KR890003682B1 - 유전자조작 미생물에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 - Google Patents

유전자조작 미생물에 의한 l-페닐알라닌의 제조방법 Download PDF

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Abstract

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Description

유전자조작 미생물에 의한 L-페닐알라닌의 제조방법
제1도는 에쉐리시아콜리에 있어서 방향족아미노산의 생합성경로 및 조절기전을 나타낸 것이며,
제2도는 본 발명의 재조합유전자 pMW 12 제조공정도 및 제한 효소 부위도를나타낸 것이다.
본 발명은 L-페닐알라닌의 생합성에 관여하는 유전자가 재조합된 새로운 미생물에 의해서 통상의 배양방법으로 L-페닐알라닌을 제조하는 방법에 관한 것이다. L-페닐알라닌은 필수 아미노산의 일종으로 의약품 혹은 저칼로리 감미료인 아스파탐의 합성원료로 사용되는 물질이다.
종래 L-페닐알라닌 제조방법으로는 브레비박테리움 혹은 코리네박테리움 속 미생물의 타이로신 요구성 변이주에 의한 벙법(일특 공개 37-6345, 60-160890)과 에쉐리시아콜리의 타이로신 요구성에 트립토판 아나로그 내성 변이주에 의한 방법(일특 공개 55-165797)등이 있다.
그러나 이들 방법은 대부분 L-페닐알라닌 생산수율이 대단히 낮다.
따라서 본 발명자들은 종래 이들 미생물보다 생산성이 우수한 균주를 발명하기 위하여 최근 균주개량에 많이 사용되는 유전자 재조합 기술을 이용하여 연구하여 오던중 본 발명을 완성하게 되었다.
본원발명에서 사용한 유전자 조작방법은 제1도에서 볼 수 있는 바와같이 L-페닐알라닌의 생산은 대장균세포내에서 2개의 효소반응에 의해서 엄밀한 제어를 받는 것으로 알려져 있다. 그 하나는 pheA유전자로 코드되는 코리스메이트 뮤타아제 P-프리페네이트 디하이드라타아제(Chorismate mutase p-prephenate dehydratase)가 촉매하는 반응이고, 다른 하나는 argG 유전자로 코드되는 3-디옥시-D-아라비노-햅툴로소네이트-7-포스페이트 신타아제(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase)가 촉매하는 반응이다.
이 DAHP 신타아제(synthase)는 3가지 동종효소(isoensyme)로 구성되고 aro F 및 aro H 유전자로 코드된다. 본 발명은 상술한바와 같이 L-페닐알라닌 생합성에 중요한 aro F-tyr A 및 phe A 유전자를 페닐알라닌 생합성 대사조절이 잘 해제된 변이주 MWEC 101-5(KAIST KTCT 8234 P)주로부터 산탄식방법으로 분리한 후 다시 본원발명에서 사용한 유전자 수용균주에서 안정적으로 재조합 유전형질을 발현시킬 수 있는 플라스미드에 삽입하여 형질 전환시킴으로써 L-페닐알라닌의 생산성이 증가된 새로운 군주 MWPEC 12-45(KAIST, KCTC 8236p, 1987. 3. 25 기탁)를 발명하게 되었다.
본원발명에서 사용한 유전자 조작방법은 주로 재조합 DNA계통분류법(Recombiant DNA Methodology, Jo-Anne. R, Diillon 등) 및 분자클로닝 실험조작법(Molccular cloning a Laboratory manual, T.Maniatis, E.F.Fritch, J, sambrook)등의 방법에 준하여 실시하였다.
본 발명의 재조합 유전자 제조공정도 및 제한효소 부위도는 제2도와 같다. 이와같은 본 발명의 방법을 좀더 상세히 설명하면 MWEC 101-5 주를 LB배지(박토 트립톤 1%, 박토 이스트엑기스 0.5%, 염화나트륨 1% : pH 7.4)에서 37℃, 15시간 진탕배양후 균체를 회수하여 알칼리 추출법(Molecular Cloning a Laboratory manual, 1982)염화세슘평형밀도 구배 원심분리법으로 클로모좀 DNA (cDNA)를 얻고 부탄올처리, 투석등으로 정제하였다. 또한 본원에서 사용되는 각 플라스미드 대장균 HB 101/pBR 322, 대장균/pPLc 2833, 대장균/pMK 20등은 위와 동일한 방법으로 각각 정제 사용하였다. MWEC 101-5주에 분리 정제된 클로모좀 DNA를 제한 효소 PstI, EcoRI으로 메디움염 제한효소 완충액(메디움염 제한효소 완충액 : 50mM 염화나트륨, 10mM트리스(pH 7.5), 10mM염화마그네슘, 1mM 디티오 쓰레이톨)에서 37℃, 15-30분간 절단하고 이 제한효소를 통상의 방법으로 불활성화시킨 다음 0.7% 아가로오스겔에서 4-7kb 크기의 유전자 단편을 얻은 후 목적 유전자원으로 사용하였다. 목적 유전자 분리를 위하여 플라스미드 pBR 322를 제한효소 PstI, EcoRI으로 절단하여 MWEC 101-5주로부터 얻은 4-7kb 유전자 단편과 1 : 3 비율로 혼합 한 후 리가제 완충액(T4DNA 리가제완충액 : 0.5M 트리스 (pH 7.4), 0.1M 염화마그네슘, 0.1M 디리오쓰레이톨, 10mM스퍼미딘, 10mM ATP, 1mg/ml 소혈청/알부민)에서 T4DNA 리가제로 12-14℃에서 12시간 반응을 통해 결합시켰다. 결합된 제조합 유전자를 대장균의 페닐알라닌 영향요구성 변이주(pheA 유전자 결손주)MW 203-7주에 노가르드(Nogard)등이 기술한 방법에 따라 염화칼슘처리법으로 형질전환 시켰다. 형질전화시킨 균체를 37℃에서 1시간 MM 배지(포도당 10g, 황산암모늄 4g, 제1인산칼륨 2g, 티아민염산염 1mg, 푸마르산 0.5g, 중류수 11 ; pH 7.4)에서 형질반현 시간을 준 다음 염화철 20mg, 염화망간 10mg, 테트라사이클린 15μg/ml를 첨가한 MM 한천배지상에서 도달한 후 10일간 배양하여 생육한 균체중에서 재조합 유전자 pMW 10g을 분리하였다.
분리한 pMW 10을 제한효소 HindIII와 pstI을 처리한 후, 0.7%아가로스겔상에서 목적유전자(pheA, aroF)단편을 분리하고 T4DNA폴리머라제와 dNTP 혼합액(dNTP혼합액 : 25mM dATP, 25mM dGTP, 25mM dCTP, 25mM dTTP)으로 효소반응시켜, 코헤시브말단(cohesive end)을 블런트말단(blunt end)으로 만들고, 가나마이신 표식유전자가 있는 플라스미드 pMK 20에 PstI 으로 처리하여 상기 효소와 혼합액을 사용 코헤시브말단을 블런트말단으로 만든후 이 사이에 삽입하여 연결한 재조합 플라스미드를 MW 203-7 주에 상기 방법으로 형질전환시키고 가나마이신 50μg/ml을 첨가한 MM 한천 배지상에서 생육한 균체중에서 재조합 유전자 PMW 11을 분리하였다. 그리고 P1프로모터(promoter)가 함유된 플라스미드 pPLc 2833을 BamHI, HaeII로 처리하여 0.2kb P1단편을 2%아가로스겔상에서 회수하여 알콜로 농축후 T4DNA폴리머라아제와 dNPT 혼합액으로 단편 양끝을 블런트 말단으로 만들었고, 제조된 pMW 11을 AflII와 DdeI 으로 절단하여 동일효소와 혼합액으로 블런트 말단을 만든 다음 블런트 말단화된 P1단편을 삽입시킨 재조합 유전자를 MW 203-7주에 상기동일방법으로 형질전환하여 균체를 분리하고 플라스미드 검색을 통해 pMW 11보다 크기가 0.4kb가 큰 플라스미드를 함유한 균체에서 최종적으로 pMW 12-1 재조합 유전자를 분리하였다.
본원발명에서는 재조합된 유전자를 수용하는 에쉐리시아클리 MWEC 101-5(KAIST, KCTC 8234P)주에 pMW 12-1을 형질 전환하여 L-페닐알라닌을 고농도 축적하는 MWPEC 12-45(KAIST, KCTC 8236 P)주를 발명하였다.
본원균주 MWPEC 12-45주의 생리적성질을 조사한 결과 수용균주로 사용한 MWEC 101-5(KAIST, KCTC 8234P)주와 거의 동일하였으나, L-페닐 알라닌 생산성을 현저히 증가하였다. 각 균주들의 L-페닐알라닌의 축적량은 표 1과 같았다.
[표 1]
Figure kpo00001
주) 실시예 1의 방법으로 각균주의 생산성을 조사하였음.
[실시예 1]
사용균주 : MWPEC 12-45(KAIST, KCTC 8236 P)
종배지 : 포도당 5%, 트립톤 1%, 효모엑시스 1%, 염화나트륨 0.1%, 가나마이신 10mg/l, pH 7.0
발효배지 : 포도당 6%, 황산칼륜 0.04%, 유안 2%, 구연산 나트륨 0.05%, 푸마르산 0.05%, 염화마그내숨 0.08%, 제1이산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 효모엑기스 0.1%, 글루타민산 0.05%, 염화코발트 0.1mg/l, 황산아연, 1mg/l, 염화망간 2mg/l, 염화칼슘 5mg/l, 티아민염산염 10mg/l, 니코틴산 10mg/l, pH 7.0.
배양방법 : 상기 종배기 500ml을 500ml진탕플라스크에 분주하여 120℃ 20분간 가압멸균한 후 본원균주를 접종한 후 30℃에서 하룻밤 진탕 배양하여 종 배양액으로 한다. 발효배지를 501 발효조에 201사입하고 120℃ 20분간 가압멸균후 상기 종 배양액 11를 접종하여 400rpm, 0.75vvm 조건으로 32℃ 50-60시간 배양하엿다. 배양중 암모니아수로 pH 3.0으로 조절한 60% 포당액을 잔당 1%일때 2회 추가하였다. 발효에 사용된 총당량은 140g/l였으며 이때 L-페닐알라니의 축적량은 28.7g/l였다. 배양액 1l를 상법에 따라 이온교환수지에 흡착시킨 후 암모니아수로 용리하여 농축후 페닐 알라닌 조 결정 25.3g을 얻었다.
[실시예 2]
사용균주, 종배지, 발효배지 실시예 1과 동일.
배양방법 : 실시예 1의 발효배지중 포도당 대신 설탕을 과당과 포도당으로 효소 분해시킨 후 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다. 이때 발효액 중 L-페닐 알라닌 축적량은 29.3g/l이었다.

Claims (3)

  1. 신균주MWPEC 12-45(KAIST, KCTC 8236 P)를 발효배지중에 발효시켜서 L-페닐알라닌을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항생제 가나마이신 표식 유전자를 갖고 있는 pMK 20 플라스미드와 phe A, aro F 유전자를 재조합 사용하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, L-페닐알라닌 생산에 관여하는 두 유전자 (phe A, aro F)를 이용한 재조합 균주조작에 제한 효소 PstI, EcoRI, DdeI, BamHI, HaeII를 사용하는 방법.
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