JP2005073697A

JP2005073697A - 腸内細菌科の細菌を用いたｌ−ヒスチジンの製造法

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Publication number: JP2005073697A
Application number: JP2004245485A
Authority: JP
Inventors: Elena Vitalievna Klyachko; ヴィタリエヴナクリャチコエレーナ; Rustem Saidovich Shakulov; サイドヴィッチシャクロフルステム; Yuri Ivanovich Kozlov; イヴァノヴィッチコズロフユーリー
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-25
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2024-08-25
Also published as: RU2003126290A; EP1510570A2; US20050048631A1; EP1510570A3; US7785860B2; EP1510570B1; RU2276688C2; JP4626220B2

Abstract

【課題】向上したＬ−ヒスチジン生産能を持つＬ−ヒスチジン生産株を開発すること、及びそれらの株を用いてＬ−ヒスチジンを製造する方法を提供すること。
【解決手段】５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール（ＡＩＣＡＲ）からイノシン−５'−モノホスフェート（ＩＭＰ）への変換に関与する１又はそれ以上の酵素の活性が増強された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌を培地で培養し、同培地からＬ−ヒスチジンを回収することにより、Ｌ−ヒスチジンを製造する。
【選択図】なし

Description

本発明は、バイオテクノロジーに関し、詳しくは発酵による、Ｌ−ヒスチジンなどのＬ−アミノ酸の製造法に関する。本発明は、さらに、エシェリヒア・コリに由来する遺伝子に関する。同遺伝子は、Ｌ−ヒスチジン生産能の改善に有用である。

従来、Ｌ−アミノ酸は、自然界から得られた微生物株、またはＬ−アミノ酸生産能が向上するように改変されたそれらの変異株を利用する発酵法により、工業的に製造されてきた。

Ｌ−アミノ酸生産能を向上させる多くの技術（例えば、組換えＤＮＡによる微生物の形質転換による）が開示されてきた（例えば、特許文献１を参照）。これらの技術は、アミノ酸生合成に関与する酵素の活性を増加させること、および／または、産生されたＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害から標的酵素を脱感作させることによる（例えば、特許文献２、特許文献３、または特許文献４および特許文献５を参照）。

Ｌ−ヒスチジン生合成経路では、ｈｉｓＨ遺伝子およびｈｉｓＦ遺伝子によりコードされるイミダゾールグリセロールホスフェートシンターゼが、中間体化合物である５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール（ＡＩＣＡＲ）を放出する反応を触媒する。同時に、Ｌ−ヒスチジン生合成経路における初発反応はＨｉｓＧタンパク質により触媒され、これはホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）のＣ−１の、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のプリン環のＮ−１による置換を含む。しかし、ＡＩＣＡＲはヒスチジン生合成に際して放出されるだけではなく、これはまたプリン、ならびに必然的にＡＭＰおよびＡＴＰのようなプリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの生合成における前駆体でもある。したがって、ＡＩＣＡＲのＡＭＰへの再生はＬ−ヒスチジン生産にとって重要なプロセスである。

ｐｕｒＨ遺伝子は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ（５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾールトランスホルミラーゼ（transformylase）としても知られている）［ＥＣ２．１．２．３］およびＩＭＰシクロヒドロラーゼ［ＥＣ３．５．４．１０］の活性を有する二機能性酵素をコードしている。後者は、イノシンモノホスフェート（ＩＭＰ）の新規（de novo）合成における最後から２番目および最後の工程を触媒する（非特許文献１）。

しかし、現在、腸内細菌科の菌株を用いたＬ−ヒスチジン製造を向上させるために、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの２つの活性を向上させること記載した報告はない。
米国特許第４，２７８，７６５号特開昭５６−１８５９６（１９８１）国際公開第９５／１６０４２号パンフレット米国特許第５，６６１，０１２号第６，０４０，１６０号 Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996

本発明の目的は、向上したＬ−ヒスチジン生産能を持つＬ−ヒスチジン生産株を開発することである。また、本発明の目的は、それらの株を用いてＬ−ヒスチジンを製造する方法を提供することである。

本発明は、５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール（ＡＩＣＡＲ）からイノシン−５'−モノホスフェート（ＩＭＰ）への変換に関与する１又はそれ以上の酵素の活性が増強された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌を提供する。
また本発明は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性が増強された前記細菌を提供する。
また本発明は、エシェリヒア属に属する前記細菌を提供する。
また本発明は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強された前記細菌を提供する。
また本発明は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、（ａ）ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、及び（ｂ）同遺伝子の増強されるように同遺伝子の発現制御配列を改変することから選ばれる方法により増強された前記細菌を提供する。
また本発明は、前記コピー数は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより増加した、前記細菌を提供する。
また本発明は、前記コピー数は、前記細菌の染色体中への付加的なコピー数の前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子の組込みにより増加した、前記細菌を提供する。
また本発明は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子はエシェリヒア属細菌に由来する前記細菌を提供する。
また本発明は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のタンパク質変異体であって、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質、をコードする、前記細菌。
また本発明は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、以下のＤＮＡ（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１５９０のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜１５９０のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる群から選ばれる、前記細菌を提供する。
また本発明は、前記ストリンジェントな条件は、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、６０℃で１５分洗浄が行われる条件である、前記細菌を提供する。
また本発明は、前記細菌を培地で培養し、同培地からＬ−ヒスチジンを回収することを含む、Ｌ−ヒスチジンの製造法を提供する。
また本発明は、前記細菌は、ヒスチジン生合成の遺伝子の発現が増強された、前記の方法を提供する。
また本発明は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性が増強された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌であって、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％を越える相同性を有し、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコード
するである細菌を提供する。

本発明により、発酵法によるＬ−ヒスチジンの生産性を向上させることができる。

前記課題は、ｐｕｒＨ遺伝子産物である、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ（５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾールトランスホルミラーゼ）［ＥＣ２．１．２．３］およびＩＭＰシクロヒドロラーゼ［ＥＣ３．５．４．１０］は、標的Ｌ−アミノ酸の生合成経路に関与しないが、付加的なコピーがそれぞれのヒスチジン生産菌の細胞中に導入されると同アミノ酸製造を向上させ得るをコードすることを明らかにすることによって達成された。こうして本発明は完成した。
以下、本発明を詳細に説明する。

「Ｌ−ヒスチジン生産菌」は、本発明の細菌を培地で培養したときに、培地中にＬ−ヒスチジンを生産、分泌する能力を有する細菌を意味する。Ｌ−ヒスチジン生産能は育種により付与されてもよく、例えば細菌をＬ−ヒスチジン生合成遺伝子の発現が強化された組換えＤＮＡにより形質転換されてもよい。また、Ｌ−ヒスチジン生産能は育種により増強されてもよく、例えばＬ−ヒスチジンの構造アナログであるＤ，Ｌ−１，２，４−トリアゾール−３−アラニンで選択し、それによって、Ｌ−ヒスチジン生合成のキー酵素であるＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｉｇＧ遺伝子によりコードされる）であって、Ｌ−ヒスチジンによるフィードバック阻害が解除された酵素（ロシア特許第２００３６７７号及び第２１１９５３６号）を保持し、かつ、Ｌ−ヒスチジンを生産し得る細菌を得てもよい。ここで使用される用語「Ｌ−ヒスチジン生産菌」はまた、野生株または親株よりも多い量のＬ−ヒスチジンを培地中に生成、分泌し得る細菌を意味し、好ましくは、微生物が、０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量のＬ−ヒスチジンを培地中に生成、分泌し得ることを意味する。

腸内細菌科（Enterobacteriaceae）には、エシェリヒア属、エルヴィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）属、およびセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属に属する細菌が含まれる。エシェリヒア属が好適である。
用語「エシェリヒア属に属する細菌」は、微生物学の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属として分類される細菌を意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物にはエシェリヒア・コリ（E. coli）が含まれるが、これには限定されない。

用語「５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール（ＡＩＣＡＲ）からイノシン−５'−モノホスフェート（ＩＭＰ）への変換に関与する酵素」は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼおよびＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有する酵素を含む。一般に、自然の生物においては、両酵素活性は１つの融合タンパク質により発現される。しかし、酵素活性が別々の非融合タンパク質により発現される場合も、本発明に含まれる。酵素のうちの１つ、好ましくはＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼの活性が向上している細菌も、本発明に含まれる。

用語「ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性」は、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸からホルミル部分をＡＩＣＡＲへ移し、続いてプリンサイクルを形成してイノシン５'−モノホスフェート（ＩＭＰ）をもたらす反応を触媒する活性を意味する。ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、ＡＩＣＡＲおよび基質として（６−Ｒ）Ｎ１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸を使用して、例えば、Ni, L. et al (Gene, 106(2): 197-205 (1991)) により記載される方法により測定し得る。また、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、
変異相補法により示され得る（例えば、Aiba, A. and Mizobuchi, K., J. Biol. Chem. 264(35): 21239-46 (1989)を参照）。

用語「酵素活性が増強された」は、細胞あたりの活性が非改変株（例えば、野生型株）のものよりも高いことを意味し、例えば、細胞あたりのＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ分子数が増加した細胞、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ分子あたりの比活性が増加した細胞等が含まれる。さらに、比較の対象となる野生株には、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２が含まれる。ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの細胞内活性の増強の結果として、培地中のＬ−ヒスチジン蓄積量が増加する。

細菌細胞内のＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性の増強は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼをコードする遺伝子の発現の増強により達成され得る。腸内細菌科の細菌由来ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子、及び／又はコリネ型細菌等の他の細菌由来の遺伝子が使用され得る。エシェリヒア属に属する細菌由来の遺伝子が好ましい。

エシェリヒア・コリのＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ（それぞれ、ＥＣ番号２．１．２．３および３．５．４．１０）をコードする遺伝子として、ｐｕｒＨ遺伝子が既に報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０００９１３．１、ｇｉ：１６１２７９９４の配列中ヌクレオチド番号４２０３５２１〜４２０５１１０）。したがって、ｐｕｒＨ遺伝子は、同遺伝子のヌクレオチド配列によって調製されたプライマーを利用したＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション；White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)を参照）により得られ得る。同様にして、他の微生物のＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼをコードする遺伝子を取得し得る。

エシェリヒア・コリ由来のｐｕｒＨ遺伝子には、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）をコードするＤＮＡが含まれる。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列のタンパク質変異体であって、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡには、それらのタンパク質の活性を失わない限り、タンパク質（Ａ）の１または複数の位置での１または複数のアミノ酸の欠失、置換、挿入、または付加を含む可能性のあるタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。「複数の」アミノ酸の数は、タンパク質の三次元構造中のアミノ酸残基の位置または種類によって異なるが、タンパク質（Ａ）に対して好ましくは２〜５０、より好ましくは２〜２０、特に好ましくは２〜１０であり得る。これは以下の理由による。いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、そしてそのようなアミノ酸における差異はタンパク質の三次元構造およびその活性に大きくは影響しないからである。したがって、タンパク質（Ｂ）は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの全アミノ酸残基に対して３０〜５０％以上、好ましくは５０〜７０％以上、より好ましくは７０〜９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するものであり得る。

タンパク質またはＤＮＡの相同性の度合いを評価するには、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索、およびＣｒｕｓｔａｌＷ等公知の計算法が使用され得る。

ＢＬＡＳＴ（基本局所配列比較検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool））
は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムに用いられている発見的（heuristic）検索アルゴリズムである。これらのプログラムは、Karlin. Samuel and Stephen F. Altschulの統計的方法を用いて、有意度をそれらの発見によるものとする（「一般的スコアリングスキームを使用することによる分子配列の特徴の統計的有意度を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes）」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-58；「分子配列における複数のハイスコア断片のための応用および統計（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1993, 90:5873-7）。ＦＡＳＴＡ検索法は、W. R. Pearsonにより記載される（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡでの迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」, Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. により記載される（「ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティ、および重さマトリクス選択を通じた進化的多重配列比較の感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」, Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680)。

上記のようなＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの改変は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性が維持されるような保存的変異である。置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１残基が除去され、そこに他の残基が挿入される変化である。ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼタンパク質の元々のアミノ酸を置換し、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸としては、Alaからser又はthrへの置換、argからgln、his又はlysへの置換、asnからglu、gln、lys、his又はaspへの置換、aspからasn、glu又はglnへの置換、cysからser又はalaへの置換、glnからasn、glu、lys、his、asp又はargへの置換、gluからasn、gln、lys又はaspへの置換、glyからproへの置換、hisからasn、lys、gln、arg又はtyrへの置換、ileからleu、met、val又はpheへの置換、leuからile、met、val又はpheへの置換、lysからasn、glu、gln、his又はargへの置換、metからile、leu、val又はpheへの置換、pheからtrp、tyr、met、ile又はleuへの置換、serからthr又はalaへの置換、thrからser又はalaへの置換、trpからphe又はtyrへの置換、tyrからhis、phe又はtrpへの置換、及び、valからmet、ile又はleuへの置換が挙げられる。

タンパク質変異体のような、（Ａ）に定義されるタンパク質と実質的に同じタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１または複数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、または付加されるように部位特異的突然変異法を使用して、（Ａ）に定義されるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を改変することにより、得ることができる。そのような改変ＤＮＡは、変異を発生させる試薬および条件での処理を用いる従来法により得られ得る。そのような処理として、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡのヒドロキシルアミンでの処理、またはＤＮＡを保持する細菌のＵＶ照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたは亜硝酸などの試薬での処理が挙げられる。

本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、異なる株で見いだされ得る変異体、および自然の多様性によるエシェリヒア属細菌の変異体を含む。そのような変異体をコードするＤＮＡは、ストリンジェントな条件下でｐｕｒＨ遺伝子または遺伝子の一部分とハイブリダイズし、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することにより得られ得る。用語「ストリンジェントな条件」には、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、かつ、非特異的ハイブリッドが形成されないような条件を含む。例えば、ストリンジェントな条件には、高い相同
性を有するＤＮＡ、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズする条件が含まれる。あるいは、ストリンジェントな条件には、サザンンハイブリダイゼーションでの通常の洗浄の条件、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を含む。洗浄の時間は、ブロッティングに使用される膜のタイプに依存し、一般に製造元により推奨される。例えば、ストリンジェントな条件におけるＨｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）の洗浄に推奨される時間は１５分である。変異体をコードするＤＮＡのための、かつｐｕｒＨ遺伝子とハイブリダイズするプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配列の部分配列もまた使用され得る。そのようなプローブは、プライマーとして配列番号１のヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチド、および鋳型として配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを使用するＰＣＲにより調製されてもよい。長さが約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントをプローブとして使用する場合、ハイブリダイゼーションにおける洗浄条件は、例えば、５０℃、２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳであり得る。

タンパク質をコードするＤＮＡでの細菌の形質転換は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させるか、細菌細胞でのタンパク質の活性を向上させる従来法によって、ＤＮＡを細菌細胞中に導入することを意味する。

本発明の細菌はまた、前記の（Ａ）または（Ｂ）に定義されるタンパク質をコードするＤＮＡでの同細菌の形質転換により、または同細菌の染色体上の上記ＤＮＡの発現を調節又は制御する配列の改変により、本発明のタンパク質の活性が向上しているものを含む。

本発明の細菌の改変に使用されるＤＮＡは、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質をコードしてもよい。より具体的には、ＤＮＡはｐｕｒＨ遺伝子であり得る。ｐｕｒＨ遺伝子は、例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に基づくプライマーを使用するＰＣＲにより取得され得る。

遺伝子発現を向上させる方法には、遺伝子コピー数の増加が含まれる。エシェリヒア属細菌中で機能し得るベクター中に遺伝子を導入すると、遺伝子のコピー数が増加する。好ましくはマルチコピーベクターが使用され、マルチコピーベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ⁺、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＹＣ３２、ｐＭＷ１１９、ｐＥＴ２２ｂなどが含まれる。また、遺伝子発現の向上は、例えば、相同組換えなどの方法により、遺伝子の複数コピーを細菌染色体中に導入することにより達成され得る。

あるいは、遺伝子発現の向上は、本来のプロモーターの代わりにより強力なプロモーターの制御下に本発明のＤＮＡを配置することにより達成され得る。プロモーターの強さは、ＲＮＡ合成開始の作用の頻度により定められる。プロモーターの強さの評価法および強力なプロモーターの例は、Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. により記載される（エシェリヒア・コリのプロモーター：ｉｎｖｉｖｏ強度の階層は交代構造を示す（Promoters in Escherichia coli : a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures）。 EMBO J. 1986, 5, 2987-2994）。例えば、Ｐ_Rプロモーターは強力な構成型プロモーターとして既知である。他の既知の強力なプロモーターは、λファージの、Ｐ_Lプロモーター、lａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター等である。

翻訳の向上は、本来のシャイン−ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列（ＳＤ配列）の代わりに、より効果的なＳＤ配列を本発明のＤＮＡ中に導入することにより達成され得る。ＳＤ配列は、リボソームの１６ＳＲＮＡと相互作用するｍＲＮＡの開始コドンの上流領
域である（Shine J. and Dalgarno L., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 1974, 71, 4, 1342-6)。

強力なプロモーターを使用することは、遺伝子コピーの増加と組合せてもよい。

染色体ＤＮＡの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択などの方法は、当業者に既知の通常の方法であってもよい。それらの方法は、Sambrook, J., and Russell D.,「分子クローニングの実験室手引き、第三版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) などに記載されている。

本発明の細菌は、上記のＤＮＡを本来的にＬ−ヒスチジン生産能を有する細菌に導入することにより得られ得る。あるいは、本発明の細菌は、既にＤＮＡを保持する細菌にＬ−ヒスチジン生産能を付与することにより得られ得る。

本発明のタンパク質の活性が向上させる親株には、Ｌ−ヒスチジン生産能を有するエシェリヒア属細菌、例えばエシェリヒア・コリ２４株（ＶＫＰＭＢ−５９４５、ロシア特許第２００３６７７号）、エシェリヒア・コリ８０株（ＶＫＰＭＢ−７２７０、ロシア特許第２１１９５３６号）、エシェリヒア・コリＮＲＲＬＢ−１２１１６〜Ｂ１２１２１株（米国特許第４３８８４０５号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４２株（ＦＥＲＭＢＰ−６６７５）およびＨ−９３４３株（ＦＥＲＭＢＰ−６６７６）（米国特許第６３４４３４７号）、エシェリヒア・コリＨ−９３４１株（ＦＥＲＭＢＰ−６６７４）（欧州特許出願第１０８５０８７Ａ２号）、エシェリヒア・コリＡＩ８０／ｐＦＭ２０１株（米国特許第６２５８５５４号）等を挙げることができる。

Ｌ−ヒスチジン生産菌は、Ｌ−ヒスチジン生合成遺伝子の発現が増強するようにさらに改変されていることが望ましい。Ｌ−ヒスチジン生合成に有効な遺伝子には、ｈｉｓＧ遺伝子およびｈｉｓＢＨＡＦＩオペロンの遺伝子が挙げられる。Ｌ−ヒスチジンによるフィードバック阻害が解除されたＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｈｉｓＧ遺伝子が好ましい（ロシア特許第２００３６７７号および第２１１９５３６号）。

本発明の方法は、本発明の細菌を培地に培養して培地中にＬ−ヒスチジンを産生させ、分泌及び蓄積されたＬ−ヒスチジンを同培地から回収する工程を含む、Ｌ−ヒスチジンの製造法を含む。

本発明において、培養、培地からのＬ−ヒスチジンの回収および精製等は、従来の微生物を用いたアミノ酸の発酵生産法によって行ってもよい。

培養に使用される培地は、培地が、炭素源および窒素源およびミネラル類、及び必要に応じて微生物が生育に必要とする適当量の栄養を含む限り、合成培地であっても天然培地であってもよい。

炭素源として、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物および種々の有機酸が含まれる。

炭素源には、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、および種々の有機酸が含まれる。使用する微生物の同化の様式によっては、エタノールおよびグリセロール等のアルコールを使用してもよい。

窒素源としては、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物、および発酵微生物の消化物のような天然の窒素源が使用される。

ミネラル類としては、リン酸２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウムなどが使用される。必要に応じて、さらなる栄養が培地に添加され得る。例えば、微生物が生育にプロリンを必要とする場合（プロリン栄養要求性）、培養のため十分量のプロリンが培地に添加され得る。

培養は、好ましくは、振盪培養、通気を伴う撹拌培養のような好気的条件下、２０℃〜４２℃、好ましくは３７℃〜４０℃の温度で行われる。培養のｐＨは、通常５〜９の間であり、好ましくは６．５〜７．２の間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１日〜５日間の培養で、培地に目的のＬ−アミノ酸が分泌及び蓄積する。

培養後、細胞のような固体は、遠心分離または膜濾過により培養液から除去することができ、次いで目的のＬ−アミノ酸がイオン交換、濃縮、および結晶法により回収および精製され得る。

以下、本発明を、実施例を参照してより具体的に説明する。本実施例においては、特記しない限り、アミノ酸はＬ−体である。

〔実施例１〕エシェリヒア・コリからのｐｕｒＨ遺伝子のクローニング
エシェリヒア・コリＫ−１２株の全ヌクレオチド配列は、既に決定されている（Science, 277, 1453-1474, 1997）。報告されたヌクレオチド配列に基づいて、ｐｕｒＨ遺伝子を増幅するための、配列番号３（プライマー１）および配列番号４（プライマー２）に示すプライマーを合成した。プライマー１は、５'末端に導入されたＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含む。プライマー２は、５'末端に導入されたＸｂａｌ認識部位を含む。

ＰＣＲ用鋳型として使用するエシェリヒア・コリＫ１２の染色体ＤＮＡを、常法により調製した。ＰＣＲを、以下の条件下で、アプライドバイオシステムズＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲシステム２４００を用いて行った。９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、次いで９５℃で３０秒間の変性、５５℃で６０秒のアニーリング、及び７２℃で１２０秒の伸長を３０サイクル、最後にＴａｑポリメラーゼ（Fermentas, Lithuania）を使用して７２℃で７分間の重合化。得られた、プロモーターを持たないｐｕｒＨ遺伝子を含むＰＣＲフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａｌで処理し、予め同じ酵素で処理した組込みベクターｐＭＷ１１９−Ｐ_R中のＰ_Rプロモーターにより制御されるように挿入した。ベクターｐＭＷ１１９−Ｐ_Rは、ファージλからのＰ_RプロモーターならびにさらなるＭｕ組込みに必要なａｔｔＲおよびａｔｔＬ部位を市販のベクターｐＭＷ１１９に挿入することにより構築した。このようにして、プラスミドｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨを得た（図１）。

〔実施例２〕ヒスチジン製造におけるｐｕｒＨ遺伝子の発現の向上の効果
２種のヒスチジン生産株を構築した。１つの株はｐｕｒＨ遺伝子を持つプラスミドを保持し、他方の株は細菌染色体中に組込まれたｐｕｒＨ遺伝子の付加的なコピーを有するプラスミドを持たない株である。ヒスチジン産生エシェリヒア・コリ８０株を、プラスミドｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨでの形質転換、および細菌染色体中へのｐｕｒＨ遺伝子組込みのための親株として使用した。８０株は、ロシア特許第２１１９５３６号に記載されており、１９９９年１０月１５日に、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russia, 117545, Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1）に、
ＶＫＰＭＢ−７２７０の受託番号で寄託され、２００４年７月１２日にブダペスト条約に基づき国際寄託に移管されている。

８０株のプラスミドｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨでの形質転換を、Sambrook, J., and Russell D.,「分子クローニングの実験室手引き、第三版（Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載の方法で行い、８０／ｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨ株を得た。

８０株の染色体中へのｐｕｒＨ遺伝子組込みを、２工程で行った。第一工程で、ヒスチジン生産性の８０株を、レプリコンｒｅｐ（ｐ１５Ａ）、トランスポザーゼ遺伝子（ファージＭｕ−ｃｔｓからのｃｔｓ６２、ｎｅｒ、Ａ、Ｂの各遺伝子）、及びｃＩ−温度感受性λファージリプレッサー（ｃＩ８５７）を含み、かつｐＢＲ３２２からのＴｅｔ^Rマーカーを持つpMH-Tcヘルパープラスミド（図２）で形質転換した。
第二工程で、得られた株を、プラスミドｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨで形質転換した。染色体中へのｐｕｒＨ遺伝子組込みのため、pMW-PR-purHで形質転換するために４２℃で１時間処理した熱ショック細胞を、１ｍｌのＬ−ブロスに移し、４４℃で２０分間、３７℃で４０分間インキュベートし、次いで１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上に広げて、両プラスミドを保持する株を選択した。３０℃で４８時間以内に出現したコロニーを１ｍｌのＬブロスに接種した後、試験管中で４２℃で、７２時間インキュベートした。各試験管から約１０コロニーについてアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性について検査した。両抗生物質に感受性のコロニーを、プライマー１（配列番号３）およびプライマー３（配列番号５）を用いたＰＣＲにより、染色体中のｐｕｒＨ遺伝子の付加的なコピーの存在について検査した。プライマー３は、ファージＭｕのａｔｔＲ部位と相補的な配列を含む。前記の目的のため、新たに単離したコロニーを５０μｌの水に懸濁させ、１μｌをＰＣＲに使用した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった。９５℃で５分間の初期ＤＮＡ変性、次いで９５℃で３０秒間の変性、５６℃で６０秒間のアニーリング、７２℃で１２０秒間の伸長を３０サイクル、最後に７２℃で７分間の最終的な重合化。検査の結果、少数の抗生物質感受性コロニーが、必要な２０００ｂｐＤＮＡフラグメントを含んでいた。こうして、８０：：Ｐ_R−ｐｕｒＨ株を得た。

８０株、８０／ｐＭＷ−Ｐ_R−ｐｕｒＨ株、および８０：：Ｐ_R−ｐｕｒＨ株を、１ｇ／Ｌのストレプトマイシンを含むＬブロス中、２９℃で６時間培養した。次いで、得られた培養物０．１ｍｌを、２０×２００ｍｍの試験管中の発酵培地２ｍｌに接種した後、ロータリーシェーカー（３５０ｒｐｍ）を用いて２９℃で６５時間培養した。培養後、培地に蓄積したヒスチジンの量を、ペーパークロマトグラフィーで決定した。ペーパーは、移動相、ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）で展開した。ニンヒドリン（０．５％）のアセトン溶液を可視化試薬として使用した。

発酵培地の成分（ｐＨ６．０）（ｇ／ｌ）：
グルコース１００．０
Ｍａｍｅｎｏ０．２のＴＮ（総窒素）として
Ｌ−プロリン１．０
（ＮＨ₄）₂Ｓ０₄ ２５．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ ２．０
ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ１．０
ＦｅＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．０１
ＭｎＳＯ₄ ０．０１
チアミン０．００１
ベタイン２．０
ＣａＣＯ₃ ６０．０
ストレプトマイシン１．０
グルコース、プロリン、ベタイン、およびＣａＣＯ₃は、別個に滅菌する。滅菌前にｐＨを６．０に調整する。

得られたデータを表１に示す。

ミニジャーバッチ発酵のため、Ｌ−寒天培地上で増殖した８０株および８０：：Ｐ_R−ｐｕｒＨ株１白金耳をＬ−ブロスに移して、培養物の光学密度ＯＤ₅₄₀が約２．０に達するまで、回転（１４０ｒｐｍ）させながら３０℃で培養した。次いで、２５ｍｌの種培養を、２５０ｍｌの発酵用培地に加えた後、回転（１５００ｒｐｍ）させながら２９℃で培養した。バッチ発酵の期間は、約３５〜４０時間であった。培養後、培地に蓄積したヒスチジンの量を、ペーパークロマトグラフィーで上記に記載したように決定した。

ジャー発酵培地の成分（ｐＨ６．０）（ｇ／ｌ）は以下のとおりである。
グルコース１００．０
Ｍａｍｅｎｏ０．２のＴＮ
（ＮＨ₄）₂Ｓ０₄ ８．０
ＫＨ₂ＰＯ₄ １．０
ＭｇＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．４
ＦｅＳＯ₄×７Ｈ₂Ｏ０．０２
ＭｎＳＯ₄ ０．０２
チアミン０．００１
ベタイン２．０
Ｌ−プロリン０．８
Ｌ−グルタミン酸３．０
Ｌ−アスパラギン酸１．０
アデノシン０．１

得られたデータを表２に示す。

ｐｕｒＨ遺伝子の発現の向上によって、エシェリヒア・コリ８０株のヒスチジン生産能が改善されたことが、表１および表２からわかる。

pMW-PR-purHプラスミドの構造を示す図。 pMH-Tcヘルパープラスミドの構造を示す図。

Claims

５'−ホスホリボシル−４−カルボキサミド−５−アミノイミダゾール（ＡＩＣＡＲ）からイノシン−５'−モノホスフェート（ＩＭＰ）への変換に関与する１又はそれ以上の酵素の活性が増強された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌。
ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性が増強された請求項１に記載の細菌。
エシェリヒア属に属する請求項２に記載の細菌。
前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子の発現量の増加により増強された請求項２に記載の細菌。
前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性は、（ａ）ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子のコピー数を増加させること、及び（ｂ）同遺伝子の増強されるように同遺伝子の発現制御配列を改変することから選ばれる方法により増強された請求項４に記載の細菌。
前記コピー数は、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子を有するマルチコピーベクターで形質転換することにより増加した、請求項５に記載の細菌。
前記コピー数は、前記細菌の染色体中への付加的なコピー数の前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子の組込みにより増加した、請求項５に記載の細菌。
前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子はエシェリヒア属細菌に由来する請求項２〜７のいずれか１項に記載の細菌。
前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、以下のタンパク質（Ａ）または（Ｂ）：
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列のタンパク質変異体であって、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質、をコードする、請求項８に記載の細菌。
前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、以下のＤＮＡ（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１のヌクレオチド１〜１５９０のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ、及び
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド１〜１５９０のヌクレオチド配列又は該ヌクレオチド配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、からなる群から選ばれる、請求項８に記載の細菌。
前記ストリンジェントな条件は、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、６０℃で１５分洗浄が行われる条件である、請求項１０に記載の細菌。
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細菌を培地で培養し、同培地からＬ−ヒスチジ
ンを回収することを含む、Ｌ−ヒスチジンの製造法。
前記細菌は、ヒスチジン生合成の遺伝子の発現が増強された、請求項１２に記載の方法。
ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼの活性が増強された腸内細菌科のＬ−ヒスチジン生産菌であって、前記ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ遺伝子は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質、又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と７０％を越える相同性を有し、ＡＩＣＡＲトランスホルミラーゼ−ＩＭＰシクロヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするである細菌。