –7,2 ppm und –7,8 ppm zeigt, wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm) mit einem Eluenten aus 0,1 M Ammoniumformiat in 40 % (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1 ml/min getrennt. Das Eluat wird mit einem UV-Diodenarray Detektor (J&M TIDAS) und einem Radiometer von Berthold analysiert. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol wird bei 30 ml eluiert. Die Fraktion, welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol enthält wird gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen.
Beispiel 10
Identifizierung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
¹H NMR und ¹H entkoppelte ¹³C NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AVANCE DRX 500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland. Die Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz und 125,6 MHz für ¹H bzw. ¹³C. Die chemischen Verschiebungen werden auf externes Trimethylsilylpropansulfonat referenziert. Zweidimensionale Korrelationsexperimente (gradient enhanced double quantum filtered COSY, HMQC) werden mit XWINNMR Software von Bruker ausgeführt. ³¹P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85 % H₃PO₄.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale NMR-Spektroskopie (Tabelle 5). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert durch zwei ³¹P NMR-Signale bei –7,2 ppm und –7,8 ppm (Dubletts mit ³¹P-³¹P Kopplungskonstanten von jeweils 20 Hz). Ein ³¹P NMR-Signal für das Substrat 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (Singulet bei 4,9 ppm) fehlt. Der beobachtete Bereich der ³¹P NMR-Verschiebung ebenso wie die ³¹P-³¹P-Kopplung besagt, dass die unbekannte Verbindung ein Pyrophosphat ist. Zum Vergleich werden die ³¹P NMR-Signale von Cytidindiphosphat (CDP) als Dubletts bei –5,1 ppm und –7,6 ppm mit Kopplungskonstanten von jeweils 21,5 Hz (²J_PP) bestimmt.
Die Anwesenheit von Phosphoratomen in der unbekannten Verbindung zeigt sich auch im ¹³C Spektrum, wo vier von 14 Signalen Kopplung mit ³¹P zeigten (³¹P-¹³C Kopplungskonstanten im Bereich von 9 Hz bis 5 Hz).

Die ¹H und ¹³C NMR-Signale werden weiterhin analysiert durch zweidimensionale COSY und HMQC Experimente. Während die beobachteten chemischen Verschiebungen verschieden sind von CDP und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, stimmen die Korrelationsmuster im homonuklearen ¹H-¹H COSY und im heteronuklearen ¹H-¹³C HMQC Experiment exakt überein mit den Korrelationssignaturen von CDP (entsprechend den Spinsystemen der Ribosyleinheit und der Cytosineinheit) und von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat. Dieses Resultat erweist die Struktur des Produkts als das Diphosphocytidyladdukt von 2C-Methyl-D-erythritol. Tabelle 5. NMR-Daten von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol

Position	chemische Verschiebung, ppm				Kopplungskonstanten, Hz
Position	¹H	¹³C	³¹P	J_HH	J_PH	J_PC	J_PP
1	3.36 (d, 1H)^a	66.24 (s)^b		11.7 (1*)^c
1*	3.48 (d, 1H)			11.7 (1)
2		73.76 (s)
2-Me	1.02 (s)	18.13 (s)
3	3.72 (dd, 1H)	73.27 (d)		8.3 (4), 2.7 (4*)		7.5
4	3.85 (ddd, 1H)	66.87 (d)		11.0 (4*), 8.3 (3)	6.8	5.7
4*	4.10 (ddd, 1H)			11.0 (4), 2.7 (3)	6.1
1'	5.68 (d, 1H)	89.25 (s)		4.1 (2')
2'	4.24 (m, 1H)	74.21 (s)
3'	4.21 (m, 1H)	69.09 (s)
4'	4.17 (m, 1H)	82.83 (d)				9.1
5'	4.10 (m, 1H)	64.41 (d)				5.5
5'*	4.17 (m, 1H)
Cyt-2		163.87 (s)
Cyt-4		170.51 (s)
Cyt-5	6.09 (d, 1H)	95.99 (s)		7.8 (Cyt-6)
Cyt-6	7.96 (d, 1H)	142.46 (s)		7.8 (Cyt-5)
P			–7.2 (d)^d				19.6
P*			–7.8 (d)				20.4

^a referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat. Die Multiplizitäten und die relativen Integralwerte von Signalen im ¹H NMR-Spektrum sind in Klammern angegeben.
^b referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulonat. Die Multiplizitäten der ¹H-entkoppelten ¹³C NMR-Signale sind in Klammern angegeben.
^c Kopplungspartner entsprechend den zweidimensionalen COSY-Experimenten sind in Klammern angegeben.
^d referenziert auf externe 85 % Orthophosphorsäure. Die Multiplizitäten der ¹H-entkoppelten ³¹P NMR-Signale sind in Klammern angegeben.

Beispiel 11
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für ychB aus E. coli
Chromosomale DNA aus Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird nach einer von Meade et al., (Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, C. B., Brown, S. E., und Auswald, F. M. (1982). Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122) beschriebenen Methode isoliert.
Der offene Leserahmen ychB aus E. coli (Accession Nr. gb AE000219) wird von bp Position 5720 bis 6571 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-GAGGAGAAATTAACCATGCGGACACAGTGGCC-3', 25 pMol des Primers 5'-GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Dann werden 25 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 Sek. bei 94 °C, 30 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 7 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. Es werden 1,5 μg des gereinigten PCR-Produkts erhalten.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG-3', 25 pMol des Primers 5'-GTCACCGAACTGCAGCTTGCCCG-3', 2 μl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
2,0 μg des Vektors pNCO113 und 1,5 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 6 μl NEB3 Puffer, 6 μg BSA, 30 E EcoRI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 18 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCOychB gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert und 100 μl der Zell/DNA-Suspension wird auf LB-Platten, die 150 mg/l Ampicillin zur Erhaltung des Plasmids pNCOychB enthalten, ausplattiert. Das Plasmid pNCOychB wird wie vorher beschrieben isoliert. 9 μg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOychB wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000219).
Beispiel 12a
Klonierung des ychB-Gens aus A. thaliana ohne Leadersequenz
Arabidopsis cDNA wird wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die resultierende cDNA (1 μl der Mischung) wird für die Amplifikation von ychB mittels PCR verwendet.
Der Expressions-Vektor pNCO113 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Der A. thaliana ORF ychB ohne die codierende Region für die vermutete Präsequenz wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-CTGATGAGAGGCTTAATAAGATAGG-3', 25 pMol des Primers 5'-TTACATGTTTGTAACATCTCATTGG-3', 1 μg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Dann werden 40 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 20 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt. Es werden 2,1 μg des gereinigten PCR-Produkts erhalten.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-GTTGACACCATGGCTCCTTTGTCC-3', 25 pMol des Primers 5'-TGTTTGTCTGCAGCTCATTGGAAATCC-3', 2 μl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 2 beschrieben. 2,4 μg des gereinigten PCR-Produkts werden erhalten. 2,0 μg des Vektors pNCO113 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 2,5 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 6 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 30 E NcoI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 23 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCOychBara gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Das Plasmid pNCOychBara wird wie vorher beschrieben isoliert. 6 μg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCOychBara wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben. Das entsprechende Protein ist identisch mit der berechneten Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE005168) wie gezeigt in Annex Ea.
Beispiel 12b
Konstruktion eines Expressionsvektors und Herstellung eines Expressionsklons für das vollständige ychB Gen aus A. thaliana
Die cDNA von A. thaliana wird wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt.
Die resultierende cDNA (1 μl der Mischung) wird für die Amplifikation von ychB mittels PCR verwendet.
Der Expressions-Vektor pQE30 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Der komplette A. thaliana ORF ychB (Accessions-Nr. gb AC005168) von Basenpaar-(bp) Position 82996 bis 85396 wird durch PCR amplifiziert unter Benutzung von cDNA aus A. thaliana als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-GGTGACATATCAGATCAAAGAG-3', 25 pMol des Primers 5'-TTACATGTTTGTAACATCTCATTGG-3', 1 μg cDNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Dann werden 40 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94 °C, 60 Sek. bei 50 °C und 90 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 20 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Es werden 1,9 μg des gereinigten PCR-Produkts erhalten.
Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers 5'-AGAAACAGGATCCATGGCAACGGCTTCTCCTCCTCC-3', 25 pMol des Primers 5'-ACACGTCTTCTGCAGAAGTAAATG, 2 μl der ersten PCR-Reaktion, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischungen werden 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 40 PCR-Zyklen mit 60 Sek. bei 94 °C, 60 Sek. bei 50 °C und 90 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. 1,4 μg des gereinigten PCR-Produkts werden erhalten. 2,0 μg des Vektors pQE30 und 1,5 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 6 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 30 E BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 60 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 12 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCOychBara gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEychBarakom wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die DNA- und die zugehörige Aminosäuresequenz des kompletten ychB-Gens aus A. thaliana sind in Annex Eb gezeigt.
Beispiel 12c
Konstruktion eines synthetischen Gens und eines Expressionsvektors für ychB aus Lycopersicon esculentum (Tomate) ohne Leadersequenz
Eine cDNA-Bibliothek von Tomaten-Blättern wird wie von Schmid J. et al. 1992 (Schmid J., Schaller A., Leininger U., Boll W. and Amrhein N. (1992). The in-vitro synthesizes tomato shikimate kinase precursur is enzymaticalle active and is imported and processed to the mature enzyme by chloroplasts. The Plant Journal 2(3), 375-383) beschrieben hergestellt.
Um den Codongebrauch für Hochexpression in E. coli zu adaptieren wird ein synthetisches Gen, welches für das mutmaßliche Tomaten-YchB-Protein (Accessions-Nr. gb U62773, bp-Position 78 bis 1283), in 8 aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen unter Benutzung der cDNA-Bibliothek aus Tomate als Matritze hergestellt. Die Oligonukleotide und die resultierende DNA-Sequenz dieses Gens sind in Annex Ec gezeigt.
Stufe 1
Ein Teil des L. esculentum ORF ychB wird mittels PCR unter Verwendung von cDNA aus L. esculentum (aus Blättern) als Matritze verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-A 5'-GGTACAGACAATTACTTTTGGATTCATC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-B 5'-AAGAGATGGAAGAACTTCAAAGGCAGGAGG-3', 1 μl der cDNA-Bibliothek, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 447 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 2
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 1 wird als Matritze für eine zweite PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-1 5'-CTGATTATCAAAGCCCTCAATCTTTATCGTAAAAAGACCGGTACAGACAATTACTTTTGGATTCATC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-2 5'-GACCGCGGCCAGCAGCAATTACACGTTGTTTTAAACGTTTAAGAGATGGAAGAACTTCAAAGCAGGAGG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 525 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 3
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 2 wird als Matritze für eine 3. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-3 5'-ACTAATGTTGCTGGCGTTCCACTCGATGAGCGTAATCTGATTATCAAAGCCCTCAATCTTTATCG-3', 25 p Mol des Primers TM-YCHB-4 5'-TGTGCTGCCACTACCAGACATGAAGACTGCATCATATTGACCGCGGCCAGCAGCAATTACACG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 599 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 4
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 3 wird als Matritze für eine 4. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-5 5'-AAAATTAAGTTCTCGCTGTCACCATCGAAATCAAAGGATCGTTTATCTACTAATGTTGCTGGCGTTCCACTC-3', 25 p Mol des Primers TM-YCHB-6 5'-CATAGACAAATTGTGGCGATCTGGAGAGCCAACACCTACGATTGTGCTGCCACTACCAGACATGAGG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 690 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 5
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 4 wird als Matritze für eine 5. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-7 5'-GACGGTTATCATGATCTGGCGTCTCTCTTTCATGTAATTAGTCTTGGCGATAAAATTAAGTTCTCGCTGTCACC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-8 5'-TGCTTCTGACAAGAAGACATCTTTGTACTCTTCGTCATCATAGACAAATTGTGGCGGATCTGG-3', 25 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 779 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 6
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 5 wird als Matritze für eine 6. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-9 5'-TTTTCTCCTTGCAAGATTAATGTTTTCCTGCGCATCACAAGCAAACGTGATGACGGTTATCATGATCTGGCGTCTC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-10 5'-CAACATACCACTCGTTGGCTGGACGAGTGATGAAACTTGCTTCTGACAAGAAGACATCTTTG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 876 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 7
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 6 wird als Matritze für eine 7. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-11 5'-CGTGAAGCTGGTCTTTCACGCCTCACTCTTTTTTCTCCTTGCAAGATTAATGTTTTCCTG-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-12 5'-CAGGTTGATCACCAATAGTGCTACCTGAAACAGGTTCAACATACCACTCGTTGGCTGGACG-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 1 E von Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach, Deutschland), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1 % Triton X-100, 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 3 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Die gesamte Mischung wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 933 bp wird aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
Stufe 8
20 ng des PCR-Produktes aus Stufe 7 wird als Matritze für eine 8. PCR verwendet. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers TM-YCHB-13 5'-ATAATAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGATCGTGAAGCTGGTCTTTCACGCCTC-3', 25 pMol des Primers TM-YCHB-14 5'-TATTATTATAAGCTTAAGACATGTCAAAAGATGTAGAGAACTCAGGTTGATCACCAATAGTGCTACC-3', 20 ng des gereinigten PCR-Produktes der ersten PCR, 0,5 E von Goldstar-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien), 20 mMol der dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl, die 1,5 mM MgCl₂, 75 mM Tris-Hydrochlorid, pH 9,0, 20 mM (NH₄)₂SO₄ und 0,01 % (G/V) Tween 20 enthalten.
Die Mischung wird 5 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 20 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 95 °C, 30 Sek. bei 48 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 7 Min. bei 72 °C wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird eine 2 % Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Produkt von 1015 bp wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt.
2 μg des Vektors pNCO-SB-H6-ACYC184 (isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben) und 2 μg des gereinigten PCR-Produktes aus Stufe 8 werden verdaut, um DNA-Fragment mit überlappenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmischung enthält 10 μl von OPA-Puffer (10 ×; 500 mM Kaliumacetat; 100 mM Magnesiumacetat; 100 mM Tris-Acetat, pH 7,5) von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) und 50 E HindIII (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) in einem Gesamtvolumen von 100 μl und wird 3 h bei 37 °C inkubiert. Nach Inkubation werden 18 μl OPA-Puffer und 50 E NcoI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) zu einem Gesamtvolumen von 140 μl hinzugefügt. Die resultierende Mischung wird für weitere 3 h inkubiert. Verdaute Vektor-DNA und PCR-Produkt werden mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie oben beschrieben gereinigt.
20 ng präparierte Vektor-DNA und 25 ng PCR-Produkt werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase von Gibco BRL (Eggenstein, Deutschland), 4 μl T4-Ligase-Puffer (5 ×; 250 mM Tris/HCl, pH 7,6; 50 mM MgCl₂; 5 mM ATP; 5 mM DTT; 25 % (G/V) Polyethylenglykol-8000) in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Bei dieser Reaktion resultiert das Plasmid pNCO-HIS6-TM-YCHB. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Kompetente E. coli XL1-Blue (Stratagene, LaJolla, CA, USA) werden mit der Ligationsmischung transformiert. Kompetente Zellen werden nach einer Methode von Hanahan D. (Hanahan, D. (1983) Studies an transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 166(4), 557-80).
Das Plasmid wird wie oben beschrieben isoliert. 5 μg DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmids pNCO-HIS6-TM-YCHB wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit folgenden Oligonukleotiden als Primer sequenziert: TM-YCHB-A 5'-GGTACAGACAATTACTTTTGGATTCATC-3', TM-YCHB-B 5'-AAGAGATGGAAGAACTTCAAAGGCAGGCAGGAGG-3', PNCO-T5 5'-GAGCGGATAACAATTATAATAGATTC-3' und mRNA5 5'-CTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTG-3'. Die zugehörige Proteinsequenz ist identisch zur berechneten Proteinsequenz der berechneten cDNA-Sequenz in der Datenbank (gb Accessions-Nr. U62773).
Beispiel 13a
Herstellung und Reinigung von rekombinantem YchB-Protein aus E. coli
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCOychB enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37 °C bebrütet. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000 UpM, 4 °C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentrifugiert wie oben beschrieben und bei –20 °C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden aufgetaut in 10 ml 20 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 mit einem Gehalt von 1 mM Dithioerythritol und 0,02 % Natriumazid (Puffer A) in Anwesenheit von 4 mg Lysozym pro ml und 10 μg DNaseI pro ml. Die Mischung wird bei 37 °C 1 Stunde inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. ultraschallbehandelt mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA), der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird bei 15.000 UpM und 4 °C 30 Min. zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule aus Sepharose QFF (Säulenvolumen 30 ml, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgetragen, die vorher mit 150 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen mit Puffer A. Das Eluat wird bei 280 nm photometriert. YchB-Protein wird von der Säule mit einem Gradienten von 0-0,5 M Natriumchlorid in 150 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese identifiziert als Bande bei 30 kDa. Fraktionen mit diese Proteinbande werden gesammelt und es wird Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M zugegeben. Das Enzym wird weiter gereinigt auf einer Säule aus Phenyl-Sepharose 6FF (Säulenvolumen 16 ml, Amersham Pharmacia Biotech), die mit Puffer A, der 0,5 M Ammoniumsulfat enthält, äquilibriert wurde. Dann wird das YchB-Protein mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M Ammoniumsulfat in 100 ml Puffer A eluiert. Fraktionen, die das Protein enthalten werden vereinigt und auf 3 ml aufkonzentriert. Dann wird das Enzym weiter gereinigt auf einer Superdex 75 HR 26/60, die mit Puffer A und 100 mM Natriumchlorid äquilibriert wurde. Das YchB-Protein eluiert bei 165 ml. Die Homogenität von YchB-Protein wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Beispiel 13b
Herstellung und Reinigung von rekombinantem 6xHis-YchB-Fusionsprotein aus Tomate
0,5 Liter Luria Bertani (LB) Medium mit einem Gehalt von 90 mg Ampicillin werden beimpft mit 10 ml einer Übernachtkultur von E. coli Stamm XL1-Blue, welcher das Plasmid pNCO-HIS6-TM-YCHB enthält. Die Kultur wird in Schüttelkolben bei 37 °C bebrütet. Bei einer optischen Dichte (600 nm) von 0,7 wird die Kultur induziert mit 2 mM IPTG. Die Kultur wird für weitere 5 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (20 Min., 5.000 UpM, 4 °C) geerntet. Die Zellen werden mit 50 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 gewaschen, zentrifugiert wie oben beschrieben und bei –20 °C zur Lagerung eingefroren.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 μg/ml DNaseI aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4 °C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt des rekombinanten YchB-Proteins von Tomate wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni²⁺-chelatierender Sepharose FF (Größe 2,6 × 6 cm, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. YchB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YchB-Protein enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM Dithioerythritol, 0,02 % Natriumazid über Nacht dialysiert. Das dialysierte YchB-Protein wird auf eine Mono Q HR 5/5 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M Natriumchlorid in 60 ml Standardpuffer entwickelt. Die Homogenität des YchB-Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 43 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 3 mg reines Enzym werden erhalten.
Beispiel 14
Screening der YchB Enzymaktivität
14.1 Mittels radiochemischer Methode unter Benutzung von [2¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol als Substrat.
Reaktionsmischungen mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 100 μM ATP, 10 mM MgCl₂, 20 mM Natriumfluorid, 10 nCi [2¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und YchB Protein werden bei 37 °C 30 Min. inkubiert. Nach Zentrifugation werden Aliquots auf Sil-NHR Dünnschichtplatten aufgetragen, die mit einer Mischung von n-Propanol/Ethylacetat/Wasser (6:1:3, v/v) entwickelt werden. Das Radiochromatogramm wird mit einem Phosphor (mager (Storm 860, Molecular Dynamics, USA) ermittelt. Der R_f-Wert des Produkts ist 0,25. Diese Screening-Methode kann in der An- oder Abwesenheit von Inhibitorkandidaten durchgeführt werden.
14.2 Mittels kernmagnetischen Resonanz (NMR) Messungen unter Benutzung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol als Substrat
Eine Lösung mit einem Gehalt von 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 5 mM ATP, 5 mM [2,2-Me-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 0,1 mg YchB Protein aus rekombinantem E. coli wird bei 37 °C 1 Stunde inkubiert. Der Reaktionsfortschritt wird durch ¹³C-NMR-Messung festgestellt. ¹³C-NMR-Spektren werden gemessen mit einem DRX 500 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 125,6 MHz. Das Produkt zeigte zwei intensive Doppel-Dubletts bei 81,91 ppm und 16,86 ppm (bezogen auf externes Trimethyl-silylpropansulfat) mit Kopplungskonstanten von 38,9 und 7,4 Hz, beziehungsweise 38,9 und 1,9 Hz.
Beispiel 15
Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM [2-¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (10,04 μCi/mmol), 5 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 100 μg gereinigtes YchB Protein und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch ³¹P NMR-Messung verfolgt. Dann wird die Probe durch eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland) zentrifugiert. Das Produkt zeigt ³¹P NMR Signale bei 0,49, –7,28 und –8,0 ppm (bezogen auf externe 85 % Phosphorsäure) und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) äquilibriert mit 0,1 M Ammoniumformiat in 40 % (v/v) Methanol bei einer Flussrate von 1 ml/min, gereinigt. Das HPLC-System ist mit einer Weltchrom HPLC Pumpe K1001, einem Weltchrom Spectro-Photometer K-2600 (Knauer, Berlin, Deutschland) und einem Radiomonitor (Berthold, Wildbad, Deutschland) ausgestattet. Nach Injektion der Probe wird die Säule mit 30 ml 0,1 M Ammoniumformiat in 40 % Methanol gewaschen. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat wird bei 14 ml durch einen linearen Gradienten von 30 ml 0,1 M Ammoniumformiat in 40 % (v/v) Methanol auf 1 M Ammoniumformiat in 0 % (v/v) Methanol eluiert. Fraktionen, welche 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration an 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat ist 21 mM.
Beispiel 16
Identifizierung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
Die Strukturaufklärung wurde mit [2,2-Me-¹³C₂]-, [1,3,4-¹³C₁]- und [1,2,2-Me,3,4-¹³C₅]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat (Tabelle 6) durchgeführt.
¹H entkoppelte ³¹P NMR-Spektren des Enzymprodukts aus [2,2-Me-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol zeigen zwei Dubletts bei –7,28 bzw. –8,00 ppm (³¹P-³¹P-Kopplungskonstante, 20,8 Hz) und ein Doppeldublett bei 0,49 ppm (³¹P-³¹P-Kopplungskonstanten, 7,6 Hz und 1,7 Hz). Ohne ¹H Entkopplung sind die ³¹P NMR-Signale bei –7,28 und –8,00 ppm verbreitert, während das Signal bei 0,49 ppm nicht von ¹H-Kopplung betroffen ist. Die chemischen Verschiebungen und das beobachtete Kopplungsmuster weisen auf einen Pyrophosphat-Rest und einen Monophosphat-Rest an Position 2 der 2C-Methyl-erythritol-Gruppe hin. Genauer, ist skalare Kopplung zwischen ³¹P und ¹H zu erwarten im Falle eines Phosphat-Restes an Position 1 oder 3. Andrerseits wird keine ³¹P-Kopplung erwartet, falls sich ein Phosphat-Rest an Position 2 befindet. Außerdem ist die beobachtete skalare Kopplung zwischen ¹³C-2-Methyl und dem ³¹P-Atom der Phosphatgruppe nur mit Position 2 vereinbar.
Das ³¹P-¹³C Kopplungsmuster wurde weiterhin mit einer Probe die aus [1,3,4-¹³C₁]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol erhalten wurde, analysiert (Tabelle 6). Die ¹³C und ¹H NMR-Signale wurden zugeordnet durch HMQC, HMQC-TOCSY, und INADEQUATE-Experimente, wobei die Probe die aus [1,2,2-Me,3,4-¹³C₅]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol erhalten wurde, verwendet wurde. Mit diesen Zuordnungen konnte die Struktur von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aufgeklärt werden.
Beispiel 17
Herstellung eines Expressionsklons für ygbB aus E. coli
Der offene Leserahmen ygbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird isoliert entsprechend einer Methode von Meade et al., 1982. (Meade, H. M., Long, S. R., Ruvkun, C. B., Brown, S. E., und Auswald, F. M. (1982). Physical and genetic characterization of symbiotic and auxotrophic mutants of Rhlzobium meliloti induced by transposon Tn5 mutagenis. J. Bacteriol. 149, 114-122)
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers GAGGAGAAATTAACCATGCGAATTGGACACGGTTTTG, 10 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 5 Min. bei 94 °C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 7 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR Amplifikat wird benützt als Matrize für eine zweite PCR-Reaktion. Die Reaktionsmischung enthielt 50 pMol des Primers ACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATG, 50 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 2,5 μl der ersten PCR-Reaktion, 10 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 100 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 500 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100. Die Mischung wird in 5 PCR-Röhrchen portioniert.
Die Mischungen werden 5 Min. bei 94 °C denaturiert. Es folgen 25 PCR-Zyklen mit 30 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 7 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Die PCR-Amplifikate werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
4,5 μg des Vektors pNCO113 (isoliert wie unter Beispiel 1 beschrieben) und 3,4 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 20 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 100 E EcoRI (NEB), 100 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 200 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
100 ng Vektor-DNA und 35 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCOygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2 Stunden bei 25 °C inkubiert. 1 μl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 18
Herstellung und Reinigung von rekombinantem YgbB-Protein von E. coli
Der zellfreie Extrakt von YgbB Protein aus E. coli wird in der gleichen Weise hergestellt wie unter Beispiel 4 beschrieben. Der Überstand wird aufgebracht auf eine Säule aus Sepharose Q FF (Säulenvolumen, 30 ml; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland), welche vorher mit 120 ml Puffer A äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 90 ml Puffer A gewaschen. Das YgbB-Protein eluiert mit einem linearen Gradient von 0-0,5 M NaCl in 150 ml Puffer A. Die Homogenität von YgbB-Protein wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft.
Beispiel 19
Screening der YgbB Enzymaktivität
Die YgbB-Enzymaktivität wird mit einer radiochemischen Methode bestimmt. Reaktionsmischungen enthielten 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 10 mM MnCl₂, 14 nCi [2-¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 2 μg YgbB-Protein aus rekombinanten E. coli Zellen. Die Mischungen werden 30 Min. bei 37 °C inkubiert. Nach Zentrifugation werden Aliquots auf Sil-NHR-Dünnschichtplatten aufgetragen, die mit einer Mischung von n-Propanol/Ethylacetat/H₂O (6:1:3, v/v) entwickelt werden. Das Radiochromatogramm wird mit einem Phosphorimager (Storm 860, Molecular Dynamics, USA) detektiert und ausgewertet. Der R_f-Wert von YgbB-Produkt ist 0,5. Die Messmethode kann ausgeführt werden in Anwesenheit oder Abwesenheit von möglichen Inhibitoren.
Beispiel 20a
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für ein 6xHis-YgbB-Fusionsprotein aus E. coli
Der offene Leserahmen YgbB von E. coli (Accession Nr. gb AE000358) wird von bp Position 6231 bis 6754 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem Escherichia coli Stamm XL1-Blue wird isoliert entsprechend Beispiel 2.
Die Reaktionsmischung enthielt 10 pMol des Primers GAGAAGGATCCATGCGAATTGGACACGGTTTTGGACG, 10 pMol des Primers TATTATCTGCAGCCTTGCGGTTTACCGTGGAGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100. Die Mischung wird 5 Min. bei 94 °C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 30 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 7 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wir in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. 1,0 μg des Vektors pQE30, isoliert wie unter Beispiel 1 beschrieben und 0,5 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 10 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 100 E BamHI (NEB), 100 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben.
5 fMol Vektor-DNA und 14 fMol des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pQEygbB gebildet. Die Ligationsmischung wird 2 Stunden bei 25 °C inkubiert. 1 μl der Ligationsmischung wird in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 2 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pQEygbB wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. 12 μg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEygbB wird sequenziert wie in Beispiel 2 beschrieben und ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000358). Das 5'-Ende des DNA-Inserts trägt die codierende Region für 6 Histidinreste.
Beispiel 20b
Konstruktion von Expressionsvektoren und Herstellung von Expressionsklonen für ygbB aus Plasmodium falciparum
Der Expressionsvektor pQE30 wird isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben.
Eine cDNA-Bibliothek von P. falciparum (Stamm HB3) wird mit dem Superscript-Plasmid-System für cDNA-Synthese und Plasmid-Klonierung von Gibco hergestellt.
Der komplette P. falciparum ORF ygbB (Accession Nr. gb AE001394) wird von Basenpaar (bp) Position 2617 bis 3495 durch PCR amplifiziert unter Verwendung von cDNA aus P. falciparum als Matrize. Die Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers 5'-TCCATATGGATCCATGTTTTTAAAAGGATACACC-3', 25 pMol des Primers 5'-GACCTGCCTGCAGTTATGAATTTTTAGGTATTAAC-3', 1 μg cDNA, 2 E Taq-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 60 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 2,2 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
2,0 μg des Vektors pQE30 und 1,5 μg des gereinigten PCR Produkts werden verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco) und 2 μl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pQEygbBPlaskom erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. 2 μl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbBPlaskom wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben und ist identisch zur berechneten cDNA-Sequenz des Datenbankeintrags (gb AE001394). Die cDNA-Sequenz und die zugehörige Aminosäuresequenz des ygbB-Gens von P. falciparum ist in Annex G gezeigt.
Eine N-terminal abgeschnittener ygbB-Expressionsklons des P. falciparum ORF ygbB wird konstruiert, der die codierende Region der mutmaßlichen Leadersequenz nicht enthält. Die PCR-Reaktionsmischung enthält 25 pMol des Primers 5'-TTATTTGGATCCATGGGTATAAGAATAGGTCAAGG-3', 25 pMol des Primers 5'-GACCTGCCTGCAGTTATGAATTTTTAGGTATTAAC-3', 1 μg cDNA, 2 E Taq-DNA-Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 100 μl.
Die Mixtur wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Es folgen 30 PCR-Zyklen von 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 45 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation für 20 Min. bei 72 °C wird die Mixtur auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie unter Beispiel 1 beschrieben. Es werden 3,0 μg gereinigtes PCR-Produkt erhalten.
2,0 μg des Vektors pQE30 und 1,5 μg des gereinigten PCR Produkts werden verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu erzeugen. Jede Restriktionsmixtur enthielt 7 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 40 E BamHI (NEB), 30 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die verdaute Vektor-DNA und das verdaute PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng der Vektor DNA und 8 ng des PCR-Produkts werden zusammen ligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco) und 2 μl T4-Ligasepuffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pQEygbBPlas erhalten. Die Ligationsmixtur wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. 2 μl der Ligationsmixtur werden in elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Das DNA-Insert vom Plasmid pQEygbBPlas wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben.
Beispiel 21a
Herstellung und Reinigung von rekombinantem 6xHis-YgbB-Fusionsprotein von E. coli
Rekombinante E. coli XL1-Blue Zellen, die überexprimiertes YgbB von E. coli (N-terminal His-tag) enthalten, werden hergestellt, wie in Beispiel 12 beschrieben. Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 μg/ml DNaseI aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4 °C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt des rekombinanten YgbB-Proteins von E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni²⁺-chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. YgbB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YgbB-Protein enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Das dialysierte YgbB-Protein wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität des YgbB-Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 17 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 27 mg reines Enzym werden erhalten.
Beispiel 21b
Herstellung und Reinigung von rekombinantem 6xHis-YgbB-Fusionsprotein von P. falciparum
Rekombinante Zellen des Stammes XL1-pQEygbBPlas mit überexprimiertem YgbB-Protein aus P. falciparum werden hergestellt wie Beispiel 6 beschrieben.
Die Zellen werden in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 μg/ml DNaseI aufgetaut. Die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird 30 Min. bei 4 °C und 15.000 UpM zentrifugiert. Der zellfreie Extrakt des rekombinanten YgbB-Proteins wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni²⁺-chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. YgbB-Protein wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. YgbB-Protein enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Das dialysierte YgbB-Protein wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität des YgbB-Proteins wird durch SDS-Polyacrylamidgel elektrophorese geprüft. Eine Bande bei 22 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. 22 mg reines Enzym werden erhalten.
Beispiel 22
Enzymatische Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat
Eine Lösung von 500 μl, die 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MnCl₂, 0,12 μCi [2-¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol, 46 mM 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 225 μg YgbB-Protein von rekombinantem E. coli enthält wird bei 37 °C für 1 Std. inkubiert. Die Reaktion wird mittel ³¹P NMR verfolgt. Das Produkt, welches ein ³¹P NMR-Signal bei +21,7 ppm zeigt, wird mittel auf einer Säule des Anionenaustauschers Nukleosil 10SB (4,6 × 260 mm) mittels HPLC gereinigt, indem 50 mM Ammoniumformiat in 40 % (v/v) als Laufmittel bei einer Flussrate von 1 ml/Min. benutzt wird. Der Durchfluss wird mittels eines Radiomonitors von Berthold analysiert. 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat wird nach 10 ml eluiert. Die Fraktion, die 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat enthält, wird aufgefangen und lyophylisiert (2,6 mg). Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser gelöst und der NMR Analyse unterworfen.
Beispiel 23
Identifizierung von 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat
¹H NMR- und ¹H entkoppelte ¹³C NMR-Spektren werden mit einem ADVANCE DRX 500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland aufgenommen. Die Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz für ¹H und entsprechend 125,6 MHz für ¹³C. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat. Zweidimensionale Korrelationsexperimente (gradient enhanced double quantum filtered COSY, HMQC) werden mit XWINNMR Software von Bruker ausgeführt. ³¹P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85 % H₃PO₄.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale NMR-Spektroskopie (Tabelle 7). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert durch ein einzelnes ³¹P NMR-Signal bei +21,7 ppm. Der ermittelte ³¹P NMR chemische Verschiebungsbereich impliziert, dass die unbekannte Verbindung ein fünfzyklisches Monophosphat ist.
Die Gegenwart eines Phosphoratoms in der unbekannten Verbindung wird weiter reflektiert in dem 130 NMR-Spektrum, in dem drei der fünf Signale Kopplungen mit ³¹P zeigen (³¹P-¹³C-Kopplungskonstanten im Bereich zwischen 6 Hz und 1 Hz).

Im Einzelnen ist das ¹³C NMR-Signal des C2 ein Dublett mit einer ³¹P-¹³C Kopplungskonstante von 6,5 Hz, welche typisch für eine ³J_PC Kopplungskonstante ist. Die ³¹P-¹³C Kopplungen für C3 und C4 sind kleiner (1,7 entsprechend 1,1 Hz), welche ²J_PC Kopplungen widerspiegeln. Somit impliziert die ³¹P-¹³C Kopplungssignatur eine 3,4-Cyclophosphatstruktur. Tabelle 7. NMR-Daten von 2C-Methyl-D-erythritol-3,4-cyclophosphat

Position	Chemische Verschiebungen, ppm				Kopplungskonstanten, Hz
	¹H	¹³C	³¹P	J_HH	J_PH	J_PC
1	3,38 (d, 1H)^a	65,64 (s)^b		12,0 (1*)
1*	3,47 (d, 1H)			12,0 (1*)
2		73,02 (d)				6,5
2-Me	1,09 (s)	17,73 (s)
3	4,15 (m, 1H)	77,61 (d)				1,7
4	4,18 (m, 1H)	64,96 (d)				1,1
4*	4,34 (ddd, 1H)			11,2 (4), 3,8 (3)	7,2
P			21,67 (s)^c

^a referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat. Die Multiplizitäten und die relativen Integralwerte von Signalen im ¹H NMR-Spektrum sind in Klammern angegeben.
^b referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulonat. Die Multiplizitäten der ¹H-entkoppelten ¹³C NMR-Signale sind in Klammern angegeben.
^c Kopplungspartner entsprechend den zweidimensionalen COSY-Experimenten sind in Klammern angegeben.
^d referenziert auf externe 85 % Orthophosphorsäure. Die Multiplizitäten der ¹H-entkoppelten ³¹P NMR-Signale sind in Klammern angegeben

Beispiel 24
Bestimmung der YgbB Enzymaktivität mittels NMR
Eine Lösung, die 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MnCl₂, 5 mM 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und 0,1 mg YgbB-Protein aus rekombinanten E. coli Zellen enthält, wird bei 37 °C 1 Std. inkubiert. Die Reaktion wird mittels ³¹P NMR verfolgt. ³¹P NMR-Spektren werden mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz aufgenommen. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85 % H₃PO4. Die Screeningmethode kann in Gegenwart und Abwesenheit von möglichen Inhibitoren durch Messung der verbleibenden Menge an Ausgangsmaterial und Vergleich der Ergebnisse.
Das Produkt zeigte ein ³¹P Singulett bei +21,7 ppm. Die Enzymaktivität kann deshalb auch durch Messung dieses Signals für die Bestimmung der Produktmenge bestimmt werden.
Beispiel 25
Enzymatische Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
Eine Lösung mit einem Gehalt von 5 mM [2-¹⁴C]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol (0,02 μCi/mMol), 5 mM ATP, 5 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 100 μg gereinigtes YchB Protein, 200 μg gereinigtes YgbB Protein und 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 in einem Gesamtvolumen von 4 ml wird 2 Stunde bei 37 °C inkubiert. Der Reaktionsverlauf wird durch ¹³C- und ³¹P-NMR-Messung verfolgt. Dann wird die Probe durch eine Nanosep 10K Membran (PALL Gelmann, Roßdorf, Deutschland) zentrifugiert. Das Produkt zeigt zwei ³¹P NMR Signale bei –7,65 und –11,66 ppm (Dubletts, ³¹P-³¹P-kopplungskonstante 23,6 Hz) und zwei intensive ¹³C-NMR-Signale bei 83,87 ppm und wird durch HPLC an einer Anionenaustauschsäule Nukleosil 10SB (4,6 × 250 mm, Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) mit 0,1 M Ammoniumformiat in 40 % (v/v) Methanol als Eluent bei einer Flussrate von 1 ml/min, gereinigt. 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat eluiert bei 34 ml. Fraktionen, welche 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Der Rückstand wird in 0,5 ml deuteriertem Wasser aufgenommen und der NMR-Analyse unterworfen. Die Konzentration 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat ist 18 mM.
Beispiel 26
Identifizierung von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat
Die Strukturaufklärung wurde mit [2,2'-Me-¹³C₂]2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat (Tabelle 8) durchgeführt.
¹H NMR- und ¹H entkoppelte ¹³C NMR-Spektren werden mit einem ADVANCE DRX 500 Spektrometer von Bruker, Karlsruhe, Deutschland aufgenommen. Die Transmitterfrequenzen sind 500,1 MHz für ¹H und entsprechend 125,6 MHz für ¹³C. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat. ³¹P NMR-Spektren werden aufgenommen mit einem AC 250 Spektrometer von Bruker bei einer Transmitterfrequenz von 101,3 MHz. Die chemischen Verschiebungen werden referenziert auf externe 85 % H₃PO₄.
Die Struktur des Produkts wird ausgewertet durch multinukleare, multidimensionale NMR-Spektroskopie (Tabelle 8). Im Einzelnen wird die Verbindung charakterisiert durch ein zwei ¹H-entkoppelte ³¹P-NMR-Signale bei –7,65 ppm (Dublett mit ³¹P-³¹P-Kopplungskonstante von 23,6 Hz) und –11,66 ppm (Doppel-Dublett mit ³¹P-³¹P-Kopplungskonstante von 23,6 Hz und ³¹P-¹³C-Kopplungskonstante von 8,5 Hz). Das ³¹P-NMR-Signal bei –7,65 ppm ist ohne ¹H-Entkopplung verbreitert. Der ermittelte ³¹P NMR chemische Verschiebungsbereich und die ³¹P-³¹P-Kopplung implizieren, dass die unbekannte Verbindung ein Pyrophosphat ist. Zusätzlich zeigt die gemessene ³¹P-¹³C-Kopplung des Signals bei –11,66 ppm in Verbindung mit der fehlenden ³¹P-¹H-Kopplung an, dass ein Phosphatrest mit C-2 des 2C-Methyl-D- erythritols verknüpft ist. In Übereinstimmung mit diesem Schluß werden ¹³C-³¹P-Kopplungen für die ¹³C-Signale von C-2 und C-2-Methyl beobachtet.
In Verbindung mit den beobachteten ¹³C-¹³C-Kopplungen (Tabelle 8), sind diese Daten die Basis für die 1H und ¹³C-NMR-Signal-Zuordnung. Das ¹³C-Signal bei 65,72 ppm (entspricht C-4) zeigte ¹³C-³¹P-Kopplung, was darauf hinwies, daß das Pyrophosphat auch mit C-4 verbunden ist. Die ¹³C-NMR-Zuordnung wird weiter durch zweidimensionale INADEQUATE Experimente überprüft, die die ¹³C-¹³C-Verknüpfungen zeigen.
Zusammenfassend zeigten die ¹H-, ¹³C- und ³¹P-NMR-Daten klar, daß es sich bei dem Produkt um 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat handelt. Die NMR-Daten stimmten gut mit den beschriebenen Daten dieser Verbindung überein (Ostrovsky, D., Kharatian, E., Dubrovsky, T., Ogrel, O., Shipanova, I und Sibeldina, L. (1992). The ability of bacteria to synthesize a new cyclopyrophosphate correlates with their tolerance to redox-cycling drugs: an a crossroad of chemotherapy, enviromental toxicology and immunobiochemical Problems. Biofactors 4(1), 63-68; 1992; Turner, D. L., Santos, H., Fareleira, P., Pacheco, I., LeGall, J., und Xavier, A. V. (1992). Structure determination of a novel cyclic phosphocompound isolated from Desulfovibrio desulfuricans. Biochem. J. 285, 387-390.)
Beispiel 27
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus Bacillus subtilis
Der Expressionsvektor pNCO113 wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. Chromosomale DNA aus dem Bacillus subtilis Stamm BR151 (Williams, D. M., Duvall, E. J., und Lovett, P. S. (1981) Cloning restriction fagments that promote expression of a gene in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 146(3), 1162-1165) wird isoliert entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Methode.
Der mutmassliche ORF yqiE codierend für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase von Bacillus subtilis (Accession Nr. dbj D84432) wird von bp Position 193991 bis 195892 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler Bacillus subtilis DNA als Matrize. Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers TGATCCGCCATGGATCTTTTATCAATACAGG, 25 pMol des Primers TTGAATAGAGGATCCCCGCC, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 95 °C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 60 Sek. bei 94 °C, 60 Sek. bei 50 °C und 120 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 20 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt. 500 μl Puffer PB (Qiagen) werden zu 98 μl der PCR-Reaktionsmischung hinzugefügt, auf eine Quiaquick-Säule aufgetragen und 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen. 0,75 ml Puffer PE (Qiagen) wird auf die Säule geladen und wie vorher zentrifugiert. Der Durchfluss wird verworfen. Die Säule wird erneut 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert. Die Säule wird anschließend in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen gestellt. 50 μl bidestilliertes, steriles Wasser wird auf die Säule aufgetragen, die anschließend 1 Min. bei 14.000 UpM zentrifugiert wird. Der Durchfluss enthielt 1,8 μg gereinigtes PCR-Produkt.
2,0 μg des Vektors pNCO113 und 1,8 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 7 μl NEB4-Puffer von New England Biolabs (NEB), 7 μg BSA (NEB), 40 E NcoI (NEB), 30 E BamHI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen.
20 ng Vektor-DNA und 34 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pNCODXSBACSU gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue Zellen transformiert wie unter Beispiel 2 beschrieben. 6 μg Plasmid-DNA werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pNCODXSBACSU wird sequenziert wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. dbj D84432).
Beispiel 28
Herstellung eines Expressionsklons und Konstruktion eines Expressionsvektors für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli
Der E. coli ORF yaeM (Accessions Nr. gb AE000126) wird von bp Position 9887 bis 11083 durch PCR amplifiziert unter Benutzung von chromosomaler E. coli DNA als Matrize. Chromosomale DNA aus dem E. coli Stamm XL1-Blue wird isoliert entsprechend der in Beispiel 2 beschriebenen Methode.
Die Reaktionsmischung enthielt 25 pMol des Primers GGAGGATCCATGAAGCAACTCACC, 25 pMol des Primers GCGCGACTCTCTGCAGCCGG, 20 ng chromosomale DNA, 2 E Taq DNA Polymerase (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 20 nMol dNTP's in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit einem Gehalt von 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,8 und 0,1 % (w/w) Triton X-100.
Die Mischung wird 3 Min. bei 94 °C denaturiert. Dann werden 30 PCR Zyklen durchgeführt mit 45 Sek. bei 94 °C, 45 Sek. bei 50 °C und 75 Sek. bei 72 °C. Nach weiterer Inkubation bei 72 °C für 20 Min. wird die Mischung auf 4 °C gekühlt. Ein Aliquot von 2 μl wird der Agarosegelelektrophorese unterworfen.
Das PCR-Amplifikat wird mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben. 2,5 μg des Vektors pQE30 (Qiagen), isoliert wir in Beispiel 2 beschrieben, und 2,0 μg des gereinigten PCR-Produkts werden verdaut, um DNA-Fragmente mit überhängenden Enden zu produzieren. Jede Restriktionsmixtur enthält 7 μl NEB3 Puffer von New England Biolabs (NEB), 50 E BamHI, 40 E PstI (NEB) in einem Gesamtvolumen von 70 μl. Die Mischungen werden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Verdaute Vektor-DNA bzw. PCR-Produkt werden gereinigt mit dem PCR-Reinigungskit von Qiagen wie in Beispiel 1 beschrieben.
20 ng Vektor-DNA und 22 ng des PCR-Produkts werden zusammenligiert mit 1 E T4-Ligase (Gibco), 2 μl T4-Ligase-Puffer (Gibco) in einem Gesamtvolumen von 10 μl. Dabei wird das Plasmid pQEyaeM gebildet. Die Ligationsmischung wird über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mit 2 μl der Ligationsmischung werden elektrokompetente E. coli XL1-Blue und M15[pREP4] (Zamenhof et al., 1972) Zellen transformiert wie unter Beispiel 1 beschrieben. Die elektrokompetenten Zellen werden hergestellt wie unter Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pQEyaeM wird wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert. 12 μg Plasmid-DNA pQEyaeM werden erhalten.
Das DNA-Insert des Plasmides pQEyaeM wird sequenziert wie in Beispiel 2 beschrieben. Die Sequenz ist identisch mit der Sequenz in der Datenbank (Accessions Nr. gb AE000126).
Beispiel 29
Herstellung und Reinigung von rekombinanter für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus Bacillus subtilis
Zellen von E. coli Stamm XL1-Blue mit dem Plasmid pNCODXSBACSU werden kultiviert, induziert und geerntet wie in Beispiel 1 beschrieben.
2 g Zellen werden in 10 ml 25 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, die 1 mM Dithioerythritol, 10 mM EDTA und 6 mM Phenylmethylsulfonylchlorid enthalten, in Gegenwart von 1 mg Lysozym suspendiert. Die Mischung wird bei 37 °C 0.5 Std. inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15.000 UpM für 30 Min. Der Überstand wird auf eine Sepharose QFF Säule (26 cm³, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) aufgebracht, welche zuvor mit 200 ml Tris-HCl, pH 8,0, die 0,5 mM MgCl₂ und 0,03 % Natriumazid (Puffer A) enthalten, äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 60 ml Puffer A gewaschen, während die Extinktion bei 280 nm detektiert wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mit einem Gradienten von 0-1 M Natriumchlorid in 300 ml Puffer A eluiert. Das Enzym wird durch SDS-PAGE, welche eine Bande bei 67 kDa zeigt, identifiziert. Fraktionen, die diese Proteinbande zeigen, werden gesammelt und über Nacht gegen Puffer A dialysiert.
Das Enzym wird weiter auf einer Hydroxylapatitsäule (Macro pep 40 μm, 2,5 × 6 cm, Biorad, München, Deutschland), welche mit Puffer A äquilibiert wurde, gereinigt. Das Enzym wird durch einen Gradienten von 0-1 M Kaliumphosphat, pH 6,5 eluiert. Die Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase wird mittels SDS-PAGE überprüft. Eine kräftige Bande bei 67 kDa ist erkennbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. Die Ausbeute von reiner 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase ist 44 mg.
Beispiel 30
Herstellung und Reinigung von rekombinanter für 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli
Rekombinante E. coli M15[pREP4] Zellen, welche überexprimierte 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli enthalten, werden identisch zur Herstellung in Beispiel 1 hergestellt. Die Zellen werden aufgetaut in 20 ml 20 mM Imidazol in 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 und 0,5 M Natriumchlorid (Standardpuffer) in Gegenwart von 1 mg/ml Lysozym und 100 μg/ml DNaseI. Die Mischung wird bei 37 °C 0.5 Std. inkubiert, auf Eis gekühlt und 6 × 10 Sek. mit einem Branson Sonifier 250 (Branson SONIC Power Company, Danbury, USA) ultraschallbehandelt, der auf 70 % Ausgangsleistung und Kontrolleinstellung 4 eingestellt wird. Die Suspension wird zentrifugiert bei 15.000 UpM für 30 Min. Der zellfreie Extrakt der rekombinanten 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase von E. coli wird aufgetragen auf eine Säule aus Ni²⁺-chelatierender Sepharose FF (Säulenvolumen 25 ml, Amersham Pharmacia Biotech), welche zuvor mit 20 mM Imidazol in Standardpuffer äquilibiert wurde. Die Säule wird mit 100 ml Standardpuffer gewaschen. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird mit einem linearen Gradienten von 20-500 mM Imidazol in Standardpuffer eluiert. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase enthaltende Fraktionen werden entsprechend SDS-PAGE vereinigt und gegen 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 über Nacht dialysiert. Die dialysierte 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird mittels Ultrafiltration (MWCO 10 kDa, Amicon, USA) konzentriert und auf eine Superdex 75 HR 26/60 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) aufgetragen. Die Homogenität der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese geprüft. Eine Bande bei 43 kDa ist sichtbar, was in Übereinstimmung mit der berechneten Molekularen Masse ist. Die Ausbeute reiner 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase ist 60 mg.
Beispiel 31
Bestimmung der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase Aktivität
31.1 Mittels Kernmagnetischer Resonanz (NMR)
Die Reaktionsmischung enthält 400 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM [2-¹³C]Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 10 mM MgCl₂, 2 mM Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mM EDTA, 10 % D₂O und 0,8 mg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Die Mischung wird 3 Std. bei 37 °C inkubiert. Protein wird durch Zugabe von 0,1 ml 50 % Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Nach Zentrifugation wird ein ¹³C NMR-Spektrum (62,9 MHz, Bruker, Karlsruhe, Deutschland) aufgenommen. Die Umsetzung wird durch Integration der 2C-Signale von Pyruvat und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat bestimmt. Pyruvat zeigt ein 2C-Signal bei 196,5 ppm und ein Signal bei 92,7 ppm, welches dem korrespondierendem Hydrat zugeordnet wird. 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat zeigt ein Signal bei 212,5 ppm.
31.2 Mittels photometrischer Detektion (Variante A)
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 25 mM Natriumpyruvat, 50 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat (zuvor mit NaOH neutralisiert), 10 mM MgCl₂, 4 mM Thiaminpyrophosphat, 8 mM Dithiothreitol, und 0,02 mg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 25 μl. Die Mischung wird 20 Min. bei 37 °C inkubiert. 25 μl 30 % TCA werden hinzugefügt und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Überstand wird zu einem Puffer, der 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM MnSO₄, 0,5 mM NADPH in einem Gesamtvolumen von 0,95 ml enthielt, hinzugefügt. Die Extinktion bei 340 nm wird gemessen. Ein Lösung (50 μl, 0,1 E) von 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase wird hinzugefügt und die Mischung wird 30 Min. bei 37 °C inkubiert. Die Extinktion bei 340 nm wird wiederum bestimmt. Die Extinktionsdifferenz ist äquivalent zum verbrauchten NADPH (ε₃₄₀ = 6300 M^–1cm^–1), die wiederum äquivalent zur Menge an gebildetem 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat.
31.3 Mittels photometrischer Detektion (Variante B)
Die Reaktionsmischung enthält 200 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 5 mM Natriumpyruvat, 10 mM D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat, 1 mM MnSO₄, 1 mM Thiaminpyrophosphat, 1 mM Dithiothreitol, 0,05 mM NADPH und 1 E 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37 °C inkubiert und die Extinktion bei 340 nm wird bestimmt. Der Test wird durch Zugabe von 5 μl Enzymprobe gestartet. Die negative Steigung der Extinktion ist äquivalent zur Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase Reaktion.
Beispiel 32
Bestimmung der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Aktivität
Die Reaktionsmischung enthält 100 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0, 1 mM MnSO₄, 0,05 mM NADPH und 5 μg Enzymprobe in einem Gesamtvolumen von 1 ml. Die Mischung wird in einer thermostatierbaren Küvette bei 37 °C inkubiert und die Reaktion wird spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt. Der Test wird gestartet durch Zugabe von 10 μl 50 mM 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat. Die negative Steigung der Extinktion ist äquivalent zur Umsatzrate der 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase Reaktion.
Beispiel 33
Enzymatische Synthese von [2,2'-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
Stufe a) Enzymatische Synthese von [1,2 ¹³C₂]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat
Rohes Dihydroxyacetonphosphat wird hergestellt wie von Effenberger, F., und Straub, A. (1987) A novel convinient preparation of dihydroxyaceton phosphate and its use in enzymatic aldol reactions, Tetrahedron Lett 28, 1641-1644 beschrieben. 1 g von Dihydroxyacetonphosphat wird in 70 ml einer Lösung von 57 mM [2,3-¹³C₂]Natriumpyruvat, 10 mM MgSO₄ und 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 gelöst. 17.000 E von Triosephosphatisomerase (Kaninchenmuskel) werden hinzugefügt und die Lösung wird 105 Min. bei 37 °C inkubiert. 0,774 ml (7,4 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase aus B. subtilis werden hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in Beispiel 17 beschrieben verfolgt. Nach 8 Std. wird die Reaktion durch Einstellen des pH auf einen Wert von 3 durch die Zugabe von 1 M HCl (11,2 ml) gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei –20 °C gelagert.
Stufe b) Enzymatische Synthese von [2,2-¹³C₂]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
Zur in Stufe a erhaltenen Reaktionsmischung, die [1,2 ¹³C₂]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat enthält, werden 19 ml 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, 1,1 ml 1 M MgCl₂, 3 g Glukose (72 mMol) und 6 ml einer Lösung von 0,1 M MnCl₂ hinzugefügt und der pH mit 7 ml 1 M NaOH auf 8,0 eingestellt. Präzipat wird durch Zentrifugation entfernt. Zu einem Endvolumen von 200 ml werden Wasser, 250 E Glukosedehydrogenase aus B. megaterium und 56,6 mg NADP⁺ (80 μMol] hinzugefügt. Nach 5 min. Präinkubation bei 37 °C werden 2 ml (11,2 E) rekombinanter 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase aus E. coli hinzugefügt. Nach ca. 30 Std. wird die Reaktion durch Zugabe von 8 ml 2 N HCl gestoppt. Die Reaktionsmischung wird bei –20 °C gelagert.
Stufe c) Enzymatische Synthese von [2,2'-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol
Der pH der [2,2'-¹³C₂]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enthaltenden Reaktionsmischung, die in Stufe b erhalten wurde, wird durch Zugabe von 4 ml 2 M NaOH auf 7,0 eingestellt. 1,4 g CTP (2,5 mMol) werden hinzugefügt und der pH wird mit 6 ml 2 N NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach 5 min. Präinkubation bei 37 °C, werden 1,5 ml (51,8 E) YgbP-Protein aus E. coli hinzugefügt. Die Reaktion wird wie in Beispiel 7 beschrieben verfolgt. Nach ca. 5 Std. wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 550 mg reines 4-Diphosphocytidyl-[2,2'-¹³C₂]2C-methyl-D-erythritol werden erhalten.
Beispiel 34
Enzymatische Synthese von [2,2'-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in einer Eintopfreaktion
Eine Reaktionsmischung, die 3 g Glukose, 1 g Dihydroxyacetonphosphat (5,7 mMol), 1,4 g CTP (2,5 mMol), 0,45 g 2,3-¹³C₂-Natriumpyruvat (4 mMol), 56,6 mg NADP⁺ (80 μMol), in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 enthalten, wird hergestellt. 17.000 E Triosephosphatisomerase, 250 E Glukosedehydrogenase, 7 E 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase, 13 E 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase und 55 E YgbP-Protein werden hinzugefügt. Zu einem Endvolumen von 200 ml werden 10 mm MgCl₂, 10 mM MnSO₄, 2,5 mM Thiaminpyrophosphat in 150 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0 hinzugefügt. Der pH wird mit 5 ml NaOH auf 8,0 eingestellt. Die Reaktionsmischung wird bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird wie in Beispiel 7 beschrieben verfolgt. Nach 30 Std. wird die Reaktionsmischung wie in Beispiel 8 beschrieben gereinigt und lyophilisiert. 490 mg [2,2'-¹³C₂]4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol werden erhalten.
Beispiel 35
Präparative Herstellung von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (Großmasstab)
Diese Herstellung kann mit jeder ¹³C-markierten Probe von Glukose oder Pyruvat als Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel ist sie für [U-¹³C₆]Glukose und [2,3-¹³C₂]Pyruvat beschrieben.
Schritt A) Präparative Herstellung von [U-¹³C₅]1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat.

Eine Reaktionsmischung mit 166 mg [U-¹³C₆]Glukose (0,89 mMol), 44 mg Thiaminpyrophosphat, 1,02 g ATP (1,79 mMol), 200 mg [2,3-¹³C₂]-Pyruvat (1,79 mMol), 6 mM MgCl₂ in 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0 wird hergestellt. 410 E Triosephosphatisomerase (aus Kaninchenmuskel, Typ III-S, E.C. 5.3.1.1., Sigma), 360 E Hexokinase (aus Bäckerhefe, Typ VI, E.C. 2.7.1.1., Sigma), 50 E Phosphoglukoseisomerase (aus Bäckerhefe, Typ III, E.C. 5.3.1.9., Sigma), 20 E Phosphofruktokinase (aus Bacillus stearothermophilus, Typ VII, E.C. 2.7.1.11, Sigma), 35 E Aldolase (aus Kaninchenmuskel, E.C. 4.1.2.13, Sigma) und 2 E rekombinante DXP-Synthase aus B. subtilis werden auf ein Endvolumen von 58 ml aufgefüllt. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37 °C inkubiert. Während der Reaktion wird der pH durch Zugabe von 1 M NaOH (2 ml) konstant bei 8,0 gehalten. Die Reaktion wird durch Zugabe von 3 ml 2 N Salzsäure gestoppt. ¹³C-NMR-Spektren werden aufgenommen um die Umsetzung zu verfolgen. (Tabelle 9). Tabelle 9. NMR-Daten von [U-¹³C₅]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat

Position	Chemische Verschiebungen, ppm^a	Kopplungskonstanten, Hz
	¹³C	J_PC	J_CC
1	25.9		41.1 (2), 12.8 (3)
2	213.1		41.3 (1), 41.3 (3), 3.1 (5)
3	77.0		41.5 (2), 40.2 (4), 12.8 (1)
4	70.7	6.9	43.2 (5), 39.6 (3)
5	64.3	4.6	43.4 (4), 3.1 (2)

^a referenziert auf externes Trimethylsilylpropansulfonat.

Schritt B) Präparative Herstellung von [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat
Zu der Lösung aus Schritt A wird 10 E DXP-Reduktoisomerase, 120 E Glukose Dehydrogenase (aus Bacillus megaterium, E.C. 1.1.1.47, Sigma), 0,97 g Glukose, 200 mM MgCl₂ und 0,3 mM NADP⁺ gegeben. Der pH wird mit 1,5 ml 4 N Natronlauge auf 8,0 eingestellt. Nach Zentrifugation beträgt das Volumen 72 ml. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Umsetzung wird durch ¹³C-NMR-Spektroskopie des ansammelnden Produkts überwacht. (Tabelle 10). Das Reaktionsprodukt wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil 10 SB (16 × 250 cm) mit 0,5 M Ameisensäure als Eluenten und einer Flußrate von 13 ml/min gereinigt. Der Eluent wird mit einem Refraktometer (GAT-LCD210 von Gamma Analyse Technik, Bremerhafen, Deutschland) überwacht. Das Produkt wird bei 14,5 ml eluiert. Die Fraktionen, die [U-¹³C₅]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat enthalten, werden gesammelt und lyophilisiert. Die Menge beträgt 86 mg. Tabelle 10. NMR-Daten von [U-13C₅]2C-Methyl-D-erythritol

Position chemische Verschiebung, ppm^a

1 66,5

2 74,1

2-Methyl 18,5

3 74,1

4 64,6

^a bezogen auf externes Trimethylsilylpropansulfonat.

Beispiel 36
Enzymatische Herstellung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat
Diese Herstellung kann mit jeder ¹³C-markierten Probe von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat als Startmaterial durchgeführt werden. In diesem Beispiel wird es für [1,3,4-¹³C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat beschrieben.
Zu einer Reaktionsmischung, enthaltend 15 mg gereinigtes [1,3,4-¹³C]2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat (69 μMol), 34 mg CTP (69 μMol), 16 mg Natriumphosphoenolpyruvat (69 μMol), 1,9 mg ATP (3,5 μMol), 10 mg MgCl₂, 5 mM DTT, 10 mM KCl und 150 mM Tris-Hydrochlorid pH 8,0, 60 μl YgbP-Protein (2,1 mg/ml), 200 μl YchB Protein (0,3 mg/ml) und 100 E Pyruvatkinase (aus Kaninchen Muskel, Typ VII, E.C. 2.7.1.40, Sigma) werden zugegeben. Das Endvolumen beträgt 5 ml. Die Reaktionsmischung wird für 4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird wie in Beispiel 15 beschrieben verfolgt.
4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat wird durch HPLC auf einer Anionenaustauschersäule Nukleosil 5 SB (7,5 × 150 mm) mit einem Gradient an 1 M Ammoniumformiat (B) und 100 mM Ammoniumformiat als Eluent bei einer Flußrate von 3,1 ml/min gereinigt.

t (Min.) A (%) B (%)

0 100 0

5 100 0

35 30 70

40 30 70
Der Eluent wird mit einem UV-Detektor (Knauer) bei 275 nm überwacht. 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat eluiert bei 26-27 Min.
Herstellungsbeispiele für markierte Substrate
Herstellungsbeispiel 1
(a) 1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol (7)
1,2,5,6-Di-O-isopropyliden-D-mannitol (5) (14 g, 53,4 mMol) wurde in 200 ml trockenem Chloroform gelöst. Wasserfreies Kaliumcarbonat (50,5 g, 366 mMol) wurde zugegeben, und die Suspension wurde auf 0 °C gekühlt. Bleitetraacetat (27,1 g, 61,1 mMol) wurde in kleinen Portionen unter starkem Rühren eingetragen. Die orangefarbene Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Kaliumcarbonat wurde abgenutscht, und der Filterkuchen mehrmals mit Ether gewaschen. Das Filtrat und die Waschphase wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl, welches den Isopropylidenglycerinaldehyd enthielt, wurde rasch destilliert (60 °C bei 30-40 mbar). Ausbeute: 10,5 g (80,7 mMol, 76 %) reiner Isopropylidenglycerinaldehyd 6. Dieses Produkt wurde sofort in 35 ml trockenem Ether gelöst, um eine Polymerisation zu verhindern. Die Lösung von 7 wurde zu einer gekühlten Lösung aus Methylmagnesiumjodid in Ether gegeben [hergestellt aus 5,1 g (207 mMol) Magnesium und 13,0 ml (209 mMol) Methyljodid in 140 ml Ether]. Nachdem der Aldehyd komplett zugegeben war, wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur weiter gerührt. Die so erhaltene Lösung wurde anschließend langsam auf zerkleinertes Eis geschüttet, und ausgefallenes Magnesiumhydroxid wurde durch Zugabe einer gesättigten Ammoniumchloridlösung (50 ml) wieder in Lösung gebracht. Die organische Phase wurde abgetrennt, und die wässrige Phase wurde mit Natriumchlorid gesättigt und anschließend mit Chloroform extrahiert (3 × 50 ml). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Ausbeute: 9,9 g (67,8 mMol, 84 %) 1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol (8).
¹H NMR (360 MHz, CDCl₃): d (ppm) 0,96 (d, ³J = 6,5 Hz), 1,07 (d, ³J = 6,5 Hz), 1,24 (s), 1,25 (s), 1,29 (s), 1,33 (s), 3,41-3,47 (m), 3,67-3,78 (m), 3,82-3,97 (m), 4,67 (d, ³J = 4,6 Hz), 4,75 (d, ³J = 5,2 Hz) (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); ¹³C NMR (90 MHz, CDCl₃): d (ppm) 18,0, 19,8, 24,8, 26,1, 64,3, 65,9, 66,1, 66,9, 79,1, 79,3, 107,7, 107,7 (unterstrichene Signale gehören zu dem Diastereomer, welches im Überschuss entsteht); Anal. ber. für: C₇H₁₄O₃: C 57,5, H 9,9, O 32,6; gef.: C 57,2, H 9,9, O 32,8.
(b) 3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon (8)
1,2-O-Isopropyliden-(2R,3RS)-1,2,3-butantriol (7) (9,9 g, 67,8 mMol) wurde in 100 ml Chloroform gelöst. Wasser (100 ml), 30 g Kaliumcarbonat (217 mMol) und 50 mg Rutheniumdioxid-Hydrat wurden zugegeben. Diese Suspension wurde bei Raumtemperatur heftig gerührt, und 29 g (136 mMol) Natriumperjodat wurde in kleinen Portionen zugefügt. Sobald der pH-Wert unter 7 fiel wurde er durch Zugabe von festem Kaliumcarbonat wieder auf einen Wert zwischen 8 und 8,5 eingestellt. Nach Beendigung der Perjodatzugabe ließ man die Suspension zwei weitere Tage bei Raumtemperatur rühren. Vor der Aufarbeitung wurde ein Aliquot der Reaktionsmischung mit Hilfe der ¹H NMR-Spektroskopie überprüft. Falls noch Ausgangsmaterial vorhanden war wurde zur Reaktionsmischung eine zusätzliche Menge an Natriumperjodat gegeben. Wenn die Oxidation vollständig abgelaufen war, wurde die Suspension abgenutscht und das Filtrat wurde mit Chloroform extrahiert (4 × 50 ml). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Ausbeute: 7,2 g (50 mMol, 74 %) 3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon (8).
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,4 (s, 3H), 1,5 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 4,0 (dd, ²J = 8,54 Hz, ³J = 5,50 Hz, 1H), 4,2 (dd, ²J = 8,54 Hz, ³J = 7,95 Hz, 1H), 4,41 (dd, ³J = 7,94 Hz, ³J = 5,5 Hz, 1H); ¹³C NMR (62 MHz, CDCl₃): d (ppm) 25,3 (CH₃), 25,6 (CH₃), 26,3 (CH₃), 66,4 (CH₂), 80,4 (CH), 110,9 (C_q).
(c) 1,2-O-Isopropyliden-3-O-trimethylsilyl-(2R,3RS)-1,2,3-trihydroxy-3-cyanobutan (9)
3,4-O-Isopropyliden-(3R)-3,4-dihydroxy-2-butanon (8) (7,2 g, 50 mMol) wurde in 50 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Zu dieser Lösung wurde eine katalytische Menge Kaliumcyanid (20 mg) und der Kronenether 18-Krone-6 (20 mg) gegeben. Unter Eiskühlung wurden 9,4 ml (70 mMol) Trimethylsilylcyanid innerhalb 20 Minuten zugetropft. Das Lösungsmittel und überschüssiges Trimethylsilylcyanid wurden unter reduziertem Druck entfernt. Der orangefarbene ölige Rückstand (12,0 g, 49,3 mMol, 99 %) enthielt eine Mischung der Erythro- und Threoverbindung in einem Verhältnis von 3:1, der darüber hinaus keine nennenswerten Mengen anderer Produkte enthielt.
¹H NMR (360 MHz, CDCl₃): d (ppm) 0,17 und 0,18 (2s, 9H), 1,12 (s), 1,29 (s), 1,40 (s), 1,43 (s), 1,46 (s), 1,57 (s) (9H), 3,85-3,90 (m, 1H), 3,97-4,10 (m, 2H); ¹³C NMR (90 MHz, CDCl₃): erythro d (ppm) 1,2 (TMS), 24,0 (CH₃), 25,0 und 26,0 ((CH₃)₂), 65,0 (CH₂), 80,4 (CH), 110,9 (CN); threo d (ppm) –3,1 (TMS), 25,2 (CH₃), 26,2 und 26,4 ((CH₃)₂), 66,4 (CH₂), 80,8 (CH), 120,7 (CN).
(d) 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton (11) und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton (12)
1,2-O-Isopropyliden-3-O-trimethylsilyl-(2R,3RS)-1,2,3-trihydroxy-3-cyanobutan (9) (12,0 g, 49,3 mMol) wurde in 30 ml 25 %iger Salzsäure suspendiert. Zur Verbesserung der Löslichkeit des lipophilen Cyanhydrins wurde Ethanol (10 ml) hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 45 °C 30 Minuten lang gerührt und anschließend 3 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Die Mischung färbte sich braun, und ein Niederschlag aus Ammoniumchlorid setzte sich ab. Anschließend wurde die Säure mit konzentrierter Ammoniaklösung neutralisiert, und die Mischung wurde zur Trockene eingeengt. Der Kristallbrei wurde danach mit Methanol digeriert, und unlösliches Ammoniumchlorid wurde abfiltriert. Das Methanol wurde im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl enthielt die Laktone 11 und 12, sowie die offenkettigen Carbonsäuren (10). Die Lactonisierung wurde durch Kochen mit 60 %iger Ameisensäure (30 ml) für 2 Stunden vervollständigt. Sobald keine offenkettigen Carbonsäuren in der Mischung mehr nachweisbar waren, wurde die Lösung unter reduziertem Druck aufkonzentriert. Das zurückbleibende Öl wurde in einer Mischung aus Ethylacetat, 2-Propanol und Wasser (5 ml, 65/24/12, v/v/v) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule gegeben (saure Form) und wurde mit der Mischung aus Ethylacetat/2-Propanol/Wasser eluiert. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde lyophilisiert. Das zurückbleibende Öl (5,9 g, 44,7 mMol, 91 %) enthielt nach NMR-spektroskopischer Analyse 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton in einem Verhältnis von 3:1.
2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton ¹H NMR (250 MHz, CD₃OD): d (ppm) 1,30 (s, 3H), 3,92 (dd, ²J = 4,27 Hz, ³J = 9,16 Hz, 1H), 4,13 (dd, ²J = 4,27 Hz, ³J = 5,50 Hz, 1H), 4,44 (dd, ²J = 5,50 Hz, ³J = 9,15 Hz, 1H); ¹³C NMR (63 MHz, CD₃OD): d (ppm) 17,9 (CH₃), 73,1 (CH₂), 78,8 (CH), 85,8 (C_q), 161,8 (C_q); IR (Film): 1770 cm^–1; Anal. ber. für C₅H₈O₄: C 45,4, H 6,0, 48,3; gef.: C 46,2, H 6,5, O 47,3.
2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton ¹H NMR (250 MHz, CD₃OD): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 4,00 (dd, ²J = 1,83 Hz, ³J = 4,27 Hz, 1H), 4,09 (dd, ²J = 1,83 Hz, ³J = 9,77 Hz, 1H), 4,38 (dd, ²J = 4,27 Hz, ³J = 10,38 Hz, 1H); ¹³C NMR (63 MHz, CD₃OD): d (ppm) 21,9 (CH₃), 73,6 (CH₂), 75,0 (CH), 75,8 (C_q), 164,9 (C_q); IR (Film): 1770 cm^–1.
Offenkettige Carbonsäuren (Isomerenmischung 1:1) ¹H NMR (250 MHz, D₂O): d (ppm) 1,14 (s, 3H), 1,17 (s, 3H), 3,45-3,85 (m, 6H); ¹³C NMR (63 MHz, D₂O): d (ppm) 19,8 (CH₃), 20,7 (CH₃), 64,9 (CH₂), 65,2 (CH₂), 70,1 (CH), 70,3 (CH), 77,8 (C_q), 77,9 (C_q), 182,5 (C_q), 182,8 (C_q).
(e) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrono-1,4-lacton (13)
Wasserfreies Zinkchlorid (14,1 g, 103 mMol) wurde in 100 ml Aceton gelöst Die Lösung wurde mit Eis gekühlt, und 5,9 g einer Mischung aus 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton (11) (33,5 mMol) und 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton (12) (11,2 mMol) gelöst in 13 ml Aceton wurde zugegeben. Nach 18 Stunden wurde die Lösung durch Zugabe von 150 ml Chloroform verdünnt. Zinkchlorid und unverändertes 2C-Methyl-D-threono-1,4-lacton wurden durch Waschen mit Wasser (3 × 100 ml) entfernt. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: reines 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrono-1,4-lactone (13) (4.4 g, 25.6 mMol, 76 % ausgehend von 2C-Methyl-D-erythrono-1,4-lacton) in Form eines farblosen Öles welches bei –20 °C kristallisierte.
¹H NMR (360 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,33 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,48 (s, 3H), 4,24 (dd, ³J = 3,54 Hz, ²J = 11,06 Hz, 1H), 4,34 (dd, ²J = 11,06 Hz, ³J = 0 Hz, 1H), 4,41 (dd, ²J = 3,50 Hz, ³J = 0 Hz, 1H); ¹³C NMR (90 MHz, CDCl₃): d (ppm) 18,4 (CH₃), 26,5 (CH₃), 26,9 (CH₃), 68,9 (CH₂), 80,3 (CH), 81,4 (C_q), 113,0 (C_q), 176,7 (C_q).
(f) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrofuranose (14)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrono-1,4-lacton (13) (2,2 g, 12,9 mMol) wurde in 60 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Die Mischung wurde unter Stickstoff auf –78 °C gekühlt. Anschließend wurde eine Lösung aus Diisobutylaluminiumhydrid (1 M in Hexan, 17 ml, 17 mMol) langsam zugetropft. Die Lösung ließ man im Kühlbad über Nacht stehen. Nasser Ether (180 ml) und nasses Kieselgel (30 g) wurden zugefügt. Die Mischung wurde 1 Stunde gerührt, danach auf Raumtemperatur erwärmt und dann filtriert. Die Lösung wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das zurückbleibende Öl wurde durch Chromatographie an Kieselgel mit einer Mischung aus Hexan/Ethylacetat (1/2, v/v) gereinigt. Ausbeute: 2,0 g (11,5 mMol, 89 %) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrofuranose (14) als anomere Mischung (α/β = 1/1).
¹H NMR (360 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,29 (s), 1,30 (s), 1,34 (s), 1,35 (s), 1,37 (s) (18H), 3,46 (dd, ³J = 3,54 Hz, ²J = 11,06 Hz, 1H), 3,55 (m, 1H), 3,78 (d, ²J = 11,50 Hz, 2H), 3,84 (d, ²J = 11,06 Hz, 1H), 3,97 (dd, ³J = 3,80 Hz, ²J = 10,40 Hz, 1H), 4,29 (dd, ³J = 3,10 Hz, ³J = 8,85 Hz, 2H), 4,52 (d, ²J = 11,06 Hz, 1H), 5,13 (d, ³J = 2,65 Hz, 1H); ¹³C NMR (90 MHz, CDCl₃): d (ppm) 19,4 (CH₃), 21,4 (CH₃), 26,3 (CH₃), 26,9 (CH₃), 27,2 (CH₃), 28,0 (CH₃), 67,1 (CH₂), 71,5 (CH₂), 84,9 (CH), 86,0 (C_q), 86,1 (CH), 91,4 (C_q), 101,4 (C_q), 103,3 (C_q), 112,4 (CH), 112,9 (CH).
(g) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim (15)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrofuranose (14) (0,5 g, 2,87 mMol) wurde in 12 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Trockenes Pyridin (1 ml) und 0,88 g (5,5 mMol) O-Benzylhydroxylaminhydrochlorid wurde auf ein Mal zugegeben. Das Hydroxylamin löste sich innerhalb von 20 Minuten auf, und die Reaktionsmischung wurde nach 40 Minuten trübe. Die Mischung wurde 15 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und anschließend das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Chloroform/Ethylacetat (1/4, v/v, 1 ml) suspendiert. Die Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (1 cm × 30 cm) aufgetragen, und das Produkt wurde mit der Lösungsmittelmischung eluiert. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 0,53 g (1,9 mMol, 66 %) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim (18) als farbloses Öl.
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,26 (s, 3H), 1,31 (s, 3H), 1,33 (s, 3H), 3,42-3,56 (m, 2H), 3,86 (dd, ³J = 4,89 Hz, ³J = 6,72 Hz, 1H), 4,92 (s, 2H), 7,15-7,25 (m, 5H), 7,32 (s, 1H); ¹³C NMR (63 MHz, CDCl₃): d (ppm) 22,8 (CH₃), 26,6 (CH₃), 27,9 (CH₃), 60,7 (CH₂), 76,0 (CH₂), 80,5 (CH), 84,3 (C_q), 109,4 (C_q), 127,9 (CH), 128,2 (CH), 128,3 (CH), 137,2 (C_q), 152,0 (CH).
(h) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat (16)
Tribenzylphosphit (1,3 g, 3,7 mMol) wurde in 20 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Die Lösung wurde auf –20 °C gekühlt. Jod (0,96 g, 3,8 mMol) wurde in einer Portion zugegeben. Die Lösung wurde lichtgeschützt auf Raumtemperatur erwärmt, sobald die violette Farbe der Lösung verschwunden war. 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim (15) (0,53 g, 1,9 mMol) wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst und 2,5 ml Pyridin (31,6 mMol) wurde zugegeben. Die Lösung wurde auf –20 °C gekühlt und die Lösung des Dibenzyljodphosphates wurde langsam zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde anschließend nacheinander mit Natriumhydrogensulfat (30 %, w/v, 2 × 10 ml), einer Lösung aus Natriumhydrogencarbonat (5 %, w/v, 10 ml), und Wasser (10 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in einer Mischung aus Hexan/Ethylacetat (3/1, v/v, 2 ml) suspendiert. Diese Mischung wurde auf eine Kieselgelsäule (1 cm × 20 cm) aufgetragen und mit Hexan/Ethylacetat (3/1, v/v) solange eluiert, bis das Benzyljodid vollständig ausgewaschen war. Das Produkt wurde danach mit einer Mischung aus Chloroform/Ethylacetat (1/4, v/v) eluiert. Produkthaltige Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 0,73 g (1,35 mMol, 71 %) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat.
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,31 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 1,39 (s, 3H), 3,90-3,99 (m, 3H), 4,94 (s, 1H), 4,97-5,02 (m, 6H), 7,24-7,33 (m, 15H); ¹³C NMR (63 MHz, CDCl₃): d (ppm) 22,0 (CH₃), 26,6 (CH₃), 28,0 (CH₃), 65,3 (d, ²J_CP = 5,5 Hz, CH₂), 69,1-69,5 (m, CH₂), 76,2 (CH₂), 80,2 (C_q), 82,5 (d, ³J_CP = 7,9 Hz, CH), 109,7 (C_q), 127,9-128,5 (CH), 135,6 (d, ³J_CP = 6,8 Hz, C_q), 137,9 (C_q), 150,3 (CH); ³¹P NMR (101 MHz, CDCl₃): d (ppm) –0,8 (s).
(i) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-(O-benzyl)oxim-4-dibenzylphosphat (16) (0,26 g, 0,43 mMol) wurde in 15 ml Dichlormethan gelöst, welches 2 ml Pyridin enthielt. Die Lösung wurde auf –78 °C gekühlt und wurde 7 Minuten lang mit einem Ozondurchfluss von ungefähr 3 g/min (0,44 mMol) ozonisiert. Anschließend wurde Stickstoff durch die tiefblaue Lösung geleitet. Sobald die blaue Farbe verschwunden war, wurden 2 ml Dimethylsulfid zugegeben. Die Mischung ließ man noch 1 Stunde bei –78 °C stehen und ließ sie dann auf Raumtemperatur erwärmen. Das Lösungsmittel und Pyridin wurden unter reduziertem Druck entfernt, und das Rohprodukt wurde chromatographisch gereinigt (Kieselgel; Chloroform/Ethylacetat 1/4, v/v). Ausbeute: 0,17 g (0,39 Mol, 81 %) reiner Aldehyd.
¹H NMR (360 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,24 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,46 (s, 3H), 3,93-4,02 (m, 2H), 4,05-4,13 (m, 1H), 4,92-5,00 (m, 4H), 7,23-7,30 (m, 10H), 9,51 (s, 1H); ¹³C NMR (90 MHz, CDCl₃): d (ppm) 19,7 (CH₃), 26,5 (CH₃), 27,8 (CH₃), 64,3 (d, ²J_CP = 6,0 Hz, CH₂), 69,5 (m, CH₂), 82,7 (d, ³J_CP = 8,7 Hz, CH), 85,1 (C_q), 110,9 (C_q), 126,8 (d, ⁴J_CP = 14,5 Hz, CH), 127,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, ³J_CP = 7,3 Hz, C_q), 202,0 (CH); ³¹P NMR (101 MHz, CDCl₃): d (ppm) –1,0 (s).
(j) 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (18)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17) (85 mg, 0,2 mMol) wurde in 3 ml trockenem Methanol gelöst, und die Lösung wurde auf 0 °C gekühlt. Natriumborhydrid, 20 mg (0,5 mMol), wurde in einer Portion zugegeben. Diese Mischung wurde 2 Stunden gerührt. Wasser (5 ml) wurde anschließend zugegeben, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören, und die Mischung wurde mit konzentrierter Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Die Suspension wurde 4 mal mit je 10 ml Chloroform extrahiert, und die organische Lösung wurde mit 20 ml einer Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5 %, w/v) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 85,5 mg (0,2 mMol, 100 %) reines 18.
¹H NMR (250 MHz, CDCl₃): d (ppm) 1,20 (s, 3H), 1,30 (s, 3H), 1,36 (s, 3H), 1,89 (s, breit, 2H), 3,34 (m, 2H), 3,95 (dd, J = 4,70 Hz, J = 7,10 Hz, 1H), 4,08-4,20 (m, 2H), 5,00 (dd, J = 1,83 Hz, J = 8,55 Hz, 4H), 7,29 (m, 10H); ¹³C NMR (63 MHz, CDCl₃): d (ppm) 22,1 (CH₃), 26,4 (CH₃), 28,1 (CH₃), 65,0 (CH₂), 65,2 (d, ²J_CP = 5,45 Hz, CH₂), 69,4 (dd, ²J_CP = 2,72 Hz, ²J_CP = 5,45 Hz, CH₂), 81,1 (d, ³J_CP = 8,18 Hz, CH), 81,7 (C_q), 108,5 (C_q), 126,9 (CH), 128,6 (CH), 135,6 (d, ³J_CP = 6,80 Hz, C_q); ³¹P NMR (101 MHz, CDCl₃): d (ppm) 0,5 (s).
(k) 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure (4)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (18) (85,5 mg, 196 μMol) wurde in 8 ml einer Mischung, bestehend aus 4 ml Methanol und 4 ml Wasser, suspendiert. Eine katalytische Menge Palladium/Aktivkohle wurde hinzugefügt, und die Suspension wurde 20 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch einen 0,2 μm Membranfilter entfernt. Die saure Lösung (pH 2) wurde auf 70 °C 60 Minuten lang erhitzt. Das Methanol wurde unter reduziertem Druck bei 40 °C entfernt, und der Rückstand wurde lyophilisiert. Ausbeute: 35,3 mg (163 μMol, 83 %) Rohprodukt. Die Phosphorsäure wurde in 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Nukleosil SB₁₀ HPLC Säule aufgetragen und mit 0,5 M Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Die Auftrennung wurde refraktometrisch verfolgt. Produkthaltige Fraktionen (Retentionsvolumen 15 ml) wurden gesammelt und lyophilisiert. Ausbeute: 18,0 mg reines 4.
¹H NMR (500 MHz, D₂O, pH 1): d (ppm) 1,04 (s, 3H), 3,37 (d, ²J = 11,77 Hz, 1H), 3,50 (d, ²J = 11,78 Hz, 1H), 3,64 (dd, ³J = 2,60 Hz, ³J = 8,10 Hz, 1H), 3,77 (ddd, ³J_HP = 6,20 Hz, ³J = 8,10 Hz, ³J = 10,80 Hz, 1H), 4,01 (ddd, ³J = 2,50 Hz, ³J_HP = 6,00 Hz, ³J = 10,80 Hz, 1H); ¹³C NMR (125 MHz, D₂O, pH 1): d (ppm) 18,2 (C₃), 65,9 (d, ²J_CP = 5,14 Hz, CH₂), 66,2 (CH₂), 73,1 (d, ³J_CP = 7,58 Hz, CH), 73,8 (C_q); ³¹P NMR (101 MHz, D₂O, pH 1): d (ppm) 3,7 (s).
Herstellungsbeispiel 2
[1-²H₁]-2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure (4)
2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17), 85 mg (0,2 mMol) wurde in 3 ml trockenem Methanol gelöst, und die Lösung wurde auf 0 °C gekühlt [²H]-NaBH₄, 20 mg, (0,5 mMol) wurde in einer Portion zugegeben. Wasser (5 ml) wurde zugegeben, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören, und die Mischung wurde mit konzentrierter Essigsäure auf pH 5 eingestellt. Die Suspension wurde 4 mal mit je 10 ml Chloroform extrahiert, und die organische Lösung wurde mit 20 ml einer 5 %-iger Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Ausbeute: 85,5 mg (0,2 mMol, 100 %) reines [1-²H₁]-2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (21).
[1-²H₁]-2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythritol-4-dibenzylphosphat (85,5 mg, 196 μMol) wurde in 8 ml einer Mischung, bestehend aus 4 ml Methanol und 4 ml Wasser, suspendiert. Eine katalytische Menge Palladium auf Aktivkohle wurde hinzugefügt, und die Suspension wurde 20 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration durch einen 0,2 μm Membranfilter entfernt. Die saure Lösung (pH 2) wurde auf 70 °C 60 Minuten lang erhitzt. Das Methanol wurde unter reduziertem Druck bei 40 °C entfernt, und der Rückstand wurde lyophilisiert. Ausbeute: 35,3 mg (163 μMol, 83 %) Rohprodukt. Die Phosphorsäure wurde in 1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Nukleosil SB₁₀ HPLC Säule aufgetragen und mit 0,5 M Ameisensäure bei einer Durchflussrate von 1 ml/min eluiert. Die Auftrennung wurde refraktometrisch verfolgt. Produkthaltige Fraktionen (Retentionsvolumen 15 ml) wurden gesammelt und lyophilisiert und gaben reines [1-²H₁]-4.
Herstellungsbeispiel 3
[1-³H₁]-2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphorsäure (4)
[³H]-NaBH₄ (8,5 μMol, 100 mCi, 11,8 Ci/mMol) wurde in 500 μl trockenem Methanol suspendiert. 170 μl einer Lösung enthaltend 33,3 μMol 2,3-O-Isopropyliden-2C-methyl-D-erythrose-4-dibenzylphosphat (17) in trockenem Methanol wurde bei Raumtemperatur in einer Portion zur Borhydrid-Suspension gegeben. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde 1 ml Wasser zugegeben, um überschüssiges Borhydrid zu zerstören. Die entstandene Suspension wurde mit Chloroform (3 × 170 μl) extrahiert, die organischen Phasen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde ohne zu trocknen unter reduziertem Druck entfernt.
Der Rückstand wurde in 50 %igem Methanol (1 ml) gelöst, eine katalytische Menge Palladium auf Aktivkohle wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde 12 Stunden (Raumtemperatur, 1 atm) hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Essigsäure (100 %, 1 ml) wurde zugegeben und die Mischung wurde für 30 Minuten auf 60 °C erhitzt.
Herstellungsbeispiel 4
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [¹³C]Methyljodid in Schritt (a) liefert die ¹³C-markierte Verbindung (4).
Herstellungsbeispiel 5
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [²H₃]Methyljodid liefert die deuteriummarkierte Verbindung (4).
Herstellungsbeispiel 6
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [³H]Methyljodid liefert die tritiummarkierte Verbindung (4).
Herstellungsbeispiel 7
Die Wiederholung des Herstellungsbeispiels 1 mit [¹⁴C] Kaliumcyanid in Schritt (c) liefert das ¹⁴C-markierte Produkt (4).
Herstellungsbeispiel 8
[1,2-¹⁴C₂]1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (spezifische Aktivität: 62,5 mCi/mMol) wurde biosynthetisch aus [U-¹⁴C]Pyruvat (spezifische Aktivität: 150 mCi/mMol) und D,L-Glycerinaldehyd-3-phosphat hergestellt nach der Methode, die in Sprenger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 12857-12862 beschrieben wurde.
Herstellungsbeispiel 9
[1-³H] 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat (spezifische Aktivität: 5 mCi/mMol) wurde entsprechend Herstellungsbeispiel 8 aus [3³H]Pyruvat (spezifische Aktivität: 72,3 Ci/mMol) synthetisiert.
Herstellungsbeispiel 10
[1,2-¹⁴C₂]1-Deoxy-D-xylulose (spezifische Aktivität: 62,5 mCi/mMol) wurde hergestellt aus [U-¹⁴C]Pyruvat mit einer spezifischen Radioaktivität von 150 mCi/mMol und D-Glycerinaldehyd unter Verwendung des Pyruvatdehydrogenasekomplexes aus E. coli DH5a als Katalysator. Die Ausbeute betrug 80 %. Es wurde die Methode von Yokota, A. und Sasajima, K. Agric. Biol. Chem. 48, 149-158 (1994) sowie ibid 50, 2517-2524 (1986) verwendet.
Annex A Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YgbP und YgbB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Annex B Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Alignment von zu YchB von E. coli orthologen Aminosäuresequenzen, Fortsetzung
Annex C Alignment von Aminsäuresequenzen von kloniertem YgbP-Genprodukt und YgbP-Genprodukt aus der Datenbank
Annex Da cDNA- und Proteinsequenz von ygbP aus A. thaliana
Annex Db CDNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ygbP Gens aus A. thaliana
Annex Ea CDNA-Sequenz und correspondierend Proteinsequenz des ychB Gens aus A. thaliana
Annex Eb CDNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ychB Gens aus A. thaliana
Annex Ec ALIGNMENT VON ZWEI NUKLEOTIDSEQUENZEN
Annex F1 Nukleotidsequenz des Plasmids pNCO113
Annex F2 Nucleotidsequenz des Plasmids pNCO-SB-H6-ACYC184
Annex G CDNA-Sequenz und Aminosäuresequenz des ygbB Gens aus P. falciparum
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Proteins zum Screening einer chemischen Bibliothek nach Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden, wobei das Protein enzymatisch funktionell für die Umwandlung von Cytidintriphosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat zu 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol in Gegenwart von Magnesiumionen ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Protein eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Menge der Sequenzen, die von ygbP im E. coli Genom codiert werden, oder aus der Menge der funktionellen Homologen davon.
Verwendung eines Proteins zum Screening einer chemischen Bibliothek nach Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden, wobei das Protein enzymatisch funktionell für die Umwandlung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und Adenosintriphosphat zu 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat in Gegenwart eines Magnesiumsalzes ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei das Protein eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von YchB im E. coli Genom codiert werden, oder aus der Menge der funktionellen Homologen davon.
Verwendung eines Proteins zum Screening einer chemischen Bibliothek nach Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden, wobei das Protein enzymatisch funktionell für die Umwandlung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat zu 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat und CMP ist.
Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei das Protein eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Menge von Sequenzen, die von dem Gen YgbB im E. coli Genom oder von zu YgbB orthologen Sequenzen codiert werden.
Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung der Biosynthese von Isoprenoiden durch Blockierung der Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol aus Cytidintriphosphat und 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat gemäß den folgenden Schritten: a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Protein wie in Anspruch 1 definiert, 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat oder eine Quelle dafür, Cytidintriphosphat und ein divalentes Metallsalz; b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum bei einer vorbestimmten Temperatur; c) Bestimmung der Umsetzung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek; e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung in Schritt d) durch Feststellung ob die bestimmte Umsetzung in Gegenwart der Testprobe erniedrigt ist oder nicht.
Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung der Biosynthese von Isoprenoiden durch Blockierung der Synthese von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat aus 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol und Adenosintriphosphat gemäß den folgenden Schritten: a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Protein wie in Anspruch 3 definiert, 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder eine Quelle dafür, Adenosintriphosphat und ein divalentes Metallsalz; b) Umsetzung der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum bei einer vorbestimmten Temperatur; c) Bestimmung der Umsetzung von 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol; d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek; e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung in Schritt d) durch Feststellung, ob die bestimmte Umsetzung in Gegenwart der Testprobe niedriger ist oder nicht.
Verfahren zum Screening chemischer Bibliotheken nach Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung der Biosynthese von Isoprenoiden durch Blockierung der Synthese von 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat gemäß den folgenden Schritten: a) Herstellung einer wässerigen Mischung umfassend ein Protein wie in Anspruch 5 definiert und 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-2-phosphat oder eine Quelle dafür; b) Umsetzen der Mischung über einen vorbestimmten Zeitraum bei einer vorbestimmten Temperatur; c) Bestimmung der Umsetzung zu 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat; d) Wiederholung der Schritte a) bis c) in Gegenwart einer Testprobe einer chemischen Bibliothek; e) Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Hemmung in Schritt d) durch Feststellung, ob die bestimmte Umsetzung niedriger ist in Gegenwart der Testprobe oder nicht.
Optional isotopmarkiertes 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol oder ein Salz desselben.
Optional isotopmarkiertes 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphat oder ein Salz desselben.
Optional isotopmarkiertes 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat oder ein Salz desselben.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12 zum Screening nach Inhibitoren der Biosynthese von Isoprenoiden.
Umfassendes Verfahren zur Herstellung von Intermediaten der Isoprenoidsynthese abwärts von 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: (a) Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat und Natriumpyruvat in Gegenwart eines Magnesiumsalzes, Thiaminpyrophosphat und Triosephosphatisomerase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Synthase, um 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat herzustellen; (b) Umsetzung der in Schritt (a) erhaltenen Reaktionsmischung mit Glukose und NADP⁺ in Gegenwart eines Mg²⁺- oder Mn²⁺-Salzes, Glukose-Dehydrogenase und 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphat-Reduktoisomerase, um 2C-Methyl-D-erythritol-4-phosphat herzustellen; (c) Umsetzung der der in Schritt (b) erhaltenen Reaktionsmischung mit Cytidintriphosphat, dem Protein wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 definiert und einem divalenten Metallsalz, um 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol herzustellen; (d) optional Umsetzung der in Schritt (c) erhaltenen Reaktionsmischung mit Adenosintriphosphat, einem divalenten Metallsalz und dem Protein wie in den Ansprüchen 3 oder 4 definiert, um 4-Diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol 2-phosphat herzustellen; (e) optional Umsetzung der in Schritt (d) erhaltenen Reaktionsmischung mit dem Protein wie in den Ansprüchen 5 oder 6 definiert, um 2C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphat herzustellen; (f) Isolierung des Produkts aus Schritt (c), aus Schritt (d) oder aus Schritt (e).