KR20230092008A - L-아미노산의 제조법 - Google Patents

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KR20230092008A
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고타 이노우에
가즈유키 하야시
고스케 요코타
미카 모리야
토모코 스즈키
요시토모 가도쿠라
다케시 나가히코
아카리 다시로
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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

L-글루타민산 등의 L-아미노산의 제조법을 제공한다. 하기 (A) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변을 갖도록 개변된 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 및/또는 상기 세균의 균체로부터 L-아미노산을 채취함으로써, L-아미노산을 제조한다: (A) 아세트산 키나제의 활성이 증대하는 개변; (B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이 증대하는 개변; (C) 피루브산 디하이드로게나제의 활성이 저하되는 개변; (D) 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이 저하되는 개변; (E) 말릭 엔자임의 활성이 저하되는 개변.

Description

L-아미노산의 제조법
본 발명은, 세균을 사용한 발효법에 의한 L-글루타민산 등의 L-아미노산의 제조법에 관한 것이다. L-아미노산은 조미료 원료 등으로서 산업상 유용하다.
　L-아미노산은, 예를 들면, L-아미노산 생산능을 갖는 세균 등의 미생물을 사용한 발효법에 의해 공업 생산되고 있다(비특허문헌 1). 이러한 미생물로서는, 예를 들면, 자연계로부터 분리된 균주나 이들의 변이주가 사용되고 있다. 또한, 재조합 DNA 기술에 의해 미생물의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있다.
비특허문헌 1: 아카시 쿠니히코 등 저서 아미노산 발효, 학회출판센터, 195 내지 215페이지, 1986년
본 발명은, 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시키는 신규의 기술을 개발하고, 효율적인 L-아미노산의 제조법을 제공하는 것을 과제로 한다.
　본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행한 결과, 하기 (A) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변을 갖도록 코리네형 세균을 개변함으로써 이 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다:
(A) 아세트산 키나제(acetate kinase)의 활성이 증대하는 개변;
(B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제(fructose 1,6-bisphosphatase)의 활성이 증대하는 개변;
(C) 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase)의 활성이 저하되는 개변;
(D) 아스파르트산 트랜스아미나제(aspartate transaminase)의 활성이 저하되는 개변;
(E) 말릭 엔자임(malic enzyme)의 활성이 저하되는 개변.
즉, 본 발명은 이하와 같이 예시할 수 있다.
[1]
L-아미노산의 제조 방법으로서,
L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및
상기 배지 및/또는 상기 균체로부터 상기 L-아미노산을 채취하는 것
을 포함하고,
상기 L-아미노산이 글루타민산계 L-아미노산이고,
상기 세균이 하기 (X) 및/또는 (Y)의 개변을 갖는, 방법:
(X) 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변;
(Y) 세포 내의 옥살로아세트산 풀이 증대하는 개변.
[2]
상기 세균이 적어도 상기 (X)의 개변을 갖는, 상기 방법.
[3]
상기 방법으로서,
상기 (X)의 개변이, 하기 (A), (B) 및 (C)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변이고;
상기 (Y)의 개변이, 하기 (D) 및 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변인, 방법:
(A) 아세트산 키나제의 활성이 증대하는 개변;
(B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이 증대하는 개변;
(C) 피루브산 디하이드로게나제의 활성이 저하되는 개변;
(D) 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이 저하되는 개변;
(E) 말릭 엔자임의 활성이 저하되는 개변.
[4]
L-아미노산의 제조 방법으로서,
L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및
상기 배지 및/또는 상기 균체로부터 상기 L-아미노산을 채취하는 것
을 포함하고,
상기 L-아미노산이 글루타민산계 L-아미노산이고,
상기 세균이, 하기 (A) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변을 갖는, 방법:
(A) 아세트산 키나제의 활성이 증대하는 개변;
(B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이 증대하는 개변;
(C) 피루브산 디하이드로게나제의 활성이 저하되는 개변;
(D) 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이 저하되는 개변;
(E) 말릭 엔자임의 활성이 저하되는 개변.
[5]
상기 세균이 적어도 상기 (A)의 개변을 갖는, 상기 방법.
[6]
상기 방법으로서,
상기 아스파르트산 트랜스아미나제가 aspT 유전자에 코드되고;
상기 말릭 엔자임이 malE 유전자에 코드되고;
상기 피루브산 디하이드로게나제가 poxB 유전자에 코드되고;
상기 아세트산 키나제가 ack 유전자에 코드되고; 및/또는
상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제가 glpX 유전자에 코드되는, 방법.
[7]
상기 방법으로서,
상기 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이, 아스파르트산 트랜스아미나제를 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
상기 말릭 엔자임의 활성이, 말릭 엔자임을 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
상기 피루브산 디하이드로게나제의 활성이, 피루브산 디하이드로게나제를 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
상기 아세트산 키나제의 활성이, 아세트산 키나제를 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대하고; 및/또는
상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대한, 방법.
[8]
상기 방법으로서,
아세트산 키나제를 코드하는 유전자의 발현이 상기 유전자의 카피수를 높이는 것, 및/또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 상승하고; 및/또는
프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 유전자의 발현이 상기 유전자의 카피수를 높이는 것, 및/또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 상승한, 방법.
[9]
상기 방법으로서,
상기 아스파르트산 트랜스아미나제가 하기 (1a), (1b) 또는 (1c)에 기재된 단백질이고:
(1a) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(1b) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아스파르트산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질;
(1c) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아스파르트산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질;
상기 말릭 엔자임이 하기 (2a), (2b) 또는 (2c)에 기재된 단백질이고:
(2a) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(2b) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 말릭 엔자임 활성을 갖는 단백질;
(2c) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 말릭 엔자임 활성을 갖는 단백질;
상기 피루브산 디하이드로게나제가 하기 (3a), (3b) 또는 (3c)에 기재된 단백질이고:
(3a) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(3b) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 피루브산 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질;
(3c) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 피루브산 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질;
상기 아세트산 키나제가 하기 (4a), (4b) 또는 (4c)에 기재된 단백질이고:
(4a) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(4b) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아세트산 키나제 활성을 갖는 단백질;
(4c) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아세트산 키나제 활성을 갖는 단백질; 및/또는
상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성이 하기 (5a), (5b) 또는 (5c)에 기재된 단백질인, 방법:
(5a) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
(5b) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성을 갖는 단백질;
(5c) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성을 갖는 단백질.
[10]
상기 세균이 또한, 비개변주와 비교하여, 포스포케톨라제의 활성이 증대하도록 개변되어 있는, 상기 방법.
[11]
상기 포스포케톨라제가 D-크실룰로스-5-인산 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스 6-인산 포스포케톨라제인, 상기 방법.
[12]
상기 세균이 코리네박테리움속 세균인, 상기 방법.
[13]
상기 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰인, 상기 방법.
[14]
상기 글루타민산계 L-아미노산이 L-글루타민산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-시트룰린, 및 L-오르니틴으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 L-아미노산인, 상기 방법.
[15]
상기 글루타민산계 L-아미노산이 L-글루타민산인, 상기 방법.
[16]
상기 L-글루타민산이 L-글루타민산암모늄 또는 L-글루타민산나트륨인, 상기 방법.
도 1은, 글루코스를 탄소원으로 한 경우의 대조주 및 ack 유전자의 발현 증강주의 L-글루타민산의 축적량을 나타낸 도면.
도 2는, 글루코스를 탄소원으로 한 경우의 대조주 및 ack 유전자의 발현 증강주의 L-글루타민산의 대당(對糖) 수율을 나타낸 도면.
도 3은, 글루코스를 탄소원으로 한 경우의 대조주 및 glpX 유전자의 발현 증강주의 L-글루타민산의 축적량을 나타낸 도면.
도 4는, 글루코스를 탄소원으로 한 경우의 대조주 및 glpX 유전자의 발현 증강주의 L-글루타민산의 대당 수율을 나타낸 도면.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법은, L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및 상기 배지 및/또는 상기 균체로부터 상기 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법으로서, 상기 세균이 특정한 성질을 갖도록 개변되어 있는 방법이다. 이 방법에 사용되는 세균를 「본 발명의 세균」이라고도 한다.
<1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은, 특정한 성질을 갖도록 개변된 L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균이다.
<1-1> L-아미노산 생산능을 갖는 세균
본 발명에 있어서, 「L-아미노산 생산능을 갖는 세균」이란, 배지에서 배양했을 때에, 목적으로 하는 L-아미노산을 생성하고, 회수할 수 있는 정도로 배지 중 및/또는 균체 내에 축적하는 능력을 갖는 세균를 말한다. L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 비개변주보다 많은 양의 목적으로 하는 L-아미노산을 배지 중 및/또는 균체 내에 축적할 수 있는 세균이라도 좋다. 「비개변주」란, 특정한 성질을 갖도록 개변되어 있지 않은 대조주를 의미한다. 즉, 비개변주로서는, 야생주나 친주를 들 수 있다. 또한, L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양의 목적으로 하는 L-아미노산을 배지에 축적할 수 있는 세균라도 좋다.
본 발명에서 제조되는 L-아미노산은, 글루타민산계 L-아미노산(L-amino acid of glutamate family)이다. 「글루타민산계 L-아미노산」이란, L-글루타민산, 및 L-글루타민산을 중간체로서 생합성되는 L-아미노산의 총칭이다. L-글루타민산을 중간체로서 생합성되는 L-아미노산으로서는, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-시트룰린, L-오르니틴을 들 수 있다. 글루타민산계 L-아미노산으로서는, 특히 L-글루타민산을 들 수 있다. 본 발명의 세균은 1종의 L-아미노산의 생산능만을 갖고 있어도 좋고, 2종 또는 그 이상의 L-아미노산의 생산능을 갖고 있어도 좋다.
본 발명에 있어서, 「아미노산」이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, L-아미노산을 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서, 「L-아미노산」이라는 용어는 달리 언급하지 않는 한, 프리체의 L-아미노산, 그 염, 또는 그들의 혼합물을 의미한다. 염에 대해서는 후술한다.
코리네형 세균으로서는, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 및 마이크로박테리움(Microbacterium)속 등의 속에 속하는 세균을 들 수 있다.
코리네형 세균으로서는, 구체적으로는 하기와 같은 종을 들 수 있다.
코리네박테리움·아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움·아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움·알카노리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움·칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움·크레나튬(Corynebacterium crenatum)
코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움·릴륨(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움·멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움·써모아미노게네스(코리네박테리움·에피시엔스)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))
코리네박테리움·헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움·디바리카룸(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·플라붐(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·이마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움·락토페르멘툼(코리네박테리움·글루타미쿰)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))
브레비박테리움·로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움·사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움·티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움·암모니아게네스(코리네박테리움·스타티오니스)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))
브레비박테리움·앨범(Brevibacterium album)
브레비박테리움·세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움·암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
코리네형 세균으로서는, 특히 코리네박테리움·글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)(구명칭: 브레비박테리움·락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum))을 들 수 있다.
코리네형 세균으로서는, 구체적으로는 하기와 같은 균주를 들 수 있다.
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens(Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340(FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
코리네형 세균으로서, 또한 특히 Brevibacterium lactofermentum(신명칭: Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869를 들 수 있다.
또한, 코리네박테리움속 세균에는, 종래 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만, 현재 코리네박테리움속으로 통합된 세균(Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991))도 포함된다. 또한, 코리네박테리움·스타티오니스에는, 종래 코리네박테리움·암모니아게네스로 분류되어 있었지만, 16S rRNA의 염기서열 해석 등에 의해 코리네박테리움·스타티오니스로 재분류된 세균도 포함된다(Int. J Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)).
이들 균주는 예를 들면, 아메리칸·타입·컬처·콜렉션(주소 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)에서 분양을 받을 수 있다. 즉 각 균주에 대응하는 등록번호가 부여되어 있고, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다(http://www.atcc.org/참조). 각 균주에 대응하는 등록번호는 아메리칸·타입·컬처·콜렉션의 카탈로그에 기재되어 있다. 또한, 이들 균주는, 예를 들면, 각 균주가 기탁된 기탁 기관으로부터 입수할 수 있다.
본 발명의 세균은, 본질적으로 L-아미노산 생산능을 갖는 것이라도 좋고, L-아미노산 생산능을 갖도록 개변된 것이라도 좋다. L-아미노산 생산능을 갖는 세균은, 예를 들면, 상기와 같은 세균에 L-아미노산 생산능을 부여함으로써, 또는, 상기와 같은 세균의 L-아미노산 생산능을 증강함으로써 취득할 수 있다.
L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 종래, 코리네형 세균 또는 에쉐리히아속 세균 등의 아미노산 생산균의 육종에 채용되어 온 방법에 의해 행할 수 있다(아미노산 발효, (주)학회출판센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77 내지 100 페이지 참조). 이러한 방법으로는, 예를 들면, 영양 요구성 변이주의 취득, L-아미노산의 아날로그 내성주의 취득, 대사 제어 변이주의 취득, L-아미노산의 생합성계 효소의 활성이 증강된 재조합주의 창제를 들 수 있다. L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은 단독이라도 좋고, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 활성이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도 좋고, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, 영양 요구성, 아날로그 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 활성의 증강이 조합되어도 좋다.
L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, 아날로그 내성주, 또는 대사제어 변이주는 친주 또는 야생주를 통상의 변이 처리에 제공하고, 얻어진 변이주 중에서 영양 요구성, 아날로그 내성, 또는 대사 조절 변이를 나타내고, 또한 L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 취득할 수 있다. 통상의 변이 처리로서는, X선이나 자외선의 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸메탄설포네이트(EMS), 메틸메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 처리를 들 수 있다.
또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 목적의 L-아미노산의 생합성에 관여하는 효소의 활성을 증강함으로써도 행할 수 있다. 효소 활성의 증강은, 예를 들면, 이 효소를 코드하는 유전자의 발현이 증강하도록 세균를 개변함으로써 행할 수 있다. 유전자의 발현을 증강하는 방법은 WO00/18935나 EP1010755A 등에 기재되어 있다. 효소 활성을 증강하는 상세한 수법에 대해서는 후술한다.
또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은, 목적의 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 목적의 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저하시킴으로써도 행할 수 있다. 또한, 여기서 말하는 「목적의 L-아미노산의 생합성 경로로부터 분기하여 목적의 L-아미노산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소」에는, 목적의 아미노산의 분해에 관여하는 효소도 포함된다. 효소 활성을 저하시키는 수법에 대해서는 후술한다.
이하, L-아미노산 생산균 및 L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강하는 방법에 대하여 구체적으로 예시한다. 또한, 이하에 예시하는 L-아미노산 생산균이 갖는 성질 및 L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 개변은, 모두, 단독으로 사용해도 좋고, 적절히 조합하여 사용해도 좋다.
<L-글루타민산 생산균>
L-글루타민산 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민산 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대하도록 세균를 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, 글루타민산 디하이드로게나제(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루타민산 신타제(gltBD), 이소시트르산 디하이드로게나제(icdA), 아코니테이트 히드라타제(acnA, acnB), 시트르산 신타제(gltA), 메틸시트르산 신타제(prpC), 피루브산 카르복실라제(pyc), 피루브산 디하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루브산 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루브산 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세로무타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세르산 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-인산 디하이드로게나제(gapA), 트리오스인산 이소메라제(tpiA), 프럭토스비스인산 알돌라제(fbp), 글루코스인산 이소메라제(pgi), 6-포스포글루콘산 디히드라타제(edd), 2-케토-3-데옥시-6-포스포글루콘산 알돌라제(eda), 트랜스하이드로게나제(pntAB)를 들 수 있다. 또한, 괄호 안은, 그 효소를 코드하는 유전자의 일례이다(이하의 기재에 있어서도 동일). 이들 효소 중에서는, 예를 들면, 글루타민산 디하이드로게나제, 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카르복실라제, 및 메틸시트르산 신타제로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성을 증강하는 것이 바람직하다.
글루타민산 신타제 유전자(gltBD)의 발현이 증대하도록 개변된 코리네형 세균으로서는, WO99/07853에 개시된 것을 들 수 있다.
또한, L-글루타민산 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루타민산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하되도록 세균를 개변하는 방법도 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, 이소시트르산 리아제(aceA), α-케토글루타르산 디하이드로게나제(sucA, odhA), 아세토락트산 신타제(ilvI), 포름산아세틸트랜스퍼라제(pfl), 락트산 디하이드로게나제(ldh), 알코올 디하이드로게나제(adh), 글루타민산 디카르복실라제(gadAB), 숙신산 디하이드로게나제(sdhABCD)를 들 수 있다. 이들 효소 중에서는, 예를 들면, α-케토글루타르산 디하이드로게나제 활성을 저하 또는 결손시키는 것이 바람직하다.
α-케토글루타르산 디하이드로게나제 활성이 저하 또는 결손된 코리네형 세균, 및 이들의 취득 방법은 WO2008/075483에 기재되어 있다. α-케토글루타르산 디하이드로게나제 활성이 저하 또는 결손된 코리네형 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 하기의 주(株)를 들 수 있다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) L30-2주(일본 공개특허공보 특개2006-340603)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) ΔS주(WO95/34672)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12821(FERM BP-4172; 프랑스 특허공보 제9401748호)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ12822(FERM BP-4173; 프랑스 특허공보 제9401748호)
Corynebacterium glutamicum AJ12823(FERM BP-4174; 프랑스 특허공보 제9401748호)
또한, L-글루타민산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, α-케토글루타르산 디하이드로게나제(sucA) 활성 및 숙신산 디하이드로게나제(sdh) 활성의 양쪽이 저하 또는 결손된 주(株)도 들 수 있다(일본 공개특허공보 특개2010-041920). 이러한 주로서, 구체적으로는, 예를 들면, Corynebacterium glutamicum ATCC14067주의 odhAsdhA 이중 결손주(Corynebacterium glutamicum 8L3GΔSDH주)를 들 수 있다(일본 공개특허공보 특개2010-041920).
또한, L-글루타민산 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, yhfK 유전자(WO2005/085419)나 ybjL 유전자(WO2008/133161) 등의 L-글루타민산 배출 유전자의 발현을 증강하는 것도 들 수 있다.
또한, 코리네형 세균에 대하여, L-글루타민산 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, 유기산 아날로그나 호흡 저해제 등에 대한 내성을 부여하는 방법이나, 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성을 부여하는 방법도 들 수 있다. 이러한 방법으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소50-113209), 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소57-065198), 우레아제를 약화시키는 방법(일본 공개특허공보 특개소52-038088), 말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소52-038088), 벤조피론류 또는 나프토퀴논류에 대한 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소56-1889), HOQNO 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소56-140895), α-케토말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소57-2689), 구아니딘 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소56-35981), 페니실린에 대한 감수성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개평4-88994)을 들 수 있다.
이러한 내성균 또는 감수성균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ3949(FERM BP-2632; 일본 공개특허공보 특개소50-113209)
Corynebacterium glutamicum AJ11628(FERM P-5736; 일본 공개특허공보 특개소57-065198)
Corynebacte glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11355(FERM P-5007; 일본 공개특허공보 특개소56-1889)
Corynebacterium glutamicum AJ11368(FERM P-5020; 일본 공개특허공보 특개소56-1889)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11217(FERM P-4318; 일본 공개특허공보 특개소57-2689)
Corynebacterium glutamicum AJ11218(FERM P-4319; 일본 공개특허공보 특개소57-2689)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11564(FERM P-5472; 일본 공개특허공보 특개소56-140895)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11439(FERM P-5136; 일본 공개특허공보 특개소56-35981)
Corynebacterium glutamicum H7684(FERM BP-3004; 일본 공개특허공보 특개평04-88994)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ11426(FERM P-5123; 일본 공개특허공보 특개평56-048890)
Corynebacterium glutamicum AJ11440(FERM P-5137; 일본 공개특허공보 특개평56-048890)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ11796(FERM P-6402; 일본 공개특허공보 특개평58-158192)
또한, 코리네형 세균에 대하여, L-글루타민산 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, yggB 유전자의 발현을 증강하는 방법이나 코드 영역 내에 변이를 도입한 변이형 yggB 유전자를 도입하는 방법도 들 수 있다(WO2006/070944). 즉, 본 발명의 세균은, yggB 유전자의 발현이 증대하도록 개변되어 있어도 좋고, 변이형 yggB 유전자를 유지하도록(갖도록) 개변되어 있어도 좋다.
yggB 유전자는, 기계수용 채널(mechanosensitive channel)을 코드하는 유전자이다. yggB 유전자로서는, 코리네형 세균의 yggB 유전자를 들 수 있다. 코리네형 세균의 yggB 유전자로서, 구체적으로는, 예를 들면, Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14967, Corynebacterium melassecola ATCC17965의 yggB 유전자를 들 수 있다(WO2006/070944). Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 yggB 유전자는, NCBI 데이터 베이스에 GenBank Accession No. NC_003450으로 등록되어 있는 게놈 서열 중, 1,336,091 내지 1,337,692의 서열의 상보 서열에 상당하며, NCgl1221이라고도 불린다. Corynebacterium glutamicum ATCC13032의 yggB 유전자에 코드되는 YggB 단백질은, GenBank accession No. NP_600492로 등록되어 있다. 또한, Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 yggB 유전자의 염기서열, 및 이 유전자가 코드하는 YggB 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 15 및 16에 나타낸다.
본 발명에 있어서, 후술하는 「특정한 변이」를 갖는 yggB 유전자를 변이형 yggB 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질을 변이형 YggB 단백질이라고도 한다. 또한, 본 발명에 있어서, 후술하는 「특정한 변이」를 갖지 않는 yggB 유전자를 야생형 yggB 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질을 야생형 YggB 단백질이라고도 한다. 또한, YggB 단백질에 있어서는, yggB 유전자에서의 「특정한 변이」에 의해 야기되는 아미노산 서열의 변화를 「특정한 변이」라고도 한다. 여기서 말하는 「야생형」이란, 「변이형」과 구별하기 위한 편의상의 기재이며, 「특정한 변이」를 갖지 않는 한, 천연으로 얻어지는 것에 한정되지 않는다. 야생형 YggB 단백질로서는, 상기 예시한 YggB 단백질, 예를 들면 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 또한, 야생형 YggB 단백질로서는, 상기 예시한 YggB 단백질의 보존적 변이체(원래의 기능이 유지된 변이체)로서, 「특정한 변이」를 갖지 않는 것도 들 수 있다. YggB 단백질에 대한 「원래 기능」이란, 예를 들면, 기계수용 채널(mechanosensitive channel)로서의 기능이라도 좋고, 코리네형 세균에서 발현을 상승시켰을 때에 코리네형 세균의 L-글루타민산 생산능을 향상시키는 성질이라도 좋다.
「특정한 변이」는, 상술한 바와 같은 야생형 YggB 단백질의 아미노산 서열을 변화시키고, 코리네형 세균의 L-글루타민산 생산능을 향상시키는 변이이면 특별히 제한되지 않는다. 「특정한 변이」로서는, C 말단측 변이나 막 관통 영역의 변이를 들 수 있다(WO2006/070944). 또한, 「특정한 변이」는 이들 변이의 조합이라도 좋다.
(1) C 말단측 변이
C 말단측 변이는 야생형 yggB 유전자 중의, 야생형 YggB 단백질의 419 내지 533 위치의 아미노산 잔기를 코드하는 영역에서의 변이이다. C 말단측 변이는, 이 영역 중의 1 또는 그 이상의 개소에 도입되어도 좋다. C 말단측 변이에 의해 야기되는 아미노산 서열의 변화의 종류는 특별히 제한되지 않는다. C 말단측 변이는, 예를 들면, 아미노산 잔기의 치환(미스센스 변이), 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실, 종지 코돈의 출현(난센스 변이), 프레임 시프트 변이, 또는 이들의 조합을 야기하는 것이라도 좋다. C 말단측 변이로서는, 예를 들면, 인서션 시퀀스(이하, 「IS」라고도 한다)나 트랜스포존 등의 염기서열의 삽입이 바람직하다.
(1-1) 염기서열의 삽입
C 말단측 변이로서는, 예를 들면, 야생형 YggB 단백질의 419 위치의 발린 잔기를 코드하는 개소에 염기서열이 삽입되는 변이(2A-1형 변이)를 들 수 있다. 2A-1형 변이는, 예를 들면, 야생형 YggB 단백질의 419 내지 533 위치의 아미노산 잔기의 일부 또는 전부의 결실 또는 치환을 일으키는 것이라도 좋다. 2A-1형 변이를 갖는 변이형 yggB 유전자로서, 구체적으로는, 예를 들면, 서열번호 15의 1255 위치의 「G」 다음에 IS가 삽입되고, 원래의 야생형 YggB 단백질(서열번호 16)보다 짧은 전장(全長) 423 아미노 잔기의 변이형 YggB 단백질을 코드하는 yggB 유전자를 들 수 있다. 이 변이형 yggB 유전자(V419::IS)의 염기서열, 및 이 유전자가 코드하는 변이형 YggB 단백질(V419::IS)의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 17 및 18에 나타낸다. 서열번호 17 중, 1 내지 1269 위치는 변이형 YggB 단백질(V419::IS)의 CDS이다. 변이형 yggB 유전자(V419::IS)를 갖는 L-글루타민산 생산균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주(WO2014/185430)를 들 수 있다.
(1-2) 프롤린 잔기의 치환
C 말단측 변이로서는, 예를 들면, 야생형 YggB 단백질의 419 내지 533 위치에 존재하는 프롤린 잔기를 다른 아미노산으로 치환하는 변이도 들 수 있다. 이러한 프롤린 잔기로서는, 야생형 YggB 단백질의 424 위치, 437 위치, 453 위치, 457 위치, 462 위치, 469 위치, 484 위치, 489 위치, 497 위치, 515 위치, 529 위치, 및 533 위치의 프롤린 잔기를 들 수 있다. 이 중에서도 424 위치 및/또는 437 위치의 프롤린 잔기를 다른 아미노산으로 치환하는 것이 바람직하다. 「다른 아미노산」은, 프롤린 이외의 천연형 아미노산이면 특별히 제한되지 않는다. 「다른 아미노산」으로서는, Lys, Glu, Thr, Val, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gln, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala, His를 들 수 있다. 예를 들면, 424 위치의 프롤린 잔기는, 바람직하게는 소수성 아미노산(Ala, Gly, Val, Leu, 또는 Ile)으로 치환되어도 좋고, 보다 바람직하게는 분기쇄 아미노산(Leu, Val, 또는 Ile)으로 치환되어도 좋다. 또한, 예를 들면, 437 위치의 프롤린 잔기는, 바람직하게는 측쇄에 하이드록실기를 갖는 아미노산(Thr, Ser, 또는 Tyr)으로 치환되어도 좋고, 보다 바람직하게는 Ser로 치환되어도 좋다.
(2) 막 관통 영역의 변이
YggB 단백질은, 5개의 막 관통 영역을 갖고 있다고 추측된다. 막 관통 영역은 각각, 야생형 YggB 단백질의 1 내지 23 위치(제1막 관통 영역), 25 내지 47 위치(제2막 관통 영역), 62 내지 84 위치(제3막 관통 영역), 86 내지 108 위치(제4막 관통 영역), 110 내지 132 위치(제5막 관통 영역)의 아미노산 잔기에 상당한다. 막 관통 영역의 변이는 야생형 yggB 유전자 중의, 이들 막 관통 영역을 코드하는 영역에서의 변이이다. 막 관통 영역의 변이는 이 영역 중의 1 또는 그 이상의 개소에 도입되어도 좋다. 막 관통 영역의 변이는 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 부가, 삽입 또는 역위(逆位)를 일으키는 것으로서, 또한, 프레임 시프트 변이 및 난센스 변이를 수반하지 않는 것이 바람직하다. 「1 또는 여러 개」란, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미한다. 막 관통 영역의 변이로서는, 야생형 YggB 단백질의, 14 위치의 류신 잔기와 15 위치의 트립토판 잔기 사이에 1 또는 여러 개의 아미노산(예를 들면, Cys-Ser-Leu)을 삽입하는 변이, 100 위치의 알라닌 잔기를 다른 아미노산 잔기(예를 들면, 측쇄에 하이드록실기를 갖는 아미노산(Thr, Ser, 또는 Tyr), 바람직하게는 Thr)로 치환하는 변이, 111 위치의 알라닌 잔기를 다른 아미노산 잔기(예를 들면, Val 또는 측쇄에 하이드록실기를 갖는 아미노산(Thr, Ser, 또는 Tyr), 바람직하게는 Val 또는 Thr)로 치환되는 변이 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 「야생형 YggB 단백질의 X 위치의 아미노산 잔기」란, 달리 언급하지 않는 한, 서열번호 16에서의 X 위치의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 의미한다. 아미노산 서열에서의 「X 위치」란, 이 아미노산 서열의 N 말단으로부터 세어 X번째의 위치를 의미하고, N 말단의 아미노산 잔기가 1 위치의 아미노산 잔기이다. 또한, 아미노산 잔기의 위치는 상대적인 위치를 나타내는 것으로서, 아미노산의 결실, 삽입, 부가 등에 의해 그 절대적인 위치는 전후하는 경우가 있다. 예를 들면, 「야생형 YggB 단백질의 419 위치의 아미노산 잔기」란, 서열번호 16에서의 419 위치의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기를 의미하고, 419 위치보다 N 말단측의 1 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우에는, N 말단으로부터 418번째의 아미노산 잔기가 「야생형 YggB 단백질의 419 위치의 아미노산 잔기」인 것으로 한다. 또한, 419 위치보다 N 말단측에 1 아미노산 잔기가 삽입되어 있는 경우에는, N 말단으로부터 420번째의 아미노산 잔기가 「야생형 YggB 단백질의 419 위치의 아미노산 잔기」인 것으로 한다. 구체적으로는, 예를 들면, Corynebacterium glutamicum ATCC14967주의 YggB 단백질에 있어서는, 419 내지 529 위치의 아미노산 잔기가, 야생형 YggB 단백질의 419 내지 533 위치의 아미노산 잔기에 상당한다.
임의의 YggB 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 어느 아미노산 잔기가 「서열번호 16에서의 X 위치의 아미노산 잔기에 상당하는 아미노산 잔기」인지는, 당해 YggB 단백질의 아미노산 서열과 서열번호 16의 아미노산 서열과의 얼라인먼트를 행함으로써 결정할 수 있다. 얼라인먼트는, 예를 들면, 공지된 유전자 분석 소프트웨어를 이용하여 행할 수 있다. 구체적인 소프트웨어로서는, 히타치 솔루션즈 제조의 DNASIS나, 제네틱스 제조의 GENETYX 등을 들 수 있다(Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991; Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987).
변이형 yggB 유전자는, 야생형 yggB 유전자를 상술한 「특정한 변이」를 갖도록 개변함으로써 취득할 수 있다. DNA의 개변은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면, DNA의 목적 부위에 목적의 변이를 도입하는 부위 특이적 변이법으로서는, PCR을 사용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))이나, 파지를 사용하는 방법(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))을 들 수 있다. 또한, 변이형 yggB 유전자는 화학 합성에 의해서도 취득할 수 있다.
변이형 yggB 유전자를 갖도록 세균를 개변하는 것은, 변이형 yggB 유전자를 세균에 도입함으로써 달성할 수 있다. 또한, 변이형 yggB 유전자를 갖도록 세균를 개변하는 것은, 자연 변이나 변이 원 처리에 의해 세균이 갖는 yggB 유전자에 변이를 도입함으로써도 달성할 수 있다.
또한, L-글루타민산의 생산능을 부여 또는 증강하는 방법은, L-글루타민산을 중간체로서 생합성되는 L-아미노산(예를 들면, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-시트룰린, L-오르니틴)의 생산능을 부여 또는 증강하기 위해서도 유효할 수 있다. 즉, 이들 L-글루타민산을 중간체로서 생합성되는 L-아미노산의 생산능을 갖는 세균은, 상기와 같은 L-글루타민산 생산균이 갖는 성질을 적절히 갖고 있어도 좋다. 예를 들면, 이들 L-글루타민산을 중간체로서 생합성되는 L-아미노산의 생산능을 갖는 세균은, α-케토글루타르산 디하이드로게나제 및/또는 숙신산 디하이드로게나제의 활성이 저하되도록 개변되어 있어도 좋다.
<L-글루타민 생산균>
L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대하도록 세균를 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, 글루타민산 디하이드로게나제(gdhA)나 글루타민 신세타제(glnA)를 들 수 있다. 또한, 글루타민 신세타제의 합성은, 글루타민 아데닐릴 트랜스퍼라제 유전자(glnE)의 파괴나 PII 제어 단백질 유전자(glnB)의 파괴에 의해 증강해도 좋다(EP1229121).
또한, L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-글루타민의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루타민 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 저하되도록 세균를 개변하는 방법도 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, 글루타미나제를 들 수 있다.
L-글루타민 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서, 구체적으로는, 예를 들면, 글루타민산 디하이드로게나제(gdhA) 및/또는 글루타민 신세타제(glnA)의 활성을 증강한 코리네형 세균(EP1229121, EP1424398)이나 글루타미나제 활성이 저하된 코리네형 세균(일본 공개특허공보 특개2004-187684)을 들 수 있다.
또한, 코리네형 세균에 대하여, L-글루타민 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, 6-디아조-5-옥소-노르류신 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개평3-232497), 푸린 아날로그 내성 및 메티오닌술폭시드 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소61-202694), α-케토말론산 내성을 부여하는 방법(일본 공개특허공보 특개소56-151495)을 들 수 있다. L-글루타민 생산능을 갖는 코리네형 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 이하의 주를 들 수 있다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11573(FERM P-5492; 일본 공개특허공보 특개소56-151495)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11576(FERM BP-10381; 일본 공개특허공보 특개소56-151495)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ12212(FERM P-8123; 일본 공개특허공보 특개소61-202694)
<L-프롤린 생산균>
L-프롤린 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, 예를 들면, L-프롤린 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대하도록 세균를 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는, 글루타민산-5-키나제(proB), γ-글루타밀-인산 리덕타제, 피롤린-5-카르복실레이트 리덕타제(putA)를 들 수 있다. 효소 활성의 증강에는, 예를 들면, L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 글루타민산-5-키나제를 코드하는 proB 유전자(독일 특허 제3127361호)를 적합하게 이용할 수 있다.
또한, L-프롤린 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-프롤린 분해에 관여하는 효소의 활성이 저하되도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는, 프롤린 디하이드로게나제 및 오르니틴 아미노트랜스퍼라제를 들 수 있다.
<L-아르기닌 생산균>
L-아르기닌 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-아르기닌 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대하도록 세균를 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, N-아세틸글루타민산 신타제(argA), N-아세틸글루타민산 키나제(argB), N-아세틸글루타밀인산 리덕타제(argC), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 디아세틸라제(argE), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(argF, argI), 아르기니노숙신산 신타제(argG), 아르기니노숙신산 리아제(argH), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제(argJ), 카바모일인산 신타제(carAB)를 들 수 있다. N-아세틸글루타민산 신타제(argA) 유전자로서는, 예를 들면, 야생형의 15 위치 내지 19 위치에 상당하는 아미노산 잔기가 치환되고, L-아르기닌에 의한 피드백 저해가 해제된 변이형 N-아세틸글루타민산 신타제를 코드하는 유전자를 사용하면 적합하다(EP1170361A).
또한, L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, 아르기닌 리프레서인 ArgR을 결손한 균주(US2002-0045223A)나 세포 내의 글루타민 신테타제 활성을 상승시킨 주(US2005-0014236A) 등의 코리네형 세균도 들 수 있다.
또한, L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서는, 아미노산 아날로그 등에 대한 내성을 갖는 코리네형 세균의 변이주도 들 수 있다. 이러한 주로서는, 예를 들면, 2-티아졸알라닌 내성에 더하여, L-히스티딘, L-프롤린, L-트레오닌, L-이소류신, L-메티오닌, 또는 L-트립토판 요구성을 갖는 주(일본 공개특허공보 특개소54-44096); 케토말론산, 플루오로말론산, 또는 모노플루오로아세트산에 내성을 갖는 주(일본 공개특허공보 특개소57-18989); 아르기니놀에 내성을 갖는 주(일본 공개특허공보 특공소62-24075); X-구아니딘(X는 지방쇄 또는 이의 유도체)에 내성을 갖는 주(일본 공개특허공보 특개평2-186995); 아르기닌 하이드록사메이트 및 6-아자우라실에 내성을 갖는 주(일본 공개특허공보 특개소57-150381)를 들 수 있다. L-아르기닌 생산능을 갖는 코리네형 세균의 구체예로서는, 하기와 같은 균주를 들 수 있다.
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11169(FERM BP-6892)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12092(FERM BP-6906)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11336(FERM BP-6893)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium flavum) AJ11345(FERM BP- 6894)
Corynebacterium glutamicum(Brevibacterium lactofermentum) AJ12430(FERM BP-2228)
<L-시트룰린 생산균 및 L-오르니틴 생산균>
L-시트룰린 및 L-오르니틴은 L-아르기닌 생합성 경로에서의 중간체이다. 따라서, L-시트룰린 및/또는 L-오르니틴의 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, L-아르기닌 생합성계 효소로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 효소의 활성이 증대하도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다. 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, L-시트룰린에 대하여, N-아세틸글루타민산 신타제(argA), N-아세틸글루타민산 키나제(argB), N-아세틸글루타밀인산 리덕타제(argC), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 디아세틸라제(argE), 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제(argF, argI), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제(argJ), 카바모일인산 신타제(carAB)를 들 수 있다. 또한, 이러한 효소로서는 특별히 제한되지 않지만, L-오르니틴에 대하여, N-아세틸글루타민산 신타제(argA), N-아세틸글루타민산 키나제(argB), N-아세틸글루타밀인산 리덕타제(argC), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 아세틸오르니틴 디아세틸라제(argE), 오르니틴아세틸 트랜스퍼라제(argJ)를 들 수 있다.
또한, L-시트룰린 생산균은, 예를 들면, 임의의 L-아르기닌 생산균으로부터, argG 유전자에 코드되는 아르기니노숙신산 신타제의 활성을 저하시킴으로써 용이하게 얻을 수 있다. 또한, L-오르니틴 생산균은, 예를 들면, 임의의 L-아르기닌 생산균으로부터, argF 및 argI 양 유전자에 의해 코드되는 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제의 활성을 저하시킴으로써 용이하게 얻을 수 있다.
또한, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, 예를 들면, 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 활성이 증대하도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다. L-아미노산을 배출하는 활성은, 예를 들면, L-아미노산을 배출하는 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대시킬 수 있다. 각종 아미노산을 배출하는 단백질을 코드하는 유전자로서는, 예를 들면, b2682 유전자(ygaZ), b2683 유전자(ygaH), b1242 유전자(ychE), b3434 유전자(yhgN)를 들 수 있다(일본 공개특허공보 특개2002-300874).
또한, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강하는 방법으로서는, 예를 들면, 당 대사에 관여하는 단백질이나 에너지 대사에 관여하는 단백질의 활성이 증대하도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다.
당 대사에 관여하는 단백질로서는, 당의 흡수에 관여하는 단백질이나 해당(解糖)계 효소를 들 수 있다. 당 대사에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자로서는, 글루코스 6-인산 이소메라제 유전자(pgi; WO01/02542), 피루브산 카르복실라제 유전자(pyc; WO99/18228, EP1092776A), 포스포글루코뮤타제 유전자(pgm; WO03/04598), 프럭토스2인산 알돌라제 유전자(pfkB, fbp; WO03/04664), 트랜스알돌라제 유전자(talB; WO03/008611), 푸마라제 유전자(fum; WO01/02545), non-PTS 수크로스 흡수 유전자(csc; EP1149911A)는 수크로스 자화성 유전자(scrAB 오페론; 미국특허 제7,179,623호)를 들 수 있다.
에너지 대사에 관여하는 단백질을 코드하는 유전자로서는, 트랜스하이드로게나제 유전자(pntAB; 미국특허 제5,830,716호), 시토크롬 bo형 옥시다제(cytochrome bo type oxidase) 유전자(cyoB; EP1070376A)를 들 수 있다.
또한, L-아미노산 등의 유용 물질의 생산능을 부여 또는 증강하기 위한 방법으로서는, 예를 들면, 포스포케톨라제의 활성이 증대하도록 세균을 개변하는 방법도 들 수 있다(WO2006/016705). 즉, 본 발명의 세균은 포스포케톨라제의 활성이 증대하도록 개변되어도 좋다. 이 방법은 특히 L-글루타민산 등의 글루타민산계 L-아미노산의 생산능을 부여 또는 증강하기 위해 유효할 수 있다. 포스포케톨라제로서는, D-크실룰로스-5-인산-포스포케톨라제나 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제를 들 수 있다. D-크실룰로스-5-인산-포스포케톨라제 활성 및 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제 활성은 어느 한쪽을 증강해도 좋고, 양쪽을 증강해도 좋다.
D-크실룰로스-5-인산-포스포케톨라제 활성이란, 인산을 소비하여, 크실로스-5-인산을 글리세르알데히드-3-인산과 아세틸인산으로 변환하고, 1분자의 H2O를 방출하는 활동을 의미한다. 이 활성은 Goldberg, M. 등의 문헌(Methods Enzymol., 9, 515-520(1966)) 또는 L. Meile의 문헌(J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다. D-크실룰로스-5-인산 포스포케톨라제로서는, 아세토박터속, 비피도박테리움속, 락토바실러스속, 티오바실러스속, 스트렙토코커스속, 메틸로코커스속, 부티리비브리오속, 또는 피브로박터속에 속하는 세균이나, 칸디다속, 로도토룰라속, 로도스포리듐속, 피키아속, 야로위아속, 한세눌라속, 클루이베로미세스속, 사카로미세스속, 트리코스포론속, 또는 윙게아속에 속하는 효모의 D-크실룰로스-5-인산 포스포케톨라제를 들 수 있다. D-크실룰로스-5-인산 포스포케톨라제 및 이를 코드하는 유전자의 구체예는, WO2006/016705에 개시되어 있다.
또한, 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제 활성이란, 인산을 소비하여, 프럭토스-6-인산을 에리스로스-4-인산과 아세틸인산으로 변환하고, 1분자의 H2O를 방출하는 활성을 의미한다. 이 활성은 Racker, E.의 문헌(Methods Enzymol., 5, 276-280(1962)) 또는 L. Meile의 문헌(J. Bacteriol. (2001) 183; 2929-2936)에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다. 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제로서는, 아세토박터속, 비피도박테리움속, 클로로비움속, 브루셀라속, 메틸로코커스속, 또는 가드네렐라속에 속하는 세균이나, 로도토룰라속, 칸디다속, 사카로미세스속 등에 속하는 효모의 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제를 들 수 있다. 프럭토스-6-인산 포스포케톨라제 및 이를 코드하는 유전자의 구체예는 WO2006/016705에 개시되어 있다.
양 포스포케톨라제 활성이, 단일의 효소(D-크실룰로스-5-인산/프럭토스-6-인산 포스포케톨라제)에 의해 유지되는 경우도 있을 수 있다.
L-아미노산 생산균의 육종에 사용되는 유전자 및 단백질은 각각, 예를 들면, 상기 예시한 유전자 및 단백질 등의 공지된 유전자 및 단백질의 염기서열 및 아미노산 서열을 갖고 있어도 좋다. 또한, L-아미노산 생산균의 육종에 사용되는 유전자 및 단백질은 각각, 상기 예시한 유전자 및 단백질 등의 공지된 유전자 및 단백질의 보존적 변이체라도 좋다. 구체적으로는, 예를 들면, L-아미노산 생산균의 육종에 사용되는 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 공지된 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 유전자 및 단백질의 보존적 변이체에 대해서는, 후술하는 표적 유전자 및 표적 단백질의 보존적 변이체에 관한 기재를 준용할 수 있다.
<1-2> 특정한 성질
본 발명의 세균은 특정한 성질을 갖도록 개변되어 있다. 본 발명의 세균은 L-아미노산 생산능을 갖는 세균를, 특정한 성질을 갖도록 개변함으로써 취득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 특정한 성질을 갖도록 세균를 개변한 후에, L-아미노산 생산능을 부여 또는 증강함으로써도 취득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 특정한 성질을 갖도록 개변됨으로써, L-아미노산 생산능을 획득한 것이라도 좋다. 본 발명의 세균은 특정한 성질을 갖도록 개변되어 있는 것에 더하여, 예를 들면, 상기와 같은 L-아미노산 생산균이 갖는 성질을 적절히 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 세균를 구축하기 위한 개변은 임의의 순서로 행할 수 있다.
특정한 성질을 갖도록 세균를 개변함으로써 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있고, 즉 이 세균에 의한 L-아미노산 생산을 증대시킬 수 있다. 「L-아미노산 생산의 증대」로서는, L-아미노산의 배지 중에서의 축적량의 향상(증대)을 들 수 있다.
특정한 성질로서는, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변을 들 수 있다. 「세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증가한다」란, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA)의 축적량이 증가하는 것을 의미해도 좋다.
또한, 특정한 성질로서는, 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변을 들 수 있다. 「포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상된다」란, 포스포케톨라제 경로의 플럭스(즉, 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 대사량)가 증가하는 것, 및/또는, 포스포케톨라제 경로를 경유하여 대사된 탄소원으로부터 생성할 수 있는 부생물의 축적량이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 부생물로서는 아세트산을 들 수 있다. 아세트산은, 예를 들면, 포스포케톨라제 경로의 플럭스의 증대에 의해 축적할 수 있다. 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변으로서는, 포스포케톨라제 경로의 플럭스가 증대하는 개변이나 아세트산의 자화성이 향상되는 개변을 들 수 있다.
또한, 특정한 성질로서는 하기의 (A) 내지 (E)의 개변을 들 수 있다:
(A) 아세트산 키나제(acetate kinase)의 활성이 증대하는 개변;
(B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제(fructose 1,6-bisphosphatase)의 활성이 증대하는 개변;
(C) 피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase)의 활성이 저하되는 개변;
(D) 아스파르트산 트랜스아미나제(aspartate transaminase)의 활성이 저하되는 개변;
E) 말릭 엔자임(malic enzyme)의 활성이 저하되는 개변.
상기 (D) 및 (E)의 개변은, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변의 일례일 수 있다. 상기 (A), (B) 및 (C)의 개변은, 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변의 일례일 수 있다. 상기 (A) 및 (C)의 개변은, 구체적으로는, 아세트산의 자화성이 향상되는 개변의 일례일 수 있다. 상기 (B)의 개변은, 구체적으로는, 포스포케톨라제 경로의 플럭스가 증대하는 개변의 일례일 수 있다.
본 발명의 세균은, 상기 예시된 성질로부터 선택되는 1개 또는 그 이상의 성질을 갖고 있어도 좋다.
본 발명의 세균은, 예를 들면, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변 및/또는 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변을 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 세균은, 예를 들면, 적어도 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변을 갖고 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 예를 들면, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변 및 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변 중, 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변만을 갖고 있어도 좋고, 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변과 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변의 조합을 갖고 있어도 좋다.
본 발명의 세균은, 예를 들면, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변, 포스포케톨라제 경로의 플럭스가 증대하는 개변, 및/또는 아세트산의 자화성이 향상되는 개변을 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 세균은, 예를 들면, 적어도 아세트산의 자화성이 향상되는 개변을 갖고 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 예를 들면, 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변, 포스포케톨라제 경로의 플럭스가 증대하는 개변, 및 아세트산의 자화성이 향상되는 개변 중, 아세트산의 자화성이 향상되는 개변만을 갖고 있어도 좋고, 아세트산의 자화성이 향상되는 개변과 세포 내의 옥살로아세트산(OAA) 풀이 증대하는 개변 및/또는 포스포케톨라제 경로의 플럭스가 증대하는 개변의 조합을 갖고 있어도 좋다.
본 발명의 세균은, 예를 들면, 상기 (A) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 모두의 개변을 갖고 있어도 좋다. 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 예를 들면, (A), (B), (C), (D), (E), (A)+(B), (A)+(C), (A)+(D), (A)+(E), (B)+(C), (B)+(D), (B)+(E), (C)+(D), (C)+(E), (D)+(E), (A)+(B)+(C), (A)+(B)+(D), (A)+(B)+(E), (A)+(C)+(D), (A)+(D)+(E), (B)+(C)+(D), (B)+(C)+(E), (B)+(D)+(E), (C)+(D)+(E), (A)+(B)+(C)+(D), (A)+(B)+(C)+(E), (A)+(B)+(D)+(E), (A)+(C)+(D)+(E), (B)+(C)+(D)+(E) , (A)+(B)+(C)+(D)+(E)의 개변을 갖고 있어도 좋다. 「(A)+(B)의 개변」이란, (A)의 개변과 (B)의 개변의 조합을 의미한다. 이 설명은 다른 조합에도 준용할 수 있다. 본 발명의 세균은, 예를 들면, 적어도 상기 (A)의 개변을 갖고 있어도 좋다. 즉, 본 발명의 세균은, 구체적으로는, 예를 들면, 상기 (A) 내지 (E)의 개변 중, 상기 (A)의 개변만을 갖고 있어도 좋고, 상기 (A)의 개변과 상기 (B) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 또는 4개 모두의 개변의 조합을 갖고 있어도 좋다. 또한, 본 발명의 세균은, 예를 들면, 적어도 상기 (B)의 개변을 갖고 있어도 좋다.
「아스파르트산 트랜스아미나제(aspartate transaminase)」란, 아스파르트산 및/또는 글루타민산의 아미노기 전이 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 의미해도 좋다(예를 들면, EC 2.6.1.1). 이 활성을 「아스파르트산 트랜스아미나제 활성」이라고도 한다. 아스파르트산 트랜스아미나제 활성은, 구체적으로는, L-아스파르트산과 α-케토글루타르산을 옥살로아세트산과 L-글루타민산으로 변환하는 반응 및/또는 그 역반응을 촉매하는 활성이라도 좋다. 아스파르트산 트랜스아미나제를, 「글루타민산-옥살로아세트산 트랜스아미나제(glutamic-oxaloacetic transaminase)」라고도 한다. 아스파르트산 트랜스아미나제를 코드하는 유전자를 「아스파르트산 트랜스아미나제 유전자」라고도 한다. 아스파르트산 트랜스아미나제 유전자로서는 aspT 유전자를 들 수 있다. 개변되는 세균이 갖는 aspT 유전자 등의 아스파르트산 트랜스아미나제 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 AspT 단백질 등의 아스파르트산 트랜스아미나제의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13869의 aspT 유전자(CGBL_0102840)의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 1 및 2에 나타낸다.
「말릭 엔자임(malic enzyme)」이란, 말산의 산화적 탈탄산 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 의미해도 좋다(예를 들면, EC EC 1.1.1.38, EC 1.1.1.39, 또는 EC 1.1.1.40). 이 활성을 「말릭 엔자임 활성」이라고도 한다. 말릭 엔자임 활성은, 구체적으로는, 전자 수용체의 존재 하에서 말산을 탈탄산하여 피루브산을 생성하는 반응을 촉매하는 활성이라도 좋다. 전자 수용체로서는 NAD+나 NADP+를 들 수 있다. 말릭 엔자임은 적어도 하나의 전자 수용체를 이용할 수 있으면 좋다. 말릭 엔자임은 또한, 옥살로아세트산의 탈탄산 반응(구체적으로는, 옥살로아세트산을 피루브산과 이산화탄소로 변환하는 반응)을 촉매하는 활성을 갖고 있어도 좋다. 말릭 엔자임을 「말산 디하이드로게나제(malate dehydrogenase)」라고도 한다. 말릭 엔자임을 코드하는 유전자를 「말릭 엔자임 유전자」라고도 한다. 말릭 엔자임 유전자로서는 malE 유전자를 들 수 있다. 개변되는 세균이 갖는 malE 유전자 등의 말릭 엔자임 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 MalE 단백질 등의 말릭 엔자임의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13869의 malE 유전자(CGBL_0129850)의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 3 및 4에 나타낸다.
「피루브산 디하이드로게나제(pyruvate dehydrogenase)」란, 피루브산의 산화적 탈탄산 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 의미해도 좋다(예를 들면, EC 1.2.5.1). 이 활성을, 「피루브산 디하이드로게나제 활성」이라고도 한다. 피루브산 디하이드로게나제 활성은, 구체적으로는, 전자 수용체의 존재 하에서 피루브산을 탈탄산하여 아세트산을 생성하는 반응을 촉매하는 활성이라도 좋다. 전자 수용체로서는 유비퀴논 등의 퀴논을 들 수 있다. 피루브산 디하이드로게나제는 적어도 하나의 전자 수용체를 이용할 수 있으면 좋다. 피루브산 디하이드로게나제를 코드하는 유전자를 「피루브산 디하이드로게나제 유전자」라고도 한다. 피루브산 디하이드로게나제 유전자로서는 poxB 유전자를 들 수 있다. 개변되는 세균이 갖는 poxB 유전자 등의 피루브산 디하이드로게나제 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 PoxB 단백질 등의 피루브산 디하이드로게나제의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13869의 poxB 유전자(CGBL_0125410)의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 5 및 6에 나타낸다.
「아세트산 키나제(acetate kinase)」란, 아세트산의 인산화 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 의미해도 좋다(예를 들면, EC 2.7.2.1). 이 활성을, 「아세트산 키나제 활성」이라고도 한다. 아세트산 키나제 활성은, 구체적으로는, 인산기 공여체의 존재 하에서 아세트산을 인산화하여 아세틸인산을 생성하는 반응을 촉매하는 활성이라도 좋다. 인산기 공여체로서는 ATP를 들 수 있다. 아세트산 키나제는 적어도 하나의 인산기 공여체를 이용할 수 있으면 좋다. 아세트산 키나제를 코드하는 유전자를 「아세트산 키나제 유전자」라고도 한다. 아세트산 키나제 유전자로서는 ack 유전자를 들 수 있다. ack 유전자 등의 아세트산 키나제 유전자로서는, 코리네형 세균이나 장내 세균과에 속하는 세균 등의 각종 생물의 유전자를 들 수 있다. ack 유전자로서, 구체적으로는, Corynebacterium glutamicum이나 E. coli의 ack 유전자를 들 수 있다. 각종 생물의 ack 유전자 등의 아세트산 키나제 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 Ack 단백질 등의 아세트산 키나제의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13869의 ack 유전자(CGBL_0126910)의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 7 및 8에 나타낸다. E. coli MG1655의 ack 유전자의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 9 및 10에 나타낸다.
「프럭토스-1,6-비스포스파타제(fructose 1,6-bisphosphatase)」란, 프럭토스-1,6-비스인산의 탈인산화 반응을 촉매하는 활성을 갖는 단백질을 의미해도 좋다(예를 들면, EC 3.1.3.11). 이 활성을, 「프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성」이라고도 한다. 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성은, 구체적으로는, 프럭토스-1,6-비스인산을 프럭토스-6-인산으로 변환하는 반응을 촉매하는 활성이라도 좋다. 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 유전자를 「프럭토스-1,6-비스포스파타제 유전자」라고도 한다. 프럭토스-1,6-비스포스파타제 유전자로서는 glpX 유전자를 들 수 있다. glpX 유전자 등의 프럭토스-1,6-비스포스파타제 유전자로서는, 코리네형 세균이나 장내 세균과에 속하는 세균 등의 각종 생물의 유전자를 들 수 있다. glpX 유전자로서, 구체적으로는, Corynebacterium glutamicum이나 E. coli의 glpX 유전자를 들 수 있다. 각종 생물의 glpX 유전자 등의 프럭토스-1,6-비스포스파타제 유전자의 염기서열 및 이들에 코드되는 GlpX 단백질 등의 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 아미노산 서열은, 예를 들면, NCBI 등의 공개 데이터 베이스로부터 취득할 수 있다. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 glpX 유전자(NCgl0976)의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 11 및 12에 나타낸다. E. coli MG1655의 glpX 유전자의 염기서열 및 이 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 13 및 14에 나타낸다.
단백질의 활성을 저하시키는 수법에 대해서는 후술한다. 단백질의 활성은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 감소시킴으로써, 또는 이 유전자를 파괴함으로써 저하시킬 수 있다. 이러한 단백질의 활성을 저하시키는 수법은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
단백질의 활성을 증대시키는 수법에 대해서는 후술한다. 단백질의 활성은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대시킬 수 있다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 유전자의 카피수를 높임으로써, 또는 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 상승시킬 수 있다. 이러한 단백질의 활성을 증대시키는 수법은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
특정한 성질에 있어서 활성이 저하 또는 증대하는 단백질을 총칭하여 「표적 단백질」이라고도 한다. 표적 단백질을 코드하는 유전자를 총칭하여 「표적 유전자」라고도 한다.
표적 유전자는, 예를 들면, 상기 예시한 표적 유전자의 염기서열(예를 들면, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 염기서열)을 갖는 유전자라도 좋다. 또한, 표적 단백질은, 예를 들면, 상기 예시한 표적 단백질의 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열)을 갖는 단백질이라도 좋다. 또한, 「(아미노산 또는 염기) 서열을 갖는다」라는 표현은, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열을 포함한다」는 것을 의미하고, 당해 「(아미노산 또는 염기) 서열로 이루어지는」 경우도 포함한다.
표적 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 표적 유전자(예를 들면, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 염기서열을 갖는 유전자)의 변이체라도 좋다. 마찬가지로, 표적 단백질은 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 예시한 표적 단백질(예를 들면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질)의 변이체라도 좋다. 또한, 이러한 원래의 기능이 유지된 변이체를 「보존적 변이체」라고 하는 경우가 있다. 「aspT 유전자」, 「malE 유전자」, 「poxB 유전자」, 「ack 유전자」, 및 「glpX 유전자」라는 용어는, 각각 상기 예시한 aspT 유전자, malE 유전자, poxB 유전자, ack 유전자, 및 glpX 유전자에 더하여, 이들의 보존적 변이체를 포함하는 것으로 한다. 마찬가지로, 「AspT 단백질」, 「MalE 단백질」, 「PoxB 단백질」, 「Ack 단백질」, 및 「GlpX 단백질」이라는 용어는, 각각 상기 예시한 AspT 단백질, MalE 단백질, PoxB 단백질, Ack 단백질, 및 GlpX 단백질에 더하여, 이들의 보존적 변이체를 포함하는 것으로 한다. 보존적 변이체로서는, 예를 들면, 상기 예시한 표적 유전자나 표적 단백질의 동족체나 인위적인 개변체를 들 수 있다.
「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 유전자 또는 단백질의 변이체가, 원래의 유전자 또는 단백질의 기능(예를 들면, 활성이나 성질)에 대응하는 기능(예를 들면, 활성이나 성질)을 갖는 것을 말한다. 유전자에 대한 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 유전자의 변이체가, 원래의 기능이 유지된 단백질을 코드하는 것을 말한다. 즉, 각 표적 유전자에 대한 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 유전자의 변이체가, 각 표적 단백질의 활성: 아스파르트산 트랜스아미나제에 대해서 아스파르트산 트랜스아미나제 활성; 말릭 엔자임에 대해서 말릭 엔자임 활성; 피루브산 디하이드로게나제에 대해서 피루브산 디하이드로게나제 활성; 아세트산 키나제에 대해서 아세트산 키나제 활성; 프럭토스-1,6-비스포스파타제에 대해서 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성;을 갖는 단백질을 코드하는 것을 의미해도 좋다. 또한, 각 표적 단백질에 대한 「원래의 기능이 유지되고 있다」란, 단백질의 변이체가, 각 표적 단백질의 활성: 아스파르트산 트랜스아미나제에 대해서 아스파르트산 트랜스아미나제 활성; 말릭 엔자임에 대해서 말릭 엔자임 활성; 피루브산 디하이드로게나제에 대해서 피루브산 디하이드로게나제 활성; 아세트산 키나제에 대해서 아세트산 키나제 활성; 프럭토스-1,6-비스포스파타제에 대해서 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성;을 갖는 것을 의미해도 좋다.
아스파르트산 트랜스아미나제 활성은, 예를 들면, 효소를 대응하는 기질(예를 들면, L-아스파르트산과 α-케토글루타르산)과 인큐베이트하고, 효소 및 기질 의존적인 대응하는 산물(예를 들면, 옥살로아세트산과 L-글루타민산)의 생성을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
말릭 엔자임 활성은, 예를 들면, 전자 수용체의 존재 하에서 효소를 대응하는 기질(예를 들면, 말산)과 인큐베이트하고, 효소 및 기질 의존적인 대응하는 산물(예를 들면, 피루브산)의 생성을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
피루브산 디하이드로게나제 활성은, 예를 들면, 전자 수용체의 존재 하에서 효소를 대응하는 기질(예를 들면, 피루브산)과 인큐베이트하고, 효소 및 기질 의존적인 대응하는 산물(예를 들면, 아세트산)의 생성을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
아세트산 키나제 활성은, 예를 들면, 인산기 공여체의 존재 하에서 효소를 대응하는 기질(예를 들면, 아세트산)과 인큐베이트하고, 효소 및 기질 의존적인 대응하는 산물(예를 들면, 아세틸인산)의 생성을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성은, 예를 들면, 효소를 대응하는 기질(예를 들면, 프럭토스-1,6-비스인산)과 인큐베이트하고, 효소 및 기질 의존적인 대응하는 산물(예를 들면, 프럭토스-6-인산)의 생성을 측정함으로써, 측정할 수 있다.
이하, 보존적 변이체에 대하여 예시한다.
표적 유전자의 동족체 또는 표적 단백질의 동족체는, 예를 들면, 상기 예시한 표적 유전자의 염기서열 또는 상기 예시한 표적 단백질의 아미노산 서열을 문의 서열로서 사용한 BLAST 검색이나 FASTA 검색에 의해 공개 데이터 베이스로부터 용이하게 취득할 수 있다. 또한, 표적 유전자의 동족체는, 예를 들면, 각종 생물의 염색체를 주형으로 하여, 이들 공지된 표적 유전자의 염기서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 취득할 수 있다.
표적 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열(예를 들면, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열)에 있어서, 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다. 예를 들면, 코드되는 단백질은 그 N-말단 및/또는 C-말단이, 연장 또는 단축되어 있어도 좋다. 또한 상기 「1 또는 여러 개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에서의 위치나 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는, 예를 들면, 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 30개, 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개를 의미한다.
상기의 1 또는 여러 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가는, 단백질의 기능이 정상적으로 유지되는 보존적 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는 Phe, Trp, Tyr 사이에서, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, Val 사이에서, 극성 아미노산인 경우에는 Gln, Asn 사이에서, 염기성 아미노산인 경우에는 Lys, Arg, His 사이에서, 산성 아미노산인 경우에는 Asp, Glu 사이에서, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는 Ser, Thr 사이에서 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환으로 간주되는 치환으로서는, 구체적으로는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn으로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp로부터 Asn, Glu 또는 Gln으로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및 Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가에는, 유전자가 유래하는 생물의 개체 차이, 종류 차이에 근거한 경우 등 천연에서 발생하는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다.
또한, 표적 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 아미노산 서열 전체에 대하여, 예를 들면, 50% 이상, 65% 이상, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 유전자라도 좋다.
또한, 표적 유전자는 원래의 기능이 유지되고 있는 한, 상기 염기서열(예를 들면, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 나타낸 염기서열)로 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면 상기 염기서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과, 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 유전자(예를 들면, DNA)라도 좋다. 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일례를 게시하면, 동일성이 높은 DNA끼리, 예를 들면, 50% 이상, 65% 이상, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더 바람직하게는 97% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖는 DNA끼리 하이브리다이즈하고, 이보다 동일성이 낮은 DNA끼리 하이브리다이즈하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정의 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 60℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 보다 바람직하게는 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서 1회, 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 하이브리드화에 사용하는 프로브는 유전자의 상보 서열의 일부라도 좋다. 이러한 프로브는, 공지된 유전자 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하고, 상술한 유전자를 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 프로브로서는 300bp 정도의 길이의 DNA 단편을 사용할 수 있다. 프로브로서 300bp 정도의 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는, 하이브리드화의 세정의 조건으로서는 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
또한, 숙주에 따라 코돈의 축중성(縮重性)이 다르기 때문에, 표적 유전자는, 임의의 코돈을 그것과 등가의 코돈으로 치환한 것이라도 좋다. 즉, 표적 유전자는, 유전 코드의 축중에 의한 상기 예시한 표적 유전자의 변이체라도 좋다. 예를 들면, 표적 유전자는, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 개변되어도 좋다.
또한, 아미노산 서열간의 「동일성」이란, blastp에 의해 디폴트 설정의 Scoring Parameters(Matrix: BLOSUM62; Gap Costs: Existence=11, Extension=1; Compositional Adjustments: Conditional compositional score matrix adjustment)를 사용하여 산출되는 아미노산 서열간의 동일성을 의미한다. 또한, 염기서열간의 「동일성」이란, blastn에 의해 디폴트 설정의 Scoring Parameters(Match/Mismatch Scores=1, -2; Gap Costs=Linear)를 사용하여 산출되는 염기서열간의 동일성을 의미한다.
또한, 상기의 유전자나 단백질의 보존적 변이체에 관한 기재는, L-아미노산 생합성계 효소 등의 임의의 단백질, 및 이들을 코드하는 유전자에도 준용할 수 있다.
<1-3> 단백질의 활성을 증대시키는 수법
이하에, 단백질의 활성을 증대시키는 수법에 대하여 설명한다.
「단백질의 활성이 증대한다」란, 이 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 증대하는 것을 의미한다. 「단백질의 활성이 증대한다」란, 구체적으로는, 이 단백질의 세포당 활성이 비개변주와 비교하여 증대하는 것을 의미한다. 여기서 말하는 「비개변주」란, 표적 단백질의 활성이 증대하도록 개변되어 있지 않은 대조주를 의미한다. 비개변주로서는 야생주나 친주를 들 수 있다. 비개변주로서, 구체적으로는, 각 세균종의 기준주(type strain)를 들 수 있다. 또한, 비개변주로서, 구체적으로는, 세균의 설명에서 예시한 균주도 들 수 있다. 즉, 일 형태에 있어서, 단백질의 활성은 기준주(즉, 본 발명의 세균이 속하는 종의 기준주)와 비교하여 증대해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum ATCC 13869주와 비교하여 증대해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum ATCC 13032주와 비교하여 증대해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)과 비교하여 증대해도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum YDK010주와 비교하여 증대해도 좋다. 또한, 「단백질의 활성이 증대한다」는 것을, 「단백질의 활성이 증강된다」라고도 한다. 「단백질의 활성이 증대한다」란, 더 구체적으로는, 비개변주와 비교하여, 이 단백질의 세포당 분자수가 증가하고 있는 것, 및/또는, 이 단백질의 분자당 기능이 증대하고 있는 것을 의미해도 좋다. 즉, 「단백질의 활성이 증대한다」고 하는 경우의 「활성」이란, 단백질의 촉매 활성에 한정되지 않고, 단백질을 코드하는 유전자의 전사량(mRNA량) 또는 번역량(단백질의 양)을 의미해도 좋다. 「단백질의 세포당 분자수」란, 이 단백질의 분자수의 세포당 평균값을 의미해도 좋다. 또한, 「단백질의 활성이 증대한다」는 것에는, 원래 표적 단백질의 활성을 갖는 균주에 있어서 이 단백질의 활성을 증대시키는 것뿐만 아니라, 원래 표적 단백질의 활성이 존재하지 않는 균주에 이 단백질의 활성을 부여하는 것도 포함된다. 또한, 결과적으로 단백질의 활성이 증대하는 한, 숙주가 본래 갖는 표적 단백질의 활성을 저하 또는 소실시킨 후, 적절한 표적 단백질의 활성을 부여해도 좋다.
단백질의 활성 증대의 정도는, 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 증대해 있으면 특별히 제한되지 않는다. 단백질의 활성은, 예를 들면, 비개변주의 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다. 또한, 비개변주가 표적 단백질의 활성을 갖고 있지 않은 경우에는, 이 단백질을 코드하는 유전자를 도입함으로써 이 단백질이 생성되어 있으면 좋지만, 예를 들면, 이 단백질은 그 활성이 측정할 수 있는 정도로 생산되어 있어도 좋다.
단백질의 활성이 증대하는 개변은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 달성할 수 있다. 「유전자의 발현이 상승한다」란, 이 유전자의 발현이 야생주나 친주 등의 비개변주과 비교하여 증대하는 것을 의미한다. 「유전자의 발현이 상승한다」란, 구체적으로는, 이 유전자의 세포당 발현량이 비개변주와 비교하여 증대하는 것을 의미한다. 「유전자의 세포당 발현량」이란, 이 유전자의 발현량의 세포당 평균값을 의미해도 좋다. 「유전자의 발현이 상승한다」란, 더 구체적으로는, 유전자의 전사량(mRNA 양)이 증대하는 것, 및/또는, 유전자의 번역량(단백질의 양)이 증대하는 것을 의미해도 좋다. 또한, 「유전자의 발현이 상승한다」는 것을, 「유전자의 발현이 증강된다」라고도 한다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 비개변주의 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다. 또한, 「유전자의 발현이 상승한다」는 것은, 원래 표적의 유전자가 발현하고 있는 균주에 있어서 이 유전자의 발현량을 상승시키는 것뿐만 아니라, 원래 표적의 유전자가 발현하고 있지 않은 균주에 있어서, 이 유전자를 발현시키는 것도 포함된다. 즉, 「유전자의 발현이 상승한다」란, 예를 들면, 표적의 유전자를 유지하지 않는 균주에 이 유전자를 도입하고, 이 유전자를 발현시키는 것을 의미해도 좋다.
유전자의 발현의 상승은, 예를 들면, 유전자의 카피수를 증가시킴으로써 달성할 수 있다.
유전자의 카피수의 증가는, 숙주의 염색체에 이 유전자를 도입함으로써 달성할 수 있다. 염색체로의 유전자의 도입은, 예를 들면, 상동 재조합을 이용하여 행할 수 있다(Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). 상동 재조합을 이용하는 유전자 도입법으로서는, 예를 들면, Red 구동된 통합(Red-driven integration)법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 사용하는 방법, 파지를 사용한 형질도입법을 들 수 있다. 구체적으로는, 표적 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 숙주를 형질 전환하고, 숙주의 염색체상의 표적 부위와 상동 재조합을 일으킴으로써, 상기 유전자를 숙주의 염색체 위에 도입할 수 있다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA의 구조는, 원하는 형태로 상동 재조합이 일어나는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 표적 유전자를 포함하는 선상 DNA로서, 상기 유전자의 양단에 염색체상의 표적 부위의 상류 및 하류에 상동인 염기서열을 각각 구비하는 선상 DNA로 숙주를 형질 전환하여, 표적 부위의 상류 및 하류에서 각각 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 표적 부위를 상기 유전자로 치환할 수 있다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA는, 형질 전환체를 선택하기 위한 마커 유전자를 구비하고 있어도 좋다. 유전자는 1카피만 도입되어도 좋고, 2카피 또는 그 이상 도입되어도 좋다. 예를 들면, 염색체 위에 다수의 카피가 존재하는 염기서열을 표적으로 하여 상동 재조합을 행함으로써, 염색체에 유전자의 다수의 카피를 도입할 수 있다. 염색체 위에 다수의 카피가 존재하는 염기서열로서는, 반복 DNA 서열(repetitive DNA) 및 트랜스포존의 양단에 존재하는 인버티드·리피트를 들 수 있다. 또한, 목적 물질의 생산에 불필요한 유전자 등의 염색체상의 적당한 염기서열을 표적으로 하여 상동 재조합을 행해도 좋다. 또한, 유전자는, 트랜스포존이나 Mini-Mu를 사용하여 염색체 위에 랜덤으로 도입할 수도 있다(일본 공개특허공보 특개평2-109985호, US5,882,888, EP805867B1). 또한, 이러한 상동 재조합을 이용한 염색체의 개변 수법은, 표적 유전자의 도입에 한정되지 않고, 발현 조절 서열의 개변 등의, 염색체의 임의의 개변에 이용할 수 있다.
염색체 위에 표적 유전자가 도입된 것의 확인은, 이 유전자의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 갖는 프로브를 사용한 서던 하이브리드화, 또는 이 유전자의 서열에 기초하여 작성한 프라이머를 사용한 PCR 등에 의해 확인할 수 있다.
또한, 유전자의 카피수의 증가는, 이 유전자를 포함하는 벡터를 숙주에 도입함으로써도 달성할 수 있다. 예를 들면, 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 숙주에서 기능하는 벡터와 연결하여 이 유전자의 발현 벡터를 구축하고, 당해 발현 벡터로 숙주를 형질 전환함으로써, 이 유전자의 카피수를 증가시킬 수 있다. 표적 유전자를 포함하는 DNA 단편은, 예를 들면, 표적 유전자를 갖는 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 하는 PCR에 의해 취득할 수 있다. 벡터로서는, 숙주의 세포 내에서 자율 복제 가능한 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 멀티 카피 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 형질 전환체를 선택하기 위해서, 벡터는 항생 물질 내성 유전자 등의 마커를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 벡터는, 삽입된 유전자를 발현하기 위한 프로모터나 터미네이터를 구비하고 있어도 좋다. 벡터는, 예를 들면, 세균 플라스미드 유래의 벡터, 효모 플라스미드 유래의 벡터, 박테리오파지 유래의 벡터, 코스미드, 또는 파지미드 등이라도 좋다. 코리네형 세균에서 자율 복제 가능한 벡터로서, 구체적으로는, 예를 들면, pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)); 이들을 개량한 약제 내성 유전자를 갖는 플라스미드; pCRY30(일본 공개특허공보 특개평3-210184); pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE, 및 pCRY3KX(일본 공개특허공보 특개평2-72876, 미국특허 제5,185,262호); pCRY2 및 pCRY3(일본 공개특허공보 특개평1-191686); pAJ655, pAJ611, 및 pAJ1844(일본 공개특허공보 특개소58-192900); pCG1(일본 공개특허공보 특개소57-134500); pCG2(일본 공개특허공보 특개소58-35197); pCG4 및 pCG11(일본 공개특허공보 특개소57-183799); pVK7(일본 공개특허공보 특개평10-215883); pVK9(US2006-0141588); pVC7(일본 공개특허공보 특개평9-070291); pVS7(WO2013/069634)을 들 수 있다.
유전자를 도입하는 경우, 유전자는 발현 가능하게 숙주에 유지되어 있으면 좋다. 구체적으로는, 유전자는, 숙주에서 기능하는 프로모터에 의한 제어를 받아 발현하도록 유지되어 있으면 좋다. 프로모터는 숙주에서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 「숙주에서 기능하는 프로모터」란, 숙주에서 프로모터 활성을 갖는 프로모터를 말한다. 프로모터는 숙주 유래의 프로모터라도 좋고, 이종 유래의 프로모터라도 좋다. 프로모터는, 도입하는 유전자의 고유한 프로모터라도 좋고, 다른 유전자의 프로모터라도 좋다. 프로모터로서는, 예를 들면, 후술하는 바와 같은, 보다 강력한 프로모터를 이용해도 좋다.
유전자의 하류에는, 전사 종결용의 터미네이터를 배치할 수 있다. 터미네이터는 숙주에서 기능하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 터미네이터는 숙주 유래의 터미네이터라도 좋고, 이종 유래의 터미네이터라도 좋다. 터미네이터는 도입하는 유전자의 고유한 터미네이터라도 좋고, 다른 유전자의 터미네이터라도 좋다.
각종 미생물에 있어서 이용 가능한 벡터, 프로모터, 터미네이터에 관해서는, 예를 들면 「미생물학 기초강좌 8 유전자공학, 공립 출판, 1987년」에 상세하게 기재되어 있고, 이들을 이용하는 것이 가능하다.
또한, 2 또는 그 이상의 유전자를 도입하는 경우, 각 유전자가, 발현 가능하게 숙주에 유지되어 있으면 좋다. 예를 들면, 각 유전자는 모두가 단일의 발현 벡터 위에 유지되어 있어도 좋고, 전부가 염색체 위에 유지되어 있어도 좋다. 또한, 각 유전자는 복수의 발현 벡터 위에 따로따로 유지되어 있어도 좋고, 단일 또는 복수의 발현 벡터 위와 염색체 위에 따로따로 유지되어 있어도 좋다. 또한, 2 또는 그 이상의 유전자로 오페론을 구성하여 도입해도 좋다. 「2 또는 그 이상의 유전자를 도입하는 경우」로서는, 예를 들면, 2 또는 그 이상의 단백질(예를 들면 효소)을 각각 코드하는 유전자를 도입하는 경우, 단일의 단백질 복합체(예를 들면 효소 복합체)를 구성하는 2 또는 그 이상의 서브유닛을 각각 코드하는 유전자를 도입하는 경우, 및 이들의 조합을 들 수 있다.
도입되는 유전자는, 숙주에서 기능하는 단백질을 코드하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 도입되는 유전자는 숙주 유래의 유전자라도 좋고, 이종 유래의 유전자라도 좋다. 도입되는 유전자는, 예를 들면, 이 유전자의 염기서열에 기초하여 설계한 프라이머를 사용하고, 이 유전자를 갖는 생물의 게놈 DNA나 이 유전자를 탑재하는 플라스미드 등을 주형으로서, PCR에 의해 취득할 수 있다. 또한, 도입되는 유전자는, 예를 들면, 이 유전자의 염기서열에 기초하여 전체 합성해도 좋다(Gene, 60(1), 115-127(1987)). 취득한 유전자는 그대로, 또는 적절히 개변하여 이용할 수 있다. 즉, 유전자를 개변함으로써 그 변이체를 취득할 수 있다. 유전자의 개변은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, DNA의 목적 부위에 목적의 변이를 도입할 수 있다. 즉, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해, 코드되는 단백질이 특정한 부위에서 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하도록, 유전자의 코드 영역을 개변할 수 있다. 부위 특이적 변이법으로서는, PCR을 사용하는 방법(Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press(1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382(1987))이나, 파지를 사용하는 방법(Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987))을 들 수 있다. 또한, 유전자의 변이체가 전체 합성해도 좋다.
또한, 단백질이 복수의 서브유닛으로 이루어지는 복합체로서 기능하는 경우, 결과로서 단백질의 활성이 증대하는 한, 이들 복수의 서브유닛의 전부를 개변해도 좋고, 일부만을 개변해도 좋다. 즉, 예를 들면, 유전자의 발현을 상승시킴으로써 단백질의 활성을 증대시키는 경우, 이들의 서브유닛을 코드하는 복수의 유전자의 전부의 발현을 증강해도 좋고, 일부의 발현만을 증강해도 좋다. 통상은, 이들 서브유닛을 코드하는 복수의 유전자의 전부의 발현을 증강하는 것이 바람직하다. 또한, 복합체를 구성하는 각 서브유닛은, 복합체가 표적의 단백질의 기능을 갖는 한, 1종의 생물 유래라도 좋고, 2종 또는 그 이상의 상이한 생물 유래라도 좋다. 즉, 예를 들면, 복수의 서브유닛을 코드하는, 동일한 생물 유래의 유전자를 숙주에 도입해도 좋고, 각각 다른 생물 유래의 유전자를 숙주에 도입해도 좋다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 전사 효율을 향상시킴으로써 달성할 수 있다. 또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 번역 효율을 향상시킴으로써 달성할 수 있다. 유전자의 전사 효율이나 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 발현 조절 서열의 개변에 의해 달성할 수 있다. 「발현 조절 서열」이란, 유전자의 발현에 영향을 미치는 부위의 총칭이다. 발현 조절 서열로서는, 예를 들면, 프로모터, 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함), 및 RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역을 들 수 있다. 발현 조절 서열은, 프로모터 검색 벡터나 GENETYX 등의 유전자 해석 소프트를 사용하여 결정할 수 있다. 이들 발현 조절 서열의 개변은, 예를 들면, 온도 감수성 벡터를 사용한 방법이나, Red 구동된 통합법(WO2005/010175)에 의해 행할 수 있다.
유전자의 전사 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 프로모터를보다 강력한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 강력한 프로모터」란, 유전자의 전사가, 원래 존재하고 있는 야생형의 프로모터보다도 향상되는 프로모터를 의미한다. 코리네형 세균에서 이용할 수 있는 보다 강력한 프로모터로서는, 예를 들면, 인위적으로 설계 변경된 P54-6 프로모터(Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000)), 코리네형 세균 내에서 아세트산 , 에탄올, 피루브산 등으로 유도할 수 있는 pta, aceA, aceB, adh, amyE 프로모터, 코리네형 세균 내에서 발현량이 많은 강력한 프로모터인 cspB, SOD, tuf(EF-Tu) 프로모터(Journal of Biotechnology 104(2003) 311-323; Appl Environ Microbiol. 2005 Dec; 71(12): 8587-96.), lac 프로모터, tac 프로모터, trc 프로모터를 들 수 있다. 또한, 보다 강력한 프로모터로서는, 각종 리포터 유전자를 사용함으로써 재래의 프로모터의 고활성형인 것을 취득해도 좋다. 예를 들면, 프로모터 영역 내의 -35, -10 영역을 콘센서스 서열에 가까이 함으로써, 프로모터의 활성을 높일 수 있다(국제공개 제00/18935호). 고활성형 프로모터로서는, 각종 tac 유사 프로모터(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)나 pnlp8 프로모터(WO2010/027045)를 들 수 있다. 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128(1995)) 등에 기재되어 있다.
유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함)을 보다 강력한 SD 서열로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 강력한 SD 서열」이란, mRNA의 번역이, 원래 존재하고 있는 야생형의 SD 서열보다도 향상되는 SD 서열을 의미한다. 보다 강력한 SD 서열로서는, 예를 들면, 파지 T7 유래의 유전자 10의 RBS를 들 수 있다(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). 또한, RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역, 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열(5'-UTR)에서의 여러 개의 뉴클레오티드의 치환, 또는 삽입, 또는 결실이 mRNA의 안정성 및 번역 효율에 매우 영향을 끼치는 것으로 알려져 있고, 이들을 개변함으로써도 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다.
유전자의 번역 효율의 향상은, 예를 들면, 코돈의 개변에 의해서도 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자 중에 존재하는 희귀 코돈을, 보다 고빈도로 이용되는 동의 코돈으로 치환함으로써, 유전자의 번역 효율을 향상시킬 수 있다. 즉, 도입되는 유전자는, 예를 들면, 사용하는 숙주의 코돈 사용 빈도에 따라 최적의 코돈을 갖도록 개변되어도 좋다. 코돈의 치환은, 예를 들면, 부위 특이적 변이법에 의해 행할 수 있다. 또한, 코돈이 치환된 유전자 단편을 전체 합성해도 좋다. 다양한 생물에서의 코돈의 사용 빈도는 「코돈 사용 데이터 베이스」(http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292(2000))에 개시되어 있다.
또한, 유전자의 발현의 상승은, 유전자의 발현을 상승시키는 조절인자를 증폭하는 것, 또는, 유전자의 발현을 저하시키는 조절인자를 결실 또는 약화시킴으로써도 달성할 수 있다.
상기와 같은 유전자의 발현을 상승시키는 수법은 단독으로 사용해도 좋고, 임의의 조합으로 사용해도 좋다.
또한, 단백질의 활성이 증대하는 개변은, 예를 들면, 단백질의 비활성을 증강함으로써도 달성할 수 있다. 비활성 증강에는 피드백 저해의 탈감작(desensitization to feedback inhibition)도 포함된다. 비활성이 증강된 단백질은, 예를 들면, 다양한 생물을 탐색하여 취득할 수 있다. 또한, 재래의 단백질에 변이를 도입함으로써 고활성형인 것을 취득해도 좋다. 도입되는 변이는, 예를 들면, 단백질의 1 또는 여러 개의 위치에서의 1 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 것이라도 좋다. 변이의 도입은, 예를 들면, 상술한 바와 같은 부위 특이적 변이법에 의해 행할 수 있다. 또한, 변이의 도입은, 예를 들면, 돌연 변이 처리에 의해 행해도 좋다. 돌연 변이 처리로서는 X선의 조사, 자외선의 조사, 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸메탄설포네이트(EMS), 및 메틸메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 처리를 들 수 있다. 또한, in vitro에서 DNA를 직접 하이드록실아민으로 처리하고, 랜덤 변이를 유도해도 좋다. 비활성의 증강은 단독으로 사용해도 좋고, 상기와 같은 유전자의 발현을 증강하는 수법과 임의로 조합하여 사용해도 좋다.
형질 전환의 방법은 특별히 한정되지 않고, 종래 알려진 방법을 사용할 수 있다. 코리네형 세균의 형질 전환의 방법으로서는, 프로토플라스트법(Gene, 39, 281-286(1985)), 일렉트로포레이션법(Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)), 전기 펄스법(일본 공개특허공보 특개평2-207791호)을 들 수 있다.
단백질의 활성이 증대한 것은, 이 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
단백질의 활성이 증대한 것은, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현이 상승한 것을 확인함으로써도 확인할 수 있다. 유전자의 발현이 상승한 것은, 이 유전자의 전사량이 상승한 것을 확인하는 것이나, 이 유전자에서 발현되는 단백질의 양이 상승한 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
유전자의 전사량이 상승한 것의 확인은, 이 유전자에서 전사되는 mRNA의 양을 야생주 또는 친주 등의 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는 노던 하이브리드화, RT-PCR, 마이크로어레이, RNA-seq 등을 들 수 있다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001). mRNA의 양(예를 들면, 세포당 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다.
단백질의 양이 상승한 것의 확인은, 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 행할 수 있다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001). 단백질의 양(예를 들면, 세포당 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의 1.5배 이상, 2배 이상, 또는 3배 이상으로 상승해도 좋다.
상기한 단백질의 활성을 증대시키는 수법은, 임의의 단백질의 활성 증강이나 임의의 유전자의 발현 증강에 이용할 수 있다.
<1-4> 단백질의 활성을 저하시키는 수법
이하에, 단백질의 활성을 저하시키는 수법에 대하여 설명한다.
「단백질의 활성이 저하된다」란, 이 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「단백질의 활성이 저하된다」란, 구체적으로는, 이 단백질의 세포당 활성이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 여기서 말하는 「비개변주」란, 표적의 단백질의 활성이 저하되도록 개변되어 있지 않은 대조주를 의미한다. 비개변주로서는 야생주나 친주를 들 수 있다. 비개변주로서, 구체적으로는, 각 세균종의 기준주(type strain)를 들 수 있다. 또한, 비개변주로서, 구체적으로는, 세균의 설명에서 예시한 균주도 들 수 있다. 즉, 일 형태에 있어서, 단백질의 활성은 기준주(즉, 본 발명의 세균이 속하는 종의 기준주)와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum ATCC 13869주와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum ATCC 13032주와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum AJ12036(FERM BP-734)과 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 다른 형태에 있어서, 단백질의 활성은 C. glutamicum YDK010주와 비교하여 저하되어도 좋다. 또한, 「단백질의 활성이 저하된다」는 것에는, 이 단백질의 활성이 완전하게 소실되어 있는 경우도 포함된다. 「단백질의 활성이 저하된다」란, 더 구체적으로는, 비개변주와 비교하여, 이 단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있는 것, 및/또는, 이 단백질의 분자당 기능이 저하되고 있는 것을 의미해도 좋다. 즉, 「단백질의 활성이 저하된다」고 하는 경우의 「활성」이란, 단백질의 촉매 활성에 한정되지 않고, 단백질을 코드하는 유전자의 전사량(mRNA량) 또는 번역량(단백질의 양)을 의미해도 좋다. 또한, 「단백질의 세포당 분자수」란, 이 단백질의 분자수의 세포당 평균값을 의미해도 좋다. 또한, 「단백질의 세포당 분자수가 저하되고 있다」는 것에는, 이 단백질이 전혀 존재하고 있지 않은 경우도 포함된다. 또한, 「단백질의 분자당 기능이 저하되고 있다」는 것에는, 이 단백질의 분자당 기능이 완전하게 소실되어 있는 경우도 포함된다. 단백질의 활성 저하의 정도는 단백질의 활성이 비개변주와 비교하여 저하되고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 단백질의 활성은, 예를 들면, 비개변주의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써 달성할 수 있다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 이 유전자의 발현이 야생주나 친주 등의 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 구체적으로는, 이 유전자의 세포당 발현량이 비개변주와 비교하여 저하되는 것을 의미한다. 「유전자의 세포당 발현량」이란, 이 유전자의 발현량의 세포당 평균값을 의미해도 좋다. 「유전자의 발현이 저하된다」란, 더 구체적으로는, 유전자의 전사량(mRNA량)이 저하되는 것, 및/또는, 유전자의 번역량(단백질의 양)이 저하되는 것을 의미해도 좋다. 「유전자의 발현이 저하된다」는 것에는, 이 유전자가 전혀 발현되고 있지 않은 경우도 포함된다. 또한, 「유전자의 발현이 저하된다」는 것을, 「유전자의 발현이 약화된다」고도 한다. 유전자의 발현은, 예를 들면, 비개변주의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 전사 효율의 저하에 의한 것이라도 좋고, 번역 효율의 저하에 의한 것이라도 좋고, 이들의 조합에 의한 것이라도 좋다. 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 유전자의 프로모터, 샤인달가노(SD) 서열(리보솜 결합 부위(RBS)라고도 함), RBS와 개시 코돈 사이의 스페이서 영역 등의 발현 조절 서열을 개변함으로써 달성할 수 있다. 발현 조절 서열을 개변하는 경우에는, 발현 조절 서열은, 바람직하게는 1염기 이상, 보다 바람직하게는 2염기 이상, 특히 바람직하게는 3염기 이상이 개변된다. 유전자의 전사 효율의 저하는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 프로모터를 보다 약한 프로모터로 치환함으로써 달성할 수 있다. 「보다 약한 프로모터」란, 유전자의 전사가, 원래 존재하고 있는 야생형의 프로모터보다도 약화되는 프로모터를 의미한다. 보다 약한 프로모터로서는, 예를 들면, 유도형의 프로모터를 들 수 있다. 즉, 유도형의 프로모터는, 비유도 조건 하(예를 들면, 유도 물질의 비존재 하)에서 보다 약한 프로모터로서 기능할 수 있다. 또한, 발현 조절 서열의 일부 또는 전부의 영역을 결실(결손)시켜도 좋다. 또한, 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 발현 제어에 관한 인자를 조작함으로써도 달성할 수 있다. 발현 제어에 관한 인자로서는, 전사나 번역 제어에 관한 저분자(유도 물질, 저해 물질 등), 단백질(전사 인자 등), 핵산(siRNA 등) 등을 들 수 있다. 또한, 유전자의 발현의 저하는, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에 유전자의 발현이 저하되는 변이를 도입함으로써도 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자의 코드 영역의 코돈을, 숙주에서 보다 저빈도로 이용되는 동의 코돈으로 치환함으로써, 유전자의 발현을 저하시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 후술하는 바와 같은 유전자의 파괴에 의해 유전자의 발현 자체가 저하될 수 있다.
또한, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 이 단백질을 코드하는 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 「유전자가 파괴된다」란, 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 이 유전자가 개변되는 것을 의미한다. 「정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않는다」는 것에는, 이 유전자로부터 단백질이 전혀 생산되지 않는 경우나, 이 유전자로부터 분자당 기능(예를 들면 활성이나 성질)이 저하 또는 소실된 단백질이 생산되는 경우가 포함된다.
유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자를 결실(결손)시킴으로써 달성할 수 있다. 「유전자의 결실」이란, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역의 결실을 말한다. 또한, 염색체상의 유전자의 코드 영역 전후의 서열을 포함하여, 유전자 전체를 결실시켜도 좋다. 유전자의 코드 영역 전후의 서열에는, 예를 들면, 유전자의 발현 조절 서열이 포함되어도 좋다. 단백질의 활성의 저하를 달성할 수 있는 한, 결실시키는 영역은 N 말단 영역(단백질의 N 말단측을 코드하는 영역), 내부 영역, C 말단 영역(단백질의 C 말단측을 코드하는 영역) 등 중 어느 영역이라도 좋다. 통상, 결실시키는 영역은 긴 것이 확실하게 유전자를 불활화할 수 있다. 결실시키는 영역은, 예를 들면, 유전자의 코드 영역 전체 길이의 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 길이 영역이라도 좋다. 또한, 결실시키는 영역의 전후의 서열은 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 리딩 프레임의 불일치에 의해, 결실시키는 영역의 하류에서 프레임 시프트가 발생할 수 있다.
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 코드 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 종지 코돈(넌센스 변이)을 도입하는 것, 또는 1 내지 2염기의 부가 또는 결실(프레임 시프트 변이)을 도입하는 것 등에 의해서도 달성할 수 있다(Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)).
또한, 유전자의 파괴는, 예를 들면, 염색체상의 유전자의 코드 영역에 다른 염기서열을 삽입함으로써도 달성할 수 있다. 삽입 부위는 유전자 중 어느 영역이라도 좋지만, 삽입하는 염기서열은 긴 것이 확실하게 유전자를 불활화할 수 있다. 또한, 삽입 부위의 전후의 서열은 리딩 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 리딩 프레임의 불일치에 의해, 삽입 부위의 하류에서 프레임 시프트가 발생할 수 있다. 다른 염기서열로서는, 코드되는 단백질의 활성을 저하 또는 소실시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 항생 물질 내성 유전자 등의 마커 유전자나 목적 물질의 생산에 유용한 유전자를 들 수 있다.
유전자의 파괴는, 특히, 코드되는 단백질의 아미노산 서열이 결실(결손)되도록 실시해도 좋다. 바꿔 말하면, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 단백질의 아미노산 서열(아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역)을 결실시킴으로써, 구체적으로는, 아미노산 서열(아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역)이 결실된 단백질을 코드하도록 유전자를 개변함으로써 달성할 수 있다. 또한, 「단백질의 아미노산 서열의 결실」이란, 단백질의 아미노산 서열의 일부 또는 전부의 영역의 결실을 말한다. 또한, 「단백질의 아미노산 서열의 결실」이란, 단백질에 있어서 원래의 아미노산 서열이 존재하지 않게 되는 것을 말하고, 원래의 아미노산 서열이 다른 아미노산 서열로 변화하는 경우도 포함된다. 즉, 예를 들면, 프레임 시프트에 의해 다른 아미노산 서열로 변화한 영역은 결실된 영역으로 간주해도 좋다. 단백질의 아미노산 서열의 결실에 의해, 전형적으로는 단백질의 전체 길이가 단축되지만, 단백질의 전체 길이가 변화하지 않거나, 또는 연장되는 경우도 있을 수 있다. 예를 들면, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역의 결실에 의해, 코드되는 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 당해 결실된 영역이 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에의 종지 코돈의 도입에 의해, 코드되는 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 당해 도입 부위보다 하류의 영역이 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, 유전자의 코드 영역에서의 프레임 시프트에 의해, 당해 프레임 시프트 부위가 코드하는 영역을 결실시킬 수 있다. 아미노산 서열의 결실에서의 결실시키는 영역의 위치 및 길이에 대해서는, 유전자의 결실에서의 결실시키는 영역의 위치 및 길이의 설명을 준용할 수 있다.
염색체상의 유전자를 상기와 같이 개변하는 것은, 예를 들면, 정상적으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 개변한 파괴형 유전자를 제작하고, 당해 파괴형 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 숙주를 형질 전환하여, 파괴형 유전자와 염색체상의 야생형 유전자로 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 염색체상의 야생형 유전자를 파괴형 유전자로 치환하여 달성할 수 있다. 이때, 재조합 DNA에는 숙주의 영양 요구성 등의 형질에 따라, 마커 유전자를 포함시켜 두면 조작하기 쉽다. 파괴형 유전자로서는, 유전자의 코드 영역의 일부 또는 전부의 영역을 결실한 유전자, 미스센스 변이를 도입한 유전자, 넌센스 변이를 도입한 유전자, 프레임 시프트 변이를 도입한 유전자, 트랜스포존이나 마커 유전자 등의 삽입 서열을 삽입한 유전자를 들 수 있다. 파괴형 유전자에 의해 코드되는 단백질은 생성되었다 하더라도, 야생형 단백질과는 다른 입체 구조를 갖고, 기능이 저하 또는 소실된다. 상동 재조합에 사용하는 재조합 DNA의 구조는, 원하는 형태로 상동 재조합이 일어나는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 파괴형 유전자를 포함하는 선상 DNA로서, 양단에 염색체상의 야생형 유전자의 상류 및 하류의 서열을 각각 구비한 선상 DNA로 숙주를 형질 전환하여, 야생형 유전자의 상류 및 하류에서 각각 상동 재조합을 일으키게 함으로써, 야생형 유전자를 파괴형 유전자로 치환할 수 있다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있고, 「Red 구동된 통합(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법(Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645(2000)), Red 구동된 통합법과 λ파지 유래의 절제 시스템(Cho, E. H., Gumport, R, I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002))을 조합한 방법(WO2005/010175호 참조) 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 기능하는 복제 기점을 갖지 않는 수이사이드 벡터를 사용하는 방법 등이 있다(미국특허 제6303383호, 일본 공개특허공보 특개평05-007491호). 또한, 이러한 상동 재조합을 이용한 염색체의 개변 수법은, 표적 유전자의 파괴에 한정되지 않고, 발현 조절 서열의 개변 등의, 염색체의 임의의 개변에 이용할 수 있다.
또한, 단백질의 활성이 저하되는 개변은, 예를 들면, 돌연 변이 처리에 의해 행해도 좋다. 돌연 변이 처리로서는 X선의 조사, 자외선의 조사, 및 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), 에틸메탄설포네이트(EMS), 및 메틸메탄설포네이트(MMS) 등의 변이제에 의한 처리를 들 수 있다.
또한, 단백질이 복수의 서브유닛으로 이루어지는 복합체로서 기능하는 경우, 결과로서 단백질의 활성이 저하되는 한, 이들 복수의 서브유닛의 전부를 개변해도 좋고, 일부만을 개변해도 좋다. 즉, 예를 들면, 이들 서브유닛을 코드하는 복수의 유전자의 전부를 파괴해도 좋고, 일부만 파괴해도 좋다. 또한, 단백질에 복수의 아이소자임이 존재하는 경우, 결과로서 단백질의 활성이 저하되는 한, 복수의 아이소자임의 전부의 활성을 저하시켜도 좋고, 일부만의 활성을 저하시켜도 좋다. 즉, 예를 들면, 이들의 아이소자임을 코드하는 복수의 유전자의 전부를 파괴해도 좋고, 일부만을 파괴해도 좋다.
상기와 같은 단백질의 활성을 저하시키는 수법은 단독으로 사용해도 좋고, 임의의 조합으로 사용해도 좋다.
단백질의 활성이 저하된 것은, 이 단백질의 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
단백질의 활성이 저하된 것은, 이 단백질을 코드하는 유전자의 발현이 저하된 것을 확인함으로써도 확인할 수 있다. 유전자의 발현이 저하된 것은, 이 유전자의 전사량이 저하된 것을 확인하는 것이나, 이 유전자에서 발현되는 단백질의 양이 저하된 것을 확인함으로써 확인할 수 있다.
유전자의 전사량이 저하된 것의 확인은, 이 유전자에서 전사되는 mRNA의 양을 비개변주와 비교함으로써 행할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는, 노던 하이브리드화, RT-PCR, 마이크로어레이, RNA-seq 등을 들 수 있다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). mRNA의 양(예를 들면, 세포당 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
단백질의 양이 저하된 것의 확인은, 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 행할 수 있다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). 단백질의 양(예를 들면, 세포당 분자수)은, 예를 들면, 비개변주의 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 0%로 저하되어도 좋다.
유전자가 파괴된 것은, 파괴에 사용한 수단에 따라 이 유전자의 일부 또는 전부의 염기서열, 제한 효소 지도, 또는 전체 길이 등을 결정함으로써 확인할 수 있다.
상기한 단백질의 활성을 저하시키는 수법은, 임의의 단백질의 활성 저하나 임의의 유전자의 발현 저하에 이용할 수 있다.
<2> 본 발명의 L-아미노산의 제조 방법
본 발명의 방법은 본 발명의 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및 상기 배지 및/또는 상기 균체에서 상기 L-아미노산을 채취하는 것을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법이다. L-아미노산에 대해서는 상술한 바와 같다. 본 발명에서는, 1종의 L-아미노산이 제조되어도 좋고, 2종 또는 그 이상의 L-아미노산이 제조되어도 좋다.
사용하는 배지는, 본 발명의 세균이 증식할 수 있고, 목적의 L-아미노산이 생산되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 배지로서는, 예를 들면, 코리네형 세균 등의 세균의 배양에 사용되는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 배지로서는, 예를 들면, 탄소원, 질소원, 인산원, 황원, 그 밖의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로부터 선택되는 성분을 필요에 따라 함유하는 배지를 사용할 수 있다. 배지 성분의 종류나 농도는, 사용하는 세균의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정해도 좋다.
탄소원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 락토스, 갈락토스, 자일로스, 아라비노스, 폐당밀, 전분 가수분해물, 바이오매스의 가수분해물 등의 당류, 아세트산, 푸마르산, 시트르산, 숙신산 등의 유기산류, 글리세롤, 조 글리세롤, 에탄올 등의 알코올류, 지방산류를 들 수 있다. 탄소원으로서는, 특히 당류를 들 수 있다. 탄소원으로서, 더 특히 글루코스나 프럭토스를 들 수 있다. 글루코스나 프럭토스 등의 당류는 단독으로, 또는 다른 탄소원과 조합하여 탄소원으로서 사용되어도 좋다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 프럭토스를 구성 당으로 하는 당이 사용되어도 좋다. 프럭토스를 구성 당으로 하는 당으로서는, 프럭토스, 수크로스, 프락토올리고당을 들 수 있다. 프럭토스를 구성 당으로 하는 당은 단독으로, 또는 다른 탄소원과 조합하여 탄소원으로서 사용되어도 좋다. 또한, 탄소원으로서는, 식물 유래 원료를 적합하게 사용할 수 있다. 식물로서는, 예를 들면, 옥수수, 쌀, 밀, 대두, 사탕수수, 비트, 면을 들 수 있다. 식물 유래 원료로서는, 예를 들면, 뿌리, 대, 줄기, 가지, 잎, 꽃, 종자 등의 기관, 이들을 포함하는 식물체, 이들 식물 기관의 분해 산물을 들 수 있다. 식물 유래 원료의 이용 형태는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 미가공품, 즙, 분쇄물, 정제물 등 중 어느 형태라도 이용할 수 있다. 또한, 자일로스 등의 5탄당, 글루코스 등의 6탄당, 또는 이들의 혼합물은, 예를 들면, 식물 바이오매스에서 취득하여 이용할 수 있다. 구체적으로는, 이들 당류는, 식물 바이오매스를, 수증기 처리, 농산(濃酸) 가수분해, 희산(稀酸) 가수분해, 셀룰라제 등의 효소에 의한 가수분해, 알칼리 처리 등의 처리에 제공함으로써 취득할 수 있다. 또한, 헤미셀룰로스는 일반적으로 셀룰로스보다도 가수분해되기 쉽기 때문에, 식물 바이오매스 중의 헤미셀룰로스를 미리 가수분해하여 5탄당을 유리시키고, 다음으로, 셀룰로스를 가수분해하여 6탄당을 생성해도 좋다. 또한, 자일로스는, 예를 들면, 본 발명의 세균에 포도당 등의 6탄당에서 자일로스로의 변환 경로를 보유시켜서, 6탄당에서의 변환에 의해 공급해도 좋다. 탄소원으로서는, 1종의 탄소원을 사용해도 좋고, 2종 또는 그 이상의 탄소원을 조합하여 사용해도 좋다.
질소원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 펩톤, 효모 엑기스, 고기 엑기스, 대두 단백질 분해물 등의 유기 질소원, 암모니아, 우레아를 들 수 있다. pH 조정에 사용되는 암모니아 가스나 암모니아수를 질소원으로서 이용해도 좋다. 질소원으로서는, 1종의 질소원을 사용해도 좋고, 2종 또는 그 이상의 질소원을 조합하여 사용해도 좋다.
인산원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 인산 2수소칼륨, 인산수소 2칼륨 등의 인산염, 피로인산 등의 인산 중합체를 들 수 있다. 인산원으로서는, 1종의 인산원을 사용해도 좋고, 2종 또는 그 이상의 인산원을 조합하여 사용해도 좋다.
황원으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 황산염, 티오황산염, 아황산염 등의 무기 황 화합물, 시스테인, 시스틴, 글루타티온 등의 함황 아미노산을 들 수 있다. 황원으로서는, 1종의 황원을 사용해도 좋고, 2종 또는 그 이상의 황원을 조합하여 사용해도 좋다.
그 밖의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로서, 구체적으로는, 예를 들면, 염화나트륨, 염화칼륨 등의 무기염류; 철, 망간, 마그네슘, 칼슘 등의 미량 금속류; 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니코틴산, 니코틴산 아미드, 비타민 B12 등의 비타민류; 아미노산류; 핵산류; 이들을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 엑기스, 대두 단백질 분해물 등의 유기 성분을 들 수 있다. 그 밖의 각종 유기 성분이나 무기 성분으로서는, 1종의 성분을 사용해도 좋고, 2종 또는 그 이상의 성분을 조합하여 사용해도 좋다.
또한, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는, 배지에 요구되는 영양소를 보첨하는 것이 바람직하다.
또한, 배지 중의 비오틴 양을 제한하는 것이나, 배지에 계면활성제 또는 페니실린을 첨가하는 것도 바람직하다.
배양 조건은 본 발명의 세균이 증식할 수 있고, 목적의 L-아미노산이 생산되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 배양은, 예를 들면, 코리네형 세균 등의 세균의 배양에 사용되는 통상의 조건으로 행할 수 있다. 배양 조건은, 사용하는 세균의 종류 등의 여러 조건에 따라 적절히 설정해도 좋다.
배양은 액체 배지를 사용하여 행할 수 있다. 배양 시에는, 본 발명의 세균을 한천 배지 등의 고체 배지에서 배양한 것을 직접 액체 배지에 접종해도 좋고, 본 발명의 세균을 액체 배지에서 종 배양한 것을 본 배양용의 액체 배지에 접종해도 좋다. 즉, 배양은 종 배양과 본 배양으로 나누어 행해져도 좋다. 이 경우, 종 배양과 본 배양의 배양 조건은 동일해도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 배양 개시시에 배지에 함유되는 본 발명의 세균의 양은 특별히 제한되지 않는다. 본 배양은, 예를 들면, 본 배양의 배지에, 종 배양액을 1 내지 50%(v/v) 식균함으로써 행해도 좋다.
배양은 회분 배양(batch culture), 유가 배양(Fed-batch culture), 연속 배양(continuous culture), 또는 이들의 조합에 의해 실시할 수 있다. 또한, 배양 개시시의 배지를, 「초발 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계(발효조)에 공급하는 배지를, 「유가 배지」라고도 한다. 또한, 유가 배양 또는 연속 배양에 있어서 배양계에 유가 배지를 공급하는 것을, 「유가」라고도 한다. 또한, 배양이 종 배양과 본 배양으로 나누어 행해지는 경우, 예를 들면, 종 배양과 본 배양을, 모두 회분 배양으로 행해도 좋다. 또한, 예를 들면, 종 배양을 회분 배양으로 행하고, 본 배양을 유가 배양 또는 연속 배양으로 행해도 좋다.
본 발명에 있어서, 각 배지 성분은 초발 배지, 유가 배지, 또는 그 양쪽에 함유되어 있어도 좋다. 초발 배지에 함유되는 성분의 종류는 유가 배지에 함유되는 성분의 종류와 동일해도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 또한, 초발 배지에 함유되는 각 성분의 농도는 유가 배지에 함유되는 각 성분의 농도와 동일해도 좋고, 그렇지 않아도 좋다. 또한, 함유하는 성분의 종류 및/또는 농도가 다른 2종 또는 그 이상의 유가 배지를 사용해도 좋다. 예를 들면, 복수회의 유가가 간헐적으로 행해지는 경우, 각 회의 유가 배지에 함유되는 성분의 종류 및/또는 농도는 동일해도 좋고, 그렇지 않아도 좋다.
배지 중의 탄소원의 농도는 본 발명의 세균이 증식할 수 있고, L-아미노산이 생산되는 한, 특별히 제한되지 않는다. 배지 중의 탄소원의 농도는, 예를 들면, L-아미노산의 생산이 저해되지 않는 범위에서 가능한 한 높게 해도 좋다. 배지 중의 탄소원의 농도는, 예를 들면, 초발 농도(초발 배지 중의 농도)로서, 1 내지 30w/v%, 바람직하게는 3 내지 10w/v%라도 좋다. 또한, 적절하게 탄소원을 추가로 배지에 첨가해도 좋다. 예를 들면, 발효의 진행에 따른 탄소원의 소비에 따라 탄소원을 추가로 배지에 첨가해도 좋다.
배양은, 예를 들면, 호기 조건에서 행할 수 있다. 호기 조건이란, 액체 배지 중의 용존 산소 농도가, 산소막 전극에 의한 검출 한계인 0.33ppm 이상인 것을 말하고, 바람직하게는 1.5ppm 이상인 것이라도 좋다. 산소 농도는, 예를 들면, 포화 산소 농도에 대하여 5 내지 50%, 바람직하게는 10% 정도로 제어되어도 좋다. 호기 조건에서의 배양은, 구체적으로는, 통기 배양, 진탕 배양, 교반 배양, 또는 이들의 조합으로 행할 수 있다. 배지의 pH는, 예를 들면, pH3 내지 10, 바람직하게는 pH4.0 내지 9.5라도 좋다. 배양 중, 필요에 따라 배지의 pH를 조정할 수 있다. 배지의 pH는 암모니아 가스, 암모니아수, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산칼륨, 중탄산칼륨, 탄산마그네슘, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화마그네슘 등의 각종 알칼리성 또는 산성 물질을 사용하여 조정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들면, 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 25℃ 내지 37℃라도 좋다. 배양 기간은, 예를 들면, 10시간 내지 120시간이라도 좋다. 배양은, 예를 들면, 배지 중의 탄소원이 소모될 때까지, 또는 본 발명의 세균의 활성이 없어질 때까지 계속해도 좋다. 이러한 조건 하에서 본 발명의 세균를 배양함으로써, 배지 중 및/또는 균체 내에 L-아미노산이 축적된다.
또한, L-글루타민산을 제조할 경우, L-글루타민산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여, 배지 중에 L-글루타민산을 석출시키면서 배양을 행할 수도 있다. L-글루타민산이 석출되는 조건으로서는, 예를 들면, pH5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH4.5 내지 4.0, 더욱 바람직하게는 pH4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH4.0의 조건을 들 수 있다(EP1078989A). 또한, L-글루타민산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용할 경우, 판토텐산을 배지에 첨가함으로써, 보다 효율적으로 정석할 수 있다(WO2004/111258). 또한, L-글루타민산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용할 경우, L-글루타민산의 결정을 종정(種晶)으로서 배지에 첨가함으로써, 보다 효율적으로 정석(晶析)할 수 있다(EP1233069A). 또한, L-글루타민산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용할 경우, L-글루타민산의 결정 및 L-리신의 결정을 종정으로서 배지에 첨가함으로써, 보다 효율적으로 정석할 수 있다(EP1624069A).
또한, 염기성 아미노산을 제조할 경우, 배양 공정(발효 공정)은, 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 염기성 아미노산의 카운터 이온이 되도록 실시해도 좋다. 이러한 발효 형태를 「탄산염 발효」라고도 한다. 탄산염 발효에 의하면, 염기성 아미노산의 카운터 이온으로서 종래 이용되고 있던 황산 이온 및/또는 염화물 이온의 사용량을 삭감하면서, 염기성 아미노산을 발효 생산할 수 있다. 탄산염 발효는, 예를 들면, US2002-025564A, EP1813677A, 일본 공개특허공보 특개2002-65287호에 기재되어 있는 바와 같이 실시할 수 있다.
발효액은, 예를 들면, 액체 사이클론으로 처리할 수 있다. 액체 사이클론으로서는, 예를 들면, 일반적 형상으로, 원통부 직경이 10 내지 110mm인 세라믹제, 스테인리스강제, 또는 수지제인 것을 사용할 수 있다. 액체 사이클론에 대한 발효액의 피드량은, 예를 들면, 발효액 중의 균체 농도나 L-아미노산 농도에 따라 설정할 수 있다. 액체 사이클론에 대한 발효액의 피드량은, 예를 들면, 2 내지 1200L/min라도 좋다.
L-아미노산이 생성된 것은, 화합물의 검출 또는 동정에 사용되는 공지된 수법에 의해 확인할 수 있다. 이러한 수법으로서는, 예를 들면, HPLC, LC/MS, GC/MS, NMR을 들 수 있다. 이들 수법은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
발효액에서의 L-아미노산의 회수는, 화합물의 분리 정제에 사용되는 공지된 수법에 의해 행할 수 있다. 이러한 수법으로서는, 예를 들면, 이온 교환 수지법(Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, 39(16), 3691-3710), 침전법, 막 분리법(일본 공개특허공보 특개평9-164323, 일본 공개특허공보 특개평9-173792), 정석법(WO2008/078448, WO2008/078646)을 들 수 있다. 이들 수법은 단독으로, 또는 적절히 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 균체 내에 L-아미노산이 축적되는 경우에는, 예를 들면, 균체를 초음파 등에 의해 파쇄하고, 원심분리에 의해 균체를 제거하여 얻어지는 상청으로부터, 이온 교환 수지법 등에 의해 L-아미노산을 회수할 수 있다. 회수되는 L-아미노산은 프리체, 이의 염, 또는 이들의 혼합물이라도 좋다. 염으로서는, 예를 들면, 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염을 들 수 있다. L-글루타민산을 제조할 경우, 회수되는 L-글루타민산은, 구체적으로는, 예를 들면, 프리체의 L-글루타민산, L-글루타민산나트륨(예를 들면 monosodium L-glutamate; MSG), L-글루타민산암모늄(예를 들면 monoammonium L-glutamate), 또는 이들의 혼합물이라도 좋다. 예를 들면, 발효액 중의 L-글루타민산암모늄을 산을 가하여 정석시키고, 결정에 등몰의 수산화나트륨을 첨가함으로써 L-글루타민산나트륨(MSG)이 얻어진다. 또한, 정석 전후에 활성탄을 가하여 탈색해도 좋다(글루타민산나트륨의 공업 정석 일본해수학회지 56권 5호 카와키타 테츠야 참조). L-글루타민산나트륨 결정은, 예를 들면, 지미 조미료로서 사용할 수 있다. L-글루타민산나트륨 결정은, 마찬가지로 감칠맛을 갖는 구아닐산나트륨이나 이노신산나트륨 등의 핵산과 혼합하여 조미료로서 사용해도 좋다.
또한, L-아미노산이 배지 중에 석출되는 경우에는, 원심분리 또는 여과 등에 의해 회수할 수 있다. 또한, 배지 중에 석출된 L-아미노산은, 배지 중에 용해되어 있는 L-아미노산을 정석한 후에, 함께 단리해도 좋다.
또한, 회수되는 L-아미노산은 L-아미노산 이외에, 세균 균체, 배지 성분, 수분, 및 세균의 대사 부산물 등의 성분을 포함하고 있어도 좋다. L-아미노산은 원하는 정도로 정제되어 있어도 좋다. 회수되는 L-아미노산의 순도는, 예를 들면, 50%(w/w) 이상, 바람직하게는 85%(w/w) 이상, 특히 바람직하게는 95%(w/w) 이상이라도 좋다(JP1214636B, USP5,431,933, USP4,956,471, USP4,777,051, USP4,946,654, USP5,840,358, USP6,238,714, US2005/0025878).
실시예
이하, 비한정적인 실시예를 참조하여 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.
<1> Corynebacterium glutamicum의 개변주의 구축
<1-1> aspT 유전자 결손용 벡터의　구축
C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 적절히 디자인한 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 아스파르트산 트랜스아미나제를 코드하는 aspT 유전자(CGBL_0102840)의 5'측 상류 약 1kbp의 DNA 단편과 3'측 하류 약 1kbp의 DNA 단편을 각각 증폭한다. 증폭한 DNA 단편을 인퓨전 반응에 의해 pBS5T (WO2006/057450)의 SmaI 부위에 삽입함으로써, aspT 유전자 결손용 벡터를 얻는다.
<1-2> malE 유전자 결손용 벡터의 구축
C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 적절히 디자인한 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 말릭 엔자임을 코드하는 malE 유전자(CGBL_0129850)의 5'측 상류 약 1kbp의 DNA 단편과 3'측 하류 약 1kbp의 DNA 단편을 각각 증폭한다. 증폭한 DNA 단편을 인퓨전 반응에 의해 pBS5T (WO2006/057450)의 SmaI 부위에 삽입함으로써, malE 유전자 결손용 벡터를 얻는다.
<1-3> poxB 유전자 결손용 벡터의 구축
C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 적절히 디자인한 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 피루브산 디하이드로게나제를 코드하는 poxB 유전자(CGBL_0125410)의 5'측 상류 약 1kbp의 DNA 단편과 3'측 하류 약 1kbp의 DNA 단편을 각각 증폭한다. 증폭한 DNA 단편을 인퓨전 반응에 의해 pBS5T (WO2006/057450)의 SmaI 부위에 삽입함으로써, poxB 유전자 결손용 벡터를 얻는다.
<1-4> ack 유전자의 발현 벡터의 구축
C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 아세트산 키나제를 코드하는 ack 유전자(CGBL_0126910)를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭한 DNA 단편과 bamHI 및 pstI로 절단한 pVK9(US2006-0141588)를 인퓨전 반응으로 연결함으로써, ack 유전자의 발현 벡터 pVK9-Plac ackA를 얻었다.
또한, C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 21과 22의 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, C. glutamicum 유래의 msrA 유전자의 상류 서열(프로모터 영역을 포함하는, 369bp)을 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 별도, C. glutamicum ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 23 및 20의 프라이머를 사용한 PCR에 의해, ack 유전자(CGBL_0126910)를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭한 양 DNA 단편과 bamHI 및 pstI로 절단한 pVK9(US2006-0141588)를 인퓨전 반응으로 연결함으로써, ack 유전자의 발현 벡터 pVK9-PmsrA ackA를 얻었다.
<1-5> glpX 유전자의 발현 벡터의 구축
E. coli K-12 MG1655(ATCC 47076)의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 24와 25의 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 glpX 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하였다. 증폭한 DNA 단편과 bamHI 및 pstI로 절단한 pVK9(US2006-0141588)를 인퓨전 반응으로 연결함으로써, glpX 유전자의 발현 벡터 pVK9-Plac glpX를 얻었다.
<1-6> Corynebacterium glutamicum의 개변주의 구축
구축한 각 유전자 결손용 벡터로 C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주(WO2014/185430)를 형질 전환한다. 얻어진 형질 전환체로부터 WO2006/057450에 기재된 방법에 따라 균주를 선택하여, aspT 유전자 결손주, malE 유전자 결손주, 및 poxB 유전자 결손주를 얻는다.
구축한 ackA 유전자의 발현 벡터 pVK9-Plac ackA 또는 pVK9-PmsrA ackA를 단독으로, 또는 pVS7-xfp(US2018-0282773)와 조합하여 C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주(WO2014)에 도입함으로써, ack 유전자의 발현 증강주를 얻었다. pVS7-xfp는 B. longum JCM1217 유래의 포스포케톨라제 유전자(xfp)의 발현 벡터이다(US2018-0282773).
구축한 glpX 유전자의 발현 벡터 pVK9-Plac glpX와 pVS7-xfp(US2018-0282773)를 C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주(WO2014/185430)에 도입함으로써, glpX 유전자의 발현 증강주를 얻었다.
pVK9를 단독으로, 또는 pVS7-xfp(US2018-0282773)와 조합하여 C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주(WO2014/185430)에 도입하여, 대조주를 얻었다.
C. glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB*주는, C. glutamicum 2256주(ATCC 13869)로부터 유도된 L-글루타민산 생산주이고, ldhA 유전자와 sucA 유전자를 결손하고, yggB 유전자에 IS 변이(V419::IS)를 갖는다. 이 변이형 yggB 유전자(V419::IS)의 염기서열, 및 이 유전자에 코드되는 변이형 YggB 단백질(V419::IS)의 아미노산 서열을, 각각 서열번호 17 및 18에 나타낸다.
<2> L-글루타민산 생산 배양
구축한 각 균주(즉, 대조주 및 그 ack 유전자의 발현 증강주 및 glpX 유전자의 발현 증강주)를 사용하여 L-글루타민산 생산 배양을 실시하였다. 사용한 배지의 조성을 표 1에 나타낸다. 탄소원이 글루코스인 배지를 「Glc 배지」, 탄소원이 프럭토스인 배지를 「Frc 배지」라고도 한다.
[표 1]
Figure pct00001
KOH로 pH8.0으로 조정한 상기 조성의 배지를 제작하고, 오토클레이브(115℃, 10min)에 의해 멸균하였다. 멸균 후의 배지에 건열 멸균(180℃, 6시간)한 탄산칼슘을 종농도 50g/L이 되도록 첨가하여 배양에 사용하였다.
각 균주를 굵은 시험관에 넣은 상기 배지(50g/L 탄산칼슘을 포함한다) 5mL에 식균하고, 31.5℃의 박스 셰이커(ABLE ML-190)를 사용하여 120rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 개시 25 또는 30시간 후에 배양액의 샘플링을 실시하였다. 배양액 중의 L-글루타민산 농도를 바이오텍 애널라이저 AS-310(사쿠라에스아이)을 사용하여 정량하고, L-글루타민산의 대당 수율을 산출하였다.
결과를 도 1 내지 도 4에 나타낸다. ack 유전자의 발현 증강주(2256ΔsucAΔldhA yggB
*/pVK9-Plac ackA/pVS7-xfp, 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfp, 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9p-Plac ackA, 및 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA)는, 글루코스를 탄소원으로 한 경우, 대응하는 대조주(2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackA/pVS7-xfp와 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA/pVS7-xfp에 대하여 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp; 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac ackA와 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-PmsrA ackA에 대하여 2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9)보다도 높은 L-글루타민산의 축적량 및 L-글루타민산의 대당 수율을 나타내었다(도 1 및 2). 또한, glpX 유전자의 발현 증강주(2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9-Plac glpX/pVS7-xfp)는 프럭토스를 탄소원으로 한 경우에, 대응하는 대조주(2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp) 보다도 높은 L-글루타민산의 축적량을 나타내고(도 3), 글루코스를 탄소원으로 한 경우에, 대응하는 대조주(2256ΔsucAΔldhA yggB*/pVK9/pVS7-xfp)보다도 높은 L-글루타민산의 대당 수율을 나타내었다(도 4).
또한, aspT 유전자 결손주, malE 유전자 결손주, 및 poxB 유전자 결손주에 대하여 동일한 순서로 L-글루타민산 생산 배양을 실시함으로써, L-글루타민산 생산의 향상을 확인한다.
본 발명에 의하면, 코리네형 세균의 L-아미노산 생산능을 향상시킬 수 있고, L-아미노산을 효율적으로 제조할 수 있다.
〔서열표의 설명〕
서열번호 1: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 aspT 유전자의 염기서열
서열번호 2: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 AspT 단백질의 아미노산 서열
서열번호 3: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 malE 유전자의 염기서열
서열번호 4: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 MalE 단백질의 아미노산 서열
서열번호 5: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 poxB 유전자의 염기서열
서열번호 6: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 PoxB 단백질의 아미노산 서열
서열번호 7: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 ack 유전자의 염기서열
서열번호 8: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 Ack 단백질의 아미노산 서열
서열번호 9: Escherichia coli K-12 MG1655의 ack 유전자의 염기서열
서열번호 10: Escherichia coli K-12 MG1655의 Ack 단백질의 아미노산 서열
서열번호 11: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 glpX 유전자의 염기서열
서열번호 12: Corynebacterium glutamicum ATCC 13032의 GlpX 단백질의 아미노산 서열
서열번호 13: Escherichia coli K-12 MG1655의 glpX 유전자의 염기서열
서열번호 14: Escherichia coli K-12 MG1655의 GlpX 단백질의 아미노산 서열
서열번호 15: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 yggB 유전자의 염기서열
서열번호 16: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 YggB 단백질의 아미노산 서열
서열번호 17: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 변이형 yggB 유전자(V419::IS)의 염기서열
서열번호 18: Corynebacterium glutamicum 2256(ATCC 13869)의 변이형 YggB 단백질(V419::IS)의 아미노산 서열
서열번호 19 내지 25: 프라이머
SEQUENCE LISTING <110> Ajinomoto Co., Inc. <120> METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID <130> H196-211266 <150> JP2020-180304 <151> 2020-10-28 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1281 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 atgagttcag tttcgctgca ggattttgat gcagagcgaa ttggtctgtt ccacgaggac 60 attaaacgca agtttgatga gctcaagtca aaaaatctga agctggatct tactcgcggt 120 aagccttcgt cggagcagtt ggatttcgct gatgagctgt tggcgttgcc tggtaagggc 180 gatttcaagg ctgcggatgg tactgatgtc cgtaactatg gcgggctgga tggcattgtt 240 gatattcgtc agatttgggc ggatttgctg ggtgttcctg tggagcaggt gctggcgggg 300 gatgcttcga gcttgaacat catgtttgat gtgatcagct ggtcgtacat ttttggtaac 360 aatgattcgg ttcagccttg gtcgaaggaa gaaactgtta agtggatttg tcctgttccg 420 ggatatgatc gccatttctc catcacggag cgtttcggct ttgagatgat ttctgtgcca 480 atgaatgaag acggccctga tatggatgct gttgaggaat tggtcaagga tccgcaggtt 540 aagggcatgt gggttgtgcc ggtattttct aacccgactg gtttcacggt gtcggaggac 600 gtcgcaaagc gtctgagcac gatggaaact gcggcgccgg acttccgcgt ggtgtgggat 660 aacgcttacg ccgttcatac tctgaccgat gagttccctg aggtcatcga catcgttggg 720 cttggtgagg cggcgggtaa cccgaaccgt ttctgggcgt tcacttctac ttcgaagatc 780 actctcgcgg gtgcgggcgt gtccttcttc atgacttctg cggagaaccg taagtggtac 840 tccggtcatg cgggtatccg tggcattggc cctaacaagg tcaatcagtt ggctcatgcg 900 cgttactttg gcgatgctga gggagtgcgc gcggtgatgc gtaagcatgc tgcgtcgttg 960 gctccgaagt tcaacaaggt tctggagatc ctggattctc gccttgctga gtacggtgtc 1020 gcgcagtgga ctgtccctgc gggcggttac ttcatttccc ttgatgtggt tcctggtacg 1080 gcatctcgtg tggctgagtt ggctaaggaa gccggcattg cgttgacggg tgcgggttct 1140 tcttacccgc tgcgtcagga tccggagaac aagaacctcc gtttggcgcc ttctctgcct 1200 cctgttgagg aacttgaggt tgccatggat ggcgtggcta cgtgtgtttt gctggcagct 1260 gcggagcact acgctagcta g 1281 <210> 2 <211> 426 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Ser Ser Val Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ala Glu Arg Ile Gly Leu 1 5 10 15 Phe His Glu Asp Ile Lys Arg Lys Phe Asp Glu Leu Lys Ser Lys Asn 20 25 30 Leu Lys Leu Asp Leu Thr Arg Gly Lys Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asp 35 40 45 Phe Ala Asp Glu Leu Leu Ala Leu Pro Gly Lys Gly Asp Phe Lys Ala 50 55 60 Ala Asp Gly Thr Asp Val Arg Asn Tyr Gly Gly Leu Asp Gly Ile Val 65 70 75 80 Asp Ile Arg Gln Ile Trp Ala Asp Leu Leu Gly Val Pro Val Glu Gln 85 90 95 Val Leu Ala Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asn Ile Met Phe Asp Val Ile 100 105 110 Ser Trp Ser Tyr Ile Phe Gly Asn Asn Asp Ser Val Gln Pro Trp Ser 115 120 125 Lys Glu Glu Thr Val Lys Trp Ile Cys Pro Val Pro Gly Tyr Asp Arg 130 135 140 His Phe Ser Ile Thr Glu Arg Phe Gly Phe Glu Met Ile Ser Val Pro 145 150 155 160 Met Asn Glu Asp Gly Pro Asp Met Asp Ala Val Glu Glu Leu Val Lys 165 170 175 Asp Pro Gln Val Lys Gly Met Trp Val Val Pro Val Phe Ser Asn Pro 180 185 190 Thr Gly Phe Thr Val Ser Glu Asp Val Ala Lys Arg Leu Ser Thr Met 195 200 205 Glu Thr Ala Ala Pro Asp Phe Arg Val Val Trp Asp Asn Ala Tyr Ala 210 215 220 Val His Thr Leu Thr Asp Glu Phe Pro Glu Val Ile Asp Ile Val Gly 225 230 235 240 Leu Gly Glu Ala Ala Gly Asn Pro Asn Arg Phe Trp Ala Phe Thr Ser 245 250 255 Thr Ser Lys Ile Thr Leu Ala Gly Ala Gly Val Ser Phe Phe Met Thr 260 265 270 Ser Ala Glu Asn Arg Lys Trp Tyr Ser Gly His Ala Gly Ile Arg Gly 275 280 285 Ile Gly Pro Asn Lys Val Asn Gln Leu Ala His Ala Arg Tyr Phe Gly 290 295 300 Asp Ala Glu Gly Val Arg Ala Val Met Arg Lys His Ala Ala Ser Leu 305 310 315 320 Ala Pro Lys Phe Asn Lys Val Leu Glu Ile Leu Asp Ser Arg Leu Ala 325 330 335 Glu Tyr Gly Val Ala Gln Trp Thr Val Pro Ala Gly Gly Tyr Phe Ile 340 345 350 Ser Leu Asp Val Val Pro Gly Thr Ala Ser Arg Val Ala Glu Leu Ala 355 360 365 Lys Glu Ala Gly Ile Ala Leu Thr Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Pro Leu 370 375 380 Arg Gln Asp Pro Glu Asn Lys Asn Leu Arg Leu Ala Pro Ser Leu Pro 385 390 395 400 Pro Val Glu Glu Leu Glu Val Ala Met Asp Gly Val Ala Thr Cys Val 405 410 415 Leu Leu Ala Ala Ala Glu His Tyr Ala Ser 420 425 <210> 3 <211> 1179 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atgaccatcg acctgcagcg ttccacccaa aacctcaccc atgaggaaat cttcgaggca 60 cacgagggcg gaaagctctc cattagttcc actcgtccgc tccgcgacat gcgcgatctt 120 tcccttgctt acaccccagg tgttgctcag gtttgtgaag caatcaaaga agatccagag 180 gttgcacgca cccacacggg cattggaaac accgtcgcgg ttatttccga cggcaccgct 240 gttcttggcc ttggcgatat cggacctcag gcatcccttc ccgtcatgga gggcaaggct 300 cagctgttca gctctttcgc tggtttgaag gctatcccta tcgttttgga tgttcacgat 360 gttgacgctt tggttgagac catcgcagcc atcgcgcctt ctttcggtgc tatcaacttg 420 gaggacatct ccgctcctcg ttgcttcgag gtggagcgcc gcctcatcga gcgtctcgat 480 attccagtta tgcacgatga ccagcacggc accgctgtgg ttatcctcgc tgcgctgcgc 540 aactccctga agctgctgga tcgcaagatc gaagacctca agattgttat ttccggcgca 600 ggcgcagcgg gcgttgcagc tgtagatatg ttgaccaatg ctggcgcaac cgacatcgtg 660 gttcttgatt cccgaggcat catccacgac agccgtgagg atctttcccc agttaaggct 720 gctctcgcgg agaagaccaa ccctcgtggc atcagcggtg gcatcaatga ggctttcacc 780 ggcgcggacc tgttcatcgg cgtgtccggc ggcaacatcg gcgaggacgc tctcaaactc 840 atggcaccac agccaatcct gttcaccctg gcgaacccaa ccccagagat cgatcctgaa 900 ctgtctcaga agtacggcgc catcgtcgcg accggccgct ctgacctgcc taaccagatc 960 aacaacgtgc tagcgttccc aggcattttc gccggcgctc tcgcagccaa ggccaagaag 1020 atcacccccg agatgaagct cgctgcagca gaggcaatcg ccgacatcgc agctgaggac 1080 ctcgaggtcg gccgcatcgt accgaccgcc ttggatcccc gcgtcgcccc agcagtaaag 1140 gcagctgtcc aggccgtcgc cgaagcgcaa aacgcttag 1179 <210> 4 <211> 392 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Ile Asp Leu Gln Arg Ser Thr Gln Asn Leu Thr His Glu Glu 1 5 10 15 Ile Phe Glu Ala His Glu Gly Gly Lys Leu Ser Ile Ser Ser Thr Arg 20 25 30 Pro Leu Arg Asp Met Arg Asp Leu Ser Leu Ala Tyr Thr Pro Gly Val 35 40 45 Ala Gln Val Cys Glu Ala Ile Lys Glu Asp Pro Glu Val Ala Arg Thr 50 55 60 His Thr Gly Ile Gly Asn Thr Val Ala Val Ile Ser Asp Gly Thr Ala 65 70 75 80 Val Leu Gly Leu Gly Asp Ile Gly Pro Gln Ala Ser Leu Pro Val Met 85 90 95 Glu Gly Lys Ala Gln Leu Phe Ser Ser Phe Ala Gly Leu Lys Ala Ile 100 105 110 Pro Ile Val Leu Asp Val His Asp Val Asp Ala Leu Val Glu Thr Ile 115 120 125 Ala Ala Ile Ala Pro Ser Phe Gly Ala Ile Asn Leu Glu Asp Ile Ser 130 135 140 Ala Pro Arg Cys Phe Glu Val Glu Arg Arg Leu Ile Glu Arg Leu Asp 145 150 155 160 Ile Pro Val Met His Asp Asp Gln His Gly Thr Ala Val Val Ile Leu 165 170 175 Ala Ala Leu Arg Asn Ser Leu Lys Leu Leu Asp Arg Lys Ile Glu Asp 180 185 190 Leu Lys Ile Val Ile Ser Gly Ala Gly Ala Ala Gly Val Ala Ala Val 195 200 205 Asp Met Leu Thr Asn Ala Gly Ala Thr Asp Ile Val Val Leu Asp Ser 210 215 220 Arg Gly Ile Ile His Asp Ser Arg Glu Asp Leu Ser Pro Val Lys Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ala Glu Lys Thr Asn Pro Arg Gly Ile Ser Gly Gly Ile Asn 245 250 255 Glu Ala Phe Thr Gly Ala Asp Leu Phe Ile Gly Val Ser Gly Gly Asn 260 265 270 Ile Gly Glu Asp Ala Leu Lys Leu Met Ala Pro Gln Pro Ile Leu Phe 275 280 285 Thr Leu Ala Asn Pro Thr Pro Glu Ile Asp Pro Glu Leu Ser Gln Lys 290 295 300 Tyr Gly Ala Ile Val Ala Thr Gly Arg Ser Asp Leu Pro Asn Gln Ile 305 310 315 320 Asn Asn Val Leu Ala Phe Pro Gly Ile Phe Ala Gly Ala Leu Ala Ala 325 330 335 Lys Ala Lys Lys Ile Thr Pro Glu Met Lys Leu Ala Ala Ala Glu Ala 340 345 350 Ile Ala Asp Ile Ala Ala Glu Asp Leu Glu Val Gly Arg Ile Val Pro 355 360 365 Thr Ala Leu Asp Pro Arg Val Ala Pro Ala Val Lys Ala Ala Val Gln 370 375 380 Ala Val Ala Glu Ala Gln Asn Ala 385 390 <210> 5 <211> 1740 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 atggcacaca gctacgcaga acaattaatt gacactttgg aagctcaagg tgtgaaacga 60 atttatggtt tggtgggtga cagccttaat ccgatcgtgg atgctgtccg ccaatcagat 120 attgagtggg tgcacgttag aaatgaggaa gcggcggcgt ttgcagctgg tgcggaatcg 180 ttgatcactg gggagctggc agtatgtgct gcttcttgtg gtcctggaaa cacacacctg 240 attcagggtc tttatgattc gcatcgaaat ggtgcgaagg tgttggccat cgctagccat 300 attccgagtg cccagattgg ttcgacgttc ttccaggaaa cgcatccgga gattttgttt 360 aaggaatgct ctggttactg cgagatggtg aatggtggtg agcagggtga acgcattttg 420 catcacgcga ttcagtccac catggcgggt aaaggtgtgt cggtggtagt gattcctggc 480 gatatcgcta aggaagacgc aggtgacggc acttattcca attccactat ttcctcgggc 540 actcctgtgg tgttcccgga tcctactgag gctgcagcgc tggtggaggc gattaacaac 600 gctaagtctg tcactttgtt ctgcggcgcg ggtgtgaaga atgctcgcgc gcaggtgttg 660 gagttggcgg agaagattaa atcaccaatc gggcatgcgc tgggtggtaa gcagtacatc 720 cagcatgaga atccgtttga ggtcggcatg tctggcctgc ttggttacgg cgcctgcgtg 780 gatgcgtcca atgaggcgga tctgctgatt ctgttgggta cggatttccc ttattctgat 840 ttccttccta aagataacgt tgcccaggtg gatatcaacg gtgcgcacat tggtcgacgt 900 accacggtga agtatccggt gactggtgat gttgctgcaa caatcgaaaa tattttgcct 960 catgtgaagg aaaagacaga tcgttccttc cttgatcgga tgctcaaggc acacgagcgt 1020 aagttgagct cggtggtgga gacgtacaca cataacgtcg agaagcatgt gcctattcac 1080 cctgaatacg ttgcctctat tttgaacgag ctggcggata aggacgcggt gtttaccgtg 1140 gacaccggaa tgtgcaatgt gtggcatgcg aggtacatcg aaaatccgga gggaactcgc 1200 gactttgtgg gttcattccg ccacggcacg atggctaatg cgttgcctca tgcgattggt 1260 gcgcaaagtg ccgaccggaa ccgccaggtg atcgcgatgt gtggcgatgg tggtttgggc 1320 atgctgctgg gtgagcttct gaccgttaag ctgcaccaac ttccgctgaa ggctgtggtg 1380 tttaacaaca gttctttggg catggtgaag ttggagatgc tcgtggaggg acagccagaa 1440 tttggtactg accatgagga agtgaatttc gcagagattg cggcggctgc gggtatcaaa 1500 tcggtacgca tcaccgatcc gaagaaagtt cgcgagcagc tagctgaggc attggcatat 1560 cctggacctg tactgatcga tatcgtcacg gatcctaatg cgctgtcgat cccaccaacc 1620 atcacgtggg aacaggtcat gggattcagc aaggcggcca cccgaaccgt ctttggtgga 1680 ggagtaggag cgatgatcga tctggcccgt tcgaacataa ggaatattcc tactccatga 1740 <210> 6 <211> 579 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile 20 25 30 Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80 Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile 130 135 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile 225 230 235 240 Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255 Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285 Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro 305 310 315 320 His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335 Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340 345 350 Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu 355 360 365 Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 375 380 Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400 Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415 His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Ala Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala 420 425 430 Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445 Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 455 460 Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu 500 505 510 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile 515 520 525 Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu 530 535 540 Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 550 555 560 Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile 565 570 575 Pro Thr Pro <210> 7 <211> 1194 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 atggcattgg cacttgtttt gaactccggt tcatcttcca tcaaattcca gctggtcaac 60 cccgaaaact ctgccatcga cgagccatat gtttctggtc ttgtggagca gattggtgag 120 ccaaacggcc gcatcgtact caaagtagag ggtgaaaaat acaccctaga gacacccatc 180 gcagatcact ccgaaggcct aaacctggcg ttcgatctca tggaccagca caactgtggt 240 ccttcccaac tggaaatcac cgcagttgga caccgcgtgg tccacggtgg aatcttgttc 300 tctgcgccgg aactcatcac tgatgaaatc gttgaaatga tccgcgatct cattccactc 360 gcaccactgc acaaccctgc aaacgttgac ggcattgatg ttgctcgaaa aattctcccc 420 gatgtcccac acgtagctgt ctttgacacc ggtttcttcc actcacttcc accagcagct 480 gcactgtatg ccatcaacaa ggatgtcgca gctgaacacg gaatcaggcg ctatggtttc 540 cacggtacct cccacgaatt tgtgtccaag cgcgtggtgg aaattttgga aaagcccacc 600 gaagacatca acaccatcac cttccacctg ggcaacggcg catccatggc tgctgttcaa 660 ggcggccgtg cggtagatac ttccatgggt atgacacctc tcgcgggact tgtcatgggt 720 acccgaagcg gtgacattga tccaggtgtc gttttccatc tctcacgcac cgctggcatg 780 agcatcgatg agatcgataa tctgctgaac aaaaagtcgg gtgtaaaggg actttccgga 840 gtcaatgatt tccgtgaact gcgggaaatg atcgacaaca atgatcaaga tgcctggtcc 900 gcgtacaaca tttacataca ccaactccgc cgctacctcg gttcctacat ggtggcactg 960 ggacgggtag acaccatcgt gttcaccgcc ggtgttggtg aaaatgccca gtttgtccgt 1020 gaggatgcct tggcaggttt ggaaatgtac ggcatcgaaa tcgatccgga gcgcaacgca 1080 ctgccaaacg atggtcctag attgatttcc accgatgcct ccaaggtgaa ggtgtttgtt 1140 attccaacta atgaagagtt ggctatcgct aggtacgcgg tgaagttcgc ttag 1194 <210> 8 <211> 397 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Met Ala Leu Ala Leu Val Leu Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile Lys Phe 1 5 10 15 Gln Leu Val Asn Pro Glu Asn Ser Ala Ile Asp Glu Pro Tyr Val Ser 20 25 30 Gly Leu Val Glu Gln Ile Gly Glu Pro Asn Gly Arg Ile Val Leu Lys 35 40 45 Val Glu Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Glu Thr Pro Ile Ala Asp His Ser 50 55 60 Glu Gly Leu Asn Leu Ala Phe Asp Leu Met Asp Gln His Asn Cys Gly 65 70 75 80 Pro Ser Gln Leu Glu Ile Thr Ala Val Gly His Arg Val Val His Gly 85 90 95 Gly Ile Leu Phe Ser Ala Pro Glu Leu Ile Thr Asp Glu Ile Val Glu 100 105 110 Met Ile Arg Asp Leu Ile Pro Leu Ala Pro Leu His Asn Pro Ala Asn 115 120 125 Val Asp Gly Ile Asp Val Ala Arg Lys Ile Leu Pro Asp Val Pro His 130 135 140 Val Ala Val Phe Asp Thr Gly Phe Phe His Ser Leu Pro Pro Ala Ala 145 150 155 160 Ala Leu Tyr Ala Ile Asn Lys Asp Val Ala Ala Glu His Gly Ile Arg 165 170 175 Arg Tyr Gly Phe His Gly Thr Ser His Glu Phe Val Ser Lys Arg Val 180 185 190 Val Glu Ile Leu Glu Lys Pro Thr Glu Asp Ile Asn Thr Ile Thr Phe 195 200 205 His Leu Gly Asn Gly Ala Ser Met Ala Ala Val Gln Gly Gly Arg Ala 210 215 220 Val Asp Thr Ser Met Gly Met Thr Pro Leu Ala Gly Leu Val Met Gly 225 230 235 240 Thr Arg Ser Gly Asp Ile Asp Pro Gly Val Val Phe His Leu Ser Arg 245 250 255 Thr Ala Gly Met Ser Ile Asp Glu Ile Asp Asn Leu Leu Asn Lys Lys 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900 gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960 gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcgtctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020 gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080 gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140 ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200 cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1260 actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1320 acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag caagcacgcc ttcgatgaca 1380 gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta gcgtcgaaac gcagcaggaa 1440 acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa 1500 gccacgtcgc aggaggaaac gactgcatcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca 1560 accgcggtcc aagaaacagt tgcgccgacg tccacccctt ag 1602 <210> 16 <211> 533 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 16 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr 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420 aacggcatcg ttgttgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 480 acgattgcac aagagaccgt gatcatcccg aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 540 tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 600 atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 660 atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacaccgcca 720 acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 780 aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcaacgaatt ctgggaagaa 840 tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 900 gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960 gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcgtctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020 gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080 gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140 ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200 cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggggctc 1260 ttcctgtttt 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ggtgaggatc gttatagacc agctcacggc acatatcgag ggctagttgg 2160 caggttaaat cccaccctag cccaagtgct ttcgcggttg cgtgaacact catccggtca 2220 atagcaaggc gttgcaaaat ccagcgggtg acccggtggg tgaccttttt accgtggtca 2280 gcgcagctta gttctgcttg gaaatacttt tgcttacatg tcgggttggt gcagcggtag 2340 cgaggtagac ggataaacag tttggtggga aacccgacga tgggtaaatc aatgagcatc 2400 cggtgggtgt gatgacgaaa caccccaggt tgggagcatt ctgggcaggt ggaggtatag 2460 tcgagtgcgt ctgcttcgat cagggtgtaa tcacctgcat cggaagcgcc ggtgatggtg 2520 agtcctagtt ccgcagtgcg gcagatggtg tcagcgatga tgttgccggt agacttcatg 2580 ggtagagcct tttgttggtg tttggttagc ttagatacct aaaccttaac cctgacaaaa 2640 ggctcgttta ttttcgggtc tacaccgcta gcccaggttc tgtgatgtac cccaaaaccg 2700 gaagggccat ttaaggtcat gactgtggaa ccaagtgaga attggcaaaa ctccagtgga 2760 tggctgtcac caagcactgc cacctcaact gcggtgacca cctccgaaac ttccgcgcca 2820 gcaagcacgc cttcgatgac agtgcccact acggtggagg agaccccaac gatggaatct 2880 agcgtcgaaa cgcagcagga aacctcaacc cctgcaaccg caacgcccca gcgagccgac 2940 accatcgaac cgaccgagga agccacgtcg caggaggaaa cgactgcatc gcagacgcag 3000 tctccagcag tggaagcacc aaccgcggtc caagaaacag ttgcgccgac gtccacccct 3060 tag 3063 <210> 18 <211> 423 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 18 Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn 1 5 10 15 Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala 20 25 30 Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln 35 40 45 Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala 50 55 60 Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala 85 90 95 Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln 100 105 110 Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys 115 120 125 Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val 130 135 140 Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val 165 170 175 Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro 180 185 190 Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser 195 200 205 Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu 210 215 220 Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln 245 250 255 Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu 260 265 270 Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser 275 280 285 Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr 290 295 300 Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu 305 310 315 320 Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala 325 330 335 Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu 340 345 350 Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu 355 360 365 Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp 370 375 380 Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val 385 390 395 400 Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu 405 410 415 Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe 420 <210> 19 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccaagcttgc atgccatggc attggcactt gttttg 36 <210> 20 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cggtacccgg ggatcctaag cgaacttcac cgcgtac 37 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccaagcttgc atgccatttg cgcctgcaac gtagg 35 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 aagtgccaat gccataacag gaatgttcct ttcgaa 36 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aggaacattc ctgttatggc attggcactt gttttg 36 <210> 24 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ccaagcttgc atgcctgcag aggaggatta taatgagacg agaacttgcc at 52 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cggtacccgg ggatccggac tggaaggctc aatcga 36

Claims (16)

  1. L-아미노산의 제조 방법으로서,
    L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및
    상기 배지 및/또는 상기 균체로부터 상기 L-아미노산을 채취하는 것
    을 포함하고,
    상기 L-아미노산이 글루타민산계 L-아미노산이고,
    상기 세균이 하기 (X) 및/또는 (Y)의 개변을 갖는, 방법:
    (X) 포스포케톨라제 경로를 경유하는 탄소원의 이용성이 향상되는 개변;
    (Y) 세포 내의 옥살로아세트산 풀이 증대하는 개변
  2. 제1항에 있어서, 상기 세균이 적어도 상기 (X)의 개변을 갖는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 (X)의 개변이, 하기 (A), (B) 및 (C)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변이고;
    상기 (Y)의 개변이, 하기 (D) 및 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변인, 방법:
    (A) 아세트산 키나제의 활성이 증대하는 개변;
    (B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이 증대하는 개변;
    (C) 피루브산 디하이드로게나제의 활성이 저하되는 개변;
    (D) 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이 저하되는 개변;
    (E) 말릭 엔자임의 활성이 저하되는 개변.
  4. L-아미노산의 제조 방법으로서,
    L-아미노산 생산능을 갖는 코리네형 세균을 배지에서 배양하고, 상기 배지 중 및/또는 상기 세균의 균체 내에 L-아미노산을 축적하는 것, 및
    상기 배지 및/또는 상기 균체로부터 상기 L-아미노산을 채취하는 것
    을 포함하고,
    상기 L-아미노산이 글루타민산계 L-아미노산이고,
    상기 세균이, 하기 (A) 내지 (E)의 개변으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 개변을 갖는, 방법:
    (A) 아세트산 키나제의 활성이 증대하는 개변;
    (B) 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이 증대하는 개변;
    (C) 피루브산 디하이드로게나제의 활성이 저하되는 개변;
    (D) 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이 저하되는 개변;
    (E) 말릭 엔자임의 활성이 저하되는 개변.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 세균이 적어도 상기 (A)의 개변을 갖는, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스파르트산 트랜스아미나제가 aspT 유전자에 코드되고;
    상기 말릭 엔자임이 malE 유전자에 코드되고;
    상기 피루브산 디하이드로게나제가 poxB 유전자에 코드되고;
    상기 아세트산 키나제가 ack 유전자에 코드되고; 및/또는
    상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제가 glpX 유전자에 코드되는, 방법.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스파르트산 트랜스아미나제의 활성이, 아스파르트산 트랜스아미나제를 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
    상기 말릭　엔자임의 활성이, 말릭 엔자임을 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
    상기 피루브산 디하이드로게나제의 활성이, 피루브산 디하이드로게나제를 코드하는 유전자의 발현을 저하시킴으로써, 또는 상기 유전자를 파괴함으로써 저하되고;
    상기 아세트산 키나제의 활성이, 아세트산 키나제를 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대하고; 및/또는
    상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제의 활성이, 프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 유전자의 발현을 상승시킴으로써 증대한, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    아세트산 키나제를 코드하는 유전자의 발현이 상기 유전자의 카피수를 높이는 것, 및/또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 상승하고; 및/또는
    프럭토스-1,6-비스포스파타제를 코드하는 유전자의 발현이 상기 유전자의 카피수를 높이는 것, 및/또는 상기 유전자의 발현 조절 서열을 개변함으로써 상승한, 방법.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스파르트산 트랜스아미나제가 하기 (1a), (1b) 또는 (1c)에 기재된 단백질이고:
    (1a) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (1b) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아스파르트산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질;
    (1c) 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아스파르트산 트랜스아미나제 활성을 갖는 단백질;
    상기 말릭 엔자임이 하기 (2a), (2b) 또는 (2c)에 기재된 단백질이고:
    (2a) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (2b) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 말릭 엔자임 활성을 갖는 단백질;
    (2c) 서열번호 4에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 말릭 엔자임 활성을 갖는 단백질;
    상기 피루브산 디하이드로게나제가 하기 (3a), (3b) 또는 (3c)에 기재된 단백질이고:
    (3a) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (3b) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 피루브산 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질;
    (3c) 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 피루브산 디하이드로게나제 활성을 갖는 단백질;
    상기 아세트산 키나제가 하기 (4a), (4b) 또는 (4c)에 기재된 단백질이고:
    (4a) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (4b) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아세트산 키나제 활성을 갖는 단백질;
    (4c) 서열번호 8 또는 10에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 아세트산 키나제 활성을 갖는 단백질; 및/또는
    상기 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성이 하기 (5a), (5b) 또는 (5c)에 기재된 단백질인, 방법:
    (5a) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질;
    (5b) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 10개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성을 갖는 단백질;
    (5c) 서열번호 12 또는 14에 나타낸 아미노산 서열에 대하여 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 프럭토스-1,6-비스포스파타제 활성을 갖는 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 또한, 비개변주와 비교하여, 포스포케톨라제의 활성이 증대하도록 개변되어 있는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 포스포케톨라제가 D-크실룰로스-5-인산 포스포케톨라제 및/또는 프럭토스 6-인산 포스포케톨라제인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움속 세균인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균이 코리네박테리움·글루타미쿰인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루타민산계 L-아미노산이 L-글루타민산, L-글루타민, L-프롤린, L-아르기닌, L-시트룰린, 및 L-오르니틴으로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 L-아미노산인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루타민산계 L-아미노산이 L-글루타민산인, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 L-글루타민산이 L-글루타민산암모늄 또는 L-글루타민산나트륨인, 방법.
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