JP5297804B2 - アミノ酸の製造法 - Google Patents

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Description

本発明は、L-アミノ酸の製造法に関する。
エシェリヒア属に属する微生物やコリネバクテリウム属に代表されるコリネ型細菌等の微生物を一般的に用いるアミノ酸の発酵生産においては、グルコースを主原料とし、微生物自身の増殖とアミノ酸生産の両者に炭素を分配している。
グルコースは主に解糖系とペントースリン酸経路を経て種々の化合物へ代謝されるが、炭素をめぐる代謝には解糖系を逆流するような糖新生も知られており、例えば酢酸のような炭素源を用いて微生物が増殖する場合には、糖新生経路により増殖に必要な代謝産物を生合成する必要がある。グルコースからの代謝は言わば解糖系と糖新生の両代謝経路の総和として表現されることになる。
糖新生は様々な環境中で微生物が生存していくために必要であり、解糖系と糖新生のバランスは環境要因に応じて調節されることが知られている。エシェリヒア・コリに属する微生物においては解糖／糖新生のバランスは主にCsr(Carbon Storage Regulator)システムによって調節されることが報告されている（非特許文献１）。Csrシステムの中心的役割を果たしているのがCsrAタンパク質と呼ばれる制御タンパク質であり、標的メッセンジャーRNAの５’−非翻訳領域と結合して解糖系酵素群の翻訳を上昇させ、糖新生酵素群の翻訳を低下させる機能を有する。近年、csrA遺伝子の欠損はL-フェニルアラニンの生産性を向上させるとの報告がなされているが、これは解糖系低下・糖新生上昇によりホスホエノールピルビン酸の供給を高めることで、L-フェニルアラニン生産に必須なシキミ酸経路が強化されるためとされている（非特許文献２）。
一方、CsrシステムにはCsrA蛋白質と結合し、その機能を低下させる制御因子としてCsrB RNA（非特許文献３）およびCsrC RNA（非特許文献４）があることが知られている。CsrB RNAおよびCsrB RNAはいずれも非翻訳スモールRNAであり、CsrA蛋白質の結合部位として配列番号１、２および３で表される塩基配列を含む保存塩基配列をそれぞれ１８個所、９個有していることが知られている。
しかし、これまでにCsrB RNA、CsrC RNAといった解糖系／糖新生のバランス調節に関与するスモールRNAの機能を改変、とりわけ欠損させることによってアミノ酸生産性を向上させたという報告はない。
Journal of Bacteriology, 1993年, 第175巻, p.4744-4755 Current Microbiology, 2001年, 第43巻, p.26-32 The Journal of Biological Chemistry, 1997年, 第272巻, p.17502-17510 Journal of Bacteriology, 1993年, 第175巻, p.4744-4755
本発明の目的は、工業的に有利なＬ−アミノ酸の製造法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（１０）に関する。
（１）CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失しており、かつアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する腸内細菌(Enterobacteriaceae)に属する微生物。
（２）CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失している微生物がcsrB遺伝子またはcsrC遺伝子の一部または全部が欠損している微生物である、上記（１）の微生物。
（３）CsrB RNAおよびCsrC RNAが、それぞれ配列番号７８および７９で表される塩基配列からなるDNAの転写物である、上記（１）または（２）の微生物。
（４）腸内細菌に属する微生物がEscherichia属、Salmonella属、Enterobacter属、Serratia属、Yersinia属およびErwinia属のいずれかに属する微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つの微生物。
（５）Escherichia属に属する微生物がEscherichia coliである、上記（４）の微生物。
（６）アミノ酸がL-アラニン、L-セリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-ホモセリン、L-スレオニン、L-メチオニン、L-リジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-フェニルアラニンおよびL-ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の微生物。
（７）アミノ酸がL-アラニン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の微生物。
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の微生物を培地に培養し、該培地中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培地からアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
（９）アミノ酸がL-アラニン、L-セリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-ホモセリン、L-スレオニン、L-メチオニン、L-リジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-フェニルアラニンおよびL-ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（８）の製造法。
（１０）アミノ酸がL-アラニン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-ロイシンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（８）の製造法。
本発明により、工業的に有利にＬ−アミノ酸を製造することができる。
１．本発明の微生物
（１）CsrB RNAまたはCsrC RNA
本発明においてCsrB RNAまたはCsrC RNAとは、配列番号７８または７９で表される塩基配列からなるDNAの転写物、および配列番号７８または７９で表される塩基配列からなるDNAの転写物のホモログであり、該DNAと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつCsrA蛋白質またはそのホモログと結合し、その活性を抑制する機能を有するRNAをあげることができる。
CsrA蛋白質としては、GENBANK Accession no. AAC75738で表されるアミノ酸配列からなるEscherichia coli由来の蛋白質、GENBANK Accession no. AAG35184およびAAF80413で表されるアミノ酸配列からなるSalmonella typhimulium由来のCsrA蛋白質、GENBANK Accession no. CAG76264で表されるアミノ酸配列からなるErwinia carotovora由来のCsrA蛋白質、GENBANK Accession no. CAH20066で表されるアミノ酸配列からなるYersinia pseudotuberculosis由来のCsrA蛋白質をあげることができ、CsrA蛋白質のホモログとしてはGENBANK Accession no. AAC75738で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつEscherichia coli由来のCsrA蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質をあげることができる。
CsrB RNAとしては、例えば配列番号７８で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるEscherichia coli由来のRNA、GENBANK Gene ID 1254489で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるSalmonella typhimulium由来のRNA、GENBANK Gene ID 2884449で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるErwinia carotovora由来のRNA、およびGENBANK Gene ID 2955376で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるYersinia pseudotuberculosis由来のRNAをあげることができる。
CsrC RNAとしては、例えば配列番号７９で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるEscherichia coli由来のRNA、およびGENBANK Gene ID 2955134で表される塩基配列からなるDNAの転写物であるYersinia pseudotuberculosis由来のRNAをあげることができる。
（２）CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失した腸内細菌に属する微生物
CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失した腸内細菌に属する微生物としては、染色体DNA上のcsrB遺伝子またはcsrC遺伝子の塩基配列に塩基の欠失、置換または付加があるため、csrB遺伝子またはcsrC遺伝子からCsrB RNAまたはCsrC RNAが転写されない微生物、または該遺伝子の転写物が有するCsrA蛋白質の活性を抑制する機能が低下または喪失している微生物をあげることができる。
csrB遺伝子またはcsrC遺伝子としては、CsrB RNAまたはCsrC RNAに対応する転写領域および該遺伝子のプロモーターなどの転写調節領域からなるDNA、好ましくはCsrB RNAまたはCsrC RNAに対応する転写領域からなるDNAをあげることができる。
CsrB RNAまたはCsrC RNAのCsrA蛋白質の活性を抑制する機能が低下または喪失している微生物としては、該RNAのCsrA蛋白質への結合力が低下または喪失しているため、塩基の欠失、置換または付加がない正常型のCsrB RNAまたはCsrC RNAを有する微生物細胞内のCsrA蛋白質の活性と比較して、細胞内のCsrA蛋白質の活性が1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは4倍以上に上昇している微生物をあげることができる。
上記した腸内細菌に属する微生物としては、CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失している腸内細菌であればいずれでもよいが、例えばEscherichia属、Salmonella属、Enterobacter属、Serratia属、Erwinia属またはYersiniaに属する微生物、好ましくはEscherichia属に属する微生物、より好ましくはEscherichia coliに属する微生物をあげることができる。
（３）本発明の微生物の製造法
本発明の微生物は、腸内細菌に属する微生物のCsrB RNAまたはCsrC RNAの機能を低下または喪失させる方法により取得することができるが、１）該微生物として元来アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物、またはアミノ酸を生成、蓄積する能力を付与した微生物を用いる方法、または２）CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失している微生物に、アミノ酸を生成、蓄積する能力を付与する方法によっても取得することができる。
CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失している微生物は、既存の微生物が有する、その機能が低下または喪失している変異型のcsrB遺伝子またはcsrC遺伝子をファージを用いた形質導入によって１つの微生物に集積する方法［J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)］、UV照射、変異剤などで微生物を異処理した後、CsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失した菌株を選択する方法、または微生物の染色体DNA上のcsrB遺伝子またはcsrC遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。
塩基の欠失、置換または付加の導入する領域としては、csrB遺伝子またはcsrC遺伝子であれば限定されず、CsrB RNAまたはCsrC RNAの転写領域および該遺伝子のプロモーターなどの転写調節領域をあげることができ、好ましくはCsrB RNAまたはCsrC RNAの転写領域をあげることができる。
転写調節領域としては、染色体DNA上における転写領域の５’末端より上流側50塩基からなるDNAをあげることができ、好ましくは-10および-35領域に相当する領域をあげることができる。
転写領域への塩基の欠失、置換または付加を導入は、転写物の機能を低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、好ましくは10塩基以上、より好ましくは20塩基以上、さらに好ましくは100塩基以上、特に好ましくは200塩基以上の転写領域の一部、最も好ましくは転写領域全部の欠失をあげることができる。塩基の置換としては、転写領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。塩基の付加としては、転写領域の５’末端から150番目以内の塩基、好ましくは100番目以内の塩基、より好ましくは50番目以内の塩基、特に好ましくは30番目以内の塩基、最も好ましくは20番目以内の塩基の直後に、50塩基以上、好ましくは100塩基以上、より好ましくは200塩基以上、さらに好ましくは500塩基以上、特に好ましくは1kb以上のDNA断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子の挿入をあげることができる。
微生物の染色体DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、大腸菌で頻用される相同組換えを利用した方法としてはラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
相同組換えを利用した方法としては、i）該相同組換え用プラスミドを常法により宿主細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択し、ii）得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜1日培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、iii）前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択する、ことで染色体ＤＮＡ上において２回目の相同組換えが生じた株を取得する方法をあげることができる。染色体ＤＮＡ上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。
また、ラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法は、直鎖ＤＮＡを取り込む能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、好ましくはエシェリヒア・コリ、より好ましくはλファージ由来の組換えタンパク質群（Red組換え系）を発現しているシェリヒア・コリに用いることができる。
λRed組換え系を発現しているエシェリヒア・コリとしては、λRed組換え系遺伝子を有するプラスミドＤＮＡであるpKD46［エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）より入手可能］を保有するエシェリヒア・コリ JM101株等をあげることができる。
上記１）および２）の方法におけるアミノ酸を生成、蓄積する能力を付与する方法はいかなる方法でもよく、所望のアミノ酸を生産する微生物を製造するための方法としては、これまで多くの報告があり、いずれの公知の方法も本発明の微生物を製造するために用いることができる。
当該公知の方法としては、例えば
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
アミノ酸を生成、蓄積する能力を有する微生物の具体的例としては、Ｌ−グルタミン酸生産株としてFERM BP-5807およびATCC13032など、Ｌ−グルタミン生産株としてFERM P-4806およびATCC14751など、Ｌ−スレオニン生産株としてATCC21148、ATCC21277およびATCC21650など、Ｌ−リジン生産株としてFERM P-5084およびATCC13286など、Ｌ−メチオニン生産株としてFERM P-5479、VKPM B-2175およびATCC21608など、Ｌ−イソロイシン生産株としてFERM BP-3757およびATCC14310など、Ｌ−バリン生産株としてATCC13005およびATCC19561など、Ｌ−ロイシン生産株としてFERM BP-4704およびATCC21302など、Ｌ−アラニン生産株としてFERM BP-4121およびATCC15108など、Ｌ−セリン生産株としてATCC21523およびFERM BP-6576など、Ｌ−プロリン生産株としてFERM BP-2807およびATCC19224など、Ｌ−アルギニン生産株としてFERM P-5616およびATCC21831など、Ｌ−オルニチン生産株としてATCC13232など、Ｌ−ヒスチジン生産株としてFERM BP-6674およびATCC21607など、Ｌ−トリプトファン生産株としてDSM10118、DSM10121、DSM10123およびFERM BP-1777など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてATCC13281およびATCC21669など、Ｌ−チロシン生産株としてATCC21652など、Ｌ−システイン生産株としてW3110/pHC34(特表2003-511086記載)など、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン生産株としてWO96/27669記載のエシェリヒア・コリSOLR/pRH71など、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン生産株としてFERM BP-5026およびFERM BP-5409など、Ｌ−シトルリン生産株としてFERM P-5643およびFERM P-1645などをあげることができる。
なお、上記のFERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）、VKPM番号で表される菌株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（ロシア）、DSM番号で表される菌株はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。
上記方法により取得されたCsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失した微生物が、CsrB RNAまたはCsrC RNAが正常に機能する親株よりアミノ酸を生成、蓄積する能力が増大していることは、該微生物を培地に培養し、該培地中に生成、蓄積するアミノ酸を公知の方法、例えばHPLCを用いた分析またはバイオアッセイ等により容易に確認することができる。
上記方法により調製できるCsrB RNAまたはCsrC RNAの機能が低下または喪失しており、かつアミノ酸を生成、蓄積する微生物としては、エシェリヒア・コリ RE7ΔcsrB、エシェリヒア・コリ RE7ΔcsrCなどをあげることができる。
２．本発明の製造法
上記１の本発明の微生物を培地に培養し、該培地中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培地からアミノ酸を採取することによりアミノ酸を製造することができる。
アミノ酸としては、L-アラニン、L-セリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-アスパラギン酸、L-アスパラギン、L-ホモセリン、L-スレオニン、L-メチオニン、L-リジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-フェニルアラニンおよびL-ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸をあげることができる。このうち特に好ましいアミノ酸としてはピルビン酸を生合成中間体として生産されるL-アラニン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-バリンおよびL-ロイシンから選ばれるアミノ酸をあげることができる。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、およびアミノ酸の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、グルコース、フラクトースのような糖質、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などをあげることができる。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カリウムなどをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
培養は、好ましくは振とう培養や通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培養時のpHは5〜9、好ましくは6〜7.5である。培養時間は、5時間〜5日間、好ましくは16時間〜3日間である。
培養物中に蓄積したアミノ酸は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばL-アルギニンは、培養終了後、遠心分離などで培養物中の菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
L-アルギニン生産能を有する微生物の作製
エシェリヒア・コリ W3110株の染色体DNA上のL-アルギニン生合成遺伝子のリプレッサー遺伝子であるargR遺伝子、L-アルギニンの取り込みに関わるargK遺伝子、L-アルギニンの分解に関わるastA遺伝子、speAB遺伝子、oat遺伝子（別名ygjG遺伝子）が欠損しており、かつL-アルギニン生合成遺伝子であるargA遺伝子に脱感作変異を導入されたL-アルギニンを生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア・コリの、csrB遺伝子およびcsrC遺伝子を欠損させることにより本発明の微生物を作製した。
なお、argA遺伝子には、argA遺伝子がコードするN-アセチルグルタミン酸合成酵素はL-アルギニンによってフィードバック阻害を受けることが知られているため、これにフィードバック阻害耐性をもたらす脱感作変異として報告されているY19C変異（Rajagopal, B.S., De Ponte, J. 3rd., Tuchman, M., Malamy, M.H., Applied and Environmental Microbiology, Vol. 64. 1805-1811, 1998参照）を導入した。
（１）ストレプトマイシン耐性株の作製
エシェリヒア・コリの遺伝子欠損および遺伝子置換はλred System［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645（2000）］を用いた相同組換えによって行った。なお、以下に示すプラスミドpKD46は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
以下の方法によりエシェリヒア・コリのストレプトマイシン耐性変異として報告されているrpsL遺伝子のK43T変異［Hosaka,T., Tamehiro,N., Chumpolkulwong,N., Hori-Takemoto,C. Shirouzu,M., Yokoyama,S., Ochi,K., Molecular Genetics and Genomics, Vol. 271. 317-324 (2004）］をエシェリヒア・コリ W3110株に導入することにより、ストレプトマイシン耐性株を取得した。
rpsL遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号４および５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、rpsL遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号６および７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは開始コドンから120塩基程度の位置の配列に基づき設計されており、開始コドンから128番目のＡがＣに置換されているため、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでrpsL遺伝子にK43T変異が導入されるように設計されている。
また、rpsL遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するためのプライマーとして配列番号８および９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号４および５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号６および７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kit(キアゲン社製)用いて精製したそれぞれの増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号８および９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbの増幅DNA断片をQiaquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて分離し、ストレプトマイシン耐性変異K43Tの導入されたrpsL遺伝子とその周辺領域を含むDNA断片を得た。
次にエシェリヒア・コリ W3110株にλリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46を導入した。pKD46を保持するW3110株を文献記載の方法［Datsenko, K.A., Warner, B.L., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Vol. 97. 6640-6645 (2000）］に従って培養し、コンピテントセルを調製してエレクトロポレーションにより上記で取得したストレプトマイシン耐性変異K43Tが導入されたrpsL遺伝子とその周辺領域を含むDNA断片を導入した。
形質転換体を、30μg/mlのストレプトマイシンを含むLB寒天プレート（LB+ストレプトマイシン）に塗布して培養し、ストレプトマイシン耐性コロニーを選択した。選択したコロニーを、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天プレート（LB+アンピシリン）にレプリカして培養し、該コロニーの中からアンピシリン感受性を示すコロニーを選択した。上記のようにして得られた株をエシェリヒア・コリ RE1株と命名した。
（２）argR遺伝子の欠損
（ａ）遺伝子欠損用マーカー遺伝子の構築
相同組換えを用いたエシェリヒア・コリの遺伝子欠損および遺伝子置換のためのマーカー遺伝子として用いるcat遺伝子およびsacB遺伝子を以下の方法で単離した。
クローニングベクターpHSG396（タカラバイオ社製）上のcat遺伝子の上流約200bpから下流約100bpまでを増幅するプライマーとして配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、バチルス・ズブチリス 168株のsacB遺伝子の上流約300bpから下流約100bpまでを増幅するプライマーとして配列番号１２および１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。なお、配列番号１０および１２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにはSalI認識サイトを付与した。
配列番号１０および１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、pHSG396を鋳型としてPCRを行い、cat遺伝子を含むDNA断片を得た。PCRはKOD-Plus-（東洋紡績社製）を用いて、添付説明書に従って行った。また配列番号１２および１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用い、常法により調製したバチルス・ズブチリス 168株の野生型株のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、sacB遺伝子を含むDNA断片を得た。
cat遺伝子を含むDNA断片、sacB遺伝子を含むDNA断片をそれぞれ精製した後、SalIで切断した。フェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿を行い、両者を等モルの比率で混合してDNA ligation Kit Ver.2（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液をフェノールクロロホルム処理、及びエタノール沈殿にて精製したものを鋳型とし、配列番号１１および１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてPCRを行い、得られた増幅DNAを精製し、cat遺伝子およびsacB遺伝子を含むDNA断片(cat-sacB断片)を取得した。
（ｂ）argR遺伝子欠損株の作製
argR遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号１４、１５および１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、argR遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号１７、１８および１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。
配列番号１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでargR遺伝子が欠損するように設計されている。
また、argR遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号１４および１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに列番号１７および１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたargR周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号１４および１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号１７および１９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号２０および２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、argR遺伝子が欠損したargR周辺領域を含むDNA断片を得た。
次にエシェリヒア・コリ RE1株にλリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドpKD46を導入し、pKD46を保持するエシェリヒア・コリ RE1株を取得した。得られた形質転換株を上記（１）の文献の方法に従って培養し、コンピテントセルを調製して上記で取得したcat-sacB断片の挿入されたargR周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。
得られた形質転換体を、25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート（LB+クロラムフェニコール）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを、6％シュクロースを含むLB寒天プレート(LB+シュクロース)およびLB+クロラムフェニコールプレートにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。
選択した株について、配列番号１４および１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、argR遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入されていることを確認した。argR遺伝子の位置にcat-sacB断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたargR遺伝子が欠損したargR周辺領域を含むDNA断片をエレクトロポレーションにより導入した。
得られた形質転換体をLB+シュクロースプレートで培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はcat-sacB断片を含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示すため、選択したコロニーをLB+クロラムフェニコールプレートおよびLB+シュクロースプレートにレプリカし、クロラムフェニコール感受性、かつシュクロース耐性を示した株を選択した。
選択された株の中からさらにアンピシリン感受性を示す株、すなわちpKD46が脱落した株を選択し、その株について配列番号１４および１７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いてコロニーPCRを行い、argR遺伝子が欠損していることを確認した。
上記のようにしてargR遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE2株と命名した。
（３）argK遺伝子欠損株の作製
argK遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号２２、２３および２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、argK遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号２５、２６および２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結することができるように設計されている。
配列番号２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでargK遺伝子が欠損するように設計されている。
また、argK遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号２２および２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号２５および２６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたargK周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号２２および２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号２５および２７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅断片を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号２８および２９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅断片を取得した。 反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、argK遺伝子が欠損したargK周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に上記で取得したDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE2株にpKD46を導入して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、argK遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE3株と命名した。
（４）astA遺伝子欠損株の作製
astA遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号３０、３１および３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、astA遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号３３、３４および３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結することができるように設計されている。
配列番号３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでastA遺伝子が欠損するように設計されている。
また、astA遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号３６および３７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号３０および３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号３３および３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅断片を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号３６および３７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅断片を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたastA周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号３０および３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号３３および３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅断片を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号３６および３７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、astA遺伝子が欠損したastA周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に上記で得られたDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE3株にpKD46を導入して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE3株のastA遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE4株と命名した。
（５）speAB遺伝子欠損株の作製
speA遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号３８、３９および４０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、speB遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号４１、４２および４３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号３９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結できるように設計されている。
配列番号４０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでspeA遺伝子とspeB遺伝子が欠損するように設計されている。
また、speA遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、speB遺伝子の終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号４４および４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号３８および３９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４１および４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号４４および４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたspeAB周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号３８および４０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４１および４３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号４４および４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、speA遺伝子およびspeB遺伝子が欠損したspeAB周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に上記で得られたDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE4株にpKD46を導入して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE4株のspeAB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE5株と命名した。
（６）oat遺伝子欠損株の作製
oat遺伝子(別名ygjG遺伝子)の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号４６、４７および４８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、oat遺伝子の終止コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号４９、５０および５１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号４７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号５０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結すできるように設計されている。
配列番号４８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号５１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列を一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでoat遺伝子が欠損するように設計されている。
また、oat遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号５２および５３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号４６および４７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４９および５０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号５２および５３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたoat遺伝子周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号４６および４８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号４９および５１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号５２および５３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、oat遺伝子が欠損したoat遺伝子周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に上記で得られたDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE5株にpKD46を導入して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE5株のoat遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE6株と命名した。
（７）argA脱感作変異の導入
argA遺伝子の脱感作変異として報告されているY19C変異を以下の方法により染色体DNAに導入した。
argA遺伝子の開始コドン付近から、その上流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号５４、５５および５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、argA遺伝子の開始コドン付近から、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号５７、５８および５９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号５５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列と相補的な配列を、配列番号５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列と相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込んだ形で連結できるように設計されている。
配列番号５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号５９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは開始コドンから50塩基程度の位置の配列に基づき設計されており、開始コドンから56番目のＡがＧに置換されているため、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでargA遺伝子にY19C変異が導入されるように設計されている。
また、argA遺伝子の開始コドン付近より上流約1200bpから、終止コドン付近より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号６０および６１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。配列番号５４および５５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号５７および５８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号６０および６１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbの増幅DNA断片をQiaquick Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたargA遺伝子周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号５４および５６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号５７および５９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号６０および６１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbの増幅DNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、脱感作変異Y19Cが導入されたargA遺伝子とその周辺領域を含むDNA断片を得た。次に上記で得られたDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE6株にpKD46を導入して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE6株のargA遺伝子に脱感作変異Y19Cが導入された株を取得し、エシェリヒア・コリ RE7株と命名した。
csrB遺伝子欠損株およびcsrC遺伝子欠損株の作製
（１）csrB遺伝子欠損株の作製
csrB遺伝子の転写領域の5’末端より上流約100bpから、その上流約1600bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号６２、６３および６４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、csrB遺伝子の転写領域の3’末端より下流約20bpから、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号６５、６６および６７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号６３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１のプライマーと相補的な配列を、配列番号６６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３のプライマーと相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結できるように設計されている。
また、配列番号６４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号６７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列をその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでcsrB遺伝子の転写領域が欠損するように設計されている。
また、csrB遺伝子の転写領域の5’末端より上流約1300bpから、3’末端より下流約1200bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号６８および６９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号６２および６３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号６５および６６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型とし、配列番号６８および６９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたcsrB周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号６２および６４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号６５および６７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれそれプライマーセットに用い、エッシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として、一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いて精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号６８および６９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、csrB遺伝子が欠損したcsrB周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に、上記で得られたDNA断片、およびエシェリヒア・コリ RE7株にpKD46を導して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE7株のcsrB遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE7ΔcsrB株と命名した。
（２）csrC遺伝子欠損株の作製
csrC遺伝子の転写領域の5’末端より上流約200bpから、その上流約1600bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号７０、７１および７２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、csrC遺伝子の転写領域の3’末端より下流約20bpから、その下流約1500bpの領域を増幅するプライマーとして配列番号７３、７４および７５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号７１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと相補的な配列を、配列番号７４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは配列番号１３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと相補的な配列を、それぞれその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物が、マーカー遺伝子であるcat-sacB断片を挟み込む形で連結できるように設計されている。
また、配列番号７２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号７５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは互いに相補的な配列をその一部に有しており、各々のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて得られる増幅産物がこの部分で連結されることでcsrC遺伝子の転写領域が欠損するように設計されている。
また、csrC遺伝子の転写領域の5’末端より上流約1500bpから、3’末端より下流約1300bpまでの領域を増幅するプライマーとして配列番号７６および７７のオリゴヌクレオチドを合成した。
配列番号７０および７１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号７３および７４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、常法により調製したエシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物と、cat-sacB断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として配列番号７６および７７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットに用い、二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供して約6kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、cat-sacB断片が挿入されたcsrC周辺領域を含むDNA断片を得た。
また、配列番号７０および７２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、並びに配列番号７３および７５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用い、エシェリヒア・コリ W3110株のゲノムDNAを鋳型として一回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
Qiaquick PCR purification Kitを用いてそれぞれ精製した増幅産物を等モルの比率で混合し、これを鋳型として配列番号７６および７７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれプライマーセットに用いて二回目のPCRを行い、増幅産物を取得した。
反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、約2.5kbのDNA断片をQiaquick Gel Extraction Kitを用いて分離し、csrC遺伝子が欠損したcsrC周辺領域を含むDNA断片を得た。
次に、上記で得られたDNA断片と、エシェリヒア・コリ RE7株にpKD46を導して得られた株を用い、上記（２）（ｂ）に準じた方法により、エシェリヒア・コリ RE7株のcsrC遺伝子が欠損した株を取得し、エシェリヒア・コリ RE7ΔcsrC株と命名した。
csrB遺伝子欠損株およびcsrC遺伝子欠損株を用いたアミノ酸の製造
（１）csrB遺伝子欠損株およびcsrC遺伝子欠損株の培養
エシェリヒア・コリ RE7株、エシェリヒア・コリ RE7ΔcsrB株、およびエシェリヒア・コリ RE7ΔcsrC株をそれぞれLB+ストレプトマイシンプレート上で30℃にて一晩培養し、グルコース15g/L、大豆ペプトン10g/L、イーストエキストラクト10g/L、NaCl 2.5g/L、CaCO3 30g/Lからなる培地が300mlが入ったバッフル付き2Ｌ三角フラスコへ植菌して、30℃で24時間培養した。
培養終了後、50mlの培養物を800mlの種培地［グルコース30g/L、イーストエキストラクト2g/L、(NH4)2SO415g/L、KH2PO45g/L、MgSO4・7H2O 1.8g/L、NaCl 0.6g/L、CaCl2・2H2O 0.2g/L、FeSO4・7H2O 50mg/L、ZnSO4・7H2O 12mg/L、MnSO4・7H2O 5mg/L、CuSO4・5H2O 0.5mg/L、チアミン塩酸塩0.1g/L］が入っているジャーファーメンターに接種し、800rpmで攪拌しながら35℃、1L／分の通気量で培養した。培養中、pHを6.8に維持するために18%アンモニア溶液を加えた。
グルコースが完全に消費されるまで培養した後、38mlの培養物を450mlの発酵培地［グルコース30g/L（別蒸にて調製）、コーンスティープリカー3g/L、(NH4)2SO420g/L、KH2PO44.2g/L、MgSO4・7H2O 2.5g/L、Na2SO40.7g/L、CaCl2・2H2O 0.23g/L、FeSO4・7H2O 20mg/L、MnSO4・7H2O 10mg/L、ZnSO4・7H2O 2mg/L、CuSO4・5H2O 2mg/L、NiCl2・6H2O 2mg/L、CoCl2・6H2O 2mg/L、β−アラニン50mg/L、ニコチン酸50mg/L、チアミン塩酸塩40mg/L、ビオチン490μg/L］が入ったジャーファーメンターに接種し、1200rpmで攪拌しながら35℃、2L／分の通気量で培養した。培養中、pHを6.8に維持するために18%アンモニア溶液を加えた。
培養物中のグルコースが完全に消費された時点よりフィード培地［グルコース600g/L、(NH4)2SO468g/L（それぞれ別蒸にて調製）］を17ml/時間の速度で流加して、該フィード培地を425ml添加するまで培養を継続した。培養終了後、培養物上清のL-アルギニン濃度をHPLCにて定量した。
HPLC分析は、分離カラムにAQ-312(YMC社製)、移動相にはクエン酸ナトリウム 2.94g/L、硫酸ナトリウム 1.42g/L、アセトニトリル 233mL/Lおよびラウリル硫酸ナトリウム 3g/L を含有するpH 6.0の溶液を用い、60℃で行った。アミノ酸の検出、定量は、分離カラムからの溶出液と、反応液(ホウ酸 18.5g/L、NaOH 11g/L、オルトフタルアルデヒド 0.6g/L、メルカプトエタノール 2ml/LおよびBrige-35 3mL/Lを含有する溶液)とを混合した後、励起波長345nm、吸収波長455nmの蛍光分析により行った。結果を表１に示す。
表１に示すとおり、L-アルギニンの蓄積量、対糖収率ともcsrB遺伝子欠損株、およびcsrC遺伝子欠損株とも、親株より向上していた。
本発明によれば、工業的に有利にＬ−アミノ酸を製造することができる。
配列番号１−人工配列の説明：保存配列
配列番号２−人工配列の説明：保存配列
配列番号３−人工配列の説明：保存配列
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ

Claims (5)

  1. CsrC RNAの機能が低下または喪失しており、かつL-グルタミン酸、L-グルタミン、L-プロリン、L-オルニチン、L-シトルリン、L-アルギニンからなる群より選ばれるアミノ酸を生成、蓄積する能力を有する腸内細菌に属する微生物を培地に培養し、該培地中に該アミノ酸を生成、蓄積させ、該培地から該アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
  2. CsrC RNAの機能が低下または喪失している微生物がcsrC遺伝子の一部または全部が欠損している微生物である、請求項１記載の製造法。
  3. CsrC RNAが、配列番号７９で表される塩基配列からなるDNAの転写物である、請求項１または２記載の製造法。
  4. 腸内細菌に属する微生物がエシェリヒア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、セラチア(Serratia)属、エルシニア(Yersinia)属およびエルウィニア(Erwinia)属のいずれかに属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
  5. エシェリヒア(Escherichia)属する微生物がエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項４記載の製造法。
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