ES2560281T3 - Producción de etanol por microorganismos - Google Patents

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Abstract

Un método para la producción biogénica de etanol, que comprende: cultivar una cianobacteria diseñada genéticamente en un medio de cultivo en la presencia de luz y CO2, en donde dicha cianobacteria comprende un gen de la piruvato descarboxilasa recombinante y al menos dos copias de un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.

Description

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DESCRIPCION
Produccion de etanol por microorganismos Campo
La presente divulgacion se refiere a metodos y cianobacterias disenadas para la produccion biogenica de etanol. Antecedentes
La fotosmtesis es un proceso mediante el cual las entidades biologicas utilizan la luz solar y el CO2 para producir azucares para obtener ene^a. La fotosmtesis, como evoluciona naturalmente, es un sistema muy complejo, con numerosos y poco entendidos bucles de retroalimentacion, mecanismos de control, y las ineficiencias del proceso. Este complicado sistema presenta obstaculos probablemente insuperables para cualquiera de los dos enfoques de optimizacion global o un factor cada vez [Nedbal et al., Photosynth Res., 93(1-3):223-34 (2007); Salvucci et al., Physiol Plant., 120(2):179-186 (2004); Greene et al., Biochem J., 404(3):517-24 (2007)].
Los organismos fotoautotroficos existentes (i.e., plantas, algas, y bacterias fotosinteticas) son poco apropiados para el bioprocesamiento industrial y por lo tanto no han demostrado viabilidad comercial para este proposito. Tales organismos tienen tiempo de generacion lento (3-72 horas) en comparacion con los organismos heterotrofos industrializados tales como Escherichia coli (20 minutos), reflejo de bajas productividades totales. Ademas, las tecnicas de manipulacion genetica (desactivacion, sobreexpresion de transgenes a traves de la integracion o propagacion del plasmido episomico) son ineficientes, lentas, laboriosas, o inexistentes.
Resumen
Se describen en este documento rutas y mecanismos para conferir capacidad de produccion de productos a base de carbono directos a organismos fotoautotroficos. Los resultantes fotoautotrofos productores de productos a base de carbono disenados geneticamente permiten unicamente la produccion eficiente de productos a base de carbono directamente a partir de dioxido de carbono y luz, eliminando las etapas de procesamiento laboriosas y costosas actualmente requeridas para generar biocombustibles y productos bioqmmicos a partir de fuentes de biomasa incluyendo mafz, cana de azucar, miscanthus, celulosa, y otros. La invencion provee un metodo para la produccion biogenica de etanol, que comprende: cultivar una cianobacteria disenada geneticamente en un medio de cultivo en la presencia de luz y CO2, en donde dicha cianobacteria comprende un gen de la piruvato descarboxilasa recombinante y al menos dos copias de un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH. La invencion tambien provee una cianobacteria disenada geneticamente, que comprende un gen de la piruvato descarboxilasa recombinante y al menos dos copias de un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.
En algunos aspectos, la produccion de etanol se optimiza canalizando carbono distante del glucogeno y hacia el piruvato, etc., durante la exposicion a la luz. Normalmente el glucogeno se forma a la luz y se consume para reducir la energfa en la oscuridad. En una realizacion, los genes de smtesis de glucogeno son atenuados o eliminados y en otras realizaciones, los genes glicoltticos se hacen constitutivos. En otros aspectos, ciertas rutas de fermentacion, tales como las que conducen a acetato, lactato, succinato, etc., si estan presentes, se eliminan.
Todavfa en otros aspectos, si se debe aplicar el ciclo de luz-oscuridad, la produccion de glucogeno se optimiza durante la exposicion a la luz (en oposicion a la biomasa, etc.) y el aumento en % de peso de celulas secas que puede ser glucogeno (i.e., la celula esta disenada geneticamente para derrotar cualquier limitacion que evite el acrecentamiento completo de glucogeno de las celulas). Luego, durante la oscuridad, se permite que la smtesis de etanol continue a partir del glucogeno acumulado, despues de haber atenuado o eliminado las otras rutas de fermentacion. Ademas, se revela utilizando un ciclo de luz-oscuridad que coincide con las tasas de smtesis/catabolismo del glucogeno de tal manera que un tiempo mmimo se desperdicia (el glucogeno no se agota y las celulas reposan improductivamente en la oscuridad, o hay demasiado glucogeno para consumir por completo durante el periodo de oscuridad).
El acido nucleico disenado geneticamente compuesto por la celula de la invencion codifica una actividad de alcohol deshidrogenasa dependiente de la NADPH. En una realizacion, la alcohol deshidrogenasa dependiente de la actividad de NADPH es Moorella sp. HUC22-1 adhA.
En ciertas realizaciones, la actividad de la piruvato descarboxilasa se selecciona a partir de la actividad de Z. palmae y Z. mobilis pdc.
En ciertas realizaciones, la celula disenada geneticamente de la invencion, en cultivo, es capaz de producir etanol en un rendimiento de al menos aproximadamente 249 mg/L de medio de cultivo en 72 horas. En ciertas otras realizaciones, el rendimiento es de al menos aproximadamente 296 mg/L de etanol durante 72 horas. En todavfa otras realizaciones, el rendimiento de etanol esta entre aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5 g/L de medio de cultivo-hr. En otras realizaciones, el nivel de acetaldehfdo en dicho cultivo despues de 72 horas es inferior a aproximadamente 14 mg/L. En otras realizaciones, la celula en cultivo produce al menos aproximadamente 36 mg/L de etanol por DO, o al menos aproximadamente 47 mg/L de etanol por DO.
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En ciertas realizaciones, la cianobacteria disenada geneticamente es una cianobacteria seleccionada de la siguiente lista de organismos de algas y cianobacterias: Acanthoceras, Acanthococcus, Acaryochloris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinochloris, Actinocyclus, Actinotaenium, Amphichrysis, Amphidinium, Amphikrikos, Amphipleura, Amphiprora, Amphithrix, Amphora, Anabaena, Anabaenopsis, Aneumastus, Ankistrodesmus, Ankyra, Anomoeoneis, Apatococcus, Aphanizomenon, Aphanocapsa, Aphanochaete, Aphanothece, Apiocystis, Apistonema, Arthrodesmus, Artherospira, Ascochloris, Asterionella, Asterococcus, Audouinella, Aulacoseira, Bacillaria, Balbiania, Bambusina, Bangia, Basichlamys, Batrachospermum, Binuclearia, Bitrichia, Blidingia, Botrdiopsis, Botrydium, Botryococcus, Botryosphaerella, Brachiomonas, Brachysira, Brachytrichia, Brebissonia, Bulbochaete, Bumilleria, Bumilleriopsis, Caloneis, Calothrix, Campylodiscus, Capsosiphon, Carteria, Catena, Cavinula, Centritractus, Centronella, Ceratium, Chaetoceros, Chaetochloris, Chaetomorpha, Chaetonella, Chaetonema, Chaetopeltis, Chaetophora, Chaetosphaeridium, Chamaesiphon, Chara, Characiochloris, Characiopsis, Characium, Charales, Chilomonas, Chlainomonas, Chlamydoblepharis, Chlamydocapsa, Chlamydomonas, Chlamydomonopsis, Chlamydomyxa, Chlamydonephris, Chlorangiella, Chlorangiopsis, Chlorella, Chlorobotrys, Chlorobrachis, Chlorochytrium, Chlorococcum, Chlorogloea, Chlorogloeopsis, Chlorogonium, Chlorolobion, Chloromonas, Chlorophysema, Chlorophyta, Chlorosaccus, Chlorosarcina, Choricystis, Chromophyton, Chromulina, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Chroodactylon, Chroomonas, Chroothece, Chrysamoeba, Chrysapsis, Chrysidiastrum, Chrysocapsa, Chrysocapsella, Chrysochaete, Chrysochromulina, Chrysococcus, Chrysocrinus, Chrysolepidomonas, Chrysolykos, Chrysonebula, Chrysophyta, Chrysopyxis, Chrysosaccus, Chrysophaerella, Chrysostephanosphaera, Clodophora, Clastidium, Closteriopsis, Closterium, Coccomyxa, Cocconeis, Coelastrella, Coelastrum, Coelosphaerium, Coenochloris, Coenococcus, Coenocystis, Colacium, Coleochaete, Collodictyon, Compsogonopsis, Compsopogon, Conjugatophyta, Conochaete, Coronastrum, Cosmarium, Cosmioneis, Cosmocladium, Crateriportula, Craticula, Crinalium, Crucigenia, Crucigeniella, Cryptoaulax, Cryptomonas, Cryptophyta, Ctenophora, Cyanodictyon, Cyanonephron, Cyanophora, Cyanophyta, Cyanothece, Cyanothomonas, Cyclonexis, Cyclostephanos, Cyclotella, Cylindrocapsa, Cylindrocystis, Cylindrospermum, Cylindrotheca, Cymatopleura, Cymbella, Cymbellonitzschia, Cystodinium Dactylococcopsis, Debarya, Denticula, Dermatochrysis, Dermocarpa, Dermocarpella, Desmatractum, Desmidium, Desmococcus, Desmonema, Desmosiphon, Diacanthos, Diacronema, Diadesmis, Diatoma, Diatomella, Dicellula, Dichothrix, Dichotomococcus, Dicranochaete, Dictyochloris, Dictyococcus, Dictyosphaerium, Didymocystis, Didymogenes, Didymosphenia, Dilabifilum, Dimorphococcus, Dinobryon, Dinococcus, Diplochloris, Diploneis, Diplostauron, Distrionella, Docidium, Draparnaldia, Dunaliella, Dysmorphococcus, Ecballocystis, Elakatothrix, Ellerbeckia, Encyonema, Enteromorpha, Entocladia, Entomoneis, Entophysalis, Epichrysis, Epipyxis, Epithemia, Eremosphaera, Euastropsis, Euastrum, Eucapsis, Eucocconeis, Eudorina, Euglena, Euglenophyta, Eunotia, Eustigmatophyta; Eutreptia, Fallacia, Fischerella, Fragilaria, Fragilariforma, Franceia, Frustulia, Curcilla, Geminella, Genicularia, Glaucocystis, Glaucophyta, Glenodiniopsis, Glenodinium, Gloeocapsa, Gloeochaete, Gloeochrysis, Gloeococcus, Gloeocystis, Gloeodendron, Gloeomonas, Gloeoplax, Gloeothece, Gloeotila, Gloeotrichia, Gloiodictyon, Golenkinia, Golenkiniopsis, Gomontia, Gomphocymbella, Gomphonema, Gomphosphcceria, Gonatozygon, Gongrosia, Gongrosira, Goniochloris, Gonium, Gonyostomum, Granulochloris, Granulocystopsis, Groenbladia, Gymnodinium, Gymnozyga, Gyrosigma, Haematococcus, Hafniomonas, Hallassia, Hammatoidea, Hannaea, Hantzschia, Hapalosiphon, Haplotaenium, Haptophyta, Haslea, Hemidinium, Hemitoma, Heribaudiella, Heteromastix, Heterothrix, Hibberdia, Hildenbrandia, Hillea, Holopedium, Homoeothrix, Hormanthonema, Hormotila, Hyalobrachion, Hyalocardium, Hyalodiscus, Hyalogonium, Hyalotheca, Hydrianum, Hydrococcus, Hydrocoleum, Hydrocoryne, Hydrodictyon, Hydrosera, Hydrurus, Hyella, Hymenomonas, Isthmochloron, Johannesbaptistia, Juranyiella, Karayevia, Kathablepharis, Katodinium, Kephyrion, Keratococcus, Kirchneriella, Klebsormidium, Kolbesia, Koliella, Komarekia, Korshikoviella, Kraskella, Lagerheimia, Lagynion, Lamprothamnium, Lemanea, Lepocinclis, Leptosira, Lobococcus, Lobocystis, Lobomonas, Luticola, Lyngbya, Malleochloris, Mallomonas, Mantoniella, Marssoniella, Martyana, Mastigocoleus, Gastogloia, Melosira, Merismopedia, Mesostigma, Mesotaenium, Micractinium, Micrasterias, Microchaete, Microcoleus, Microcystis, Microglena, Micromonas, Microspora, Microthamnion, Mischococcus, Monochrysis, Monodus, Monomastix, Monoraphidium, Monostroma, Mougeotia, Mougeotiopsis, Myochloris, Myromecia, Myxosarcina, Naegeliella, Nannochloris, Nautococcus, Navicula, Neglectella, Neidium, Nephroclamys, Nephrocytium, Nephrodiella, Nephroselmis, Netrium, Nitella, Nitellopsis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Ochromonas, Oedogonium, Oligochaetophora, Onychonema, Oocardium, Oocystis, Opephora, Ophiocytium, Orthoseira, Oscillatoria, Oxyneis, Pachycladella, Palmella, Palmodictyon, Pnadorina, Pannus, Paralia, Pascherina, Paulschulzia, Pediastrum, Pedinella, Pedinomonas, Pedinopera, Pelagodictyon, Penium, Peranema, Peridiniopsis, Peridinium, Peronia, Petroneis, Phacotus, Phacus, Phaeaster, Phaeodermatium, Phaeophyta, Phaeosphaera, Phaeothamnion, Phormidium, Phycopeltis, Phyllariochloris, Phyllocardium, Phyllomitas, Pinnularia, Pitophora, Placoneis, Planctonema, Planktosphaeria, Planothidium, Plectonema, Pleodorina, Pleurastrum, Pleurocapsa, Pleurocladia, Pleurodiscus, Pleurosigma, Pleurosira, Pleurotaenium, Pocillomonas, Podohedra, Polyblepharides, Polychaetophora, Polyedriella, Polyedriopsis, Polygoniochloris, Polyepidomonas, Polytaenia, Polytoma, Polytomella, Porphyridium, Posteriochromonas, Prasinochloris, Prasinocladus, Prasinophyta, Prasiola, Prochlorphyta, Prochlorothrix, Protoderma, Protosiphon, Provasoliella, Prymnesium, Psammodictyon, Psammothidium, Pseudanabaena, Pseudenoclonium, Psuedocarteria, Pseudochate, Pseudocharacium, Pseudococcomyxa, Pseudodictyosphaerium, Pseudokephyrion, Pseudoncobyrsa, Pseudoquadrigula, Pseudosphaerocystis, Pseudostaurastrum, Pseudostaurosira, Pseudotetrastrum, Pteromonas, Punctastruata, Pyramichlamys, Pyramimonas, Pyrrophyta, Quadrichloris, Quadricoccus, Quadrigula, Radiococcus, Radiofilum, Raphidiopsis, Raphidocelis, Raphidonema, Raphidophyta, Peimeria, Rhabdoderma, Rhabdomonas, Rhizoclonium, Rhodomonas, Rhodophyta, Rhoicosphenia, Rhopalodia, Rivularia, Rosenvingiella, Rossithidium, Roya, Scenedesmus, Scherffelia, Schizochlamydella, Schizochlamys, Schizomeris, Schizothrix, Schroederia, Scolioneis, Scotiella, Scotiellopsis, Scourfieldia, Scytonema, Selenastrum, Selenochloris, Sellaphora, Semiorbis, Siderocelis, Diderocystopsis, Dimonsenia, Siphononema, Sirocladium, Sirogonium, Skeletonema, Sorastrum, Spermatozopsis, Sphaerellocystis, Sphaerellopsis, Sphaerodinium, Sphaeroplea, Sphaerozosma, Spiniferomonas, Spirogyra, Spirotaenia,
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Spirulina, Spondylomorum, Spondylosium, Sporotetras, Spumella, Staurastrum, Stauerodesmus, Stauroneis, Staurosira, Staurosirella, Stenopterobia, Stephanocostis, Stephanodiscus, Stephanoporos, Stephanosphaera, Stichococcus, Stichogloea, Stigeoclonium, Stigonema, Stipitococcus, Stokesiella, Strombomonas, Stylochrysalis, Stylodinium, Styloyxis, Stylosphaeridium, Surirella, Sykidion, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Synedra, Synochromonas, Synura, Tabellaria, Tabularia, Teilingia, Temnogametum, Tetmemorus, Tetrachlorella, Tetracyclus, Tetradesmus, Tetraedriella, Tetraedron, Tetraselmis, Tetraspora, Tetrastrum, Thalassiosira, Thamniochaete, Thermosynechococcus, Thorakochloris, Thorea, Tolypella, Tolypothrix, Trachelomonas, Trachydiscus, Trebouxia, Trentepholia, Treubaria, Tribonema, Trichodesmium, Trichodiscus, Trochiscia, Tryblionella, Ulothrix, Uroglena, Uronema, Urosolenia, Urospora, Uva, Vaeuolaria, Vaucheria, Volvox, Volvulina, Westella, Woloszynskia, Xanthidium, Xanthophyta, Xenococcus, Zygnema, Zygnemopsis, y Zygonium.
En ciertas realizaciones, la celula se cultiva en un fotobiorreactor. En otra realizacion relacionada, los productos a base de carbono de interes son liberados, impregnados o exportados desde la celula. En todavfa otra realizacion relacionada, el producto a base de carbono se afsla del medio de cultivo.
En ciertas realizaciones, al menos una copia de dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante es extracromosomico. En ciertas realizaciones relacionadas, la expresion de al menos una copia de dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante es impulsada por un promotor cl lambda.
En ciertas realizaciones, los niveles de actividad de alcohol deshidrogenasa y piruvato descarboxilasa expresada recombinantemente en dicha cianobacteria son variados por la expresion diferencial. En ciertas realizaciones, la cianobacteria es un termofilo. En aun otra realizacion, la expresion diferencial se logra mediante la modulacion de la fuerza de un promotor que controla expresion de alcohol deshidrogenasa o piruvato descarboxilasa. En aun otra realizacion, dicha expresion de alcohol deshidrogenasa es impulsada por los promotores en al menos dos plasmidos diferentes, por ejemplo, un plasmido seleccionado del grupo de plasmidos que consiste de AQ1, pAQ3, pAQ4, pAQ5, pAQ6, y pAQ7. En aun otra realizacion, la actividad se vana mediante el control del nivel de un co-factor requerido por el la alcohol deshidrogenasa o la piruvato descarboxilasa.
En ciertas realizaciones, el nivel medido de acetaldehudo liberado en dicho medio de cultivo por dicho organismo disenado geneticamente es inferior a aproximadamente 7 mg/mL despues de aproximadamente 10 dfas de cultivo. En ciertas otras realizaciones, la cantidad acumulada de etanol liberado en dicho medio de cultivo por dicho organismo disenado geneticamente es igual o mayor que aproximadamente 4 g/L despues de aproximadamente 380 horas. En aun otras realizaciones, el nivel medido de etanol liberado en dicho medio de cultivo por dicho organismo disenado geneticamente es al menos aproximadamente 1750 mg/mL. En todavfa otras realizaciones, la concentracion medida (mg/mL) de etanol liberado en dicho medio de cultivo por dicho organismo disenado geneticamente es 100, 200 o 300 veces mayor que el nivel medido de acetaldehudo en dicho medio de cultivo.
En ciertas realizaciones, la cianobacteria disenada geneticamente es una cepa de Synechococcus disenada geneticamente que comprende al menos dos plasmidos disenados geneticamente. Por ejemplo, los plasmidos podnan ser seleccionados del grupo que consiste de pAQI, pAQ3, pAQ4, pAQ5, pAQ6, y pAQ7. En realizaciones relacionadas, los dos plasmidos disenados geneticamente codifican por separado una actividad del alcohol deshidrogenasa recombinante. En aun otras realizaciones relacionadas, la actividad del alcohol deshidrogenasa recombinante es adhAM. En una realizacion, la cianobacteria carece de un gen de lactato deshidrogenasa de funcionamiento o actividad de la enzima lactato deshidrogenasa. En aun otra realizacion, la actividad de la piruvato descarboxilasa recombinante se codifica por uno de los al menos dos plasmidos disenados geneticamente que codifican la actividad de alcohol deshidrogenasa recombinante.
Breve descripcion de las figuras
La figura 1 (A-O) provee varios genes identificados que se pueden expresar, favorecer la expresion, atenuar o eliminar en el diseno por ingeniena de fijacion de dioxido de carbono en la produccion de productos a base de carbono de interes.
La figura 2 provee un ejemplo de las rutas para producir etanol, succinato y otros derivados.
La figura 3 muestra el cromatograma GC/FID de la cepa de control Synechococcus 7002.
La figura 4 muestra el cromatograma GC/FID de la cepa recombinante 7002/efe_rs.
La figura 5 ilustra graficamente la densidad optica de etanologenos seleccionados con el tiempo.
La figura 6 ilustra graficamente las concentraciones de etanol de los cultivos en el sobrenadante con el tiempo.
La figura 7 ilustra graficamente las concentraciones de acetaldehudo de los cultivos en el sobrenadante con el tiempo.
La figura 8 ilustra graficamente las relaciones de etanol con acetaldehudo de los cultivos en el sobrenadante con el tiempo.
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La figura 9 ilustra graficamente las relaciones de concentracion de etanol con DO (730mm) de los cultivos en el sobrenadante con el tiempo.
La figura 10 ilustra graficamente las mediciones de OD730 y las curvas de crecimiento derivadas.
La figura 11 ilustra graficamente los niveles de etanol en medio de cultivo.
La figura 12 ilustra graficamente los niveles de acetaldehudo en medio de cultivo.
Descripcion detallada Abreviaturas y Terminos
Las siguientes explicaciones de terminos y metodos se proporcionan para describir mejor la presente divulgacion y guiar a los expertos normales en el arte en la practica de la presente divulgacion. Como se usa en este documento, "que comprende" significa "que incluye" y las formas singulares "un" o "una" o "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la referencia a "que comprende una celula" incluye una o una pluralidad de tales celulas, y la referencia a "que comprende la tioesterasa" incluye la referencia a uno o mas peptidos de la tioesterasa y sus equivalentes conocidos para los expertos normales en el arte, y en adelante. El termino "o" se refiere a un solo elemento de elementos alternativos indicados o una combinacion de dos o mas elementos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
A menos que se explique de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en este documento tienen el mismo significado como se entiende comunmente para un experto normal en el arte al que pertenece esta divulgacion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento se pueden utilizar en la practica o ensayo de la presente divulgacion, los metodos y materiales apropiados se describen a continuacion. Los materiales, metodos, y ejemplos solo son ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Otras caractensticas de la divulgacion son evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada y las reivindicaciones.
Numeros de referencia: Los numeros de referencia a lo largo de esta descripcion se derivan de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) mantenida por el Instituto Nacional de Salud, de los Estados Unidos. Los numeros de referencia son segun lo establecido en la base de datos del 1 de febrero de 2008.
Numeros de clasificacion de enzimas (EC): Los numeros de la EC proporcionadas en a lo largo de esta descripcion se derivan de la base de datos de Ligando KEGG, mantenida por the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics, patrocinada en parte por the University of Tokyo. Los numeros EC son segun lo establecido en la base de datos del 1 de febrero de 2008.
Aminoacidos: tripletes de nucleotidos, denominados como codones, en moleculas de ADN codifican un aminoacido en un peptido. El termino codon tambien se utiliza para las secuencias correspondientes (y complementarias) de tres nucleotidos en el ARNm, en las que se transcribe la secuencia de ADN.
Atenuar: El termino como se usa en este documento se refiere generalmente a una delecion funcional, incluyendo una mutacion, delecion parcial o completa, insercion u otra variacion hecha a una secuencia de gen o una secuencia de control de la transcripcion de una secuencia de genes, que reduce o inhibe la produccion del producto del gen, o hace el producto del gen no funcional. En algunos casos una delecion funcional se describe como una mutacion de desactivacion. La atenuacion tambien incluye los cambios de la secuencia de aminoacidos mediante la alteracion de la secuencia de acido nucleico, colocando el gen bajo el control de un promotor menos activo, inhibicion de la expresion, expresando ARN de interferencia, ribozimas o secuencias antisentido que se dirigen al gen de interes, o mediante cualquier otra tecnica conocida en el arte. En un ejemplo, la sensibilidad de una enzima particular a la inhibicion de retroalimentacion o la inhibicion causada por una composicion que no es un producto o un reactivo (retroalimentacion espedfica no ruta) se reduce de tal manera que la actividad de la enzima no se ve afectada por la presencia de un compuesto. En otros casos, una enzima que ha sido alterada para ser menos activa se puede denominar como atenuada.
Los "productos a base de carbono de interes" incluyen alcoholes tales como etanol, propanol, isopropanol, butanol, alcoholes grasos, esteres de acidos grasos, esteres de cera; hidrocarburos y alcanos tales como propano, octano, diesel, Jet Propellant 8, polfmeros tales como tereftalato, 1,3-propanodiol, 1,4-butanodiol, polioles, polihidroxialcanoatos (PHAs), polihidroxibutiratos (PHB), acrilato, acido adfpico, e caprolactona, isopreno, caprolactama, caucho; productos qmmicos basicos, tales como lactato, acido docosahexaenoico (DHA), 3-hidroxipropionato, y-valerolactona, lisina, serina, aspartato, acido aspartico, sorbitol, ascorbato, acido ascorbico, isopentenol, lanosterol, omega-3 DHA, licopeno, itaconato, 1,3-butadieno, etileno, propileno, succinato, citrato, acido cftrico, glutamato, malato, acido 3-hidroxipropionico (HPA), acido lactico, THF, gamma butirolactona, pirrolidonas, hidroxibutirato, acido glutamico, acido levulmico, acido acnlico, acido malonico; productos qmmicos especiales, tales como carotenoides, isoprenoides, acido itaconico; productos farmaceuticos y productos intermedios farmaceuticos, tales como el acido 7-aminodesacetoxicefalosporonico, cefalosporina, eritromicina, policetidos, estatinas, paclitaxel, docetaxel, terpenos, peptidos, esteroides, acidos grasos omega y otros dichos productos apropiados de interes. Tales productos son utiles en el contexto de los biocombustibles, productos qmmicos industriales y especiales, como productos intermedios utilizados para hacer productos adicionales,
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tales como suplementos nutricionales, nutraceuticos, poKmeros, reemplazos de parafina, productos para el cuidado personal y productos farmaceuticos.
Delecion: La eliminacion de uno o mas nucleotidos desde una molecula de acido nucleico o uno o mas aminoacidos a partir de una protema, estando las regiones a ambos lados unidas entre st
ADN: Acido desoxirribonucleico. El ADN es un polfmero de cadena larga que incluye el material genetico de la mayona de los organismos vivos (algunos virus tienen genes incluyendo el acido ribonucleico, ARN). Las unidades que se repiten en los polfmeros de ADN son cuatro nucleotidos diferentes, cada uno de los cuales incluye una de las cuatro bases, adenina, guanina, citosina y timina unida a un azucar desoxirribosa a la que esta unido un grupo fosfato.
Endogeno: Como se usa en este documento con referencia a una molecula de acido nucleico y una celula o microorganismo particular, se refiere a una secuencia de acido nucleico o peptido que esta en la celula y no fue introducida en la celula (o sus progenitores) utilizando tecnicas de ingeniena recombinante. Por ejemplo, un gen que estaba presente en la celula cuando la celula se aislo originalmente de la naturaleza. Un gen se considera todavfa endogeno si las secuencias de control, tales como una secuencia promotora o potenciadora que activa la transcripcion o traduccion se han modificado a traves de las tecnicas recombinantes.
"Una actividad de la enzima": Como se utiliza en este documento, el termino "una actividad enzimatica" significa que la enzima indicada (por ejemplo, "una actividad de alcohol deshidrogenasa") tiene atributos medibles en terminos de, por ejemplo, la actividad espedfica de sustrato, pH y temperatura optimos, y otras medidas estandar de la actividad de la enzima como la actividad codificada por una enzima de referencia (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa). Ademas, la enzima es al menos 90% identica a un nivel nucleico o aminoacido a la secuencia de la enzima de referencia como se mide por una busqueda BLAST.
Exogeno: Como se usa en este documento con referencia a una molecula de acido nucleico y una celula o microorganismo particular, se refiere a una secuencia o peptido de acido nucleico que no estaba presente en la celula cuando la celula se aislo originalmente de la naturaleza. Por ejemplo, un acido nucleico que se origino en un microorganismo diferente y se diseno en una celula alternativa utilizando tecnicas de ADN recombinante u otros metodos para suministrar dicho acido nucleico es exogeno.
Expresion: El proceso por el cual una informacion codificada del gen se convierte en las estructuras y funciones de una celula, tales como una protema, ARN de transferencia, o ARN ribosomico. Los genes expresados incluyen aquellos que se transcriben en ARNm y luego traducen en protema y los que se transcriben en ARN, pero no se traducen en las protemas (por ejemplo, transferencia y ARN ribosomico).
Secuencia de control de la expresion: como se utiliza en este documento, se refiere a secuencias de polinucleotidos que son necesarias para afectar la expresion de secuencias codificantes a las que estan unidos operativamente. Las secuencias de control de la expresion son secuencias que controlan la transcripcion, eventos post-transcripcional y la traduccion de secuencias de acidos nucleicos. Las secuencias de control de la expresion incluyen secuencias de inicio de la transcripcion, terminacion, promotoras y potenciadoras apropiadas; senales de procesamiento del ARN eficaces tales como senales de corte y empalme y poliadenilacion; secuencias que estabilizan ARNm citoplasmico; secuencias que aumentan la eficiencia de traduccion (por ejemplo, sitios de union a ribosoma); secuencias que potencian la estabilidad de la protema; y cuando se desee, secuencias que potencian la secrecion de protemas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huesped; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de union a ribosoma, y secuencia de terminacion de la transcripcion. El termino "secuencias de control" pretende incluir, como mmimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresion, y tambien puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias lfder y secuencias socias de fusion.
Sobreexpresion: Cuando un gen es producido para ser transcrito a una tasa elevada en comparacion con la tasa de transcripcion endogena para ese gen. En algunos ejemplos, la sobreexpresion incluye, ademas, una elevada tasa de traduccion del gen en comparacion con la tasa de traduccion endogena para ese gen. Los metodos de ensayo para la sobreexpresion son bien conocidos en la tecnica, por ejemplo, se pueden evaluar los niveles de ARN transcrito utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) y se pueden evaluar los niveles de protema utilizando analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Adicionalmente, se considera que un gen se sobreexpresa cuando muestra actividad elevada en comparacion con su actividad endogena, lo que puede ocurrir, por ejemplo, a traves de reduccion en la concentracion o actividad de su inhibidor, o mediante la expresion de la version mutante con actividad elevada. En realizaciones preferidas, cuando la celula huesped codifica un gen endogeno con una actividad bioqmmica deseada, es util sobreexpresar un gen exogeno, que permite un control regulador mas explfcito en la fermentacion y un medio para mitigar potencialmente los efectos de la regulacion del metabolismo central, que se centra alrededor de los genes explfcitamente nativos.
Inhibicion de la expresion: Cuando se provoca que un gen se transcriba a una tasa reducida en comparacion con la tasa de transcripcion de genes endogenos para ese gen. En algunos ejemplos, la inhibicion de la expresion incluye adicionalmente un nivel reducido de la traduccion del gen en comparacion con la tasa de traduccion endogena para ese gen. Metodos de ensayo para la inhibicion de la expresion son bien conocidos por aquellos en el arte. Por ejemplo, los
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niveles de ARN transcrito se pueden evaluar mediante RT-PCR, y los niveles de protema pueden ser evaluados utilizando el analisis de SDS-PAGE.
Desactivacion: Un gen cuyo nivel de expresion o actividad se ha reducido a cero. En algunos ejemplos, un gen es desactivado a traves de la delecion de algo o toda su secuencia de codificacion. En otros ejemplos, un gen es desactivado a traves de la introduccion de uno o mas nucleotidos en su marco de lectura abierto, lo que resulta en la traduccion de un producto de protema no-sentido o de otro modo no funcional.
Autotrofo: Los autotrofos (o los organismos autotrofos) son organismos que producen compuestos organicos complejos de moleculas inorganicas simples y una fuente externa de energfa, como la luz (fotoautotrofo) o reacciones qmmicas de los compuestos inorganicos.
Hidrocarburos: El termino generalmente se refiere a un compuesto qmmico que consta de los elementos carbono (C), hidrogeno (H) y opcionalmente oxfgeno (O). Hay esencialmente tres tipos de hidrocarburos, por ejemplo, hidrocarburos aromaticos, hidrocarburos saturados e hidrocarburos insaturados tales como alquenos, alquinos, y dienos. El termino tambien incluye combustibles, biocombustibles, plasticos, ceras, solventes y aceites. Los hidrocarburos abarcan los biocombustibles, asf como plasticos, ceras, solventes y aceites.
"Inmiscible" o "inmiscibilidad" se refiere a la incapacidad relativa de un compuesto para disolverse en agua y se define por el coeficiente de particion de los compuestos. El coeficiente de particion, P, se define como la concentracion de equilibrio del compuesto en una fase organica (en un sistema bi-fasico la fase organica es generalmente la fase formada por el derivado de acido graso durante el proceso de produccion, sin embargo, en algunos ejemplos una fase organica puede ser proporcionada (tal como una capa de octano para facilitar la separacion del producto) dividida por la concentracion en equilibrio en una fase acuosa (i.e., caldo de fermentacion). Cuando se describe un sistema de dos fases el P generalmente se discute en terminos de logP. Un compuesto con un logP de 10 se dividina 10: 1 con la fase organica, mientras que un compuesto de logP de 0.1 se dividina 10: 1 con la fase acuosa.
Ruta biosintetica: Tambien se conoce como "ruta metabolica", se refiere a un conjunto de anabolicos o reacciones bioqmmicas catabolicas para convertir (transmutar) una especie qmmica en otra. Por ejemplo, una ruta biosintetica de hidrocarburo se refiere al conjunto de reacciones bioqmmicas que convierten insumos y/o metabolitos a intermedios como productos de hidrocarburos y luego a hidrocarburos o productos de hidrocarburos. Las rutas anabolicas implican la construccion de una molecula mas grande desde moleculas mas pequenas, un proceso que requiere energfa. Las rutas catabolicas implican ruptura de moleculas mayor tamano, a menudo liberando energfa.
Celulosa: La celulosa [(C6H-i0O5)n] es un carbohidrato polisacarido polfmero de cadena larga, de beta-glucosa. Esta forma el componente estructural principal de las plantas y no es digerible por los seres humanos. La celulosa es un material comun en las paredes celulares de la planta y se observo primero como tal en 1838. Se produce naturalmente en forma casi pura solo en la fibra de algodon; en combinacion con lignina y cualquier hemicelulosa, que se encuentra en todo el material vegetal.
Biocombustible: Un biocombustible es cualquier combustible que se deriva desde una fuente biologica. El biocombustible se refiere a uno o mas hidrocarburos, uno o mas alcoholes, uno o mas esteres grasos o una mezcla de los mismos. Preferiblemente, se utilizan hidrocarburos lfquidos.
"Componente de combustible" es cualquier compuesto o una mezcla de compuestos que se utilizan para formular una composicion de combustible. Existen "componentes de combustible mayores" y "componentes de combustible menores". Un componente de combustible mayor esta presente en una composicion de combustible en al menos 50% en volumen; y un componente de combustible menor esta presente en una composicion de combustible por menos del 50%. Los aditivos de combustible son componentes de combustible menores. Los compuestos isoprenoides revelados en este documento pueden ser un componente principal o un componente menor, por sf mismo o en una mezcla con otros componentes de combustible.
Como se usa en este documento, una composicion que es un compuesto "sustancialmente puro" esta sustancialmente libre de uno o mas de otros compuestos, i.e., la composicion contiene mas del 80% en volumen, mas del 90% en volumen, mas del 95 % en volumen, mas del 96 % en volumen, mas del 97 % en volumen, mas del 98 % en volumen, mas del 99 % en volumen, mas del 99.5 % en volumen, mas del 99.6 % en volumen, mas del 99.7 % en volumen, mas del 99.8 % en volumen, o mas del 99.9 % en volumen del compuesto; o menos del 20 % en volumen, menos del 10 % en volumen, menos del 5 % en volumen, menos del 3 % en volumen, menos del 1 % en volumen, menos del 0.5 % en volumen, menos del 0.1 % en volumen, o menos del 0.01 % en volumen del uno o mas otros compuestos, basandose en el volumen total de la composicion.
Molecula de acido nucleico: El termino abarca tanto moleculas de ARN como de ADN, incluyendo, sin limitacion, ADNc, ADN genomico, y ARNm y tambien incluye moleculas de acidos nucleicos sinteticos, tales como los que se sintetizan qmmicamente o se producen de forma recombinante. La molecula de acido nucleico puede ser bicatenaria o monocatenaria, circular o lineal. Si es monocatenaria, la molecula de acido nucleico puede ser la cadena sentido o la cadena antisentido.
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Acido nucleico disenado geneticamente: Un "acido nucleico disenado geneticamente" es una molecula de acido nucleico que incluye al menos una diferencia de una molecula de acido nucleico de origen natural. Un acido nucleico disenado geneticamente incluye todas las secuencias heterologas no modificadas y modificadas exogenas (i.e., secuencias derivadas de un organismo o celula diferente del que hospede el acido nucleico disenado geneticamente), asf como genes endogenos, operones, secuencias codificantes, o secuencias no codificantes, que han sido modificados, mutados, o que incluyen deleciones o inserciones en comparacion con una secuencia de origen natural. Los acidos nucleicos disenados geneticamente tambien incluyen todas las secuencias, independientemente del origen, que estan unidos a un promotor inducible o a otra secuencia de control con los que no estan asociados de forma natural.
Condiciones de fermentacion apropiadas. El termino generalmente se refiere a medios de fermentacion y condiciones ajustables con, pH, temperatura, niveles de aireacion, etc., preferiblemente condiciones optimas que permiten a los microorganismos para producir productos a base de carbono de interes. Para determinar si las condiciones de cultivo permiten la produccion de productos, el microorganismo se puede cultivar durante aproximadamente 24 horas a una semana despues de la inoculacion y una muestra se puede obtener y analizar. Las celulas en la muestra o el medio en el cual se cultivan las celulas se ensayan para determinar la presencia del producto deseado.
Aislado: Un acido nucleico o polinucleotido "aislado" (por ejemplo, un ARN, ADN o un polfmero mixto) es uno que esta separado sustancialmente de otros componentes celulares que acompanan de forma natural el polinucleotido nativo en su celula huesped natural, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y secuencias genomicas con las que se asocia naturalmente. El termino abarca un acido nucleico o polinucleotido que (1) se ha retirado desde su entorno de origen natural, (2) no esta asociado con toda o una porcion de un polinucleotido en el cual el "polinucleotido aislado" se encuentra en la naturaleza, (3) esta unido operativamente a un polinucleotido al cual no esta unido en la naturaleza, o (4) no se produce en la naturaleza. El termino "aislado" o "sustancialmente puro" se puede utilizar tambien en referencia a aislados de ADN recombinante o clonado, los analogos de polinucleotidos sintetizados qmmicamente, o analogos de polinucleotidos que son sintetizados biologicamente por sistemas heterologos. Sin embargo, los "aislados" no requieren necesariamente que el acido nucleico o polinucleotido descrito de esta manera haya sido retirado en sf ffsicamente de su entorno nativo. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico endogeno en el genoma de un organismo se considera "aislado" en este documento si una secuencia heterologa (i.e., una secuencia que no es, naturalmente, adyacente a esta secuencia de acido nucleico endogena) se coloca adyacente a la secuencia de acido nucleico endogena, de tal manera que la expresion de esta secuencia de acido nucleico endogena se altera. A modo de ejemplo, una secuencia promotora no nativa puede ser sustituida (por ejemplo, mediante recombinacion homologa) para el promotor nativo de un gen en el genoma de una celula humana, de tal manera que este gen tiene un patron de expresion alterado. Este gen sena ahora convertido en "aislado" debido a que se separa desde al menos algunas de las secuencias que naturalmente lo flanquean. Un acido nucleico tambien se considera "aislado" si contiene cualquier modificacion que no se produzca naturalmente al acido nucleico correspondiente en un genoma. Por ejemplo, una secuencia codificante endogena se considera "aislada" si contiene una insercion, delecion o una mutacion puntual introducida artificialmente, por ejemplo, por la intervencion humana. Un "acido nucleico aislado" tambien incluye un acido nucleico integrado en un cromosoma de la celula huesped en un sitio heterologo, asf como una construccion del acido nucleico presente como un episoma. Ademas, un "acido nucleico aislado" puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o sustancialmente libre de medio de cultivo cuando se produce por tecnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores qmmicos u otros productos qmmicos cuando se sintetiza qmmicamente. El termino tambien abarca moleculas de acidos nucleicos y protemas preparados por expresion recombinante en una celula huesped, asf como moleculas de acidos nucleicos y protemas sintetizados qmmicamente.
Unido operativamente: Una primera secuencia de acido nucleico esta unida operativamente con una segunda secuencia de acido nucleico cuando la primera secuencia de acido nucleico se coloca en una relacion funcional con la segunda secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, un promotor esta unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta a la transcripcion o expresion de la secuencia codificante. Generalmente, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de protemas, en el mismo marco de lectura. Las configuraciones de genes separados que se transcriben en tandem como un solo ARN mensajero se indican como operones. Por lo tanto, la colocacion de genes en estrecha proximidad, por ejemplo, en un vector plasirndico, bajo la regulacion transcripcional de un promotor unico, que constituye un operon sintetico.
Purificado: El termino purificado no requiere pureza absoluta; mas bien, se pretende como un termino relativo. Asf, por ejemplo, una preparacion de producto purificado, es una en la cual el producto es mas concentrado de lo que esta el producto en su entorno dentro de una celula. Por ejemplo, una cera purificada es una que esta separada sustancialmente de componentes celulares (acidos nucleicos, lfpidos, carbohidratos, y otros peptidos) que pueden acompanar a la misma. En otro ejemplo, una preparacion de cera purificada es una en la que la cera esta sustancialmente libre de contaminantes, tales como los que puedan estar presentes despues de la fermentacion.
Detectable: capaz de tener una existencia o presencia comprobada utilizando diversos metodos de analisis tal como se describe a lo largo de la descripcion o de otra manera conocida para un experto en el arte.
Recombinante: Una protema o molecula de acido nucleico recombinante es una que tiene una secuencia que no es de origen natural, tiene una secuencia que se hace por una combinacion artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, o ambos. Esta combinacion artificial se puede lograr, por ejemplo, por smtesis qmmica o por la manipulacion artificial de segmentos aislados de moleculas de acidos nucleicos o protemas, tales como tecnicas de
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ingeniena genetica. Recombinante tambien se utiliza para describir moleculas de acido nucleico que han sido manipulados artificialmente, pero contienen las mismas secuencias reguladoras y las regiones codificantes que se encuentran en el organismo desde el cual se aislo el acido nucleico.
El termino "celula huesped recombinante" ("celula huesped de expresion", "sistema huesped de expresion", "sistema de expresion", o simplemente "celula huesped"), como se usa en este documento, se refiere a una celula en la cual un vector recombinante se ha introducido, por ejemplo, un vector que comprende acil-CoA sintasa. Se debe entender que tales terminos pretenden referirse no solo a la celula objeto particular sino a la progenie de dicha celula. Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutacion o influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser identica a la celula progenitora, pero aun asf se incluyen dentro del alcance del termino "celula huesped" como se usa en este documento. Una celula huesped recombinante puede ser una celula aislada o lmea celular cultivada en cultivo o puede ser una celula que reside en un tejido vivo o un organismo.
Liberacion: El movimiento de un compuesto desde el interior de una celula (intracelular) al exterior de una celula (extracelular). El movimiento puede ser activo o pasivo. Cuando la liberacion se activa puede ser facilitada por uno o mas peptidos del transportador y en algunos ejemplos puede consumir energfa. Cuando la liberacion es pasiva, puede ser a traves de difusion a traves de la membrana y se puede facilitar mediante la recoleccion continuamente del compuesto deseado desde el entorno extracelular, promoviendo asf aun mas la difusion. La liberacion de un compuesto tambien se puede lograr mediante la lisis de una celula.
Surfactantes: sustancias capaces de reducir la tension superficial de un lfquido en el cual se disuelven. Por lo general se componen de una cabeza soluble en agua y una cadena de hidrocarburo o cola. El grupo soluble en agua es hidrofilo y puede ser ya sea ionico o no ionico, y la cadena de hidrocarburo es hidrofoba. Los surfactantes se usan en una variedad de productos, incluyendo detergentes y limpiadores, y tambien se utilizan como auxiliares para textiles, cuero y papel, en los procesos qmmicos, en cosmeticos y productos farmaceuticos, en la industria alimentaria y en la agricultura. Ademas, pueden ser utilizados para ayudar en la extraccion y aislamiento de aceites crudos que se encuentran en lugares de diffcil acceso o como emulsiones en agua.
Existen cuatro tipos de surfactantes caracterizados por diversos usos. Los surfactantes anionicos tienen actividad como detergente y generalmente se usan para aplicaciones de limpieza. Los surfactantes cationicos contienen hidrocarburos de cadena larga y, a menudo se utilizan para tratar las protemas y polfmeros sinteticos o son componentes de los suavizantes y acondicionadores para el pelo. Los surfactantes anfoteros tambien contienen hidrocarburos de cadena larga y se utilizan normalmente en los champus. Los surfactantes no ionicos se utilizan generalmente en productos de limpieza.
Vector: El termino "vector", como se usa en este documento, se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular, en el cual segmentos de ADN adicionales se pueden unir. Otros vectores incluyen cosmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC). Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden unir en el genoma viral (discutido en mas detalle a continuacion). Ciertos vectores son capaces de replicacion autonoma en una celula huesped en la que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicacion que funciona en la celula huesped). Otros vectores se pueden integrar en el genoma de una celula huesped tras la introduccion en la celula huesped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huesped. Ademas, ciertos vectores preferidos son capaces de dirigir la expresion de genes a los que estan unidos operativamente. Tales vectores se denominan en este documento como "vectores de expresion recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresion"). Un vector tambien puede incluir uno o mas genes marcadores seleccionables y otros elementos geneticos conocidos en el arte.
Cera: Una variedad de esteres de acidos grasos que forman solidos o sustancias flexibles bajo un conjunto identificado de condiciones ffsicas. Esteres de acidos grasos que se denominan ceras generalmente tienen cadenas de carbono mas largas que los esteres de acidos grasos que no son ceras. Por ejemplo, una cera generalmente forma una sustancia flexible a temperatura ambiente.
Ester graso: Incluye cualquier ester obtenido de un acido graso. Las cadenas de carbono en acidos grasos pueden contener cualquier combinacion de las modificaciones descritas en este documento. Por ejemplo, la cadena de carbono puede contener uno o mas puntos de insaturacion, uno o mas puntos de ramificacion, incluyendo la ramificacion dclica, y puede ser disenado para ser corto o largo. Cualquier alcohol se puede utilizar para formar esteres de acidos grasos, por ejemplo, alcoholes derivados de la ruta biosintetica de acidos grasos, alcoholes producidos por el huesped de produccion a traves de las rutas biosinteticas de acido no graso, y alcoholes que se suministran en el caldo de fermentacion.
Acido graso: Incluye productos o derivados de los mismos realizados en parte desde la ruta biosintetica de acidos grasos del organismo huesped. La ruta biosintetica de acidos grasos incluye enzimas acido graso sintasas que pueden ser disenadas como se describe en este documento para producir derivados de acidos grasos, y en algunos ejemplos se puede expresar con enzimas adicionales para producir derivados de acidos grasos que tienen caractensticas de la cadena de carbono deseadas. Los derivados de acidos grasos de ejemplo incluyen, por ejemplo, alcoholes de cadena corta y larga, hidrocarburos y esteres de acidos grasos incluyendo ceras.
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Metodos generales para microorganismos disenados geneticamente para producir productos basados en carbono
Los metodos para microorganismos disenados geneticamente para producir productos a base de carbono se basan en los principios de la ingeniena metabolica, y usos, por ejemplo, las rutas disenadas geneticamente como se describe, por ejemplo, en WO 2007/136762 y WO 2007/139925 para hacer productos de energfa capturados por organismos fotoautotroficos. Generalmente, los productos a base de carbono de interes se producen mediante la expresion de un gen o un conjunto de genes como se describe en la figura 1 en un microorganismo fotoautotrofico, por ejemplo, cianobacterias, tal como se describe en este documento. Los plasmidos se construyen para expresar diversas protemas que son utiles en la produccion de productos a base de carbono, como se describe en los ejemplos en este documento, por ejemplo, el ejemplo 1. Las construcciones se pueden hacer sinteticamente o hacer utilizando metodos estandar de biologfa molecular y todos los genes clonados se ponen bajo el control de promotores constitutivos o promotores inducibles. Los plasmidos que contienen los genes de interes se transforman en el huesped y los correspondientes transformantes se seleccionan en la placa LB suplementada con antibioticos tales como la espectinomicina, carbenicilina, etc. Utilizando tecnicas de biologfa molecular estandar, celulas en las que se ha introducido una molecula de acido nucleico son transformados para expresar o sobre-expresar los genes deseados, mientras que otras moleculas de acido nucleico se atenuan o suprimen funcionalmente. Las tecnicas de transformacion por las cuales una molecula de acido nucleico se puede introducir en dicha celula, incluyendo, pero no limitadas a, la transfeccion con vectores virales, conjugacion, transformacion con vectores de plasmidos, y la introduccion de ADN desnudo mediante electroporacion, lipofeccion y aceleracion con pistola de partfculas. Los transformantes se inoculan en un medio apropiado. Las muestras que contienen los transformantes se cultivan a temperaturas apropiadas en un agitador hasta que llegan a una cierta DO. A continuacion, las celulas se sedimentan por centrifugacion y se suspenden los pellets celulares. Las tecnicas de separacion permiten que la muestra se someta a analisis mediante GC/MS. Se determina el rendimiento total.
Microorganismos seleccionados o disenados geneticamente para la produccion de productos a base de carbono de interes
Microorganismos: incluye especies microbianas procariotas y eucariotas a partir de los dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, incluyendo estos ultimos levaduras y hongos filamentosos, protozoos, algas, o Protista superior. Los terminos "celulas microbianas" y "microbios" se usan de forma intercambiable con el termino microorganismo. Los organismos apropiados incluyen extremofilos que soportan diversos parametros ambientales tales como temperatura, radiacion, presion, gravedad, vado, desecacion, salinidad, pH, tension de oxfgeno, y productos qmmicos. Ellos incluyen hipertermofilos, que crecen en o por encima de 80 °C como Pyrolobus fumarii; termofilos, que crecen entre 60 a 80 °C tales como Synechococcus lividis; mesofilos, que crecen entre 15-60 °C y psicrofilos, que crecen en o por debajo de 15 °C tales como Psychrobacter y algunos insectos. Los organismos tolerantes a la radiacion incluyen Deinococcus radiodurans. Los organismos tolerantes a presion incluyen piezofilos o barofilos que toleran la presion de 130 MPa. Tambien se contemplan organismos tolerantes a la hipergravedad (por ejemplo, > 1 g) e hipogravedad (por ejemplo, <1 g). Los organismos tolerantes al vado incluyen tardfgrados, insectos, microbios y semillas. Organismos tolerantes y anhidrobioticos desecantes incluyen xerofilos tales como Artemia salina; nematodos, microbios, hongos y lfquenes. Organismos tolerantes a la sal incluyen halofilos (por ejemplo, NaCl 2-5 M) Halobacteriacea y Dunaliella salina. Los organismos tolerantes a pH incluyen alcalofilos como Natronobacterium, Bacillus firmus OF4, Spirulina spp. (por ejemplo, pH> 9) y acidofilos tales como Cyanidium caldarium, Ferroplasma sp. (por ejemplo, un pH bajo). Los anaerobios, que no pueden tolerar O2 tales como Methanococcus jannaschii; microaerofilos, que toleran algunos O2 tales como Clostridium y aerobios, que requieren O2 tambien se contemplan. Los organismos tolerantes de gas, que toleran CO2 puro incluyen Cyanidium caldarium y organismos tolerantes a metales incluyen metalotolerantes como Ferroplasma acidarmanus (por ejemplo, Cu, As, Cd, Zn), Ralstonia sp. CH34 (por ejemplo, Zn, Co, Cd, Hg, Pb). Gross, Michael. Life on the Edge: Amazing Creatures Thriving in Extreme Environments. New York: Plenum (1998) y Seckbach, J. "Search for Life in the Universe with Terrestrial Microbes Which Thrive Under Extreme Conditions." In Cristiano Batalli Cosmovici, Stuart Bowyer, y Dan Wertheimer, eds., Astronomical and Biochemical Origins and the Search for Life in the Universe, p. 511. Milan: Editrice Compositori (1997).
Las algas y las cianobacterias incluyen, pero no se limitan a los siguientes generos:
Acanthoceras, Acanthococcus, Acaryochloris, Achnanthes, Achnanthidium, Actinastrum, Actinochloris, Actinocyclus, Actinotaenium, Amphichrysis, Amphidinium, Amphikrikos, Amphipleura, Amphiprora, Amphithrix, Amphora, Anabaena, Anabaenopsis, Aneumastus, Ankistrodesmus, Ankyra, Anomoeoneis, Apatococcus, Aphanizomenon, Aphanocapsa, Aphanochaete, Aphanothece, Apiocystis, Apistonema, Arthrodesmus, Artherospira, Ascochloris, Asterionella, Asterococcus, Audouinella, Aulacoseira, Bacillaria, Balbiania, Bambusina, Bangia, Basichlamys, Batrachospermum, Binuclearia, Bitrichia, Blidingia, Botrdiopsis, Botrydium, Botryococcus, Botryosphaerella, Brachiomonas, Brachysira, Brachytrichia, Brebissonia, Bulbochaete, Bumilleria, Bumilleriopsis, Caloneis, Calothrix, Campylodiscus, Capsosiphon, Carteria, Catena, Cavinula, Centritractus, Centronella, Ceratium, Chaetoceros, Chaetochloris, Chaetomorpha, Chaetonella, Chaetonema, Chaetopeltis, Chaetophora, Chaetosphaeridium, Chamaesiphon, Chara, Characiochloris, Characiopsis, Characium, Charales, Chilomonas, Chlainomonas, Chlamydoblepharis, Chlamydocapsa,
Chlamydomonas, Chlamydomonopsis, Chlamydomyxa, Chlamydonephris, Chlorangiella, Chlorangiopsis, Chlorella, Chlorobotrys, Chlorobrachis, Chlorochytrium, Chlorococcum, Chlorogloea, Chlorogloeopsis, Chlorogonium, Chlorolobion, Chloromonas, Chlorophysema, Chlorophyta, Chlorosaccus, Chlorosarcina, Choricystis, Chromophyton, Chromulina, Chroococcidiopsis, Chroococcus, Chroodactylon, Chroomonas, Chroothece, Chrysamoeba, Chrysapsis, Chrysidiastrum,
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Chrysocapsa, Chrysocapsella, Chrysochaete, Chrysochromulina, Chrysococcus, Chrysocrinus, Chrysolepidomonas, Chrysolykos, Chrysonebula, Chrysophyta, Chrysopyxis, Chrysosaccus, Chrysophaerella, Chrysostephanosphaera, Clodophora, Clastidium, Closteriopsis, Closterium, Coccomyxa, Cocconeis, Coelastrella, Coelastrum, Coelosphaerium, Coenochloris, Coenococcus, Coenocystis, Colacium, Coleochaete, Collodictyon, Compsogonopsis, Compsopogon, Conjugatophyta, Conochaete, Coronastrum, Cosmarium, Cosmioneis, Cosmocladium, Crateriportula, Craticula, Crinalium, Crucigenia, Crucigeniella, Cryptoaulax, Cryptomonas, Cryptophyta, Ctenophora, Cyanodictyon, Cyanonephron, Cyanophora, Cyanophyta, Cyanothece, Cyanothomonas, Cyclonexis, Cyclostephanos, Cyclotella, Cylindrocapsa, Cylindrocystis, Cylindrospermum, Cylindrotheca, Cymatopleura, Cymbella, Cymbellonitzschia, Cystodinium Dactylococcopsis, Debarya, Denticula, Dermatochrysis, Dermocarpa, Dermocarpella, Desmatractum, Desmidium, Desmococcus, Desmonema, Desmosiphon, Diacanthos, Diacronema, Diadesmis, Diatoma, Diatomella, Dicellula, Dichothrix, Dichotomococcus, Dicranochaete, Dictyochloris, Dictyococcus, Dictyosphaerium, Didymocystis, Didymogenes, Didymosphenia, Dilabifilum, Dimorphococcus, Dinobryon, Dinococcus, Diplochloris, Diploneis, Diplostauron, Distrionella, Docidium, Draparnaldia, Dunaliella, Dysmorphococcus, Ecballocystis, Elakatothrix, Ellerbeckia, Encyonema, Enteromorpha, Entocladia, Entomoneis, Entophysalis, Epichrysis, Epipyxis, Epithemia, Eremosphaera, Euastropsis, Euastrum, Eucapsis, Eucocconeis, Eudorina, Euglena, Euglenophyta, Eunotia, Eustigmatophyta, Eutreptia, Fallacia, Fischerella, Fragilaria, Fragilariforma, Franceia, Frustulia, Curcilla, Geminella, Genicularia, Glaucocystis, Glaucophyta, Glenodiniopsis, Glenodinium, Gloeocapsa, Gloeochaete, Gloeochrysis, Gloeococcus, Gloeocystis, Gloeodendron, Gloeomonas, Gloeoplax, Gloeothece, Gloeotila, Gloeotrichia, Gloiodictyon, Golenkinia, Golenkiniopsis, Gomontia, Gomphocymbella, Gomphonema, Gomphosphaeria, Gonatozygon, Gongrosia, Gongrosira, Goniochloris, Gonium, Gonyostomum, Granulochloris, Granulocystopsis, Groenbladia, Gymnodinium, Gymnozyga, Gyrosigma, Haematococcus, Hafniomonas, Hallassia, Hammatoidea, Hannaea, Hantzschia, Hapalosiphon, Haplotaenium, Haptophyta, Haslea, Hemidinium, Hemitoma, Heribaudiella, Heteromastix, Heterothrix, Hibberdia, Hildenbrandia, Hillea, Holopedium, Homoeothrix, Hormanthonema, Hormotila, Hyalobrachion, Hyalocardium, Hyalodiscus, Hyalogonium, Hyalotheca, Hydrianum, Hydrococcus, Hydrocoleum, Hydrocoryne, Hydrodictyon, Hydrosera, Hydrurus, Hyella, Hymenomonas, Isthmochloron, Johannesbaptistia, Juranyiella, Karayevia, Kathablepharis, Katodinium, Kephyrion, Keratococcus, Kirchneriella, Klebsormidium, Kolbesia, Koliella, Komarekia, Korshikoviella, Kraskella, Lagerheimia, Lagynion, Lamprothamnium, Lemanea, Lepocinclis, Leptosira, Lobococcus, Lobocystis, Lobomonas, Luticola, Lyngbya, Malleochloris, Mallomonas, Mantoniella, Marssoniella, Martyana, Mastigocoleus, Gastogloia, Melosira, Merismopedia, Mesostigma, Mesotaenium, Micractinium, Micrasterias, Microchaete, Microcoleus, Microcystis, Microglena, Micromonas, Microspora, Microthamnion, Mischococcus, Monochrysis, Monodus, Monomastix, Monoraphidium, Monostroma, Mougeotia, Mougeotiopsis, Myochloris, Myromecia, Myxosarcina, Naegeliella, Nannochloris, Nautococcus, Navicula, Neglectella, Neidium, Nephroclamys, Nephrocytium, Nephrodiella, Nephroselmis, Netrium, Nitella, Nitellopsis, Nitzschia, Nodularia, Nostoc, Ochromonas, Oedogonium, Oligochaetophora, Onychonema, Oocardium, Oocystis, Opephora, Ophiocytium, Orthoseira, Oscillatoria, Oxyneis, Pachycladella, Palmella, Palmodictyon, Pnadorina, Pannus, Paralia, Pascherina, Paulschulzia, Pediastrum, Pedinella, Pedinomonas, Pedinopera, Pelagodictyon, Penium, Peranema, Peridiniopsis, Peridinium, Peronia, Petroneis, Phacotus, Phacus, Phaeaster, Phaeodermatium, Phaeophyta, Phaeosphaera, Phaeothamnion, Phormidium, Phycopeltis, Phyllariochloris, Phyllocardium, Phyllomitas, Pinnularia, Pitophora, Placoneis, Planctonema, Planktosphaeria, Planothidium, Plectonema, Pleodorina, Pleurastrum, Pleurocapsa, Pleurocladia, Pleurodiscus, Pleurosigma, Pleurosira, Pleurotaenium, Pocillomonas, Podohedra, Polyblepharides, Polychaetophora, Polyedriella, Polyedriopsis, Polygoniochloris, Polyepidomonas, Polytaenia, Polytoma, Polytomella, Porphyridium, Posteriochromonas, Prasinochloris, Prasinocladus, Prasinophyta, Prasiola, Prochlorphyta, Prochlorothrix, Protoderma, Protosiphon, Provasoliella, Prymnesium, Psammodictyon, Psammothidium, Pseudanabaena, Pseudenoclonium, Psuedocarteria, Pseudochate, Pseudocharacium, Pseudococcomyxa, Pseudodictyosphaerium, Pseudokephyrion, Pseudoncobyrsa, Pseudoquadrigula, Pseudosphaerocystis, Pseudostaurastrum, Pseudostaurosira, Pseudotetrastrum, Pteromonas, Punctastruata, Pyramichlamys, Pyramimonas, Pyrrophyta, Quadrichloris, Quadricoccus, Quadrigula, Radiococcus, Radiofilum, Raphidiopsis, Raphidocelis, Raphidonema, Raphidophyta, Peimeria, Rhabdoderma, Rhabdomonas, Rhizoclonium, Rhodomonas, Rhodophyta, Rhoicosphenia, Rhopalodia, Rivularia, Rosenvingiella, Rossithidium, Roya, Scenedesmus, Scherffelia, Schizochlamydella, Schizochlamys, Schizomeris, Schizothrix, Schroederia, Scolioneis, Scotiella, Scotiellopsis, Scourfieldia, Scytonema, Selenastrum, Selenochloris, Sellaphora, Semiorbis, Siderocelis, Diderocystopsis, Dimonsenia, Siphononema, Sirocladium, Sirogonium, Skeletonema, Sorastrum, Spermatozopsis, Sphaerellocystis, Sphaerellopsis, Sphaerodinium, Sphaeroplea, Sphaerozosma, Spiniferomonas, Spirogyra, Spirotaenia, Spirulina, Spondylomorum, Spondylosium, Sporotetras, Spumella, Staurastrum, Stauerodesmus, Stauroneis, Staurosira, Staurosirella, Stenopterobia, Stephanocostis, Stephanodiscus, Stephanoporos, Stephanosphaera, Stichococcus, Stichogloea, Stigeoclonium, Stigonema, Stipitococcus, Stokesiella, Strombomonas, Stylochrysalis, Stylodinium, Styloyxis, Stylosphaeridium, Surirella, Sykidion, Symploca, Synechococcus, Synechocystis, Synedra, Synochromonas, Synura, Tabellaria, Tabularia, Teilingia, Temnogametum, Tetmemorus, Tetrachlorella, Tetracyclus, Tetradesmus, Tetraedriella, Tetraedron, Tetraselmis, Tetraspora, Tetrastrum, Thalassiosira, Thamniochaete, Thorakochloris, Thorea, Tolypella, Tolypothrix, Trachelomonas, Trachydiscus, Trebouxia, Trentepholia, Treubaria, Tribonema, Trichodesmium, Trichodiscus, Trochiscia, Tryblionella, Ulothrix, Uroglena, Uronema, Urosolenia, Urospora, Uva, Vacuolaria, Vaucheria, Volvox, Volvulina, Westella, Woloszynskia, Xanthidium, Xanthophyta, Xenococcus, Zygnema, Zygnemopsis, y Zygonium.
La conversion Hiperfotosintetica requiere una amplia modificacion genetica; por lo tanto, en realizaciones preferidas, el organismo foto autotrofo parental puede ser transformado con el ADN exogeno.
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Los organismos preferidos para la conversion Hiperfotosintetica incluyen: Synechococcus sp PCC 7002, Synechococcus sp. PCC 7942, Synechocystis sp. PCC 6803, y Thermosynechococcus elongatus BP-1.
Sin embargo, otros organismos apropiados incluyen celulas sinteticas o celulas producidas por genomas sinteticos como se describe en Venter et al. US Pat. Pub. No. 2007/0264688, y los sistemas similares a celulas o celulas de smtesis como se describe en Glass et al. US Pat. Pub. No. 2007/0269862.
Un tema comun en la seleccion o diseno geneticamente de un organismo apropiado es la fijacion autotrofa de carbono, tales como el CO2 a los productos. Esto cubrina la fotosmtesis y la metanogenesis. La acetogenesis, que abarca los tres tipos de fijacion de CO2; ciclo de Calvin, ruta de acetil CoA y ruta TCA reductiva tambien esta cubierta. La capacidad de usar dioxido de carbono como la unica fuente de carbono celular (autotrofia) se encuentra en casi todos los grupos principales de procariotas. Las rutas de fijacion de CO2 difieren entre los grupos, y no hay ningun patron de distribucion claro de las cuatro rutas autotrofas actualmente conocidas. Fuchs, G. 1989. Alternative pathways of autotrophic CO2 fixation, p. 365-382. In H. G. Schlegel, and B. Bowien (ed.), Autotrophic bacteria. Springer-Verlag, Berlin, Germany. El ciclo reductor de la pentosa fosfato (ciclo Calvin-Benson-Bassham) representa la ruta de fijacion de CO2 en casi todas las bacterias autotrofas aerobicas, por ejemplo, las cianobacterias.
Propagacion de microorganismos seleccionados
Los metodos para el cultivo de organismos fotosinteticos en medios lfquidos y en placas que contienen agarosa son bien conocidos para los expertos en el arte (vease, por ejemplo, sitios web asociados con ATCC, y con el Instituto Pasteur). Por ejemplo, Synechococcus sp. celulas PCC 7002 (disponibles de la Coleccion de Cultivos Pasteur de cianobacterias) se cultivan en medio BG 1l(NaNO3 17.65 mM, K2HPO4 0.18 mM, MgSO4 0.3 mM, CaCl2 0.25 mM, acido cftrico 0.03 mM, citrato de amonio ferrico 0.03 mM, EDTA 0.003 mM, Na2CO3 0.19 mM, 2.86 mg/L de H3BO3, 1.81 mg/L de MnC12, 0.222 mg/L de ZnSO4, 0.390 mg/L de Na2MoO4, 0.079 mg/L de CuSO4, y 0.049 mg/L de Co(NO3)2, pH 7.4) suplementado con 16 |ig/L de biotina, MgSO4 20 mM, KCl 8 mM, y NaCl 300 mM (vease, por ejemplo, un sitio web asociado con el Institute Pasteur, and Price GD, Woodger FJ, Badger MR, Howitt SM, Tucker L. "Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria. Proc Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101(52):18228-33). Normalmente, los cultivos se mantienen a 28 °C y se burbujeo continuamente con 5% de CO2 bajo una intensidad de luz de 120 |imol de fotones/m2/s Alternativamente, tal como se describe en el ejemplo. 1, Synechococcus sp. celulas PCC 7002 se cultivan en medio A+ como se describe anteriormente [Frigaard NU et al. (2004) "Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation," Methods Mol. Biol., 274:325-340].
Thermosynechococcus elongatus BP-1 (disponible en el Kazusa DNAResearch Institute, Japon) se propaga en medio BG11 suplementado con TES-KOH 20 mM (pH 8.2) como se describe anteriormente [Iwai M, Katoh H, Katayama M, Ikeuchi M. "Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP- 1." Plant Cell Physiol (2004). 45(2):171-175)]. Normalmente, los cultivos se mantienen a 50 °C y se burbujean continuamente con 5% de CO2 en virtud de una intensidad de luz de 38 |imol de fotones/m2/s. T. elongatus BP-1 se pueden cultivar en medio A+ tambien como se describe en el Ejemplo 2.
Lo anterior define las condiciones tfpicas de propagacion. En su caso, las incubaciones se realizan utilizando medios alternativos o composiciones de gas, temperaturas alternas (5 - 75 °C), y/o flujos de luz (0-5500 |imol de fotones /m2/s).
La luz se suministra a traves de una variedad de mecanismos, incluyendo la iluminacion natural (luz solar), bombillas incandescentes estandar, fluorescentes, o halogenas, o por medio de propagacion en camaras de crecimiento iluminadas especialmente disenadas (por ejemplo, Model LI15 Illuminated Growth Chamber (Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR). Para los experimentos que requieren longitudes de onda y/o intensidades espedficas, la luz se distribuye a traves de diodos emisores de luz (LED), en los cuales los espectros de longitud de onda y la intensidad pueden ser controladas cuidadosamente (Philips).
El dioxido de carbono se suministra a traves de la inclusion de suplementos de medios solidos (i.e., bicarbonato de sodio) o como un gas a traves de su distribucion en la incubadora del crecimiento o medios. La mayona de los experimentos se realizaron utilizando gas de dioxido de carbono concentrado, a concentraciones entre 1 y 30%, lo que se hace burbujear directamente en el medio de cultivo a velocidades suficientes para proporcionar la mezcla para los organismos. Cuando se utiliza el gas de dioxido de carbono concentrado, el gas se origina en forma pura desde cilindros disponibles en el mercado, o preferentemente desde fuentes concentradas incluyendo descarga gaseosa o gases de escape de plantas de carbon, refinenas, instalaciones de produccion de cemento, instalaciones de gas natural, cervecenas, y similares.
Transformacion de microorganismos seleccionados
Se transforman las celulas Synechococcus sp. PCC 7002 de acuerdo con el protocolo optimizado descrito [Essich ES, Stevens Jr E, Porter RD "Chromosomal Transformation in the Cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum". J Bacteriol (1990). 172(4):1916-1922]. Las celulas se cultivan en medio A (18 g/L de NaCl, 5 g/L de MgSO4. 7 H20, 30 mg/L de Na2EDTA, 600 mg/L de KCl, 370 mg/L de CaCl2. 2 H2O, 1 g/L de NaNO3, 50 mg/L de KH2PO4, 1 g/L de Trizma base pH 8.2, 4 |ig/L de Vitamina B12, 3.89 mg/L de FeC13. 6 H20, 34.3 mg/L H3BO3, 4.3 mg/L de MnCl2. 4 H20, 315 |ig/L de
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ZnCl2, 30 |ig/L de MoO3, 3 |ig/L de CuSO4. 5 H20, 12.2 |ig/L de CoCl2. 6 H20) [Stevens SE, Patterson COP, and Myers J. "The production of hydrogen peroxide by green algae: a survey." J. Phycology (1973). 9:427-430] mas 5g/L de NaNO3 a aproximadamente 108 celulas/mL. Nueve volumenes de celulas se mezclan con 1 volumen de 1-10 |ig/mL de ADN en NaCl 0.15 M/Na3citrato 0.015 M y se incubaron a 27-30 °C, durante 3 horas antes de la adicion de 1 volumen de ADNasa I a una concentracion final de 10 |ig/mL. Las celulas se sembraron en placas en 2.5mL de medio A al 0.6% de agar de recubrimiento que fue atemperado a 45 °C y se incuba. Las celulas se estimularon con antibiotico poniendo por debajo 2.0 mL de medio A al 0.6% de agar, que contiene la concentracion apropiada de antibiotico con una pipeta Pasteur esteril. Los transformantes se recogieron 3-4 dfas mas tarde. Las selecciones se realizan por lo general utilizando 200 |ig/mL de kanamicina, 8 |ig/mL de cloranfenicol, 10 |ig/mL de espectinomicina en medios solidos, mientras que 150 |ig/mL de kanamicina, 7 |ig/mL de cloranfenicol, y 5 |ig/mL de espectinomicina se emplean en medio lfquido.
Se transforman las celulas de T. elongatus BP-1 de acuerdo con el protocolo optimizado previamente descrito (Iwai M, Katoh H, Katayama M, and Ikeuchi).
Se transforman E. coli utilizando tecnicas estandar conocidas para los expertos en el arte, incluyendo choque termico de las celulas qmmicamente competentes y electroporacion [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning- -A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (a traves de e incluyendo el Suplemento de 1997)].
Las rutas biosinteticas como se describen en este documento en primer lugar primero se prueban y optimizan utilizando plasmidos episodicos descritos anteriormente. Las optimizaciones no limitantes incluyen intercambio y puesta a punto del promotor, manipulacion del sitio de union del ribosoma, alteracion de orden de los genes (por ejemplo, gen ABC frente BAC, CBA, CAB, BCA), coexpresion de chaperones moleculares, mutagenesis aleatoria o dirigida de secuencias de genes para aumentar o disminucion de la actividad, plegado, o regulacion alosterica, expresion de secuencias de genes de especies alternativas, manipulacion del codon, adicion o eliminacion de las secuencias dirigidas intracelulares tales como secuencias senal, y similares.
Cada gen o acido nucleico disenado geneticamente es optimizado de forma individual, o, alternativamente, en paralelo. Las secuencias genicas y promotoras funcionales estan integradas posteriormente en el cromosoma de E. coli para permitir la propagacion estable en ausencia de presion selectiva (i.e., inclusion de antibioticos) utilizando tecnicas estandar conocidas para los expertos en el arte.
La figura 1 enumera los genes implicados en la produccion de productos a base de carbono de interes, relacionados con las rutas asociadas, numeros de comision de enzimas (CE), nombres de genes de ejemplo, organismo fuente, numeros de referencia GenBank, y homologos de fuentes alternativas. Cuando el organismo parental codifica un gen con la actividad enzimatica indicada, es util sobreexpresar estos componentes o al menos atenuar estos componentes como se indica. En algunas circunstancias, la secuencia de la enzima nativa se puede sobreexpresar o atenuar. En otras circunstancias, es util sobreexpresar o atenuar un gen exogeno, que permite un control regulador mas explfcito en el bioproceso y un medio para mitigar potencialmente los efectos de la regulacion del metabolismo central, que se centra alrededor de los genes nativos de forma explfcita.
Produccion de Etanol
La figura 2 provee una ruta para producir etanol, succinato y derivados de los mismos.
Hasta la fecha, los rendimientos actuales de etanol producido en las cianobacterias no son apropiados para la produccion comercial a 1.3 mM por OD730 por dfa, como se revela en WO 2007/084477, o 1.7 |imol de etanol por mg de clorofila por hora, como se muestra en la Patente de los Estados Unidos No. 6,699,696.
La presente invencion, por lo tanto, provee una celula huesped capaz de fijar el CO2 que produce etanol a un nivel comercial, por ejemplo, entre aproximadamente 50 y 150 g/L en aproximadamente un penodo de 48 horas. En ciertas realizaciones, la tasa de productividad de etanol esta en el intervalo de aproximadamente 2.5 g/L-hr a aproximadamente 5 g/L-hr. En una realizacion, una celula huesped capaz de fijar el CO2 tal como una cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002 esta disenada geneticamente para expresar genes tales como pdc y/o adh como se describe. Tal microorganismo recombinante codifica la actividad pDc convirtiendo el acido piruvico a acetoaldetudo y/o actividad ADH convirtiendo acetoaldehfdo a etanol. La capacidad del microorganismo transformado para fijar CO2 evita la necesidad de suplementar, ya sea con azucares o biomasa. De acuerdo con lo anterior, los microorganismos de la presente invencion son alternativas atractivas para producir biocombustibles. La presente invencion provee el peso/vol. de etanol para que sea al menos 50, o al menos 60 o al menos 70 o al menos 80 o al menos 90 o al menos 100 o al menos 125 o al menos 150 g/L o de otra manera producido a escala comercial.
Seleccion de enzimas y enzimas optimas
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En la actualidad, los productos de fermentacion tales como etanol, butanol, acido lactico, formiato, acetato producidos en los organismos biologicos emplean un proceso dependiente de NADH. Se usa NAD para descomponer la glucosa u otras fuentes de azucar para formar NADH. NADH se recicla durante la fermentacion a NAD+ para permitir la interrupcion adicional de azucar, lo que resulta en productos secundarios de fermentacion. Durante la fotosmtesis, sin embargo, la celula forma NADPH, que se utiliza sobre todo para las operaciones de biosmtesis en los organismos biologicos, por ejemplo, para la division, crecimiento celular, y para la construccion de almacenes de qmmicos, tales como glucogeno, sacarosa, y otras macromoleculas. Los productos de fermentacion se producen en la luz, pero en pequenas cantidades.
El uso de enzimas naturales o disenadas geneticamente que utilizan NADPH como una fuente para reducir la energfa en lugar de NADH permite el uso directo de energfa reductora fotosintetica hacia la formacion de productos secundarios normalmente fermentativos. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion provee metodos para producir etanol que comprende cultivar una cianobacteria disenada geneticamente que comprende un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH. Esto es una mejora de los metodos anteriores de uso de organismos tales como algas para construir almacenes de productos qmmicos, que se utilizan posteriormente para hacer productos de fermentacion durante la noche o el uso de excedentes extranos de organismos separados. En efecto, los productos de fermentacion se forman a mayores eficiencias directamente a la luz durante la fotosmtesis. Ademas, la produccion obligatoria de macromoleculas en una concentracion elevada se alivia durante el dfa, mediante la produccion de dichos productos directamente durante el dfa.
Las enzimas dependientes de NADPH que producen productos normalmente fermentados son raros en la naturaleza. De acuerdo con lo anterior, en ciertos aspectos de la invencion, el etanol se produce en los organismos que se expresan o modifican para expresar Moorella sp. HUC22-1 o un homologo del mismo que incluye al menos tres deshidrogenasas de alcohol tales como AdhA (Registro de NCBI YP_430754). Se ha demostrado previamente que esta enzima utiliza preferentemente NADP como un cofactor en oposicion a NAD y produce etanol a altas tasas a partir de acetaldehndo ["Characterization of enzymes involved in the ethanol production of Moorella sp. HUC22-1 "]. Por coexpresion de este gen en organismos seleccionados, tales como cianobacterias, la NADPH2 formado durante la fotosmtesis se puede utilizar directamente para formar el etanol en estos organismos. Alternativamente, las enzimas que naturalmente utilizan NADH pueden ser disenadas geneticamente utilizando tecnicas establecidas de ingeniena de protemas para requerir NADPH2 en lugar de NADH.
En ciertas realizaciones, adhA dependiente de NADPH a partir de Moorella es coexpresada con la piruvato descarboxilasa a partir de Zymomonas mobilis en las cianobacterias con el fin de obtener un proceso eficiente para la produccion de etanol dependiente de NADPH como un cofactor en lugar de la tradicional NADH. Tales organismos transgenicos son capaces de producir etanol utilizando procesos dependientes de NADPH.
Polinucleotidos aislados
Las moleculas de acido nucleico aisladas para el gen adhA y variantes de los mismos se describen en este documento. La secuencia de acido nucleico de longitud completa para este gen, que codifica la enzima alcohol deshidrogenasa dependiente de NADP, EC 1.1.1.2, se ha identificado y secuenciado. SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de codificacion del codon y expresion optimizada para el gen adhA de Moorella sp. HUC22-1.
La celula de la presente invencion puede comprender una molecula de acido nucleico que comprende o que consiste en una secuencia que es un codon y la version optimizada de la expresion del gen adhA de tipo salvaje. En una realizacion adicional, la celula de la presente invencion puede comprender una molecula de acido nucleico y homologos, variantes y derivados de SEQ ID NO: 1 que comprende o consiste en una secuencia que es una variante del gen adhA tiene una identidad de al menos 77,1% a SEQ ID NO: 1. La secuencia de acido nucleico puede tener preferiblemente 78%, 79%, 80%, 81%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, 99%, 99.9% o incluso mas identidad con la SEQ ID NO: 1.
En otra realizacion, la celula de la invencion comprende una molecula de acido nucleico que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2.
Las moleculas de acido nucleico pueden hibridar en condiciones rigurosas con las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente. Como se definio anteriormente, y como es bien conocido en la tecnica, las hibridaciones estrictas se llevan a cabo a aproximadamente 25 °C por debajo del punto de fusion termico (Tm) para el hnbrido de ADN espedfico en un conjunto particular de condiciones, donde el Tm es la temperatura a la cual 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Se realiza el lavado riguroso a temperaturas aproximadamente 5 °C mas baja que el Tm para el hnbrido de ADN espedfico en un conjunto particular de condiciones.
Tambien se describen las moleculas de acido nucleico que comprende un fragmento de una cualquiera de las secuencias de acido nucleico descritas anteriormente. Estos fragmentos contienen preferiblemente al menos 20 nucleotidos contiguos. Mas preferiblemente, los fragmentos de las secuencias de acido nucleico que contienen al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o incluso mas nucleotidos contiguos.
Los fragmentos de la secuencia de acido nucleico de mas utilidad de pantalla en una variedad de sistemas y metodos. Por ejemplo, los fragmentos se pueden usar como sondas en diversas tecnicas de hibridacion. Dependiendo del metodo, las secuencias de acidos nucleicos diana pueden ser ADN o ARN. Las secuencias de acidos nucleicos diana
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se pueden fraccionar (por ejemplo, mediante electroforesis en gel) antes de la hibridacion, o la hibridacion se puede realizar en muestras in situ. Un experto en el arte apreciara que las sondas de acido nucleico de secuencia conocida encuentran utilidad en la determinacion de la estructura cromosomica (por ejemplo, mediante transferencia Southern) y en la medicion de la expresion genica (por ejemplo, mediante transferencia de Northern). En tales experimentos, los fragmentos de secuencia preferiblemente se marcan de forma detectable, de modo que su hidridacion espedfica a secuencias diana se pueden detectar y opcionalmente cuantificar. Un experto en el arte apreciara que los fragmentos de acido nucleico se pueden usar en una amplia variedad de tecnicas de transferencia no descritas espedficamente en este documento.
Tambien se debe apreciar que los fragmentos de secuencias de acido nucleico revelados en este documento tambien encuentran utilidad como sondas cuando se inmovilizada sobre micromatrices. Los metodos para la creacion de micromatrices por la deposicion y fijacion de los acidos nucleicos sobre sustratos de soporte son bien conocidos en el arte. Revisado en Chip de Micromatrices de ADN: A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1) (suppl):1-60 (1999); Microarray Biochip: Tools and Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376). Analisis de, por ejemplo, la expresion genica utilizando micromatrices que comprenden fragmentos de secuencia de acido nucleico, tales como los fragmentos de secuencias de acido nucleico revelados en este documento, es una utilidad bien establecida para fragmentos de secuencia en el campo de la biologfa celular y molecular. Otros usos de fragmentos de secuencias inmovilizadas sobre micromatrices se describen en Gerhold et al., Trends Biochem. Sci. 24:168-173 (1999) and Zweiger, Trends Biotechnol. 17:429-436 (1999); ADN Microarrays: A Practical Approach (Practical Approach Series), Schena (ed.), Oxford University Press (1999) (ISBN: 0199637768); Nature Genet. 21(1)(suppl):1-60 (1999); Microarray Biochip: Tools and Technology, Schena (ed.), Eaton Publishing
Company/BioTechniques Books Division (2000) (ISBN: 1881299376).
Se revelan las moleculas de acido nucleico aisladas que codifican el polipeptido AdhA dependiente de NADPH que comprende la actividad de alcohol deshidrogenasa. Como es bien conocido en la tecnica, las actividades enzimaticas se pueden medir de varias maneras. Por ejemplo, la pirofosforolisis de OMP se puede seguir espectroscopicamente. Grubmeyer et al., J. Biol. Chem. 268: 20299 a 20304 (1993). Alternativamente, la actividad de la enzima se puede seguir utilizando tecnicas cromatograficas, tales como por cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Chung and Sloan, J. Chromatogr. 371:71-81 (1986). Como otra alternativa la actividad se puede medir indirectamente mediante la determinacion de los niveles de producto hecho de la actividad enzimatica. Estos niveles se pueden medir con tecnicas que incluyen extraccion con cloroformo/metanol acuoso como es conocido y se describe en la tecnica (cf. M. Kates (1986) Techniques of Lipidology; Isolation, analysis and identification of Lipids. Elsevier Science Publishers, New York (ISBN: 0444807322)). Tecnicas mas modernas incluyen el uso de la cromatograffa de gases unida a espectrometna de masas (Niessen, W. M. A. (2001). La practica actual de la cromatograffa de gases - espectrometna de masas New York, N.Y: Marcel Dekker. (ISBN: 0824704738))de Nueva York, Nueva York:... Marcel Dekker (ISBN: 0824704738)). Tecnicas modernas adicionales para la identificacion de actividad de la protema recombinante y productos incluyendo cromatograffa Kquida-espectrometna de masas (LCMS), cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis capilar, espectrometna de masas de desorcion e ionizacion por laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS), resonancia magnetica nuclear (NMR), espectroscopfa de infrarrojo cercano (NIR), viscosimetna (Knothe, G., R.O. Dunn, and M.O. Bagby. 1997. Biodiesel: The use of vegetable oils and their derivatives as alternative diesel fuels. Am. Chem. Soc. Symp. Series 666: 172-208), titulacion para la determinacion de acidos grasos libres (Komers, K., F. Skopal, and R. Stloukal. 1997. Determination of the neutralization number for biodiesel fuel production. Fett/Lipid 99(2): 52-54), metodos enzimaticos (Bailer, J., and K. de Hueber. 1991. Determination de saponifiable glycerol in "bio-diesel." Fresenius J. Anal. Chem. 340(3): 186), metodos basados en las propiedades ffsicas, metodos qrnmicos humedos, etc., pueden ser utilizados para analizar los niveles y la identidad del producto producido por los microorganismos de la presente invencion. Otros metodos y tecnicas tambien pueden ser apropiados para la medicion de la actividad enzimatica, como sera conocido por un experto en el arte.
Tambien se describen los vectores, incluyendo vectores de expresion, que comprenden las moleculas de acido nucleico anteriores. Los vectores pueden incluir las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente unidas operativamente a una o mas secuencias de control de expresion. Los vectores pueden por lo tanto usarse para expresar un polipeptido AdhA dependiente de NADPH, que comprende la actividad del alcohol deshidrogenasa.
Polipeptidos aislados
Los polipeptidos aislados (incluyendo mutemas, variantes alelicas, fragmentos, derivados, y analogos) codificados por las moleculas de acido nucleico descritas anteriormente tambien se describen. El polipeptido aislado puede comprender la secuencia de polipeptido que corresponde a SEQ ID NO: 2. El polipeptido aislado puede comprender una secuencia de polipeptido al menos 71,1% identica a SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el polipeptido aislado tiene 72%, 73%, 75%, 76%, 80%, 81%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 98,1%, 98,2%, 98,3%, 98,4%, 98,5%, 98,6%, 98,7%, 98,8%, 98,9%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% o incluso mas de identidad con la SEQ ID NO: 2.
Se describen los polipeptidos aislados que comprenden un fragmento de las secuencias de polipeptidos descritas anteriormente. Estos fragmentos incluyen preferiblemente al menos 20 aminoacidos contiguos, mas preferiblemente al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o incluso mas aminoacidos contiguos.
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Los polipeptidos tambien incluyen fusiones entre las secuencias de polipeptidos antes descritos y polipeptidos heterologos. Las secuencias heterologas pueden, por ejemplo, incluir secuencias disenadas para facilitar la purificacion, por ejemplo, etiquetas de histidina, y/o visualizacion de protemas expresadas de forma recombinante. Otros ejemplos no limitantes de fusiones de protemas incluyen aquellos que permiten la visualizacion de la protema codificada en la superficie de un fago o una celula, fusiones a protemas intrmsecamente fluorescentes, tales como la protema fluorescente verde (GFP) y fusiones con la region Fc de IgG.
Resultados de enzimas optimas
El aumento del nivel de etanol es observado por las celulas huesped disenadas geneticamente para tener actividad de alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH. Los metodos para producir mayor nivel de etanol comprenden la expresion de dichos genes adhA dependientes de NADPH como se describe en este documento.
En ciertos aspectos de la invencion, se produce el aumento de los niveles de etanol de al menos aproximadamente 249 mg/L de etanol sobre las 72 horas. Mas preferiblemente, al menos aproximadamente 297 mg/L de etanol se producen sobre las 72 horas (Figura 6).
En otros aspectos de la invencion, se produce la disminucion de los niveles de acetaldetndo. En realizaciones preferidas, se produce menos de aproximadamente 14 mg/L de acetaldetndo (Figura 7).
Sin embargo, en otros aspectos de la invencion, se producen los metodos para producir una mayor cantidad de etanol en relacion con el aumento de DO. En realizaciones preferidas, se producen al menos aproximadamente 36 mg/L de etanol por DO. Mas preferiblemente, se producen al menos aproximadamente 47 mg/L de etanol por DO (Figura 8).
De acuerdo con lo anterior, en este documento se muestra que la expresion de tales enzimas dependientes de NADPH para la generacion de productos de fermentacion tales como el etanol, aumenta los niveles de etanol, disminuye los niveles de acetaldetndo y, en efecto, permite una mayor produccion de etanol como una funcion de DO.
Independencia de nutrientes
En otro aspecto, ademas de CO2 y la luz, los organismos fotoautotroficos normalmente requieren fuentes de nutrientes inorganicos y vitaminas. Los nutrientes necesarios generalmente estan suplementados al medio de cultivo, durante la propagacion a escala experimental de tales organismos. Sin embargo, tales nutrientes son prohibitivamente caros en el contexto del bioprocesamiento a escala industrial.
La vitamina B12 es un cofactor vitammico que facilita la catalizacion de reaccion basada en radicales. Muchos organismos, incluyendo Synechococcus sp. PCC 7002, requieren fuentes externas de vitamina B12 para el crecimiento, que es prohibitivamente cara en el bioprocesamiento industrial a gran escala. En una realizacion, la necesidad de vitamina B12 se evita mediante el diseno de celulas fotoautotroficas para expresar la ruta biosintetica de la vitamina B12 como se describe en PCT/US2008/083056, presentada el 10 de noviembre de 2008. Una ruta biosintetica de ejemplo, encontrada en Salmonella typhimurium se sobreexpresa, incluyendo pero no limitado a, los siguientes genes que codifican las secuencias de aminoacidos, se expone en (Uroporfirin-III C-metiltransferasa (CysG), EC 2.1.1.107, locus NP_462380), (Sirohidroclorin cobaltoquelatasa (CbiK), EC 4.99.1.3, locus NP_460970), (Precorrin-2 C20 metiltransferasa (CbiL), EC 2.1.1.130, locus NP_460969), (Precorrin3B metilasa (CbiH), EC 2.1.1.131, locus NP_460972), (CbiG/precorrin metiltransferasa bifuncional (CbiG), locus NP_460973), (Precorrin-4 C11-metiltransferasa (CbiF), EC 2.1.1.133, locus NP_460974), (protema de la smtesis de cobalamina (CbiD), locus NP_460977), (precorrin- 6a reductasa dependiente de NADPH (CbiJ) (precorrin-6A reductasa dependiente de nAdPH (CbiJ), EC 1.3.1.54, locus NP_460971), (Precorrin-6B C5,15-metiltransferasa (CbiE), EC 2.1.1.132, locus NP_460976), (Precorrin-6B C12 descarboxilasa (CbiT), EC 2.1.1.132, locus NP_460975), (Precorrin-8X-metilmutasa (CbiC), Ec 5.4.1.2, locus NP_460978), (acido cobirmico A,C-diamida sintasa (CbiA), eC 6.3.1.-, locus NP_460980), (acido Cob(I)irmico a,c- diamida adenosiltransferasa (BtuR), EC 2.5.1.17, locus NP_460677), (acido cobirmico sintasa (CbiP), EC 6.3.5.10, locus NP_460964), (acido cobmco descarboxilasa (CobD), EC 4.1.1.81, locus NP_459636), (Adenosilcobinamida-fosfato sintasa (CbiB), EC 6.3.1.10, locus NP_460979), (Alfa ribazol-5'-P fosfatasa (CobC), EC 3.1.3.73, locus NP_459635), (Cobalamina(5'-fosfato) sintasa (CobS), EC 2.7.8.26, locus NP_460962), (Cobinamida fosfato guaninil transferasa (cobU), EC 2.7.7.62, locus NP_460963), y (Nicotinato-nucleotido dimetilbencimidazol-P fosforribosil transferasa (CobT), EC 2.4.2.21, locus NP_460961)].
Ademas, para permitir la captacion de cobalto y la incorporacion en la vitamina B12, los genes que codifican el transportador de cobalto se sobreexpresan. La protema transportadora de cobalto de ejemplo encontrado en Salmonella typhimurium se sobreexpresa y esta codificada por secuencias de aminoacidos expuestas en (sistema de transporte Co2+ de tipo ABC, el componente permeasa (CbiM), locus NP_460968), (sistema de transporte de cobalto de tipo ABC, componente periplasmico (CbiN), locus NP_460967), y (sistema de transporte de cobalto de tipo ABC, componente permeasa (CbiQ), locus NP_461989).
En una realizacion preferida, los organismos fotoautotroficos se disenan geneticamente para sobreexpresar enzimas independientes de la vitamina B12 para evitar la necesidad de este cofactor completamente. En la mayona de los organismos fotoautotroficos, solo la metionina sintasa (EC 2.1.1.13) y las ribonucleotido reductasas clase II requieren vitamina B12. Por lo tanto, se sobreexpresa una metionina sintasa independiente de la vitamina B12 de ejemplo (EC
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2.1.1.14) a partir de Thermotoga maritime, como se expone en PCT/US2008/083,506 (5-
metiltetrahidropteroiltriglutamato-homocistema metiltransferasa (MetE), locus NP_229090). Ademas, se sobreexpresa una ribonucleotido reductasa clase I de ejemplo (nrdAB) a partir de Synechocystis sp. PCC 6803, que codifica las secuencias de aminoacidos expuestas en (ribonucleosido-difosfato reductasa, subunidad alfa (NrdA), locus NP_441654), (ribonucleosido-difosfato reductasa, subunidad beta (NrdB), locus NP_443040).
Mediante ingeniena genetica un organismo con las enzimas mencionadas anteriormente y en la figura 1, se produce un fotoetanolgeno como se describe mas espedficamente en el Ejemplo 3. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion provee una celula huesped capaz de fijar el CO2 tal como una cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002 que esta disenada para expresar pdc y adh para producir etanol, y esta disenada para ser independiente de los nutrientes.
Produccion de etanol bajo iluminacion continua
Normalmente, se forma el glucogeno en los microorganismos en la luz, para ser consumidos por la energfa de reduccion en la oscuridad. Con iluminacion continua, sin embargo, puede ser desventajoso acumular cantidades significativas de glucogeno, que alejanan el carbono de la(s) ruta(s) deseada(s), especialmente debido a que no podfa haber un penodo de oscuridad suficientemente largo para utilizar el glucogeno. En ciertas realizaciones para evitar la smtesis de glucogeno durante la iluminacion, los genes que codifican actividades enzimaticas relacionadas con la smtesis de glucogeno se atenuan o se eliminan por completo, en la medida en que el organismo sigue siendo facil de mantener en un estado viable y siendo robusto en condiciones de fermentacion. De acuerdo con lo anterior, la celula de la presente invencion puede ser al menos atenuada en las actividades enzimaticas que incluyen, sin limitacion: glucosa-1-fosfato adeniltransferasa (EC 2.7.7.27), glucogeno sintasa (EC 2.4.1.21 y EC 2.4.1.11), glucosa -1-fosfato uridililtransferasa (EC 2.7.7.9), y enzima de ramificacion 1,4-alfa-glucano (EC 2.4.1.18).
En ciertos aspectos para la produccion de etanol, el carbono que esta disponible a partir de la fijacion de CO2 se dirige a piruvato tan eficazmente como sea posible. Las cianobacterias pueden sintetizar algo de piruvato a partir de la fijacion de carbono durante la iluminacion, utilizando gliceraldehndo-3-fosfato derivado del ciclo de Calvin, debido a que aun deben realizar precursores de biosmtesis a partir de estas. Sin embargo, lo hacen solo en la medida en que lo requieran para el crecimiento. Para aumentar el flujo un piruvato a partir de intermedios del ciclo de Calvin, es deseable expresar de forma constitutiva los genes que codifican las enzimas glucolfticas, a partir de un huesped nativo o un huesped no nativo. La eleccion de genes se realiza basandose en si se proyectan efectos reguladores alostericos eviten que ejerciten sus actividades completas en el contexto metabolico esperado del huesped. La capacidad constitutiva podna lograrse mediante la eliminacion de la regulacion transcripcional donde exista, o mediante la expresion de las enzimas a partir de promotores constitutivos con los que no estan asociados normalmente. De acuerdo con lo anterior, la celula de la presente invencion puede comprender ademas las actividades enzimaticas incluyendo, pero sin limitacion: gliceraldehndo 3-fosfato deshidrogenasa (EC 1.2.1.12 o EC 1.2.1.13), fosfoglicerato quinasa (EC 2.7.2.3), fosfoglicerato mutasa (EC 5,4.2.1), enolasa (EC 4.2.1.11) y piruvato quinasa (EC 2.7.1.40).
La celula de la presente invencion tambien comprende las actividades enzimaticas adicionales para la conversion de piruvato a etanol. En ciertas realizaciones, dicha conversion puede llevarse a cabo por al menos cuatro rutas distintas: 1) la ruta de la piruvato descarboxilasa, 2) la ruta de la piruvato deshidrogenasa, 3) la ruta de la piruvato oxidasa, y 4) la ruta de piruvato-formiato liasa. Las actividades enzimaticas requeridas para la ruta de la piruvato descarboxilasa son: la piruvato descarboxilasa (EC 4.1.1.1) y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o EC 1.1.1.2). Las actividades enzimaticas requeridas para la ruta de la piruvato deshidrogenasa son: acetaldehndo deshidrogenasa (EC 1.2.1.10), y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o Ec 1.1.1.2). Las actividades enzimaticas requeridas para la ruta de la piruvato oxidasa son: piruvato oxidasa (EC 1.2.2.2), acetil-CoA sintetasa (EC 6.2.1.1), acetaldehndo deshidrogenasa (EC 1.2.1.10), y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o EC 1.1.1.2). Las actividades enzimaticas requeridas para la ruta piruvato-formiato liasa son: piruvato formiato-liasa (EC 2.3.1.54), formiato hidrogeno-liasa (sin numero de EC), acetaldehndo deshidrogenasa (EC 1.2.1.10), y alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1 o EC 1.1.1.2). Preferiblemente, una o mas de estas rutas se expresa de forma constitutiva o bajo alguna otra regulacion controlada.
Ademas de proporcionar genes exogenos o genes endogenos con nueva regulacion, la optimizacion de la produccion de etanol en microorganismos preferiblemente requiere la eliminacion o atenuacion de ciertas actividades enzimaticas huesped. Estas incluyen, pero no se limitan a, piruvato oxidasa (EC 1.2.2.2), D-lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.28), acetato quinasa (EC 2.7.2.1), fosfato acetiltransferasa (EC 2.3.1.8), citrato sintasa (EC 2.3.3.1), fosfoenolpiruvato carboxilasa (EC 4.1.1.31). El grado en que estas manipulaciones sean necesarias viene determinado por los productos secundarios observados se encuentran en el biorreactor o matraz de agitacion. Por ejemplo, la observacion de acetato sugerina la supresion de actividades enzimaticas de piruvato oxidasa, acetato quinasa, y/o fosfotransacetilasa. En otro ejemplo, la observacion de D-lactato sugerina la supresion de actividades enzimaticas de D-lactato deshidrogenasa, mientras que la observacion de succinato, malato, fumarato, oxalacetato, o citrato sugerina la supresion de las actividades enzimaticas de citrato sintasa y/o PEP carboxilasa.
Produccion de etanol en ciclo de luz-oscuridad
En realizaciones alternativas, la presente invencion esta adaptada de modo que los microorganismos se utilizan en sistemas que son apropiados para funcionar con un ciclo de luz-oscuridad, en donde varias horas de iluminacion constante se siguen de varias horas de oscuridad relativa. Utilizando dicho ciclo, la eliminacion completa de la
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capacidad de smtesis de glucogeno puede no ser una estrategia viable, debido a que las celulas requeriran algo de glucogeno para sobrevivir al periodo de oscuridad. En este caso, puede implementarse una de dos estrategias alternativas: 1) atenuacion, pero no eliminacion, de las enzimas de smtesis de glucogeno, de modo que aun se realice algo de glucogeno durante la fase de la luz; o 2) maximizacion de la produccion de glucogeno durante la fase de luz.
En una realizacion, los microorganismos se atenuan, pero no se eliminan en las actividades enzimaticas de smtesis de glucogeno. Tales metodos se implementan suprimiendo las actividades del gen(s) de smtesis del glucogeno nativo(s) y su sustitucion por analogos que tienen regulacion y expresion no nativa en un nivel mas bajo que en el huesped nativo.
En otra realizacion, los microorganismos maximizan la produccion de glucogeno durante la fase de luz. Tales metodos se implementan por la deteccion de cepas con el contenido mas alto de glucogeno entre una coleccion de cepas de tipo salvaje o una biblioteca de mutantes de una cepa particular, despues de que tales cepas se han cultivado a una concentracion celular apropiada y se han sometido posteriormente a la limitacion de un mutriente clave tal como nitrogeno, fosforo, o potasio. Sena muy ventajoso utilizar un ciclo de luz-oscuridad de tal manera que el glucogeno se sintetiza a la maxima cantidad posible en terminos de peso celular seco durante el ciclo de luz, entonces metabolizado a etanol a punto de terminar como sea posible durante el ciclo de oscuridad.
Durante el ciclo de oscuridad, el glucogeno se convierte en piruvato por enzimas endogenas, pero, como en el caso de iluminacion continua, estas enzimas pueden ser reguladas en el huesped de tal manera que la conversion global suceda a una tasa suboptima. Para aumentar la tasa de esta conversion, tal regulacion se contrarresta, ya sea por mutagenesis o cribado de cepas con respecto a rapida utilizacion de glucogeno en oscuridad o proporcionando al huesped las enzimas necesarias a mayores niveles de expresion y/o proporcionando genes exogenos que codifican enzimas que son menos sometidas a la regulacion alosterica que las del huesped. De acuerdo con lo anterior, las actividades enzimaticas preferidas para conseguir este efecto incluyen los enumerados anteriormente para la conversion de gliceraldehndo-3-fosfato en etanol, ademas de actividades enzimaticas que convierten el glucogeno en gliceraldehndo-3- fosfato: glucogeno fosforilasa (EC 2.4.1.1), fosfoglucomutasa (EC 5.4.2.2), glucosa-6-fosfato isomerasa (EC 5.3.1.9), fosfofructoquinasa (EC 2.7.1.11), fructosa-6-fosfato aldolasa (EC 4.1.2.13), y triosafosfato isomerasa (EC 5.3.1.1 ).
En aun otra realizacion, al menos una actividad citocromo oxidasa esta atenuada o funcionalmente suprimida. Las citocromo oxidasas funcionan para transferir electrones al oxfgeno en la oscuridad. Howitt et al., realizaron supresiones de citocromo oxidasas (Ctal, CtaII y Cyd) y fueron capaces de obtener cepas que no respiran en la oscuridad, pero que crecieran de forma normal a la luz. (Quinol and Cytochrome Oxidases in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803, [Howitt et al., Biochemistr y (1998) 37 (51):17944-51]). Las cepas que caredan de una oxidasa respiraban a tasas casi de tipo salvaje, mientras que las que caredan tanto de Ctal como de Cyd no respiraban. La incapacidad para respirar en la oscuridad significa mas productos de fermentacion, incluyendo etanol y quizas tambien succinato, asf como 1,4-butanodiol. De acuerdo con lo anterior, la presente invencion provee un organismo fijador de carbono, por ejemplo, una cianobacteria disenada geneticamente en donde al menos una actividad oxidasa del citocromo es atenuada, lo que aumenta la produccion de etanol, succinato y/o 1,4-butanodiol.
La introduccion de secuencias de acidos nucleicos heterologas implicadas en una ruta biosintetica para la produccion de hidrocarburos se puede realizar de forma estable o transitoria en diversas celulas huesped utilizando tecnicas bien conocidas en el arte, por ejemplo, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE- dextrano, transfeccion mediada por liposomas, conjugacion y transduccion. Para la transformacion estable, una secuencia de ADN puede incluir ademas un marcador seleccionable, tal como, resistencia a los antibioticos, por ejemplo, resistencia a neomicina, tetraciclina, cloranfenicol, kanamicina y genes que complementan las deficiencias auxotroficas.
Las secuencias de control de expresion apropiadas para uso en celulas huesped procariotas incluyen, pero no se limitan a, promotores capaces de reconocer las polimerasas T4, T3, Sp6 y T7, los promotores PR y PL del bacteriofago lambda, los promotores trp, recA, de choque termico, y lacZ de E. coli, los promotores de alfa-amilasa y los espedficos de sigma de B. subtilis, los promotores de los bacteriofagos de Bacillus, los promotores de Streptomyces, el promotor int del bacteriofago lambda, el promotor bla del gen de beta- lactamasa de pBR322, y el promotor cAt del gen cloranfenicol acetil transferasa. Los promotores procariotas son revisados Glick, J. Ind. Microbiol. 1:277, 1987; Watson et al, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENES 4a Ed., Benjamin Cummins (1987); y Sambrook et al., mencionado anteriormente.
Ejemplos no limitantes de promotores eucariotas apropiados para su uso dentro de un huesped eucariota son de origen viral e incluyen el promotor del gen de la metalotionema I de raton (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273, 1982); el promotor TK de virus del Herpes (McKnight, Cell 31:355, 1982); el promotor temprano de SV40 (Benoist et al, Nature (London) 290: 304, 1981); el promotor del virus del sarcoma de Rous; el promotor de citomegalovirus (Foecking et al, Gene 45: 101, 1980); el promotor del gen de gal4 de levadura (Johnston, et al, PNAS (USA) 79: 6 971, 1982; Silver, et al., PNAS (USA) 81:5951, 1984); y el promotor de IgG (Orlandi et al, PNAS (USA) 86:3833, 1989).
En algunos ejemplos una celula huesped modificada geneticamente se modifica geneticamente con una secuencia de ADN heterologa que codifica un producto genico de la ruta biosintetica que esta unido operativamente a un promotor constitutivo. Promotores constitutivos apropiados son conocidos en el arte e incluyen, promotor tardm constitutivo principal de adenovirus, un promotor de MpSv constitutivo, y un promotor de CMV constitutivo. Promotores constitutivos apropiados aplicables para Synechococcus sp. PCC 7002 incluyen, por ejemplo, Ptacl, P-EM7, Paph2 y PaadA
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La celula huesped microbiana se puede modificar geneticamente con una secuencia del acido nucleico heterologa que codifica un producto genico de ruta biosintetica que esta unido operativamente a un promotor inducible. Los promotores inducibles son bien conocidos en el arte. Los promotores inducibles apropiados incluyen, pero no se limitan a los promotores que se ven afectados por protemas, metabolitos, o productos qmmicos. Estos incluyen: un promotor del virus de la leucemia bovina, un promotor de metalotionema, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor de MRP pollll, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor de CMV temprano inmediato humano) asf como los de los operones trp y lac.
Cuando una celula huesped se modifica geneticamente con secuencias de acido nucleico heterologos que codifican dos o mas protemas implicadas en una ruta biosintetica para producir productos a base de carbono de interes, las secuencias de acidos nucleicos pueden ser impulsadas por un unico promotor en un unico vector o al menos un promotor en vectores de expresion separados.
La concentracion intracelular (por ejemplo, la concentracion del intermedio en la celula huesped modificada geneticamente) del intermedio de la ruta biosintetica se puede aumentar para potenciar aun mas el rendimiento del producto final. Por ejemplo, aumentando la cantidad intracelular de un sustrato (por ejemplo, un sustrato primario) para una enzima que es activa en la ruta biosintetica, y similares.
Modificaciones de cadenas de carbono
La figura 1 provee una descripcion de los diversos genes que pueden ser modulados para alterar la estructura del producto derivado de acidos grasos y las enzimas codificadas que pueden ser utilizados solos o en combinacion para hacer diversos acidos grasos e hidrocarburos. Los productos se pueden producir de tal manera que contengan puntos de ramificacion, los niveles de saturacion, y longitud de cadena de carbono, haciendo de este modo a estos productos materiales de partida deseables para su uso en muchas aplicaciones. Se describen diversos productos a base de carbono de interes producidos por los microorganismos.
La figura 1 tambien enumera las enzimas que estan implicadas directamente en la smtesis de productos a base de carbono, incluidas las ceras, esteres de acidos grasos y/o alcoholes grasos. Para aumentar la produccion de ceras/esteres de acidos grasos y alcoholes grasos, una o mas de las enzimas se puede sobreexpresar o mutar para reducir la inhibicion por retroalimentacion. Adicionalmente, las enzimas que metabolizan los intermedios para hacer productos basados en acidos no grasos (reacciones secundarias) pueden ser eliminadas o atenuadas funcionalmente para aumentar el flujo de carbono a traves de la ruta biosintetica de acidos grasos. Los ejemplos proporcionados en este documento describen como realizar enzimas disenadas geneticamente en las respectivas rutas de organismos huesped para producir organismos disenados geneticamente que producen etanol.
Foto-Fermentacion consolidada
En un enfoque alternativo para producir directamente producto a base de carbono de interes final como resultado de la fotosmtesis, los productos a base de carbono de interes pueden ser producidos impulsando otros organismos que son mas susceptibles de hacer cualquier producto particular, mientras se cultiva el organismo fotosintetico por su fuente de carbono. En consecuencia, la fermentacion y produccion de productos a base de carbono de interes se pueden producir por separado de la produccion de fuente de carbono en un fotobiorreactor.
Los metodos de produccion de tales productos a base de carbono de interes pueden incluir dos etapas. La primera etapa incluye el uso de organismos fotosinteticos para convertir dioxido de carbono a los productos fotosinteticos tales como glucosa. La segunda etapa es usar los productos fotosinteticos como fuente de carbono para las celulas que producen productos a base de carbono de interes. El enfoque de dos etapas puede comprender un fotobiorreactor comprende celulas fotosinteticas; un segundo reactor que comprende celulas capaces de fermentacion; en el cual las celulas fotosinteticas proveen una fuente de carbono tal como glucosa para las celulas capaces de fermentacion para producir un producto a base de carbono de interes. El segundo reactor puede comprender mas de un tipo de microorganismo. Los resultantes productos a base de carbono de interes posteriormente se separan y/o recogen.
Las dos etapas se pueden combinar en un proceso de una unica etapa mediante el cual los organismos fotosinteticos disenados geneticamente convierten luz y CO2 directamente en glucosa y tales organismos son capaces de producir una variedad de productos a base de carbono de interes.
Ciertos cambios en las condiciones de cultivo de celulas huesped fotosinteticas, por ejemplo, cianobacterias para la produccion de azucares se pueden optimizar para el crecimiento. Por ejemplo, las condiciones se han optimizado para la intensidad de luz, exposicion a la luz, tiempo de exposicion, ciclo diurno, adicion de suplementos, nutrientes, la velocidad de recirculacion y la velocidad de flujo que mantienen una relacion de luz y oscuridad. Como sera evidente para los expertos en el arte, las condiciones suficientes para lograr un crecimiento optimo variaran dependiendo de la ubicacion, el clima y otros factores ambientales, tales como el ciclo diurno, intensidad de luz y tiempo de exposicion a la luz. Pueden ser necesarios otros ajustes, por ejemplo, la capacidad de un organismo para la captacion de carbono. Se puede introducir un aumento de carbono en forma de CO2 en un biorreactor por rociadores de gas o dispositivos de aireacion
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Las ventajas de foto-fermentacion consolidada incluyen un proceso donde hay separacion de productos qmmicos finales, por ejemplo, glucosa, separacion espacial entre los productos finales (membranas) y el tiempo. Adicionalmente, a diferencia de la tradicional o biomasa celulosica con la produccion de biocombustibles, se evitan el pretratamiento, sacarificacion y arado del cultivo.
El proceso de foto-fermentacion consolidada produce productos continuos. El proceso puede implicar la captura directa de luz para el producto a partir de organismos iniciales disenados geneticamente para producir diversos productos sin la necesidad de lisar los organismos. Por ejemplo, los organismos pueden utilizar 3PGAL a la luz para hacer un producto de fermentacion deseado, por ejemplo, etanol. Como alternativa, los organismos pueden acumular glucogeno a la luz y metabolizar etanol en la oscuridad para hacer mas productos de fermentacion. Tales productos finales se pueden secretar facilmente en contraposicion a los productos intracelulares tales como el aceite y celulosa. Los organismos pueden producir azucares a la luz, que se secretan en el medio y dichos azucares se utilizan en oscuridad durante la fermentacion con los mismos o diferentes organismos o una combinacion de ambos.
Condiciones de fermentacion
La produccion y aislamiento de productos a base de carbono de interes se puede potenciar empleando tecnicas de fermentacion espedficos. Un metodo para maximizar la produccion y reducir los costos esta aumentando el porcentaje de carbono que se convierte en productos de hidrocarburo. Durante los ciclos de vida celulares normales se utiliza carbono en las funciones celulares, incluyendo produccion de lfpidos, sacaridos, protemas, acidos organicos, y acidos nucleicos. La reduccion de la cantidad de carbono necesaria para las actividades relacionadas con el crecimiento puede aumentar la eficiencia de la conversion de fuente de carbono para la produccion. Esto se puede lograr cultivando en primer lugar microorganismos hasta una densidad deseada, tal como una densidad alcanzada en el pico de la fase iogantmica de crecimiento. A tal punto, se pueden aprovechar los genes de punto de control de replicacion para detener el crecimiento de las celulas. En concreto, se pueden utilizar los mecanismos de deteccion de quorum [revisado en Camilli and Bassler, Science 311:1113, (2006); Venturi FEMS Microbio Rev 30:274-291 (2006); y Reading and Sperandio, FEMS Microbiol Lett, 254:1-11, (2006)] para activar genes, tales como p53, p21, u otros genes de punto de control. Los genes que se pueden activar para detener la replicacion y el crecimiento celular en E. coli incluyen los genes umuDC, cuya sobreexpresion detiene la progresion de la fase estacionaria a crecimiento exponencial [Murli et al, J. of Bact., 182:1127, (2000)]. UmuC es un ADN polimerasa que puede llevar a cabo la smtesis de translesion sobre lesiones no codificantes, la base mecanica de la mayona UV y de las mutagenesis qmmica. Los productos genicos de umuDC se utilizan para el proceso de smtesis de translesion y tambien sirven como un punto de control del dano del ADN. Los productos genicos de UmuDC incluyen UmuC, UmuD, UmuD', UmuD'2C, UmuD'2 y UmUD2. Simultaneamente, los genes productores de producto se activan, minimizando asf la necesidad de rutas de mantenimiento y replicacion para utilizar mientras se esta realizando el derivado de acido graso.
En un aspecto, el porcentaje de carbonos de entrada convertido en productos de hidrocarburos es un proceso eficiente y de bajo costo. Usando dioxido de carbono como fuente de carbono, el oxfgeno se libera en forma de O2, lo que conduce a una eficacia metabolica teorica maxima de ~ 34% (peso/peso) (para productos derivados de acidos grasos).
Esta cifra, sin embargo, cambia para otros productos de hidrocarburo y fuentes de carbono. Las eficacias tfpicas en la bibliograffa son ~ < 5 %. Los microorganismos disenados geneticamente que producen productos de hidrocarburo pueden tener mas de 1, 3, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 % de eficacia. En un ejemplo los microorganismos mostraran una eficacia de aproximadamente el 10 % a aproximadamente el 25 %. En otros ejemplos, dichos microorganismos mostraran una eficacia de aproximadamente el 25 % a aproximadamente el 30 %, y en otros ejemplos dichos microorganismos mostraran > 30 % de eficacia.
En algunos ejemplos, cuando el producto final se libera de la celula, se puede emplear un proceso continuo. En este enfoque, un reactor con organismos productores de derivados de acidos grasos se puede ensamblar de varias maneras. En un ejemplo, una parte del medio se retira y se permite que se separe. Los derivados de acidos grasos se separan de la capa acuosa, que a su vez se devolvera a la camara de fermentacion.
En otro ejemplo, la camara de fermentacion incluira una fermentacion que se somete a una reduccion continua. En este caso, se creana un ambiente reductor estable. El equilibrio electronico se mantendna por la liberacion de oxfgeno. Los intentos de aumentar el equilibrio de NAD/H y NADP/H tambien pueden facilitar la estabilizacion del equilibrio electronico.
La disponibilidad de NADPH intracelular tambien se puede potenciar disenando geneticamente el huesped de produccion para expresar una NADH:NADPH transhidrogenasa. La expresion de una o mas NADH:NADPH transhidrogenasas convierte el NADH producido en glucolisis a NADPH que energfa la produccion de derivados de acidos grasos.
Para la produccion de producto a gran escala, los microorganismos disenados geneticamente se cultivan en lotes de 10 L, 100 L o mayores, se fermentan y se inducen para expresar productos deseados basados en los genes espedficos codificados en plasmidos segun sea apropiado. Se incuban celulas que albergan acidos nucleicos disenados geneticamente para sobreexpresar o atenuar productos genicos a partir de un cultivo de siembra de 500 mL para fermentaciones de 10 L (5 L para fermentaciones de 100 L) en medio LB (sin glicerol) a 37 °C agitado a > 200 rpm hasta que los cultivos alcanzan una DO deseada (por lo general 16 horas) incubados con kanamicina, ampicilina o similares.
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El medio se trata con complemento continuamente para mantener un propionato de sodio 25 mM a un pH apropiado de aproximadamente 8.0 para activar los sistemas genicos introducidos por ingenieffa genetica para la produccion, as^ como para detener la proliferacion celular. El medio se complementa continuamente con dioxido de carbono. Se retiran alfcuotas de no mas del 10 % del volumen celular total cada hora y se permite que reposen sin agitacion para permitir que el producto de hidrocarburo suba a la superficie y experimente una separacion de fase espontanea. El componente de hidrocarburo se recoge despues y la fase acuosa se devuelve a la camara de reaccion. La camara de reaccion funciona continuamente. Para la produccion de ester de cera, despues del aislamiento, los esteres de cera se lavan brevemente en HCl 1 M para romper el enlace ester y se devuelven a pH 7 con lavado exhaustivo con agua destilada.
Procesamiento y separacion
Los productos a base de carbono producidas por los organismos fijadores de dioxido de carbono durante la fermentacion pueden ser separados del medio de fermentacion. Se pueden emplear tecnicas conocidas para separar los derivados de acido grasos a partir de medios acuosos. Un proceso de separacion a modo de ejemplo proporcionado en este documento es un proceso de separacion de dos fases (bifasica). Este proceso implica la fermentacion de los huespedes de produccion disenados geneticamente en condiciones suficientes para producir, por ejemplo, un acido graso, permitiendo que el acido graso se recoja en una fase organica y separando la fase organica del medio de fermentacion acuosa. Este metodo puede ser practicado tanto en una configuracion de fermentacion tanto discontinua como continua.
La separacion bifasica utiliza la relativa inmiscibilidad del acido graso para facilitar la separacion. Un experto en el arte apreciara que eligiendo un medio de fermentacion y la fase organica de modo que el derivado de acido graso que se produzca tenga un valor logP alto, incluso a concentraciones muy bajas, el acido graso se separara en la fase organica en el recipiente de fermentacion.
Cuando se produzcan los acidos grasos mediante los metodos descritos en este documento, estos productos seran relativamente inmiscible en el medio de fermentacion, asf como en el citoplasma. Por lo tanto, el acido graso se acumula en una fase organica, ya sea intracelular o extracelularmente. La recoleccion de los productos en una fase organica disminuira el impacto del derivado de acido graso sobre la funcion celular y permite que el huesped de produccion produzca mas producto.
Los alcoholes grasos, esteres de acidos grasos, ceras e hidrocarburos producidos como se describe en este documento permiten la produccion de compuestos homogeneos con respecto a otros compuestos en donde al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% de los alcoholes grasos, esteres de acidos grasos, ceras e hidrocarburos producidos tienen longitudes de cadena de carbono que vaffan en menos de 4 carbonos, o menos de 2 carbonos. Estos compuestos tambien pueden ser producidos de manera que tengan un grado relativamente uniforme de saturacion con respecto a otros compuestos, por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o 95% de los alcoholes grasos, esteres de acidos grasos, hidrocarburos y ceras son mono-, di-, tri- o insaturados.
Deteccion y analisis
En general, los productos de interes producidos a partir de las “biofabricas solares” descritas en este documento se pueden analizar por cualquiera de los metodos analfficos estandar, por ejemplo, cromatograffa de gases (GC), espectrometna de masas (MS), cromatograffa de gases-espectrometffa de masas (GCMS), y cromatograffa lfquida- espectrometffa de masas (LCMS), cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis capilar, espectrometna de masas de desorcion e ionizacion por laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS), resonancia magnetica nuclear (RMN), espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR), viscometffa [Knothe et al., Am. Chem. Soc. Sump. Series, 666:172-208 (1997)], valoracion para determinar acidos grasos libres [Komers et al., Fett/Lipid 99 (2):52-54 (1997)], metodos enzimaticos [Bailer et al, J Anal. Chem. 340 (3): 186 (1991)], metodos basados en propiedades ffsicas, metodos qrnmicos humedos, etc.
Obtencion de la huella del Carbono
Los productos a base de carbono producidos biologicamente, por ejemplo, etanol, acidos grasos, alcanos, isoprenoides, representan una nueva materia prima para los combustibles, tales como alcoholes, diesel y gasolina. Tales biocombustibles no han sido producidos a partir de biomasa, pero utilizan el CO2 como fuente de carbono. Estos nuevos combustibles se pueden distinguir de combustibles derivados de carbono petroqmmico sobre la base de la obtencion de la huella isotopica de carbono doble. Tales productos, derivados y mezclas de los mismos se pueden distinguir completamente de sus homologos derivados de productos petroqmmicos sobre la base de la identificacion isotopica de carbono doble y 14C (fM), indicando nuevas composiciones de materia.
Hay tres isotopos de origen natural del carbono: C, C y C. Estos isotopos aparecen en carbono total sobre el suelo en fracciones de 0.989, 0.011, y 10-12, respectivamente. Los isotopos 12C y 13C son estables, mientras que el 14C se degrada de forma natural a 14N, una parffcula beta, y un anti-neutrino en un proceso con una vida media de 5730 anos. El isotopo 14C se origina en la atmosfera, debido principalmente al bombardeo de neutrones de 14N provocado en ultima instancia por la radiacion cosmica. Debido a su vida media relativamente corta (en terminos geologicos), 14C aparece a niveles extremadamente bajos en el carbono fosil. Durante el transcurso de 1 millon de anos sin exposicion a la atmosfera, solamente 1 parte en 1050 seguira siendo 14C.
La relacion de 13C:12C vana ligeramente, pero de forma medible entre fuentes de carbono naturales. Generalmente estas diferencias se expresan como desviaciones de la relacion de 13C:12C en un material estandar. El estandar internacional para el carbono es el Pee Dee Belemnite, una forma de caliza hallada en Carolina del Sur, con una fraccion de 13C de 0.0112372. Para una fuente de carbono a, la desviacion de la relacion 13C:12C de la del Pee Dee 5 Belemnite se expresa como:
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8a = (Ra/Rs) - 1, donde Ra = relacion C: C en la fuente natural, y Rs = relacion C: C en el estandar de Pee Dee Belemnite.
Por conveniencia, 8a se expresa en partes por mil, o %%. Un valor negativo de 8a muestra una desviacion hacia 12C sobre 13C en comparacion con el Pee Dee Belemnite. La Tabla 1 muestra 8a y la fraccion de 14C para varias fuentes naturales 10 de carbono.
Tabla 1:
Variaciones de 13C:12C en las fuentes naturales de carbono
Fuente
-8a (%») Referencias
Carbon subterraneo
32.5 Farquhar et al.
Combustible fosil
26 Farquhar et al.
DIC* Oceanico
0-1.5 Goericke et al., Ivlev
CO2 Atmosferico
6-8 Ivlev, Farquhar et al.
DIC* de Agua dulce
6-14 Dettman et al.
Pee Dee Belemnite
0 Ivlev
* DIC = carbono inorganico disuelto
15 Los procesos biologicos a menudo discriminan entre los isotopos de carbono. La abundancia natural de 14C es muy pequena, y por lo tanto la discriminacion a favor o en contra 14C es diffcil de medir. La discriminacion biologica entre 13C y 12C, sin embargo, esta bien documentada. Para un producto biologico p, se pueden definir cantidades similares a las anteriores:
13 12 13 12
8p = (Rp/Rs) - 1, donde Rp = relacion C: C en el producto biologico, y Rs = relacion C: C en el estandar Pee Dee 20 Belemnite, el estandar.
La Tabla 2 muestra las desviaciones medidas en la relacion 13C:12C para algunos productos biologicos.
Tabla 2: variaciones 13C; 12C en productos biologicos seleccionados
Producto
-8p(%o) -D(%)* Referencias
Azucar/almidon vegetal de CO2 atmosferico
18-28 10-20 Ivlev
Biomasa de cianobacterias de DIC marino
18-31 16.5-31 Goericke et al., Sakata et al.
Lfpido de cianobacterias de DIC marino
39-40 37.5-40 Sakata et al.
Lfpidos de algas de DIC marino
17-28 15.5-28 Goericke et al., Abelseon et al.
Biomasa de algas de DIC de agua dulce
17-36 3-30 Marty et al.
Lfpido de E. coli a partir de azucar vegetal
15-27 casi 0 Monson et al.
Lfpidos de cianobacterias de carbono fosil
63.5-66 37.5-40 -
Biomasa de cianobacterias de carbono fosil
42.5-57 16.5-31 -
D = discriminacion por un proceso biologico en su utilizacion de |2C vs. |3C (vease el texto)
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La Tabla 2 presenta una nueva cantidad, D. Esta es la discriminacion por un proceso biologico en su utilizacion de 12C vs. 13C. Se define D de la siguiente manera: D = (Rp/Ra) -1.
Esta cantidad es muy similar a 8a y 8p, excepto que ahora se compara el producto biologico directamente con la fuente de carbono en lugar de con un estandar. Usando D, se pueden combinar los efectos de desviacion de una fuente de carbono y un proceso biologico para obtener la desviacion del producto biologico en comparacion con el estandar. Resolviendo para 8p, se obtiene: 8p = (D) (8a) + D + 8a, y, debido a que (D) (8a) es generalmente muy pequeno en comparacion con los otros terminos, 8p ° 8a + D.
Para un producto biologico que tiene un proceso de produccion con una D conocida, se puede estimar por lo tanto 8p sumando 8a y D. Se supone que D actua independientemente de la fuente de carbono.
Esto se ha realizado en la Tabla 2 para los lfpidos de cianobacterias y la biomasa producida a partir de carbono fosil. Como se muestra en las tablas anteriores, los productos de cianobacterias realizados de carbono fosil (en forma de, por ejemplo, gas de combustion u otras emisiones) tendran un 8p mas alto que el de los productos biologicos comparables realizados de otras fuentes, distinguiendolos sobre la base de la composicion de la materia a partir de estos otros productos biologicos. Ademas, cualquier producto derivado exclusivamente de carbono fosil tendra una fraccion insignificante de 14C, mientras que los productos elaborados a partir de carbono sobre el suelo tendran una fraccion 14C de aproximadamente 10-12.
De acuerdo con lo anterior, diversos productos a base de carbono de interes se pueden caracterizar como -8p (%<>) de aproximadamente 63.5 a aproximadamente 66 y -D (%) de aproximadamente 37.5 a aproximadamente 40.
Referencias
1. Goericke, R., Montoya, J.P., and Fry, B. Physiology of isotopic fractionation in algae and cyanobacteria. Chapter 9 in "Stable Isotopes in Ecology and Environmental Science”, By K. Lajtha and R. H. Michener, Blackwell Publishing, 1994.
2. Monson, K.D. and Hayes, J.M. Biosynthetic control of the natural abundance of carbon 13 at specific positions within fatty acids in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 255:11435-41 (1980).
3. Abelseon, P.H. and Hoering, T.C. Carbon isotope fractionation in formation of amino acids by photosynthetic organisms. Proc. Natl. Acad. Sci. 47:623-32 (1961).
4. Sakata, S., Hayes, J.M., McTaggart, A.R., Evans, R.A., Leckrone, K.J., and Togasaki, R.K. Carbon isotopic fractionation associated with lipid biosynthesis by a cyanobacterium: relevance for interpretation of biomarker records. Geochim. Cosmochim. Acta 61:5379-89 (1997).
5. Ivlev, A.A. Carbon isotope effects (13C/12C) in biological systems. Separation Sci. Technol. 36:1819-1914 (20010).
6. Farquhar, G. D., Ehleringer, J. R., and Hubick, K. T. Carbon isotope discrimination and photosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 40:503-37 (1989).
7. Marty, J. and Planas, D. Comparison of methods to determine algal ™13C in freshwater. Limnol. Oceanogr.: Methods 6:51-63 (2008).
8. Dettman, D.L., Reische, A.K., and K.C. Lohmann. Controls on the stable isotope composition of seasonal growth bands in aragonitic fresh-water bivalves (unionidae). Geochim. Cosmochim. Acta 63:1049-1057 (1999).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan en este documento con fines ilustrativos y no se pretende que sean restrictivos.
Ejemplo 1
Construccion de plasmidos para Synechococcus sp. PCC 7002
Construccion de pJB5: El plasmido base pJB5 se diseno como un vector de expresion vacfo para la recombinacion en Synechococcus sp. PCC 7002. Se disenaron dos regiones de homologfa, la region de homologfa en direccion 5' (UHR) y la region de homologfa en direccion 3' para flanquear la construccion. Estas regiones de 500 pb de homologfa se corresponden con las posiciones 3301-3800 y 3801-4300 (referencia de Genbank NC_005025) para UHR y DHR respectivamente. El promotor de aadA, secuencia genica y terminador se disenaron para conferir resistencia a estreptomicina y espectinomicina a la construccion integrada. Para la expresion, se diseno pJB5 con el promotor del casete de resistencia a kanamicina aph2 y el sitio de union a ribosomas (RBS). En direccion 3' de este promotor y RBS, se diseno e inserto el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restriccion para Ndel y EcoRI, asf como los sitios para Xhol, BamHI, SpeI y PacI. Despues del sitio EcoRI, se incluyo el terminador natural desde el gen del alcohol
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deshidrogenasa de Zymomonas mobilis (adhIl). Sitios de restriccion de xbal flanquean la UHR y la DHR permitiendo la escision del ADN que se pretende usar para recombinacion desde el resto del vector. Se construyo pJB5 por smtesis contractual de DNA2.0 (Menlo Park, CA).
Construccion de pJB5-PdcAdhII. Los genes de la piruvato descarboxilasa (pdc) y alcohol deshidrogenasa (adhll) se clonaron en el plasmido pJB5 con el siguiente procedimiento. Los genes pdc-adhll de Zymomonas mobilis (GenBank: DD161475, M15394) se disenaron con un sitio Ndel reemplazando el inicio de la region codificante de pdc. Despues del gen pdc, se disenaron dos sitios de endonucleasa de restriccion (Xhol y BamHI). A continuacion, se diseno la secuencia adhll completa posterior a los sitios de restriccion y finalmente se incluyo tambien el terminador de adhll natural, en direccion 3' de un sitio de EcoRl insertado. Esta construccion se construyo por smtesis contractual de DNA2.0 (Menlo Park, CA) y se inserto por digestion de restriccion con Ndel y EcoRl (New England Biolabs; Ipswitch, MA) tanto en pJB5 como el inserto seguido de ligacion con un kit Quick Ligation (New England Biolabs, Ipswitch, MA). La construccion ligada se transformo en la E. coli competente F'lq NEB 5-alfa (alta eficacia) (New England Biolabs: Ipswitch, MA).
pJB5-PdcAdhII (TS): Los genes de la piruvato descarboxilasa (pdc) desde Zymobacterpalmae (GenBank: AF474145) y la alcohol deshidrogenasa TS42 (adhll) como se describe en Rellos et al. (1998) “Thermostable variants of Zymomonas mobilis alcohol dehydrogenase obtained using PCR-mediated random mutagenesis” Protein Expr Purif 65 12:61-61) se clonaron en el plasmido pJB5 con el siguiente procedimiento. Estos genes se disenaron con un sitio Ndel reemplazando el inicio de la region codificante pdc. Despues del gen pdc y antes del gen adhll, esta presente una brecha que incluye los sitios Xhol y BamHI para permitir insertar promotores posteriormente (longitud total de la brecha: 39 pb) y el rBs original para adhll de Z. mobilis. El gen adhll (Z. mobilis) tiene el terminador original presente despues, en el que se ha situado un sitio de EcoRl entre el gen adhll y el terminador. Despues del terminador, estaban presentes los sitios Spel y Pacl para clonacion. Esta construccion se construyo por smtesis contractual de DNA2.0 (Menlo Park, CA) y se inserto por digestion de restriccion con Ndel y EcoRl (New England Biolabs; Ipswitch, MA) tanto en pJB5 como en el inserto seguido de ligacion con un kit Quick Ligation (New England Biolabs, Ipswitch, MA). La construccion ligada se transformo en la E. coli competente F'Iq NEB 5-alfa (alta eficacia) (New England Biolabs, Ipswitch, MA).
pJB5-Pdc: El gen de la piruvato descarboxilasa (pdc) se clono en el plasmido pJB5 con el siguiente procedimiento. La construccion de pJB5-PdcAdhII del Ejemplo 2 se digirio con BamHI y EcoRl (New England Biolabs; Ipswitch, MA). Los
salientes de ADN 5' y 3' incompatibles se retiraron utilizando el kit Quick Blunting (New England Biolabs, MA), y a
continuacion se ligaron utilizando el kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, Ma).
pJB5-AdhII: El gen del alcohol deshidrogenasa (adhll) se clono en el plasmido pJB5 con el siguiente procedimiento. La construccion de pJB5-PdcAdhII del Ejemplo 2 se digirio con Ndel y BamHI (New England Biolabs; Ipswitch, MA). Los
salientes de ADN 5' y 3' incompatibles se retiraron utilizando el kit Quick Blunting (New England Biolabs, MA) y a
continuacion se ligaron utilizando el kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, Ma)
pJB5-metE (E. coli): El gen de la metionina sintasa (metE) independiente de vitamina B12 de E. coli (GenBank: NP_418273.1), se clono en el plasmido pJB5 por el siguiente procedimiento. Se sintetizo una construccion por smtesis contractual por DNA2.0 (Menlo Park, CA) para incluir un sitio Ndel para reemplazar el inicio del gen metE, y un sitio EcoRl en el extremo del gen. Esta construccion se inserto por digestion de restriccion con Ndel y EcoRl (New England Biolabs; Ipswitch, MA) tanto en pJB5 como el inserto seguido de ligacion con un kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, MA). La construccion ligada se transformo en la E. coli competente F'Iq NEB 5-alfa (alta eficacia) (New England Biolabs: Ipswitch, MA).
pJB5-metE (T. elongatus BP-1): El gen de la metionina sintasa (metE) independiente de vitamina B12 de Thermosynechococcus elongatus BP-1 (GenBank: NP_681881), se clono en el plasmido pJB5 mediante el siguiente procedimiento. Una construccion se sintetizo por smtesis contractual por DNA2.0 (Menlo Park, CA) para incluir un sitio Ndel para reemplazar el inicio del gen metE, y un sitio EcoRl en el extremo del gen. Esta construccion se inserta por digestion de restriccion con Ndel y EcoRl (New England Biolabs; Ipswitch, MA) en tanto pJB5 como el inserto seguido por ligacion con un kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, MA). La construccion ligada se transformo en E. coli competente F'Iq NEB 5-alfa (alta eficacia) (New England Biolabs: Ipswitch, MA).
Ejemplo 2
Construccion del plasmido para Thermosynechococcus elongatus BP-1
Se selecciono Thermosynechococcus elongatus BP-1 como otro huesped de produccion de fijador de CO2 de ejemplo y se modifica por acidos nucleicos disenados por ingeniena genetica para suprimir funcionalmente ciertos genes y/o para expresar, sobreexpresar ciertos genes.
Se construyeron cuatro plasmidos (pJB518, pJB59, pJB20 y pJB21), todos derivados de pJB5, para permitir la recombinacion homologa en cuatro loci diferentes en el genoma de Thermosynechococcus elongatus BP-1. Espedficamente, las regiones de 0.5 kb de homologfa en direccion 5' (UH) y homologfa en direccion 3' (DH) usadas para recombinacion homologa de Synechococcus sp. PCC 7002 en pJB5 se reemplazaron por las siguientes regiones de aproximadamente 2,5 kb de T. elongatus BP-1 (referencia nC_004113): coordenadas 831908-834231 (UH) y 834232-836607 (DH) del genoma para pJB18, 454847-457252 (UH) y 457252-459740 (DH) para pJB19, 481310483712 (UH) y 483709-486109 (DH) para pJB20 y 787356-789654 (UH) y 791080-793494 (DH) para pJB21. Las
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primeras tres regiones de homologfa se basan en los sitios de integracion TS1, TS3 y TS4 descritos en Onai K. et al. (2004). “Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1: a simple and efficient method for gene transfer.” Mol. Gen. Genomics 271: 50-59. El ultimo se disena para suprimir completamente el marco de lectura abierto de glgA, que codifica glucogeno sintasa: El fin de esta delecion es minimizar el flujo de carbono fijado competitivo a glucogeno una vez que se han integrado los genes productores de etanol en el cromosoma.
Todas las regiones de homologfa de T. elongatus BP-1 se generaron por PCR utilizando ADN polimerasa Phusion™ Hot Start High-Fidelity (desarrollada y fabricada por Finnzymes Oy. Distribuida por New England Biolabs, Ipswitch, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cebador de PCR hacia UH tiene un sitio de restriccion Sbf 5'-terminal, el cebador de PCR inverso de UH, un sitio de restriccion Notl 5' terminal, el cebador de PCR hacia DH, un sitio de restriccion AscI 5'-terminal y el cebador de PCR inverso DH, un sitio de restriccion FseI 5'-terminal. Para pJB18, pJB59, pJB20 y pJB21, la region UH se inserta en primer lugar en pJB5 mediante digestion de restriccion con Sbfl y Notl (New England Biolabs, Ipswitch, MA) de tanto el vector como el inserto generado por PCR, seguido de un kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, MA). La construccion ligada se transforma en la E. coli competente NEB 5-alfa (alta eficacia) (New England Biolabs: Ipswitch, MA). La secuencia de la region UH en pHB5 se valida por secuenciacion contractual con GENEWIZ (South Plainfield, nJ). Para pJB18, pJB19, pJB20 y pJB21, la region DH se inserta despues en la construccion de region pJB5-UH exactamente como se ha realizado para la region UH, excepto que se usan las enzimas de restriccion AscI y FseI (New England Biolabs, Ipswitch, MA). Se confirma la secuencia de las regiones DH por secuenciacion contractual con GENEWIZ (South Plainfield, NJ).
En cada uno de pJB18, pJB19, pJB20 y pJB21, se clonan dos versiones diferentes de los operones de piruvato descarboxilasa (pdc) /alcohol deshidrogenasa (adhIl), creando un conjunto de ocho plasmidos listos para integracion en el genoma de T. elongatus BP-1. En cada caso, el marcador seleccionable es el gen aadA de pJB5 que codifica resistencia a espectinomicina y estreptomicina. La primera version del operon comprende los genes pdc y adhII desde Zymomonas mobilis (GenBank: DD161475, M15394) y se disena con un sitio NdeI que abarca el codon de partida de la secuencia codificante pdc. Despues del gen pdc en orden estan: un sitio de restriccion XhoI, un sitio de restriccion BamHI, la secuencia codificante adhII, el terminador de adhII de Zymomonas mobilis natural, y finalmente un sitio de restriccion EcoRI. La segunda version del operon, disenada para codificar versiones relativamente mas termoestables de piruvato descarboxilasa y alcohol deshidrogenasa, comprendfa el gen pdc desde Zymobacter palmae (GenBank: AF474145) y el mutante de adhII TS42 descrito en Rellos et al., Protein Expr. Purif., 12:61-61 (1998), y es identico de otro modo a la primera construccion en todas las otras formas. Ambas construcciones se realizan por smtesis contractual de DNA2.0 (Menlo Park, CA) y se insertan por digestion de restriccion con NdeI y EcoRI (New England Biolabs; Ipswitch, MA) en pJB18, pJB59, pJB20, y pJB21, seguido de ligacion con un kit Quick Ligation (New England Biolabs; Ipswitch, MA). De esta manera se construyen ocho plasmidos de operones pdc-adhII: pJB22, pJB23, pJB24 y pJB25 que conteman la version 1 del operon, basandose en pJB18, PJB19, pJB20 y pJB21, respectivamente, y pJB26, pJB27, pJB28 y pJB29 que contema la version 2 del operon, basandose en pJB18, pJB19, pJB20 y pJB21, respectivamente.
En los plasmidos pJB22, pJB23, pJB24, pJB25, pJB26, pJB27, pJB28 y pJB29, el operon pdc-adhII se expresa por el promotor PaphI constitutivo, que esta flanqueado por sitios de restriccion NotI y NdeI unicos. Estos sitios permiten clonar otros promotores constitutivos, en lugar del promotor PaphII, en caso de que ese promotor no proporcione suficiente expresion del operon cuando se integra en el genoma de T. elongatus BP-1. Se construyen plasmidos separados (pJB9, pJB10, pJB11, pJB12, pJB13, pJB14, pJB15, pJB16 y pJB17), todos realizados por smtesis contractual, por ejemplo, DNA2.0 (Menlo Park, CA), portando cada uno nueve promotores constitutivos alternativos candidatos flanqueados por sitios NotI y NdeI de modo que puedan reemplazar el promotor PaphII por metodos de clonacion convencionales. Siete de esos promotores son promotores de T. elongatus BP-1 nativos, correspondientes a la secuencia en direccion 5' de los siguientes genes: cpcC, apcA, tsr2142, psaA, rbcL, hsp33, y trnE_UUC y dos son promotores: E. coli-type Ptac (como se describe en De Boer et al., Proc Natl Acad USA 80:21-25 (1983)) y el promotor Pem7 sintetico.
Ejemplo 3
Microorganismos disenados geneticamente que producen etanol
Synechococcus sp. PCC 7002 modificado geneticamente: Cada una de las construcciones como se describe en el ejemplo 1 se integro en el genoma de Synechococcus sp. PCC 7002 utilizando el siguiente protocolo. Se cultivo Synechococcus 7002 durante 48 horas a partir de colonias en un matraz de agitacion incubado a 30 °C al 1% de CO2 hasta un OD730 de 1 en medio A+ descrito en Frigaard NU et al. (2004) "Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the Green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation" Methods Mol Biol 274:325-340. Se adicionaron 500 |iL de cultivo a un tubo de ensayo con 30 |iL de 1-5 |ig de ADN preparado a partir de un kit Qiagen Qiaprep Spin Miniprep (Valencia, CA) para cada construccion. Las celulas se incubaron burbujeando CO2 1 % a aproximadamente 1 burbuja cada 2 segundos durante 4 horas. Se sembraron 200 |il de celulas en placas de medio A+ con agarosa al 1.5 % y se cultivaron a 30 °C, durante dos dfas con luz baja. Se aplico como base 10 |ig/mL de espectinomicina en las placas. Las colonias resistentes fueron visibles en 7-10 dfas.
Construccion de cepas y expresion de AdhA de Moorella sp. HUC22-1: Se ha mostrado que la secuencia para AdHA de Moorella sp. HUC22-1 es un alcohol deshidrogenasa que utiliza NADP que tambien es termoestable y preferencial para
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40
la reduccion de acetaldehudo [Inokuma et al., Arch. Microbiol., 188:37-45 (2007)]. Aunque la secuencia no se ha publicado, la similitud de aminoacidos con AdhIV de Moorella thermoacetica (Numero de referencia: ABC20211) fue del 100 %. La secuencia de acido nucleico de AdhIV a partir de Moorella thermoacetica (Numero de referencia: CP000232) tuvo codones optimizados para la expresion y se construyo por DNA2.0 y se designo SEQ ID NO: 1 (el aminoacido codificado es sEq ID NO: 2). La secuencia esta flanqueada con CTCGAGTTGGATCC en el extremo 5', que codifica los sitios de restriccion Xho y BamHI, y en el extremo 3' con TTTCAAAACAGGAATTC en el extremo 3' (similar a pJB5-3) que contiene un sitio EcoRI para los fines de clonar en vectores de expresion.
A continuacion, se clono adhA de Moorella en direccion 3' de dos genes de piruvato descarboxilasa, uno desde Zymomonas mobilis (numero de referencia: AAV89984) y uno desde Zymobacter palmae (numero de referencia: AAM49566) para formar los plasmidos de expresion pJB136 y pJB133, respectivamente. Como controles, se construyeron plasmidos de expresion para el gen de la piruvato descarboxilasa de Z. mobilis con el gen adhII de Z. mobilis (numero de referencia: YP_163331) y el gen de piruvato descarboxilasa de Z. palmae con un adhII TS42 termotolerante mejorado [Rellos et al., Protein Expression and Purification, 12:61-66 (1998)] para formar pJB5-3 y pJB5- 4, respectivamente.
Los plasmidos pJB5-3, pJB5-4, pJB133, pJB136 se clonaron en Synechococcus sp. PCC 7002 (JCC1) utilizando procedimientos estandar y se designaron como JCC136, JCC137, JCC445, JCC446 respectivamente (Tabla 3).
Tab la 3
Hufisped
Construccion de inlegracion Piruvato descarboxilasa Alcohol deshidrogenasa
JCC136
PJB5-3 Z. mobilis pdc Z. mobihs adMl
JCC137
pJBEj-4 Z palmae pdc Z mobilis adhll TS42
JCC445
pjBm Z. palmae pdc Morelia adhA
JCC44&
pJB13€ Z- mobilis pdc Morelia adhA
JCC1, JCC136, JCC137, JCC445, JCC446 se cultivaron en placas con medio A+ (agar al 1.5 %) con espectinomicina 100 |ig/mL para cepas transgenicas. Se cultivo una unica colonia en 10 mL de A+ con espectinomicina 100 |ig/mL en un tubo de ensayo sumergido en un bano a 37 °C con CO2 al 1 % introducido por burbujeo. Los cultivos se dejaron crecer hasta DO730 nm 5.0 o mayor (Molecular Devices Spectramax M2e; previamente se determino que un DO730 nm de 1 es igual a ~0.3 g de CDW), y despues se sedimento por centrifugacion (21,000 RCF, 20 °C, 5 minutos), se vuelve a suspender en medio A+ nuevo hasta la concentracion original, y despues se vuelve a diluir de forma apropiada hasta DO730 nm 0.2 en 25 mL de A+ en un matraz de agitacion de 125 mL con deflectores. Se tomo aproximadamente 1 mL de cultivo para cada punto temporal (0, 6, 24, 48, 72 horas despues de dilucion; el punto temporal de 6 horas no se representa por razones de espaciado temporal), se registro el DO730 nm (diluido de forma apropiada para proporcionar una lectura entre 0.04 y 0.4, que se determino previamente que era el intervalo mas preciso en el Spectramax M2e). Inmediatamente las muestras se sedimentaron por centrifugacion a 4 °C durante 10 minutos a 21,000 RCF. El sobrenadante se coloco en un nuevo tubo, y se congelo a -80 °C hasta que estuvo listo para su analisis.
El sobrenadante de cada punto temporal se analizo con respecto a etanol y acetaldehfdo mediante el uso de un cromatografo de gases Agilent 7890 equipado con un analizador de espacio de cabeza y un detector de ionizacion de llama (Agilent) utilizando un J & W Scientific DB-ALC1 (numero de catalogo: 123-9134; longitud: 30 m, diametro interno, 0.320 mm, espesor de la pelfcula: 1.80 |im). Se sometieron 100 |iL de cada muestra se sometio a analisis de espacio de cabeza. Se midieron los controles con A+ solo, asf como la dilucion en serie de estandares para etanol y acetaldehfdo obtenidos de Sigma para obtener una curva de calibracion.
Para medir las densidades opticas, concentraciones de etanol y acetaldehfdo, los cultivos se diluyeron otra vez desde una DO730nm 5 o mayor a una DO730nm de partida y los puntos temporales se tomaron a las 0, 24, 48, y 72 horas despues de la dilucion.
Se muestran las densidades opticas de cultivos de Synechococcus sp. de tipo salvaje y diversos transgenicos (Figura 5). La grafica muestra representaciones de mediciones de DO730nm en cada punto temporal. Las mediciones de DO resultantes se muestran en la Tabla 4.
imagen1
Las concentraciones de etanol de cultivos en el sobrenadante se representan mostrando el aumento de las concentraciones de etanol con respecto al tiempo en diversos cultivos de especies de Synechococcus transgenicas (Figura 6). Notablemente, se midio mayor concentracion de etanol en JCC445, la cepa transformada con adHA de 5 Moorella a las 72 horas (Tabla 5).
Tabla 5
EtOH (mg/L)
0 24 46 72
JCC1
0 0 1.704726 5.830188
JCC136
0 63,00976 140,7334 252,8226
JCC137
0 72.02925 137.0422 256,4378
JCC445
0 14,03474 153,5205 296,761
JCC446
0 16,06255 125,6418 249.6592
Adicionalmente, se observaron concentraciones de acetaldehfdo reducidas en diversos puntos temporales en las cepas transformadas con adhA de Moorella (Figura 7 y Tabla 6).
imagen2
10 En los puntos temporales posteriores, las cepas transformadas con adhA de Moorella (JCC445 y JCC446) muestran aumentos notables en la relacion de etanol y acetaldehfdo en comparacion con las alcohol deshidrogenasas basadas en Z. mobilis como se muestra en los cultivos a lo largo del tiempo (Figura 8 y Tabla 7).
Tab la 7
EtOH/Acetal deli Ido
0 24 48 72
JCC1
WD N/D 4,144204 16,20655
JCC136
N/D 4,436656 4,026287 6,927526
JCC137
WD 3,637479 3,801316 7,155373
JOC445
N/D 1.484226 14,18532 21.85348
JCC446
N/D 1,919491 13,85137 20,26414
La Figura 9 representa relaciones de etanol y DO730nm de los cultivos a lo largo del tiempo. Se representan las relaciones de concentracion de etanol y DO730nm en el sobrenadante en cada punto temporal. La relacion de las cepas transformadas con adh de Z. mobilis (JCC136 y JCC137) llega rapidamente a un estado estacionario mientras que la 5 relacion de las cepas transformadas con construcciones de adhA de Moorella (JCC445 y JCC446) aumenta a lo largo del tiempo (Tabla 8).
Tab la 8
EtOH/DO (mg/L/DO)
0 24 48 72
JCC1
0 0 0,299075 0,502197
JCC136
0 27,88043 27,81293 33,26613
JCC137
0 31.80099 27.29924 32.05472
JCC445
0 9,233379 36,90395 46.73402
JCC446
0 9.393303 27.79687 35,92218
Thermosynechococcus elongatus BP-1 modificado geneticamente: A partir del Ejemplo 2, se integran pJB22, pJB23, pJB24, pJB25, pJB26, pJB27, pJB28 y pJB29 en el cromosoma de T. elongatus BP-1 por recombinacion homologa 10 utilizando el metodo de transformacion detallado en Onai K. et al (2004). "Natural transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1: a simple and efficient method for gene transfer." Mol. Gen. Genomics 271: 50-59. Los antibioticos de seleccion utilizados son espectinomicina mas estreptomicina.
Ejemplo 4
Produccion de etanol mejorada
15 Este ejemplo provee una ilustracion de como la produccion de etanol en un organismo disenado geneticamente se puede mejorar y hacer mas eficiente modificando los niveles de expresion y/o identidad de las enzimas implicadas en la produccion de etanol. Espedficamente, se construyo una serie de plasmidos dirigidos pAQ7 Aldh que contienen genes de alcohol deshidrogenasa (adh) de Moorella bajo el control de diferentes promotores de fuerza. Estos plasmidos se transformaron en JCC445 (vease Tabla 5) y las cepas resultantes se examinaron para la produccion de etanol. La 20 transformacion de JCC445 por varios plasmidos diferentes se muestra para mejorar la produccion de etanol, pero solo un modelo, PcI_adhAM, resulto en el aumento de los niveles de etanol, acompanado por una disminucion concomitante en los niveles de acetaldehfdo.
Construccion de la cepa:
Tabla 27
Cepa
huesped + plasmido (pAQ7-derivado)
JCC445 + 773
JCC445 + 773 Aldh_kan_PaphN_adhAM
JCC445 + 782
JCC445 + 782 Aldh_kan_PcI_adhAM
5
10
15
20
25
30
35
(aka JCC1005)
(SEQ ID NO: 27)
Cuatro |ig de ADN del plasmido se digirio con Xmal y se utilizo para transformar 400 |iL de JCC445 (OD730 = 1.15) utilizando el protocolo de transformacion descrito en este documento. La mezcla de transformacion total se extendio sobre placas de A + agar y se incubo a 37 °C (~ 50|iE) en el aire. Despues de 24 horas, las placas se subplantaron con kanamicina a una concentracion final de 50 |ig/mL y se incubaron como anteriormente. Despues de 5 dfas de crecimiento base se disminuyo y comenzaron a ser visibles las colonias de KmR, momento en el cual las placas se transfirieron a 37 °C (~ 50uE) + 1% de CO2. Despues de 3 dfas, dos colonias de KmR de cada transformacion se sembraron en placas de A+Km5 Sp100 agar para aislamiento de colonias individuales. Las placas sembradas por estnas se incubaron durante 4 dfas a 37°C (~ 50|iE) en el aire y luego fueron transferidas a 37C (~ 50|i E) + CO2 al 1% durante 3 dfas mas.
Etanol por lotes en matraces: Una sola colonia de un clon desde la placa sembrada por estnas original a partir de cada transformacion se inoculo en 5 mL de A +Km50SP100 caldo en un tubo de cultivo de plastico con tapon de 16 mM x 150 mM y se incubaron en la incubadora Infors (37C, 150 rpm, 2% de CO2) en un angulo de ~60° Despues de 3 dfas, los cultivos se transfirieron a matraces Erlenmeyer de 125 mL de conectado a espuma que contiene 30 mL JB2.1Km50SP100 a un DO730 = ~ 0.1. El peso inicial de cada cultivo en matraz se determino de manera que dH2O esteril podna ser adicionada en tiempos de muestreo para tener en cuenta la evaporacion. En cada punto de muestreo, se eliminaron 300 |iL del cultivo y los cultivos se repoman con una cantidad igual de medio JB2.1 fresco. En intervalos de aproximadamente 24 horas, se tomaron muestras para las determinaciones de velocidad de crecimiento y del etanol/acetaldelddo. Las mediciones de OD730 y las curvas de crecimiento derivadas se muestran la figura 10. Los niveles de etanol y acetaldehfdo en el medio se determinaron como se describe en este documento y los datos se presentan en la figura 11 y la figura 12, respectivamente.
Como se puede ver en las figuras, los niveles de etanol fueron mas altos en JCC445 + 782, donde adhAM adicional se expresa bajo el control del promotor lambda cl. Los niveles acumulativos de etanol producidos por esta cepa fueron de aproximadamente 4 g/L. En cualquier momento dado, los niveles medidos de etanol fueron sustancialmente mas altos que los medidos en JC445 o JCC445 + 773, en algunos casos, casi dos veces mas altos. Ademas, la misma cepa produce solo el 50% (o menos) acetaldelddo en comparacion con JC445 o JCC445 + 773 (que expresa adhAM bajo el control del promotor Paphll). Por lo tanto, este ejemplo demuestra no solo los niveles de etanol mejorados y los niveles reducidos de productos intermedios toxicos pueden ser el resultado a partir de alteraciones a los promotores que controlan la expresion de adhAM, sino que tambien provee un ejemplo espedfico de una cianobacteria disenada geneticamente (JCC445 + 773) con mejoradas capacidades de produccion de etanol.
Listado informal de secuencias
SEQ ID NO: 1
Gen de adhA de Moorella con codon optimizado
ATGTGGGAA ACTAAGATTA ATATC A AOG AAGTOCGTGAG ATCCGCGCG AAA ACC ACCGTTT ACTTTG G
1GTTGGTGCTATC A AG A AAATTG ATG AT ATCGCTCGOG A( rTTCAA AC i A AAAACiGTTACG ATOGC ATC A
TCGTt i AT C ACCGGT AA AGGCGCTTAC AAAGCG ACCGGTGC ATGGG AAT AC ATCGT GCCT GCTGTGAAC
AAAAACCAGATTACGTATATCCATTATGATCAGGTGACCCCGAACCCGACCGTAGATCAGGTTGACGA
AGCGACCAAACAGGCCCOTGAATTTGGCGCTCGCGCAGTACTGGCTATTGGTGGCGCTrCCCCGATCG
ACGCAGCC A AATCT GTGGCGGTGCT GCT GTCTTATCCGG AC AAAAACGCTCGT C AGCT GTACCAGCTG
GAGTTTACC C OGGTAAAA GCAGCGCCGATC ATCGCCATGAACCTG ACCC ACG GTACGGGCACCGAAGC
GGACCGCTTCGCGGTTGTATCTATGCCGGAGAAGGCCTACAAACCGGCTATCGCTTACGATTGCATCT
ACCCGCTGTACTCTATTGACGACCCGGCTCTGATGGTTAAACTGCCGAGCGACCAGACGGCGTACGTT
AGCGTGGATGCCCTGAACCA7GTTGTTGAAGCTGCGACCTCCAAAGTTGCATCTCCGTACACTATTATC
CTGGCAAAAGAAACGGTCCGTGTCATCGCACGCTACCTGCCTCAGGCCCTGTCTCACCCrGCAGACCT
GAGCGCGCGTTATTACCTCCTGTATGCCTCTCTGATCGOCGGTATTGCGrrTGATAACGGCCTGCTGCA
TTTCACCCACGCACTGGAACACCCGCTOTCTGCCGTGAAACCrGAACrGGCTCATGGCCrGGGTCTGG
GTATGCTCCTGCCTGCGGTAGTTAAj\CAAATTTATCCGG CTACCCCGGAGGTA CTG GCGGAAATCCTG
GA ACC AATCGT ACCGGATCTG A A AGGCGTTCCGGGCG AGGCTG AG A AAGCGGCGTCTGGCGTGGCG A AATGGCTGGCTGGT GC AGGC ATC ACTATG A A ACTG AA AG ACG CGGGTTT CCAGGCTG A AG ATATCGCG OGTCTGACCGACCTGGCCTTCACCACTOCATCCCTGGAACTCCTCjCTGTCTATGGCACCAGTAACTCiCT GATCGTGAGOGTGTGAAAGCAATTTACCAGGACGCATTTTCtA
SEQ ID NO: 2
Secuencia de aminoacidos de Moorella sp. HUC22-1 y Moorella thermoacetica
M W ETKININt VRBiRAKTTV YFG VG AIKKTDDTA RFFKEKG YDRTTVITGKGA YK ATXj A WRYTVPA LKKKQF TYHYDQVrPNPTVDQVDFATKQAREFGARAVLAKjGGSPIDAAKSVAVLLSYPDKNARQLYQLEFTFVK. AA PUMNLTHGTGT E ADRPAW SIPEKAY KPALAYDCIYPLY SIDD PAL M VKLPSDQTA YVS VD ALM IVV E A ATS K.V AS P YTHL A KETVRLIAR Y LPOA LSHPA DLTARY YLL Y ASLIAG1AFDNGLLHFTHALEHPLS AYKP ELAHGLGLGMLLPA V VKQ J Y P ATPEVL AEILEPIVPD LKGVPGE AF KAASGVAK WL AG AGTTMK LK D AGF QAED1ARLTDL AETTPSLELLLSMA PVT A DRER VK AT YQD AF
SEQ ID NO: 27
Secuencia en direccion 5' de adhAM en JCC782
5 Secuencia del promotor lambda cl aparece en letras minusculas claras; A mayuscula es el sitio de inicio de la transcripcion; secuencia en cursiva es secuencia UTR 5' rbcL a partir de PCC7002; letras subrayadas, mayusculas indican primer codon en el gen
taacaccgtgcgtgttgactattttacctctggcggtgataatggttgcAggatccttttgctggaggaaaaccatATG

Claims (18)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para la produccion biogenica de etanol, que comprende: cultivar una cianobacteria disenada geneticamente en un medio de cultivo en la presencia de luz y CO2, en donde dicha cianobacteria comprende un gen de la piruvato descarboxilasa recombinante y al menos dos copias de un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde al menos un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante es extracromosomico.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la expresion del alcohol deshidrogenasa es impulsada por los promotores en al menos dos plasmidos diferentes.
  4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los niveles de actividad del alcohol deshidrogenasa expresada recombinantemente y piruvato descarboxilasa en dicha cianobacteria son variados por la expresion diferencial.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en donde dicha expresion diferencial se logra mediante la modulacion de la fuerza de un promotor que controla la expresion de alcohol deshidrogenasa o piruvato descarboxilasa.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la expresion de al menos una copia de dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante, es impulsado por un promotor cl lambda.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde dicha cianobacteria es una cianobacteria termofila.
  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante codifica una Moorella sp. HUC22-1 adhA.
  9. 9. Una cianobacteria disenada geneticamente, que comprende un gen de la piruvato descarboxilasa recombinante y al menos dos copias de un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante que codifica un alcohol deshidrogenasa dependiente de NADPH.
  10. 10. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 9, en donde al menos un gen del alcohol deshidrogenasa recombinante es extracromosomico.
  11. 11. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en donde la expresion del alcohol deshidrogenasa es impulsada por los promotores en al menos dos plasmidos diferentes.
  12. 12. La cianobacteria disenada geneticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde los niveles de actividad del alcohol deshidrogenasa expresada recombinantemente y la piruvato descarboxilasa en dicha cianobacteria son variados por la expresion diferencial.
  13. 13. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 12, en donde dicha expresion diferencial se logra mediante la modulacion de la fuerza de un promotor que controla la expresion del alcohol deshidrogenasa o la piruvato descarboxilasa.
  14. 14. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 9, en donde la expresion de al menos una copia de dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante es impulsada por un promotor cl lambda.
  15. 15. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 9, en donde dicha cianobacteria carece de un gen de la lactato deshidrogenasa de funcionamiento o actividad de la enzima lactato deshidrogenasa.
  16. 16. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 9, en donde dicha cianobacteria es un termofilo o una cepa de Synechococcus.
  17. 17. La cianobacteria disenada geneticamente de la reivindicacion 16, en donde dicha cianobacteria es una cianobacteria termofila.
  18. 18. La cianobacteria disenada geneticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, en donde dicho gen del alcohol deshidrogenasa recombinante codifica una Moorella sp. HUC22-1 adhA.
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