DE4228525C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch rekombinante E.coli - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin durch rekombinante E.coli

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her­ stellung von L-Phenylalanin mittels rekombinanten Escherichia coli (im folgenden mit E. coli bezeichnet). Ins­ besondere betrifft die Erfindung einen neuen E. coli Stamm, welcher ein Plasmid zur Herstellung von L-Phenylalanin ent­ hält, sowie ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin mittels des neuen Mikroorganismus.
L-Phenylalanin gehört zu den essentiellen Aminosäuren und kann für die synthetische Herstellung von ASPARTAME®, einem Süßstoff, verwendet werden. Es gibt viele bekannte Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung von Mi­ kroorganismen. Z.B. offenbaren die JP-B-37-6345 und die JP-A 60-1 60 890 ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung von Brevibacterium oder Corynebacterium sp., welche Tyrosin benötigen. Die JP-A-55-1 65 797 offenbart ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von E. coli, welches Tyrosin benötigt und welches resistent gegen Tryptophananaloge ist. KR-A-88-11 331 und 88-11 332 offenbaren ein ähnliches Verfahren unter Verwendung von E. coli, welches eine Revertante von Tyrosin- und Tryptophanauxotrophen ist und resistent ist gegenüber Phenylalanin, Tyrosin sowie Tryptophananalogen. KR-A-89-3682 und KR-B-89-3714 offenbaren Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin mittels rekombinanten E. coli, welche die Ko­ pienzahl eines Genes verstärken, welches für ein geschwin­ digkeitsbegrenzendes Enzym kodieren.
Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen E. coli Stamm zur Verfügung zu stellen, welcher hohe Ausbeuten an Phenylalanin, insbesondere L-Phenylalanin erzeugen kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es ein Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin, insbesondere L-Phenylalanin mittels eines rekombinanten E. coli Stammes zur Verfügung zu stellen.
Dabei kann der rekombinante E. coli Stamm transformiert wer­ den mit einem neuen Plasmid pMW16, welcher zwei Promotoren und einen temperatursensitiven Repressor zum Manifestieren eines pheA-Genes und eines aroF-Genes enthält. Chorismatmutase-p-prephenat-dehydratase wird kodiert durch das pheA-Gen und 3-Desoxy-D-arabinoheptulosonat·7- phosphatsynthase wird durch das aroF-Gen kodiert.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin begrün­ det, ein replizierbares rekombinantes Plasmid pMW16 zur Ver­ fügung zu stellen, welches in der Lage ist, E. coli derart zu transformieren, daß ein transformiertes E. coli ein hohes Phenylalaninproduktionsniveau aufweist.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin begründet, daß ein Verfahren für die Herstellung von Phenylalanin in hohen Ausbeuten zur Verfügung gestellt wird, welches die Kultivierung des neuen E. coli Stammes der vor­ liegenden Erfindung in einem Kulturmedium umfaßt.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung er­ geben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispie­ len sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
Fig. 1 die Stoffwechselwege zur Biosynthese von aromatischen Aminosäuren in E. coli; und
Fig. 2 Schritte zum Herstellen eines rekombinanten Plasmids pMW16 und dessen Restriktionskarte.
Die aroF- und pheA-Gene zur Verwendung bei der L-Phenylalanin-Produktion stammen aus E. coli MWPWJ 304 (KCCM 10,013).
Im folgenden wird detailliert auf die Zeichnungen zum Zwecke der Verdeutlichung der vorliegenden Erfindung Bezug genom­ men. Wie in Fig. 1 gezeigt, wird der Prozeß zur Herstellung von L-Phenylalanin unter Verwendung des rekombinanten Plas­ mids, kontrolliert durch Enzymwirkung in E. coli Zellen. Ei­ nes der Enzyme, welches die Reaktion steuert, ist Chorismatmutase-p-prephenat-dehydratase. Eines der anderen Enzyme, welche die Reaktion steuert, ist das Enzym 3-Desoxy- D-arabinoheptulosonat·7-phosphatsynthase (im folgenden mit "DAHP-Synthase" bezeichnet). Die DAHP-Synthase existiert in Form von drei Isoenzymen, welche durch das aroF-, aroG- bzw. das aroH-Gen kodiert werden. In der vorliegenden Erfindung wird ein PL-Promotor eines Lambdaphagen, mit jedem Gen ver­ bunden, um die Manifestation von pheA und aroF extrem zu steigern, und ein temperatursensitiver Repressor wird ver­ wendet, um die Manifestation des Genes zu steuern.
Wie in Fig. 2 gezeigt, wird das Verfahren zur Herstellung des Pasmids pMW16 beschrieben in "Recombinant DNA-Methodo­ logy and Molecular Cloning, A Laboratory Manual". Das rekom­ binante Verfahren für die Herstellung des Plasmids pMW16 wird beschrieben in "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (T. Maniatis et al.) und Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. Ausubel et al.).
Demzufolge wird ein neuer Stamm MWPWJ 304 zur Verwendung bei der Herstellung von L-Phenylalanin erhalten. Der neue Stamm MWPWJ 304 wurde bei der Korean Fermentation Culture Collec­ tion am 20. Dezember 1991 gemäß den Bedingungen des Budape­ ster Übereinkommens hinterlegt und wurde mit der Hinterlegungsnummer KCCM 10,013 versehen.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt im Detail im Zusammen­ hang mit den folgenden Beispielen beschrieben, welche als erläuternd und nicht als die Erfindung beschränkend dienen mögen.
Beispiel 1 Herstellung des Plasmids pMW16 (1) Isolierung der pMW12 DNA
pMW12 (US-PS-50 08 190 und 50 30 567), ein rekombinantes Plasmid, enthaltend das pheA-Gen und das aroF-Gen, wird mit EcoRV in Medium Salz Restriktionsenzympuffer (50 mM Natrium­ chlorid, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Dithiothreitol) bei 37°C für 16 Std. verdaut. Die verdaute DNA wird mit einer Phenol-Chloroformmischung behan­ delt und durch Ethanol präzipitiert, um linearisierte Plas­ mid-DNA herzustellen. Diese Plasmid-DNA wird behandelt mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsintestinum (im folgenden mit "CIP" bezeichnet), um zu verhindern, daß die lineari­ sierte Plasmid DNA sich selbst ligiert.
(2) Erhalten des PL-Promotorfragmentes
Das Plasmid pPLC 2833 wird verdaut durch die Restriktionsen­ zyme Hae II und Bam HI und ein 0,26 Kb PL-Fragment wird aus einem Agarosegel mit einem niedrigen Schmelzpunkt erhalten und wird gereinigt. Das 0,26 Kb PL-Fragment mit einem kohä­ siven Ende wird mit T4-DNA-Polymerase im Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM Magnesiumchlorid, 5 mM Dithiothreitol, 50 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 100 µM dATP, 100 µM dGTP, 100 µM dCTP und 100 µM dTTP) bei einer Temperatur von 11°C für 20 Min. behandelt, um glatte Enden zu bilden.
(3) Herstellung des Plasmids pMW14
Das Phosphatase behandelte, linearisierte Plasmid pMW12 des oben erwähnten Schrittes (1) wird mit dem PL-Promo­ torfragment mit den glatten Enden an beiden Enden des oben erwähnten Schrittes (2) in einer Menge von 1:3 gemischt und mit T4-DNA-Ligase bei einer Temperatur von 16°C für 16 Std. behandelt, um die Fragmente zu ligieren. Das kombinierte re­ kombinante Plasmid wird mittels eines herkömmlichen Calciumchloridverfahrens in E. coli MWEC 203-7 transformiert, welche Phenylalanin zum Wachstum benötigen. Der transfor­ mierte Stamm wird in MM-Kulturmedium, enthaltend 50 µg/ml Kanamycin-Antibiotikum (10 g Glukose, 4 g Ammoniumsulfat, 2 g monobasisches Kaliumphosphat, 1 mg Thiamin-HCl, 0,5 g Fumarsäure, 20 g Agar, 1 l destilliertes Wasser und pH 7,4) kultiviert. Das rekombinante Plasmid pMW14 wird getrennt von dem kultivierten Stamm, welcher auf dem MM-Kulturmedium, 50 µg/ml Kanamycin enthaltend, wuchs.
(4) Herstellung von pMW15
Ein Plasmid pMK5, enthaltend ein temperatursensitives Re­ pressor CI857-Gen wird mit dem Restriktionsenzym Bgl II be­ handelt und ein 0,9 Kb-DNA-Fragment wird aus einem 0,9% Agarosegel erhalten und dann mit T4-DNA-Polymerase behan­ delt, um glatte Enden zu bilden. Das Plasmid pMW14 des oben erwähnten Schrittes (3), welches kombiniert ist mit dem PL- Promotor vor dem aroF-Gen, wird mit Dra III verdaut und mit CIP behandelt, um die 5′-Phosphatgruppen zu entfernen. An­ schließend wird das behandelte Plasmid pMW14 mit dem CI857- Fragment gemischt, welches an beiden Enden glatte Enden auf­ weist, und mittels T4-DNA-Ligase verbunden. Das rekombinante Plasmid wird in E. coli HB101 transformiert, um pMW15 zu er­ zeugen.
(5) Herstellung von pMW16
Das isolierte rekombinante Plasmid pMW15 wird verdaut mit Bam HI und Bgl II und behandelt mit T4-DNA-Ligase, um pMW16 zu erzeugen. Das pMW15-Plasmid enthält das gesamte tyrA-Gen. In pMW16 wird ein 0,7 Kb Fragment des tyrA-Genes davon ent­ fernt. Das rekombinante Plasmid pMW16 wird transformiert in einen temperatursensitiven Tyrosinmangelstamm (tyrosine­ leaky strain), E. coli MWWJ 304 (KFCC 10737, hinterlegt bei der Korean Fermentation Culture Collection, 30. August, 1991) und wird dann kultiviert in Kulturmedium, welches 50 µg/ml Kanamycin enthält, bei 37°C für 24 Std. Unter den transformierten Stämmen mit pMW16, wurde der beste Stamm, welcher L-Phenylalanin herstellt, MWPWJ 304 (KCCM 10,013, hinterlegt bei Korean Culture of Microorganismus, 20. Dezem­ ber 1991) isoliert. Die biochemischen Eigenschaften des neuen Stammes MWPWJ 304 (KCCM 10,013) sind dieselben, wie jene des Wirtsstammes MWWJ 304 (KFCC 10,737). Jedoch erfor­ dert der neue Stamm MWPWJ 304 mehr Tyrosin zum Wachstum und Herstellen von L-Phenylalanin, verglichen mit dem Wirtsstamm MWWJ 304. Ebenfalls sind die L-Phenylalanin-Ausbeute und die Aktivität der DAHP-Synthase bei dem neuen Stamm MWPWJ 304 erhöht.
Experimentelles Beispiel 1
Die Enzymaktivität und Ausbeute von L-Phenylalanin des neuen Stammes MWPWJ 304 sind erhöht, wenn man mit dem vorliegenden Stamm, wie in den Tabellen I und II gezeigt, vergleicht:
Tabelle
Enzymaktivität von DAHP-Synthase
Die obigen Daten wurden erhalten durch ein Meßverfahren nach I. Shiio et al. (Journal of Biochemistry, 75, 987-997, 1974). Die Enzymaktivität von MWPWJ 304 (KCCM 10,013) ba­ siert auf derjenigen des MWPEC 13-60 (KCTC 8337 P). Die Kul­ turmedien von MWWJ 304, (KFCC 10,737) und MWPWJ 304 (KCCM 10,013) enthielten, zusätzlich 100 mg/l an L-Tyrosin, verg­ lichen mit denjenigen des MWPEC 13-60.
Beispiel 2 Herstellung von L-Phenylalanin
(A) Stamm
MWPWJ 304 (KCCM 10,013)
(B) Kulturmedium
Glukose|3%
Trypton 1%
Bactohefeextrakt 1%
Natriumchlorid 0,1%
Kanamycin 10 mg/l
pH 7,0
(C) Fermentationsmedium
Glucose|6%
Kaliumsulfat 0,04%
Ammoniumsulfat 2%
Natriumcitrat 0,05%
Fumarsäure 0,05%
Magnesiumchlorid 0,08%
monobasisches Kaliumphosphat 0,1%
dibasisches Kaliumphosphat 0,1%
Bactohefeextrakt 0,1%
Mononatriumglutamat 0,05%
Kobaltchlorid 0,1 mg/l
Zinksulfat 1 mg/l
Manganchlorid 2 mg/l
Calciumchlorid 5 mg/l
Eisen(III)-Chlorid 20 mg/l
L-Tyrosin 300 mg/l
Thiaminhydrochlorid 10 mg/l
Nikotinsäure 10 mg/l
pH 7,0
(D) Fermentationsverfahren
40 ml des Kulturmediums wird in einem 500 ml Testkolben ge­ geben und bei 120°C für 20 Min. autoklaviert. Nach dem Ste­ rilisieren wird der neue E. coli Stamm MWPWJ 304 (KCCM 10,013) in den Kolben inokuliert und bei 37°C für 16 Std. unter Schütteln kultiviert. Das Fermentationsmedium wird hergestellt unter Verwendung der oben erwähnten Formulie­ rung. Anschließend wird 3,5% Calciumcarbonat, welches sepa­ rat autoklaviert wurde, dem Fermentationsmedium zugegeben und 2 ml Impflösung wird dazugegeben, das Fermentationsmedium wird bewegt und bei 37°C 36 Std. fermen­ tiert. Nach Beendigung der Fermentation hat sich die L-Phenylalaninmenge auf 16,2 g/l angereichert.
Beispiel 3 Herstellung von L-Phenylalanin
Der (A) Stamm, (B) Kulturmedium und (C) Fermentationsmedium mit Ausnahme von 400 mg/l L-Tyrosin sind dieselben, die in den Beispielen 1 und 2 verwendet wurden.
(D) Fermentationsverfahren
1 l Fermentationsmedium wird in einen 2 l Fermenter gegeben und 15 Min. bei 120°C autoklaviert. Der neue Stamm MWPWJ 304 (KCCM 10,013) wird zu 50 ml Kulturmedium in einem 500 ml Kolben hinzugefügt und bei 37°C 16 Std. unter Schütteln kul­ tiviert, wobei 50 ml der Kulturlösung in den Fermenter unter 1000 rpm und 1,0 vvm (Sauerstoffrate) bei 37°C für 48 Std. gegeben wurde. Während der Fermentation wird ein pH von 7,0 aufrechterhalten, durch Zugeben von Ammoniumhydroxid und ei­ ner 60%igen Glukoselösung, welche dem Fermenter dreifach zu­ gegeben wird, wenn das Glukoseniveau unter 1% fällt.
Die gesamte Glukosemenge, welche in der Fermentierung ver­ wendet wird, beträgt 185 g/l. L-Phenylalanin wird erhalten in einer Konzentration von 50,8 g/l. 1 l Fermentationslösung wird gereinigt mittels eines herkömmlichen Verfahrens, bei­ spielsweise durch Absorption an Ionenaustauschharz und Iso­ lieren mit Ammoniumhydroxid, um 45,7 g/l L-Phenylalanin als Rohkristalle zu gewinnen.
Tabelle II
Phenylalanin Ausbeute (g/l)
Beispiel 4
Beispiel 3 wurde wiederholt mit Ausnahme, daß 27 l Kultur in eine 50 l Fermentationsvorrichtung gegeben wurde und 1,3 l der Kulturlösung in die Fermentationsvorrichtung unter 450 rpm und 1,0 vvm gegeben wurde. Die hergestellte L-Phenylalaninmenge beträgt 49,1 g/l.
Es wird verstanden, daß die vorliegende Erfindung auf ver­ schiedene Arten variiert werden kann.

Claims (9)

1. Replizierbares rekombinantes Plasmid mit einer Plasmid- DNA, welche zwei Promotoren und einen temperatursensi­ tiven Repressor enthält, zum Manifestieren eines pheA- Genes, welches kodiert für Chorismatmutase-p-prephenat- dehydratase und ein aroF-Gen, welches kodiert für 3- Desoxy-D-arabinoheptulosonat·7-phosphatsynthase, wobei das rekombinante Plasmid als das Plasmid pMW16 identi­ fiziert wird, welches in E. coli MWPWJ 304 (KCCM 10,013) enthalten ist, welches in der Lage ist, E. coli zu transformieren, um ein transformiertes E. coli mit einer optimalen Phenylalanin-Herstellungskapazität zu erzeugen.
2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotoren Lambda PL-Promotoren sind.
3. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der temperatursensitive Repressor ein CI857-Repressor ist.
4. E. coli MWPWJ 304 (KCCM 10,013) welches eine optimale Phenylalanin-Produktionskapazität aufgrund der darin enthaltenen pheA- und aroF-Gene aufweist.
5. Verfahren zur Herstellung von Phenylalanin, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Kultivieren eines E. coli Stammes, welcher das Plasmid aus KCCM 10,013 in einem Kulturmedium enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung in Gegenwart von Zucker durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Zucker Glukose ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von 37°C durchge­ führt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß L-Phenylalanin hergestellt wird.
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