KR940011838B1 - 유전자 조작 미생물 발효에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 - Google Patents

유전자 조작 미생물 발효에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 Download PDF

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Abstract

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Description

유전자 조작 미생물 발효에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법
제1도는 에쉬리시아 콜리(Escherichia coli)에 있어서 방향족 아미노산의 생합성 경로 및 조절 기작을 나타낸 것이며,
제2도는 본 발명의 재조합 플라스미드 pMW16의 제조 공정도 및 제한효소 부위도를 나타낸 것이다.
본 발명은 유전자 재조합 기술에 의하여 L-페닐알라닌 생합성에 관여하는 유전자가 재조합된 플라스미드를 함유한 새로운 에쉬리시아 콜리(Escherichia coli)를 배양하여 L-페닐알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다.
L-페닐알라닌은 필수 아미노산의 일종으로 주로 의약품 원료 및 저칼로리 감미료인 아스파탐의 원료로 사용되고, 일부 식품의 첨가제로도 사용되는 물질이다.
종래의 미생물에 의한 L-페닐알라닌 제조방법으로는 고전적인 돌연변이 방법을 이용한 브레비박테리움(Brevibacterium)속 혹은 코리네박테리움(Corynebacterium)속의 타이로신 변이주에 의한 방법(일본특허공개 37-6345, 60-160890). 에쉬리시아 콜리(Esherichia coli)의 타이로신 요구성 및 트립토판 아날로그 내성을 갖는 변이주에 의한 방법(일본특허공개 55-165797), 타이로신 및 트립토판 영양 요구성 복귀변이주이면서 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 아날로그에 대해 내성을 갖는 변이주에 의한 방법(한국특허공개 88-11331, 88-11332)등이 알려져 있으나, 이들 방법은 모두 L-페닐알라닌 생산성이 비교적 낮은 결점을 갖는다.
또한, 유전자 재조합 기술을 이용하여 에쉬리시아 콜리에서 L-페닐알라닌 생합성 관련 유전자를 증폭 및 조절한 재조합 미생물에 의한 방법(한국특허공보 89-3682, 89-3714)이 알려져 있으나, 이들 방법 역시 L-페닐알라닌의 생산성이 낮은 단점을 갖는다. 따라서 세포안에서 생합성 관련 유전자들의 발현을 최적화하여 L-페닐알라닌의 생산성을 향상시킨 새로운 우수한 균주의 개발이 요구 되어왔다.
본 발명자들은 이러한 상황하에서 유전자 재조합 기술을 이용하여 생합성관련 유전자의 발현이 증가된 L-페닐알라닌의 생산성이 우수한 새로운 균주를 개발하고자 연구한 결과 본원 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본원발명의 목적은 유전자 재조합 기술에 의해 재조합된, 코리스메이트 뮤타아제 p-프리페네이트 디히드라타제를 코딩하는 pheA유전자, 3-데옥시-D-아리비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제를 코딩하는 aroF, 이들 두 유전자의 발현을 위한 두개의 프로모터 및 온도 감수성 리프레서 유전자를 함유하는 새로운 플라스미드 pMW16을 제공하는 것이다.
본원 발명의 다른 목적은 상기 플라스미드 pMW16에 의해 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 것이다.
본원 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환주를 배양하므로써 L-페닐알라닌을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이하 본원 발명을 상세히 설명한다.
제1도에서 볼 수 있는 바와같이 대장균에서의 L-페닐알라닌의 생합성은 2개의 효소 반응에 의해 엄밀한 제어를 받는 것으로 알려져 있다. 그 하나는 pheA 유전자에 의해 코딩되는 코리스메이트 뮤타아제 P-프리페네이트 디하이드라타아제(chorismate mutase P-prephenate dehydratase)가 촉매하는 반응이고, 다른 하나는 aroF, aroG 및 aroH 유전자에 코딩되는 3가지 동종효소(isozyme)인 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase, 이하 DAHP 신타아제라 한다)가 촉매하는 반응이다. 상기 pheA 유전자와 aroF 유전자는 염색체 DNA상에서 각각 독립적으로 전사된다고 알려져 있다.
본 발명은 상술한 바와 같이 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 유전자인 aroF와 pheA의 발현을 최대로 증가시키기 위해 강력한 프로모터의 하나로 알려진 λ파아지의 PL프로모터를 각각의 유전자에 연결시킨 후 유전자 발현을 조절하기 위해 온도 감수성 리프레서(repressor)를 사용하였다.
본 발명에 따라 제공되는 재조합 플라스미드의 제작공정 및 제한효소 부위도는 제2도와 같다. 본 발명의 플라스미드 제작방법에서 사용한 유전자 조작 방법은 주로 Molecular Cloning a Laboratory Manual(T. Maniatis et al.) 및 Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. Ausubel et al.)의 방법에 준하여 실시하였다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나, 본원 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
플라스미드 pMW16의 제작
(1) pMW12의 선형화
pheA 및 aroF-tyrA 유전자가 재조합된 플라스미드 pMW 12(한국특허공고 89-3714)를 제한효소 EcoRV를 이용하여 제한효소 완충액[50mM NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레톨]에서 37℃, 16시간 절단했다.
절단된 DNA를 페놀-클로로포름 혼합 용액으로 처리하고 에탄올로 침전시켜 선형 DNA를 얻었다. 이 선형 DNA를 송아지 장 알칼리 포스파타아제(calf intestinal alkaline phosphatase(CIP))로 처리하여, 5'-말단의 인산기를 제거해서 선형 pMW12가 자기폐환(self-ligation)되는 것을 방지하였다.
(2) PL프로모터 단편의 수득
PL프로모터 단편을 얻기위해 플라스미드 pPLc2833을 제한효소 HaeII 및 BamHI으로 절단하고, 저융점 이가로스 겔상에서 전기영동하여 0.26Kb PL단편을 회수하고 정제하였다. 점착성 말단(cohesive end)을 갖는 0.26Kb PL단편을 반응액[50mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM MgCl2, 5mM 디티오트레톨, 50ug/ml소혈청 알부민(BSA), 100uM dATP, 100uM dGTP, 100μM dCTP, 100uM dTTP]에서 DNA중합효소인 T4 DNA 폴리머라제로 11℃, 20분간 처리하여 블런트 말단(blunt end)을 만들었다.
(3) pMW14의 제작
상기 (1)에서 얻은 5'-말단의 인산기가 제거된 선형 pMW12와 상기(2)에서 얻은 블런트 말단화된 PL단편을 1 : 3 비율로 혼합한 후 T4 DNA 리가아제로 16℃, 16시간 처리하여 결합시켰다. 결합된 재조합 플라스미드를 pheA 유전자가 결손된 페닐알라닌 영양 요구성 변이주 MWEC203-7주에 통상의 염화칼슘 방법에 따라 형질전환시키고 가나마이신(Kanamycin) 50ug/ml을 첨가한 MM한천배지[포도당 10g, 황산암모늄 4g, 제1인산칼륨 2g, 티아민염산염 1mg, 푸마르산 0.5g, 한천 20g, 증류수 1l, pH7.4]상에서 배양하고, 생육한 균체중에서 플라스미드 검색을 통해 pMW12보다 크기가 0.26Kb 큰 재조합 플라스미드 pMW14를 분리하였다.
(4) pMW15의 제작
온도에 의해 재조합 유전자의 발현을 조절하기 위해 온도 감수성 억제체인 CI857유전자를 함유한 플라스미드 pMK5를 제한효소 BglII로 절단하여 0.9% 이가로스 겔상에서 0.9Kb DNA 단편을 회수하고 T4 DNA 폴리머라제를 처리하여 블런트 말단을 만들었다. aroF 유전자 앞에 PL프로모터가 결합된 상기(3)의 pMW14를 DraIII로 절단하고 CIP 처리하여 5'-말단의 인산기를 제거한후 CI857유전자 단편과 혼합하고 T4 DNA리가아제를 이용하여 두 단편을 블런트 말단 결찰 시켰다. 결찰된 단편을 에쉬리시아 콜리 HB101주에 형질 전환하여 pMW14보다 0.9Kb 큰 플라스미드 pMW15를 얻었다.
(5) pMW16의 제작
분리한 플라스미드 pMW15를 BamHI, Bg-1 II로 절단하고 T4 DNA리가아제로 처리하여 tryA 유전자의 일부인 0.7Kb 단편이 제거된 pMW16을 만들었다.
이 재조합 플라스미드 pMW16은 온도 감수성 타이로신 누수(leaky)주인 에쉬리시아 콜리 MWWJ304(KFCC 10737, 1991년 8월 30일 KFCC기탁)에 형질전환하여 50ug/ml 가나마이신이 포함된 한천배지에 도말후 37℃, 24시간 배양하여 생육한 균주중 DAHP 신타아제 활성이 증가되고, L-페닐알라닌 생산성이 우수한 균주 MWPWJ304를 스크리닝 하였다.
본 발명이 균주 에쉬리시아 콜리 MWPWJ304는 1991년 8월 30일자로 한국종균협회(KFCC)에 기탁되어 KFCC 10738에 수탁번호를 받았다.
[실험예 1]
본원 발명 균주의 생리적 특성을 조사한 결과 재조합 플라스미드의 수용균주인 MWWJ304주에 비해 생육 및 L-페닐알라닌 생산성에 필요한 타이로신이 좀더 요구되었으나, 그외 다른 성질들은 동일하였다.
DAHP신타아제의 활성도 및 배양 온도에 따른 L-페닐알라닌 생산성 변화는 표1 및 표2와 같다.
[표 1]
DAHP 신타아제 효소 활성도 비교
측정방법은 I. Shiio et al.[Journal of Biochemistry, 75,987~997,1974]변형방법으로 하였으며 활성도는 MWPEC 13-60(KAIST, KCTC 8337 P)주의 값에 대한 상대치로 표현하였다. 배양배지에 L-타이로신을 각각 100mg/l씩 첨가하여 MWWJ 304 및 MWPWJ304주를 배양하였다.
[표 2]
배양온도에 따른 L-페닐알라닌 생산성(g/l)
배양방법은 각 온도별로 실시예 3의 방법으로 행하였으며 MWWJ304주의 배양시 L-타이로신 200mg/l를 첨가하였다.
[실시예 2]
L-페닐알라닌의 생산
<배지조성>
종배지 : 포도당 3%, 트립톤 1%, 효모액기스 1%, 염화나트륨 0.1%, 가나마이신 10mg/l, pH 7.0
발효배지 : 포도당 6%, 황산칼륨 0.04%, 유안 2%, 구연산나트륨 0.05%, 푸마르산 0.05%, 염화마그네슘 0.08%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 효모액기스 0.1%, 글루타민산 0.05%, 염화코발트 0.1mg/l, 황산아연 1mg/l, 염화망간 2mg/l, 염화칼슘 5mg/l, 염화철 20mg/l, L-타이로신 300mg/l, 티아민산염 5mg/l, 니코틴산 10mg/l, pH 7.0
상기 종배지 40ml을 500ml 진탕플라스크에 분주하여 120℃, 20분간 가압 멸균한 후 실시예 1에서 얻은 본 발명균주 MWPWJ304를 접종하고 37℃에서 16시간 진탕배양하여 종균 배양액으로 하였다. 발효배지를 상기 동일조건으로 준비한 후 탄산칼슘 3.5%를 별도 멸균첨가하여 위의 종균 배양액 2ml을 무균적으로 접종하여 37℃에서 36시간 진탕 배양하였다. 배양완료 후 배양액중의 L-페닐알라닌 축적량은 16.2g/l이였다.
[실시예 3]
L-페닐알라닌의 생산
발효배지 : L-타이로신 400mg/l의 실시예 2의 배지
배양방법 : 발효배지를 2L소형 발효조에 1L삽입하여 120℃에서 15분간 가압 멸균후 실시예 2에서와 같이 미리 준비한 종균 배양액 50ml을 접종하고 1000rpm, 1.0vvm, 조건으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양중의 pH는 암모니아수로 7.0으로 조절하였으며 60%포도당액을 잔당 1%일 때 3회 추가하였다. 발효에 사용된 총 당량은 185g/l였으며 이때 L-페닐알라닌 축적량은 50.8g/l였다. 배양액 1L를 통상의 방법에 따라 이온교환 수지에 흡착시킨 후 용리시켜 농축 후 L-페닐알라닌 조결정 45.7g/l를 얻었다.
[실시예 4]
L-페닐알라닌의 생산
50L발효조에 실시예 3과 동일한 방법으로 발효배지 27L를 삽입 멸균한 후 종배양액 1.3L를 접종하여 450rpm, 1.0vvm조건으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양중 pH는 암모니아를 사용하여 7.0으로 조절하였으며 60%포도당액을 잔당 1%일때 3회 추가하였다. 발효에 사용된 총 당량은 180g/l였으며 이때 L-페닐알라닌 축적량은 49.1g/l였다.

Claims (6)

  1. 코리스메이트 뮤타아제 p-프리페네이트 디히드라타제를 코딩하는 pheA 유전자, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제를 코딩하는 aroF, 이들 두 유전자의 발현을 위한 두개의 프로모터 및 온도 감수성 리프레서 유전자를 함유하는 플라스미드에 의해 형질전환된 재조합 세포를 배지에서 배양하여 L-페닐알라닌을 생산 축적하고, 배양액으로부터 L-페닐알라닌을 회수함을 특징으로 하는 L-페닐알라닌의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 형질전환된 재조합 세포는 에쉬리시아 콜리(Escherichia coli) MWPWJ304(KFCC 10738)임을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 프로모터는 PL프로모터임을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 온도 감수성 리프레서는 CI857리프레서임을 특징으로 하는 방법.
  5. 코리스메이트 뮤타아제 p-프리퍼네이트 디히드라타제를 코딩하는 pheA 유전자, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제를 코딩하는 aroF, 이들 두 유전자의 발현을 위한 두개의 프로모터 및 온도 감수성 리프레서 유전자를 함유함을 특징으로 하는 플라스미드 pMW16.
  6. 플라스미드 PMW16에 의해 형질전환된 것임을 특징으로 하는 재조합 세포.
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