JPWO2006001380A1 - 物質の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
一方、L−グルタミンの生合成はglnA遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ(GS)によって行われるが、GS活性は非常に厳密かつ複雑な制御を受けることが知られている。すなわちGSはアデニリル化されることで活性を負に調節されている。このアデニリル化および脱アデニリル化はglnE遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ(以下、GlnE蛋白質と称す)によって触媒され、どちらの方向を触媒するかはさらにglnB遺伝子にコードされるグルタミンシンテターゼ調節蛋白質PII(PII regulatory protein for glutamine synthetase。以下、GlnB蛋白質と称す)によって決定される。GlnB蛋白質がウリジリル化されている場合はGlnE蛋白質によるGSの脱アデニリル化を促進し、逆にGlnB蛋白質がウリジリル化されていない場合はGlnE蛋白質によるGSのアデニリル化を促進する。GlnB蛋白質のウリジリル、脱ウリジリル化はglnD遺伝子にコードされる蛋白質によって決定される。L−グルタミンは脱ウリジリル化を促進するため、GSはアデニリル化されて活性が低下し、L−グルタミンの合成が低下する調節が働く。一方、2−オキソグルタル酸はGlnB蛋白質のウリジリル化を促進するため、上記と逆のスキームによりL−グルタミン合成が促進される(非特許文献1および2)。
また、グルタミン生産菌としては、glnE遺伝子が欠損したコリネグルタミクム・フラバム(特許文献2)、glnA遺伝子を改変しかつgdh遺伝子の発現を強化したコリネグルタミクム・フラバム(特許文献2)、L−アルギニン生産菌としては、argA遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ(特許文献3)など、L−トリプトファン生産菌としては、トリプトファンオペロン、aroG遺伝子およびserA遺伝子を導入したエシェリヒア・コリ(特許文献4)など、L−ヒスチジン生産菌としては、アミノキノリン耐性を付与したエシェリヒア・コリ(特許文献5)など、核酸生産菌としては、5’−イノシン酸を生産するpurA、deoD、purR、add、gsk、edd、xapA、ushAおよびaphの各遺伝子が欠損し、脱感作型purF遺伝子の発現を強化したエシェリヒア・コリ(特許文献6)など、5’−グアニル酸を生産するpurA、deoD、purR、add、gsk、edd、xapA、ushAおよびaphの各遺伝子を欠損し、脱感作型purF遺伝子およびguaAB遺伝子の発現を強化したエシェリヒア・コリ(特許文献6)などが知られているが、GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下もしくは喪失した微生物であり、かつL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物、および該微生物を用いたL−グルタミンまたは該物質の製造法は知られていない。
E.coli and Salmonella,Second Edition(1996) FEMS Microb.Lett.,201,91−98(2001)
(1)グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ(以下、GlnE蛋白質と称す)およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質PII(PII regulatory protein for glutamine synthetase。以下、GlnB蛋白質と称す)の活性が低下または喪失し、かつL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物。
(2)エシェリヒア属に属する微生物が野生型のGlnE蛋白質をコードする遺伝子(以下、glnE遺伝子と称す)、および野生型のGlnB蛋白質をコードする遺伝子(以下、glnB遺伝子と称す)の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有する微生物である、上記(1)の微生物。
(3)エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、上記(1)または(2)の微生物。
(4)L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記(1)〜(3)のいずれか1つの微生物。
(5)アミノ酸がL−アルギニン、L−トリプトファン、L−ヒスチジンおよびL−グルタミン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記(4)の微生物。
(6)核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、5’−アデニル酸、5’−イノシン酸、5’−グアニル酸、5’−シチジル酸、5’−キサンチル酸、5’−ウリジル酸および5’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記(4)の微生物。
(7)上記(1)〜(3)のいずれか1つの微生物を培地に培養し、該培地中にL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からL−グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とするL−グルタミンまたは該物質の製造法。
(8)L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、上記(7)の製造法。
(9)アミノ酸がL−アルギニン、L−トリプトファン、L−ヒスチジン、L−グルタミン酸からなる群よりえらばれるアミノ酸である、上記(8)の製造法。
(10)核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、5’−アデニル酸、5’−イノシン酸、5’−グアニル酸、5’−シチジル酸、5’−キサンチル酸、5’−ウリジル酸および5’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、上記(8)の製造法。
GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下または喪失したエシェリヒア属に属する微生物は、既存のエシェリヒア属に属する微生物が有するglnE遺伝子またはglnB遺伝子欠損変異をP1形質導入[J.H.Miller,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.(1972)]によって1種のエシェリヒア属に属する微生物に集積する方法、UV照射などの変異処理後、GlnE蛋白質またはGlnB蛋白質の活性が低下または喪失した菌株を選択する方法、またはエシェリヒア属に属する微生物の染色体DNA上のglnE遺伝子およびglnB遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。ここで、glnE遺伝子およびglnB遺伝子は、それぞれGlnE蛋白質またはGlnB蛋白質をコードする塩基配列にプロモーター配列などの該遺伝子の発現を調節する領域を含む塩基配列が付加した配列よりなる。
本発明においてGlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下したエシェリヒア属に属する微生物とは、上記変異を導入することにより、該変異導入前の株(親株)に比べ、GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下している微生物であり、好ましくは80%以下、好ましくは50%以下、より好ましくは30%以下、さらに好ましくは20%、特に好ましくは10%以下、最も好ましくは5%以下に低下した微生物をいう。GlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性は、公知の方法により測定することができる。
相同組換えに用いられるDNAとしては、
(a)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に存在するDNAと相同性を有するDNAを、薬剤耐性遺伝子の両端に有する直鎖DNA、
(b)塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に存在するDNAと相同性を有するDNAが連結した直鎖DNA、
(c)薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子からなるDNAの両端に、塩基の欠失、置換または付加の導入対象である染色体DNA上の領域の両端の外側に存在するDNAと相同性を有するDNAを有する直鎖DNA、および
(d)上記(a)の直鎖DNAにおいて、薬剤耐性遺伝子と染色体DNA上の領域の両端の外側に存在するDNAと相同性を有するDNAの間に、さらに酵母由来のFlp recombinase〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,82,5875(1985)〕が認識する塩基配列を有するDNA、
をあげることができる。
酵母由来のFlp recombinaseが認識する塩基配列とは、該蛋白質が認識し、相同組換えを触媒する塩基配列であれば、特に限定されないが、好ましくは配列番号9で表される塩基配列を有するDNA、および該DNAにおいて1個〜数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつ酵母由来のFlp recombinaseが認識し、相同組換えを触媒する塩基配列を有するDNAをあげることができる。
上記塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol.,183,63(1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore=100、wordlength=12とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
相同組換えを利用した微生物の染色体DNAに塩基の欠失、置換または付加を導入する、より具体的な方法としては、以下の方法1〜4をあげることができる。
方法1:上記(a)または(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する方法。
方法2:上記方法1により取得された形質転換株に、上記(b)の直鎖DNAを導入し、該方法により染色体DNA上に挿入された薬剤遺伝子を削除することにより、微生物の染色体DNA上の領域を置換または欠失させる方法。
方法3:
[1]上記(c)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]染色体DNA上の置換または欠失の対象領域の両端の外側に位置するDNAと相同性を有するDNAを、染色体DNA上における方向と同一の方向で連結したDNAを合成し、上記[1]で得られた形質転換株に導入する、
[3]ネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が発現する条件下において、上記[2]の操作を行った形質転換株を培養し、該培養において生育可能な株を、薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子が染色体DNA上から削除された株として選択する方法。
方法4:
[1]上記(d)の直鎖DNAを宿主微生物に導入し、薬剤耐性を指標に該直鎖DNAが染色体DNA上に相同組換えにより挿入された形質転換株を選択する、
[2]上記[1]で得られた形質転換株にFlp recombinase遺伝子発現プラスミドを導入し、該遺伝子を発現させた後、上記[1]で用いた薬剤に感受性である株を取得する方法。
上記方法2〜4は、最終的に得られる形質転換株の染色体DNA上には薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子等の外来遺伝子を残さない方法である。よって、同一の薬剤耐性遺伝子およびネガティブセレクションに用いることができる遺伝子を用いて、該方法の操作を繰り返すことにより、容易に染色体DNA上の位置の異なる2以上の領域に塩基の欠失、置換または付加を有する微生物を製造することができる。
上記したGlnE蛋白質およびGlnB蛋白質の活性が低下または喪失したエシェリヒア属に属する微生物は、L−グルタミンを生成、蓄積する能力を有するだけでなく、L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力も有する。
(a)該物質の生合成を制御する機構の少なくとも1つを緩和または解除する方法、
(b)該物質の生合成に関与する酵素の少なくとも1つを発現強化する方法、
(c)該物質の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも1つのコピー数を増加させる方法、
(d)該物質の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも1つを弱化または遮断する方法、および
(e)野生型株に比べ、該物質のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などの方法を単独または組み合わせて用いて取得される微生物をあげることができる。
L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生産する能力を有する公知のエシェリヒア属に属する微生物としては、L−アルギニン生産菌であるエシェリヒア・コリ(特開昭57−5693号)など、L−トリプトファン生産菌であるエシェリヒア・コリ(米国特許第5,939,295号)、L−ヒスチジン生産菌であるエシェリヒア・コリ(特開2001−86998)、L−グルタミン酸生産菌であるエシェリヒア・コリ(特開平5−244970)、5’−イノシン酸生産菌である、エシェリヒア・コリ(特開2002−355087)、5’−グアニル酸生産菌であるエシェリヒア・コリ(特開2002−355087)などをあげることができる。
2.本発明の製造法
上記1の方法で調製することができるエシェリヒア属に属する微生物を培地に培養し、該培地中にL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からL−グルタミンまたは該物質を採取することによりL−グルタミンまたは該物質を製造することができる。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩、ビタミンなど本発明の微生物の増殖、およびL−グルタミンまたはL−グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質の生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、アミン等の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物のような天然窒素源などをあげることができる。
ビタミンとしては、ビオチンやチアミンなどをあげることができる。さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質(例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸)を添加することができる。
培地中に蓄積したL−グルタミンまたはL−グルタミンからから供給される窒素を利用して生合成される物質は、通常の精製方法によって採取することができる。例えばL−グルタミンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、イオン交換、濃縮、結晶分別によって採取することができる。
エシェリヒア・コリの染色体DNA上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,97,6641−6645(2000)]に従って行った。なお、以下に示すプラスミドpKD46、pKD3およびpCP20は、エシェリヒア・コリジェネティック ストック センター(米国エール大学)から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
(1)遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
エシェリヒア・コリK12株のglnE、glnBの各遺伝子の塩基配列は既に明らかにされている[Science,5331,1453−1474(1997)]。報告されている塩基配列に基づいてパーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型DNA合成機を用いて、glnE遺伝子欠損用のプライマーDNAとして配列番号1および2で表される塩基配列からなるDNA、glnB遺伝子欠損用のプライマーDNAとして配列番号3および4で表される塩基配列からなるDNAを合成した。合成したプライマーDNAは、各々の欠失の標的遺伝子の上流と下流に位置する36bpからなる塩基配列に基づき設計した。
該混合液を遠心分離後、得られた上層に2倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離してDNAを沈殿させた後、該DNAを20μLのTEに溶解した。上記操作により、glnE遺伝子欠損用、およびglnB遺伝子欠損用のクロラムフェニコール耐性遺伝子断片をそれぞれ取得した。
(2)染色体DNA上のglnE遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJM101株の作製
エシェリヒア・コリJM101株をpKD46で形質転換した後、100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地上でpKD46を保持するエシェリヒア・コリJM101株(以下、エシェリヒア・コリJM101/pKD46と称す)を選択した。10mmol/LのL−アラビノースと50μg/mlのアンピシリン存在下で培養したエシェリヒア・コリJM101/pKD46を、電気パルス法によりglnE遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて形質転換し、JM101株の染色体DNA上のglnE遺伝子にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、glnE構造遺伝子が欠損するように組換えられた株を25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で選択した。
コロニーPCRは、200μlのピペットチップをコロニーに触れさせることで取得した量の菌体、プライマー各0.5μmol/L、PfuDNAポリメラーゼ2.5units、Pfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液4μL、deoxyNTP各200μmol/Lを含む反応液40μlを用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。PCRに供した株のうちで遺伝子増幅の見られなかった株は、glnE遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリJGLE1と命名した。
(3)染色体DNA上のglnE遺伝子およびglnB遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリJM101株の作製
上記(2)で得られたエシェリヒア・コリJGLE1株をpKD46で形質転換した後、100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養することによりpKD46を保持するエシェリヒア・コリJGLE1株(以下、エシェリヒア・コリJGLE1/pKD46と称す)を取得した。上記(2)と同様の操作により、エシェリヒア・コリJGLE1/pKD46をglnB遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて電気パルス法により形質転換し、染色体DNA上のglnB遺伝子が欠損するように組換えられた株を取得した。glnB遺伝子の内部配列を元に設計した配列番号7および8で表される塩基配列からなるプライマーDNAを用いて、上記(2)の条件下でコロニーPCRを行った。該PCRにより遺伝子増幅が見られなかった株は、glnB遺伝子欠損株であることを確認し、エシェリヒア・コリJGLBE1と命名した。
エシェリヒア・コリJM101、実施例1で得られたエシェリヒア・コリJGLB1、エシェリヒア・コリJGLE1およびエシェリヒア・コリJGLBE1をそれぞれ8mlのLB培地[10g/lバクトトリプトン(ディフコ社製)、5g/lイーストエキス(ディフコ社製)、5g/l塩化ナトリウム]が入っている試験管に接種し、28℃で17時間培養した。該培養液をそれぞれ生産培地[16g/Lリン酸水素二カリウム、14g/Lリン酸二水素カリウム、5g/L硫酸アンモニウム、1g/Lクエン酸(無水)、5g/Lカザミノ酸(ディフコ社製)、10g/Lグルコース、10mg/LビタミンB1、25mg/L硫酸マグネシウム・7水和物、50mg/L硫酸鉄・7水和物、pH7.2に10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・7水和物、硫酸鉄・7水和物は別個に蒸煮後添加した]が8ml入っている試験管に1%接種し、30℃で24時間培養した後、該培養液を遠心分離し培養上清を取得した。
実施例1で得られたエシェリヒア・コリJGLBE1を50mlのLB培地が入っている300ml容の三角フラスコに接種し、28℃で17時間培養した。
50時間培養した後の培養液を実施例2と同様の方法で分析した結果、培養液中には8.0g/LのL−グルタミンが蓄積していた。
配列番号2−人工配列の説明:合成DNA
配列番号3−人工配列の説明:合成DNA
配列番号4−人工配列の説明:合成DNA
配列番号5−人工配列の説明:合成DNA
配列番号6−人工配列の説明:合成DNA
配列番号7−人工配列の説明:合成DNA
配列番号8−人工配列の説明:合成DNA
配列番号9−人工配列の説明:合成DNA
Claims (10)
- グルタミンシンテターゼアデニリルトランスフェラーゼ(以下、GlnE蛋白質と称す)およびグルタミンシンテターゼ調節蛋白質PII(PII regulatory protein for glutamine synthetase。以下、GlnB蛋白質と称す)の活性が低下または喪失し、かつL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積する能力を有するエシェリヒア属に属する微生物。
- エシェリヒア属に属する微生物が野生型のGlnE蛋白質をコードする遺伝子、および野生型のGlnB蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列中に塩基の欠失、置換または付加がある該遺伝子を有する微生物である、請求項1記載の微生物。
- エシェリヒア属に属する微生物がエシェリヒア・コリである、請求項1または2記載の微生物。
- L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の微生物。
- アミノ酸がL−アルギニン、L−トリプトファン、L−ヒスチジンおよびL−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項4記載の微生物。
- 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、5’−アデニル酸、5’−イノシン酸、5’−グアニル酸、5’−シチジル酸、5’−キサンチル酸、5’−ウリジル酸および5’−チミジル酸からなる群より選ばれる核酸である、請求項4記載の微生物。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の微生物を培地に培養し、該培地中にL−グルタミンまたはL−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質を生成、蓄積させ、該培地からL−グルタミンまたは該物質を採取することを特徴とするL−グルタミンまたは該物質の製造法。
- L−グルタミンから供給される窒素を利用して生合成される物質がアミノ酸または核酸である、請求項7記載の製造法。
- アミノ酸がL−アルギニン、L−トリプトファン、L−ヒスチジンおよびL−グルタミン酸からなる群より選ばれるアミノ酸である、請求項8記載の製造法。
- 核酸がアデノシン、イノシン、グアノシン、キサントシン、シチジン、ウリジン、チミジン、5’−アデニル酸、5’−イノシン酸、5’−グアニル酸、5’−シチジル酸、5’−キサンチル酸、5’−ウリジル酸および5’−チミジル酸からなる群よりえらばれる核酸である、請求項8記載の製造法。
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