DE3027922C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus des Genus Escherichia mit erhöhter Produktivität für L-Lysin sowie dessen Verwendung zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
Damit Wildstämme L-Lysin aus Kohlenhydraten bilden können, war es bisher notwendig, künstliche Mutanten des Wildstammes herzustellen. Es ist eine Vielzahl von Lysin-bildenden künstlichen Mutanten bekannt, von denen die meisten gegen Lysin-Analoge, wie S-(2-Aminoäthyl)-cystein (AEC), resistent sind und/oder für ihr Wachstum Homoserin benötigen und zu den Genera Brevibacterium oder Corynebacterium zählen. Diese Mikroorganismen produzieren L-Lysin in einer Ausbeute von 40 bis 50%. Beispiele für jüngere Publikationen über die fermentative Herstellung von L-Lysin sind die JP-OS 9784/1980, 9783/1980, 9559/1980, 9785/1980, 86091/1978, 86090/1978, 86089/1978, 26391/1978, 20490/1978, 9394/1978 und 6486/1978.
Es ist jedoch schwierig geworden, die Ausbeuten an L-Lysin bei Anwendung der künstlichen Mutation zu erhöhen. Es besteht daher Bedarf für neue Mikroorganismen, die L-Lysin in hohen Ausbeuten bilden.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen neuen Mikroorganismus und ein Verfahren bereitzustellen, die eine hohe L-Lysin-Ausbeute ermöglichen.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus des Genus Escherichia mit erhöhter Produktivität für L-Lysin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Hybridplasmid in das ein DNA-Fragment insertiert ist, welches die genetische Information für die L-Lysin-Synthese enthält und sich von der DNA eines gegen L-Lysin-Analoge resistenten Donorstammes des Genus Escherichia herleitet, in an sich üblicher Weise in einen Wirtsstamm des Genus Escherichia einschleust.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung des so erhältlichen Mikroorganismus zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, sowie ein Hybridplasmid mit der genetischen Information für erhöhte Produktivität für L-Lysin, welches aus Escherichia coli FERM BP-1543 erhältlich ist (vgl. die Patentansprüche 2 bis 4).
Der erfindungsgemäße Mikroorganismus des Genus Escherichia bildet L-Lysin in höherer Ausbeute als künstlich induzierte Mutanten von Escherichia.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird daher L-Lysin dadurch fermentativ hergestellt, daß man in einem Kulturmedium einen L-Lysin bildenden Mikroorganismus, der erhältlich ist durch Einverleiben eines Hybridplasmids in einen Empfängerorganismus des Genus Escherichia, in einem Kulturmedium züchtet und das in dem Kulturmedium angereicherte L-Lysin gewinnt, wobei das Hybridplasmid ein Desoxyribonucleinsäure (DNA)-Fragment enthält, das sich von einem gegen Lysin-Analoge resistenten Mikroorganismus des Genus Escherichia herleitet und genetische Information für die L-Lysin-Synthese besitzt.
Der zur Herstellung des erfindungsgemäßen L-Lysin bildenden Mikroorganismus verwendete NDA-Donorstamm ist ein Mikroorganismus des Genus Escherichia, der genetische Information für die L-Lysin-Synthese besitzt. Stämme mit höherer Produktivität für L-Lysin sind als DNA-Donoren bevorzugt. Die als DNA-Donor verwendete, gegen Lysin-Analoge resistente Mutante kann nach üblichen Mutationstechniken hergestellt werden.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Lysin-Analogen inhibieren das Wachstum von Escherichia-Stämmen; die Inhibierung wird jedoch durch die Anwesenheit von L-Lysin in dem Medium teilweise oder vollständig aufgehoben. Beispiele für Lysin-Analoge sind Oxolysin, Lysin-hydroxamat, AEC, q-Methyllysin und β-Chlorcaprolactam.
Die chromosomale DNA wird aus dem DNA-Donor auf übliche Weise extrahiert und nach bekannten Methoden (Biochem. Biophys. Acta, Bd. 383, S. 457 (1975)) mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt.
Die als Vektor verwendete Plasmid- oder Phagen-DNA wird in gleicher Weise mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt. Zu diesem Zweck können verschiedene Arten von Restriktions-Endonucleasen verwendet werden, solange der Abbau der chromosomalen DNA partiell erfolgt. Danach werden die gespaltene chromosomale DNA und Vektor-DNA einer Ligationsreaktion unterworfen.
Die Rekombination der DNA zur Herstellung des rekombinanten Plasmids kann dadurch erfolgen, daß man dem chromosomalen DNA-Fragment und der gespaltenen Vektor-DNA mit Terminaltransferase Desoxyadenylsäure und Thymidylsäure oder Desoxyguanylsäure und Desoxycytidylsäure einverleibt und das modifizierte chromosomale DNA-Fragment und die gespaltene DNA einer Wärmebehandlung unterwirft.
Als Vektor-DNA eignen sich herkömmliche Vektoren, z. B. Col E1, pSC 101, pBR 322, pACYC 177, pCR 1, R6K oder g-Phagen bzw. deren Derivate.
Die so erhaltene Hybrid-DNA kann nach üblichen Transformationsmethoden einem Mikroorganismus des Genus Escherichia einverleibt werden; vgl. J. Bacteriol., Bd. 119, S. 1072 (1974). Der gewünschte Transformant wird unter Verwendung eines Mediums selektiert, auf welchem nur ein Klon wachsen kann, das eine oder beide der charakteristischen Eigenschaften für die L-Lysin-Synthese aufweist, die dem chromosomalen DNA-Fragment und der Vektor-DNA eigen sind.
Als Empfängerorganismus für die Hybrid-DNA wird gewöhnlich ein L-Lysin-Auxotroph verwendet, da der lysinbildende Transformant gewöhnlich von dem Empfänger unterschieden wird. Vorzugsweise wird als Empfänger eine Mutante mit höherer Produktivität für L-Lysin verwendet.
Die so erhaltenen L-Lysin bildenden Stämme werden nach dem für die Züchtung von bekannten L-Lysin bildenden Mikroorganismen üblichen Methoden gezüchtet. So wird ein übliches Kulturmedium verwendet, das Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine oder Aminosäuren, enthält. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Saccharose, Lactose, Stärkehydrolysat und Melassen. Als Stickstoffquellen können gasförmiges Ammoniak, wäßriges Ammoniak und Ammoniumsalze sowie andere stickstoffhaltige Materialien verwendet werden.
Die Züchtung des rekombinierten Mikroorganismus erfolgt unter aeroben Bedingungen und unter Einstellen des pH-Werts und der Temperatur des Mediums auf einen geeigneten Wert und wird solange fortgesetzt, bis die Bildung von L-Lysin aufgehört hat. Das in dem Kulturmedium angereicherte L-Lysin kann nach üblichen Methoden gewonnen werden.
Erfindungsgemäß kann L-Lysin in höheren Ausbeuten gebildet werden als in bekannten Verfahren unter Verwendung von künstlichen Escherichia-Mutanten.
Die nachstehend beschriebenen Stämme EL-1, BT-14 und FERM BP-1543 haben dieselben Eigenschaften wie der Stamm K-12, der wiederum die in "Bergeys' Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, genannten Eigenschaften hat. Die Stämme NRRL B-12 199 und B-12 200 wurden am bzw. vor dem 17. Juli 1980 beim Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, V. St. A. hinterlegt.
Der L-Lysin-bildende transformierte Stamm AJ 11 442 = FERM-P 5084 wurde vom FRI selbst in die internationale Hinterlegungsstelle des Fermentation Research Institutes übergeführt und hat die Hinterlegungsnummer FERM BP-1543 erhalten.
Beispiel 1 (1) Herstellung von chromosomaler DNA mit genetischer Information für die L-Lysin-Bildung
Escherichia coli EL-1 (NRRL B-12 199), eine gegen AEC resistente Mutante, die aus K-12-Zellen (ATCC 10 798) durch 60minütige Einwirkung von 250 µg/ml N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin in einem Citronensäurepuffer von pH 6,0 bei 30°C und Abtrennen der auf dem Agarmedium auftretenden Kolonie erhalten wurde, wird 3 Stunden bei 37°C unter Schütteln in 1 Liter L-Medium kultiviert, das 1 g/dl Pepton, 0,5/dl Hefeextrakt, 0,1 g/dl Glucose und 0,5 g/dl NaCl enthält und einen pH von 7,2 aufweist. Die Bakterienzellen in der experimentellen Wachstumsphase werden gewonnen. Chromosomale DNA wird nach der üblichen Phenolmethode extrahiert, wobei 3,6 mg gereinigte DNA erhalten werden.
(2) Herstellung der Vektor-DNA
Als Vektor wird DNA von Col E1 folgendermaßen hergestellt:
Der Stamm Escherichia coli K-12, der das Plasmid Col E1 enthält, wird bei 37°C in 1 Liter eines Glucose-Casaminosäure-anorganische Salze-Medium gezüchtet, das 2 g Glucose, 1 g NH₄Cl, 6 g Na₂HPO₄, 3 g KH₂PO₄, 5 g NaCl, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,015 g CaCl₂ · 2 H₂O, 20 g "Casaminosäure" (Caseinhydrolysat), 0,05 g Thymin, 0,05 g L-Methionin und 100 µg Thiamin · HCl pro Liter enthält und einen pH von 7,2 aufweist. E. coli K-12, der das Plasmid ColE1 enthält, ist aus der Veröffentlichung von Nishimura et al in Plasmid I, S. 67-77 (1977) bekannt. Nachdem die Inkubation bis in die späte logarithmische Phase durchgeführt wurde, versetzt man das Kulturmedium mit 170 µg/ml Chloramphenicol. Auf diese Weise wird die Plasmid-DNA vermehrt und in überschüssiger Menge in den Bakterienzellen angereichert. Nach 16stündiger Inkubation werden die Zellen geerntet und durch Behandeln mit Lysozym und SDS lysiert. Das Lysat wird 1 Stunde bei 30 000 X g zentrifugiert. Der Überstand wird gewonnen und eingeengt, worauf man durch Fraktionieren mit Hilfe der Cäsiumchlorid-Äthidiumbromid-Gleichgewichtsdichtegradienten-Zentrifu-gierung 450 µg der Plasmid-DNA gewinnt.
(3) Insertieren des chromosomalen DNA-Fragments in den Vektor
10 µg der chromosomalen DNA werden 5, 10, 20, 30 bzw. 60 Minuten bei 37°C mit der Restriktions-Endonuclease EcoRI behandelt, um die DNA-Ketten zu spalten, worauf man jeweils 5 Minuten auf 65°C erwärmt. 10 µg der Vektor-DNA werden außerdem 1 Stunde bei 37°C zur vollständigen Spaltung der DNA mit der Restriktions-Endonuclease EcoRI behandelt und dann 5 Minuten auf 65°C erhitzt.
Die Lösung der abgebauten chromosomalen DNA und die Lösung der gespaltenen Vektor-DNA werden vermischt und mit Hilfe der T₄-Phagen-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP und Dithiothreitol 24 Stunden bei 10°C der Ligationsreaktion von DNA-Fragmenten unterworfen. Das Reaktionsgemisch wird dann 5 Minuten auf 65°C erhitzt und mit dem zweifachen Volumen Äthanol versetzt. Die hierbei ausgefällte rekombinante DNA wird gewonnen.
(4) Genetische Transformation mit dem Hybridplasmid, das die genetische Information für die L-Lysin-Bildung enthält.
Ein Biotin und Thymin benötigender Stamm, Escherichia coli BT-14 (NRRL B-12 200), der von Escherichia coli K-12 durch 60minütige mutagene Behandlung mit 250 µg/ml N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin in Citronensäurepuffer von pH 6,0 bei 30°C und Abtrennen der Biotin/Thiamin benötigenden Mutante abgeleitet worden ist, wird in 10 ml L-Medium von 37°C unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen werden in der exponentiellen Wachstumsphase geerntet, in 0,1 M MgCl-Lösung und dann in 0,1 M CaCl₂-Lösung in einem Eisbad suspendiert, wobei "kompetente" Zellen mit der Fähigkeit zur DNA-Aufnahme erhalten werden.
Der Suspension von kompetenten Zellen wird die in Stufe (3) erhaltene DNA, welche die Hybridplasmid-DNA enthält, zugesetzt. Die Suspension wird 30 Minuten in einem Eisbad gehalten, dann 2 Minuten auf 42°C erwärmt und wieder 30 Minuten in einem Eisbad stehengelassen. Mit den Zellen, in die auf diese Weise die Hybridplasmid-DNA eingeschleust worden ist, wird L-Medium beimpft und 3 Stunden bei 37°C geschüttelt, um die Transformationsreaktion zu vervollständigen. Die Zellen werden gewonnen, gewaschen und wieder suspendiert. Ein kleiner Teil der Zellsuspension wird auf einer Agarplatte ausgestrichen, die pro Liter 2 g Glucose, 1 g (NH₄)₂SO₄, 7 g K₂HPO₄, 2 g KH₂PO₄, 0,1 g MgSO₄ · 7 H₂O, 0,5 g Natriumcitrat · 2 H₂O, 1 g AEC · HCl, 0,1 mg Biotin, 0,1 mg Thiamin-hydrochlorid und 2 g Agar enthält und auf einen pH von 7,2 eingestellt ist. Die Platte wird 3 Tage bei 37°C inkubiert.
Die auf der Platte erschienenen Kolonien werden aufgenommen und die L-Lysin bildenden Transformanten werden durch die Bildung eines Hofes auf einem Agar-Minimalmedium selektiert, auf dem vorher die Lysin benötigende Mutante L-1 von Escherichia coli K-12 ausgestrichen wurde.
Auf diese Weise erhält man FERM BP-1543 als Lysin bildenden Transformanten.
(5) Herstellung von L-Lysin mit Hilfe des neuen L-Lysin bildenden Stammes.
Tabelle I zeigt die Versuchsergebnisse bei der fermentativen Bildung von L-Lysin unter Verwendung der Stämme FERM BP-1543 und des DNA-Donorstamms EL-1, einer künstlichen Mutante.
Das Fermentationsmedium enthält 5 g/dl Glucose, 2,5 g/dl Ammoniumsulfat, 0,2 g/dl KH₂PO₄, 0,1 g/dl MgSO₄ · 7 H₂O, 0,05 g/dl Hefeextrakt, 100 µg/dl Thiamin · HCl, 30 µg/dl Biotin, 1 mg/dl FeSO₄ · 7 H₂O, 1 mg/dl MnSO₄ · 4 H₂O und 2,5 g/dl CaCO₃ (gesondert sterilisiert) und weist einen pH von 7,0 auf.
20 ml-Anteile des Fermentationsmediums werden in 500 ml Kolben eingefüllt und mit einer mit dem Inoculum des zu prüfenden Mikroorganismus gefüllten Öse angeimpft. Die Züchtung erfolgt 72 Stunden bei 31°C.
Die L-Lysinmenge in dem überstehenden Teil der Fermentationsbrühe wird durch mikrobiologischen Assay bestimmt.
getesteter Mikroorganismus
gebildetes L-Lysin (mg/dl)
El-1
16
FERM BP-1543 28

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus des Genus Escherichia mit erhöhter Produktivität für L-Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hybridplasmid, in das ein DNA-Fragment insertiert ist, welches die genetische Information für die L-Lysin-Synthese enthält und sich von der DNA eines gegen L-Lysin-Analoge resistenten Donorstammes des Genus Escherichia herleitet, in an sich üblicher Weise in einen Wirtsstamm des Genus Escherichia einschleust.
2. Hybridplasmid mit der genetischen Information für erhöhte Produktivität für L-Lysin, welches aus Escherichia coli FERM BP-1543 erhältlich ist.
3. Verwendung eines nach Anspruch 1 erhältlichen Mikroorganismus des Genus Escherichia zur fermentativen Herstellung von L-Lysin.
4. Verwendung von E. coli FERM BP-1543 gemäß Anspruch 3.
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