CN107034250B

CN107034250B - 谷氨酸类l-氨基酸的制造方法

Info

Publication number: CN107034250B
Application number: CN201610963326.3A
Authority: CN
Inventors: 平野圣子; 林和之; 高屋敷均; 福井启太
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: BR102016025154A2; JP6623690B2; CN107034250A; US9932614B2; EP3165608B1; JP2017079705A; EP3165608A1; US20170121743A1; ES2706323T3

Abstract

本发明提供L‑谷氨酸等谷氨酸类L‑氨基酸的制造方法。该方法包括：通过用培养基培养具有谷氨酸类L‑氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌，并从该培养基采集谷氨酸类L‑氨基酸来制造谷氨酸类L‑氨基酸，所述棒杆菌型细菌进行了改变，使得α‑酮戊二酸(α‑KG)摄入载体的活性增加。

Description

谷氨酸类L-氨基酸的制造方法

技术领域

本发明涉及使用了棒杆菌型细菌的L-谷氨酸等谷氨酸类L-氨基酸(L-amino acidof glutamate family)的制造方法。L-氨基酸作为调料原料等可用于工业上。

背景技术

L-氨基酸通过例如发酵法进行工业生产，所述发酵法使用了具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌等微生物(非专利文献1)。作为这样的微生物，例如可以使用从自然界分离的菌株及其突变株。而且，通过重组DNA技术可以使微生物的L-氨基酸生产能力提高。例如，作为使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的方法，已知增加磷酸转酮酶活性(专利文献1)、利用突变型yggB基因(专利文献2)的技术。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的kgtP基因是编码α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的基因(非专利文献2)。α-KG作为L-谷氨酸生物合成中L-谷氨酸的中间体而众所周知。然而，α-KG摄入载体与谷氨酸类L-氨基酸生产的关系尚不清楚。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2006/016705

专利文献2：WO2006/070944

非专利文献

非专利文献1：明石邦彦等著氨基酸发酵(アミノ酸発酵)、学会出版中心、195～215页、1986年

非专利文献2：Seol W,Shatkin AJ.Escherichia coli kgtP encodes an alpha-ketoglutarate transporter.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 May 1；88(9)：3802-6.

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题在于开发使棒杆菌型细菌的谷氨酸类L-氨基酸生产能力提高的新技术，提供一种高效的谷氨酸类L-氨基酸的制造方法。

解决课题的方法

本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，通过对棒杆菌型细菌进行改变，使α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的活性增加，能够使棒杆菌型细菌的谷氨酸类L-氨基酸生产能力提高，从而完成了本发明。

即，本发明如下所示。

[1]

一种L-氨基酸的制造方法，该方法包括：用培养基对具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌进行培养，以及从该培养基采集L-氨基酸，

其中，对所述细菌进行了改变，使α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的活性相比于非改变株增加，

所述L-氨基酸为谷氨酸类L-氨基酸。

[2]

根据上述方法，其中，所述α-KG摄入载体是由kgtP基因编码的蛋白质。

[3]

根据上述方法，其中，所述α-KG摄入载体是下述(a)、(b)或(c)中记载的蛋白质：

(a)包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含在序列号8所示的氨基酸序列中含有取代、缺失、插入或添加1～10个氨基酸残基而成的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有α-KG摄入活性；

(c)包含相对于序列号8所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有α-KG摄入活性。

[4]

根据上述方法，其中，通过使编码α-KG摄入载体的基因的表达增高来增加α-KG摄入载体的活性。

[5]

根据上述方法，其中，所述基因的表达通过提高该基因的拷贝数和/或改变该基因的表达调节序列而增高。

[6]

根据上述方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使磷酸转酮酶的活性相比于非改变株增加。

[7]

根据上述方法，其中，所述磷酸转酮酶为D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖6-磷酸磷酸转酮酶。

[8]

根据上述方法，其中，通过使编码磷酸转酮酶的基因的表达增高来增加磷酸转酮酶的活性。

[9]

根据上述方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使得α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性相比于非改变株降低。

[10]

根据上述方法，其中，所述细菌为棒杆菌属细菌。

[11]根据上述方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。

[12]

根据上述方法，其中，所述谷氨酸类L-氨基酸为选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸中的1种或1种以上的L-氨基酸。

[13]

根据上述方法，其中，所述谷氨酸类L-氨基酸为L-谷氨酸。

[14]

根据上述方法，其中，所述L-谷氨酸为L-谷氨酸铵或L-谷氨酸钠。

[15]

根据上述方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使其保持突变型yggB基因。

[16]

根据上述方法，其中，所述突变型yggB基因是具有使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的突变的yggB基因。

[17]

根据上述方法，其中，所述突变型yggB基因具有下述(1)、(2)或(3)中记载的突变：

(1)编码野生型YggB蛋白质的419～533位氨基酸残基的区域中的突变；

(2)编码野生型YggB蛋白质的跨膜结构域的区域中的突变；

(3)上述(1)和(2)的组合。

[18]

根据上述方法，其中，所述野生型YggB蛋白质是下述(a)、(b)或(c)中记载的蛋白质：

(a)包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)包含在序列号12所示的氨基酸序列中含有取代、缺失、插入和/或添加1～10个氨基酸残基而成的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有在棒杆菌型细菌中使其表达增高时使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的性质；

(c)包含相对于序列号12所示的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有在棒杆菌型细菌中使其表达增高时使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的性质。

根据本发明，能够使棒杆菌型细菌的谷氨酸类L-氨基酸生产能力提高，可以高效地制造谷氨酸类L-氨基酸。

具体实施方式

以下，详细地对本发明进行说明。

本发明的方法是L-氨基酸的制造方法，该方法包括：用培养基对具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌进行培养，以及从该培养基采集L-氨基酸，其中，对所述细菌进行了改变，使α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的活性增加，所述L-氨基酸为谷氨酸类L-氨基酸。该方法所用的棒杆菌型细菌也称为“本发明的细菌”。

＜1＞本发明的细菌

本发明的细菌是具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌，其经过了改变，使α-KG摄入载体的活性增加。

＜1-1＞具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌

在本发明中，“具有L-氨基酸生产能力的细菌”是指在用培养基进行培养时，具有生成作为目标的L-氨基酸、且在培养基中或菌体内积蓄至可回收的程度的能力的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以是能够在培养基中积蓄比非改变株更多量的作为目标的L-氨基酸的细菌。“非改变株”是指未以α-KG摄入载体的活性增加的方式进行改变的对照株。即，作为非改变株，可以列举：野生株、亲本株，例如谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869株、ATCC13032株。另外，具有L-氨基酸生产能力的细菌优选在培养基中能够积蓄0.5g/L以上，更优选能够积蓄1.0g/L以上的量的作为目标的L-氨基酸的细菌。

本发明中制造的L-氨基酸为谷氨酸类L-氨基酸。“谷氨酸类L-氨基酸”是指L-谷氨酸及以L-谷氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸的总称。作为以L-谷氨酸作为中间体生物合成的L-氨基酸，可以列举：L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸。本发明的细菌可以仅具有1种L-氨基酸的生产能力，也可以具有2种或2种以上L-氨基酸的生产能力。

在本发明中，“氨基酸”这样的用语只要没有特别说明，就表示L-氨基酸的意思。另外，在本发明中，“L-氨基酸”这样的用语只要没有特别说明，就表示游离的L-氨基酸、其盐或它们的混合物的意思。在后面对盐进行说明。

作为棒杆菌型细菌，可以列举属于棒杆菌(Corynebacterium)属、短杆菌(Brevibacterium)属及微杆菌(Microbacterium)属等属的细菌。

作为棒杆菌型细菌，具体而言可以列举下述种类。

嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)

醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)

解烷烃棒杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)

石南棒杆菌(Corynebacterium callunae)

钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

百合花棒杆菌(Corynebacterium lilium)

栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)

热产氨棒杆菌(有效棒杆菌)(Corynebacterium thermoaminogenes(Corynebacterium efficiens))

力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)

叉开短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium divaricatum(Corynebacteriumglutamicum))

黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium flavum(Corynebacteriumglutamicum))

Brevibacterium immariophilum

乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum))

玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)

解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)

硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)

产氨棒杆菌(Corynebacterium stationis)(Corynebacterium ammoniagenes(Corynebacterium stationis))

白短杆菌(Brevibacterium album)

多角短杆菌(Brevibacterium cerinum)

嗜氨微杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)

作为棒杆菌型细菌，具体而言可以列举下述菌株。

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

醋谷棒杆菌ATCC 15806

解烷烃棒杆菌ATCC 21511

石南棒杆菌ATCC 15991

钝齿棒杆菌AS1.542

谷氨酸棒杆菌ATCC 13020,谷氨酸棒杆菌ATCC 13032,谷氨酸棒杆菌ATCC 13060，谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，谷氨酸棒杆菌FERM BP-734

百合花棒杆菌ATCC 15990

栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965

有效棒杆菌(热产氨棒杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)

力士棒杆菌ATCC 13868

谷氨酸棒杆菌(叉开短杆菌)ATCC 14020

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)ATCC 13826,谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)ATCC14067,谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12418(FERM BP-2205)

Brevibacterium immariophilum ATCC 14068

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)ATCC 13869

玫瑰色短杆菌ATCC 13825

解糖短杆菌ATCC 14066

硫殖短杆菌ATCC 19240

产氨棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6871,产氨棒杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6872

白短杆菌ATCC 15111

多角短杆菌ATCC 15112

嗜氨微杆菌ATCC 15354

需要说明的是，棒杆菌属细菌还包括以往分类为短杆菌属，但现在合并至棒杆菌属的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。另外，Corynebacterium stationis中还包括以往分类为产氨棒杆菌，但通过16S rRNA的核苷酸序列分析等再分类为Corynebacterium stationis的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。

这些菌株可以通过例如美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(地址12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852P.O.Box1549,Manassas,VA 20108,United States of America)购买。即，赋予了与各菌株对应的登记号，可以利用该登记号来购买(参照http：//www.atcc.org/)。与各菌株对应的登记号记载于美国模式培养物保藏所的产品目录。另外，这些菌株可以通过例如保藏各菌株的保藏单位而获得。

本发明的细菌可以是原本具有L-氨基酸生产能力的细菌，也可以是经过改变而具有L-氨基酸生产能力的细菌。具有L-氨基酸生产能力的细菌可以通过例如对上述那样的细菌赋予L-氨基酸生产能力而获得，或者通过增强上述那样的细菌的L-氨基酸生产能力而获得。

赋予或增强L-氨基酸生产能力以往可以通过棒杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌的育种所采用的方法来进行(参照氨基酸发酵、株式会社学会出版中心、1986年5月30日初版发行、第77～100页)。作为这样的方法，可以列举例如：营养缺陷性突变株的获得、L-氨基酸类似物耐受性株的获得、代谢控制突变株的获得、增加了L-氨基酸的生物合成酶的活性的重组株的创制。在L-氨基酸生产菌的育种中，赋予的营养缺陷性、类似物耐受性、代谢控制突变等性质可以是单独的，也可以是2种或3种以上。另外，在L-氨基酸生产菌的育种中，活性增加的L-氨基酸生物合成酶可以是单独的，也可以是2种或3种以上。并且，还可以将营养缺陷性、类似物耐受性、代谢控制突变等性质的赋予与生物合成酶活性的增加进行组合。

具有L-氨基酸生产能力的营养缺陷性突变株、类似物耐受性株或代谢控制突变株可以通过以下方式获得：将亲本株或野生株供于通常的突变处理，从得到的突变株中选择显示出营养缺陷性、类似物耐受性或代谢控制突变、且具有L-氨基酸生产能力的菌株。作为通常的突变处理，可以列举：X射线、紫外线的照射、利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂的处理。

另外，赋予或增强L-氨基酸生产能力也可以通过增强与目标L-氨基酸的生物合成相关的酶的活性来进行。酶活性的增强可以通过对细菌进行改变例如使增高编码该酶的基因的表达来进行。增高基因表达的方法记载于WO00/18935号小册子、欧洲专利申请公开1010755号说明书等。增加酶活性的详细方法在后面叙述。

另外，赋予或增强L-氨基酸生产能力还可以通过使下述酶的活性降低来进行，所述酶是催化从目标L-氨基酸的生物合成路径分支出生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶。需要说明的是，这里，所谓的“催化从目标L-氨基酸的生物合成路径分支出生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶”还含有与目标氨基酸的分解相关的酶。在后面对使酶活性降低的方法进行叙述。

以下，具体例示出L-氨基酸生产菌及赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法。需要说明的是，以下例示出的L-氨基酸生产菌所具有的性质和用于赋予或增强L-氨基酸生产能力的改变均可以单独使用，也可以适当组合使用。

＜L-谷氨酸生产菌＞

作为用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以举出例如下述方法：对细菌进行改变，使得选自L-谷氨酸生物合成酶的1种或1种以上酶的活性增加。作为这样的酶，没有特别限制，可以列举：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltBD)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA,acnB)、柠檬合成酶(gltA)、甲基柠檬酸合成酶(prpC)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF,lpdA)、丙酮酸激酶(pykA,pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合成酶(ppsA)、烯醇酶(eno)、磷酸甘油变位酶(pgmA,pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、6-磷酸葡糖酸脱水酶(edd)、2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶(eda)、转氢酶。需要说明的是，括号内是编码该酶的基因的例子(以下的记载中也是同样的)。在这些酶当中，优选对选自例如谷氨酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及甲基柠檬酸合成酶中的1种或1种以上的酶的活性进行增加。

作为以增高谷氨酸合成酶基因(gltBD)的表达的方式进行了改变的棒杆菌型细菌，可以举出WO99/07853中公开的细菌。

另外，作为用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以举出以下方法：例如，对细菌行进改变，使得选自下述酶中的1种或1种以上的酶的活性降低，所述酶是催化从L-氨基酸的生物合成路径分支出生成L-氨基酸以外的化合物的反应的酶。作为这样的酶，没有特别限制，可以列举：异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA,odhA)、乙酰乳酸合成酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh)、醇脱氢酶(adh)、谷氨酸脱羧酶(gadAB)、琥珀酸脱氢酶(sdhABCD)。在这些酶当中，例如，优选使α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺失。

α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺失的棒杆菌型细菌及其获得方法记载于WO2008/075483。作为α-酮戊二酸脱氢酶活性降低或缺失的棒杆菌型细菌，具体而言，可以列举例如下述菌株。

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)L30-2株(日本特开2006-340603号说明书)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)ΔS株(国际公开95/34672号小册子)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)AJ12821(FERM BP-4172；参照法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12822(FERM BP-4173；法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌AJ12823(FERM BP-4174；法国专利公报9401748号说明书)

谷氨酸棒杆菌L30-2株(日本特开2006-340603号)

另外，作为L-谷氨酸生产菌或用于诱导L-谷氨酸生产菌的亲本株，可以列举α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)活性和琥珀酸脱氢酶(sdh)活性两者降低或缺失的菌株(日本特开2010-041920号)。作为这样的菌株，具体而言可以列举例如谷氨酸棒杆菌ATCC14067的odhAsdhA双重缺失株(谷氨酸棒杆菌8L3GΔSDH株)(日本特开2010-041920号)。

另外，作为用于赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举例如增强作为L-谷氨酸分泌基因的yhfK基因(WO2005/085419)及ybjL基因(WO2008/133161)的表达。

另外，对于棒杆菌型细菌，作为赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举：赋予对有机酸类似物、呼吸抑制剂等的耐受性的方法、赋予对细胞壁合成抑制剂的敏感性的方法。作为这样的方法，具体而言可以列举例如：赋予单氟乙酸耐受性的方法(日本特开昭50-113209)、赋予腺嘌呤耐受性或胸腺嘧啶耐受性的方法(日本特开昭57-065198)、使脲酶弱化的方法(日本特开昭52-038088)、赋予丙二酸耐受性的方法(日本特开昭52-038088)、赋予对苯并呲喃酮类或萘醌类的耐受性的方法(日本特开昭56-1889)、赋予HOQNO耐受性的方法(日本特开昭56-140895)、赋予α-酮基丙二酸耐受性的方法(日本特开昭57-2689)、赋予胍耐受性的方法(日本特开昭56-35981)、赋予对青霉素的敏感性的方法(日本特开平4-88994)等。

作为这样的耐受性菌或敏感性菌的具体例子，可以列举下述这样的菌株。

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ3949(FERM BP-2632；参照日本特开昭50-113209)

谷氨酸棒杆菌AJ11628(FERM P-5736；参照日本特开昭57-065198)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11355(FERM P-5007；参照日本特开昭56-1889号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11368(FERM P-5020；参照日本特开昭56-1889号公报)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11217(FERM P-4318；参照日本特开昭57-2689号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11218(FERM P-4319；参照日本特开昭57-2689号公报)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11564(FERM P-5472；参照日本特开昭56-140895公报)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11439(FERM P-5136；参照日本特开昭56-35981号公报)

谷氨酸棒杆菌H7684(FERM BP-3004；参照日本特开平04-88994号公报)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)AJ11426(FERM P-5123；参照日本特开平56-048890号公报)

谷氨酸棒杆菌AJ11440(FERM P-5137；参照日本特开平56-048890号公报)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)AJ11796(FERM P-6402；参照日本特开平58-158192号公报)

另外，对于棒杆菌型细菌，作为赋予或增强L-谷氨酸生产能力的方法，可以列举：增高yggB基因的表达的方法、将在编码区域内导入了突变的突变型yggB基因导入的方法(WO2006/070944)。即，本发明的细菌可以进行了改变而使yggB基因的表达增高，也可以进行了改变而保持(具有)突变型yggB基因。

yggB基因是编码力敏感通道(mechanosensitive channel)的基因。作为yggB基因，可以举出棒杆菌型细菌的yggB基因。作为棒杆菌型细菌的yggB基因，具体而言，可以列举例如谷氨酸棒杆菌ATCC13869、谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14967、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965的yggB基因(WO2006/070944)。谷氨酸棒杆菌ATCC13032的yggB基因被称为NCgl1221，相当于NCBI数据库中以GenBank Accession No.NC_003450登记的基因组序列中1,336,091～1,337,692序列的互补序列。由谷氨酸棒杆菌ATCC13032的yggB基因编码的YggB蛋白质登记为GenBank accession No.NP_600492。另外，谷氨酸棒杆菌2256(ATCC13869)的yggB基因的核苷酸序列和该基因所编码的YggB蛋白质的氨基酸序列分别表示于序列号11和12。

在本发明中，将具有后面叙述的“特定的突变”的yggB基因称为突变型yggB基因，将由该突变型yggB基因编码的蛋白质称为突变型YggB蛋白质。另外，在本发明中，将没有后面叙述的“特定的突变”的yggB基因称为野生型yggB基因，将由该野生型yggB基因编码的蛋白质称为野生型YggB蛋白质。需要说明的是，对于YggB蛋白质而言，也将由yggB基因中的“特定的突变”所引起的氨基酸序列变化称为“特定的突变”。这里所谓的“野生型”是为了区别于“突变型”的方便的记载，只要不具有“特定的突变”即可，并不限定于由自然界获得。作为野生型YggB蛋白质，可以举出上述例示出的YggB蛋白质，例如，具有序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质。另外，作为野生型YggB蛋白质，可以举出上述例示出的YggB蛋白质的保守变异体(保持了原本功能的变异体)，其不具有“特定的突变”。YggB蛋白质的“原本功能”例如可以是作为力敏感通道(mechanosensitive channel)的功能，也可以是棒杆菌型细菌中使其表达增高时使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力增高的性质。

对于“特定的突变”而言，只要是使上述这样的野生型YggB蛋白质的氨基酸序列而使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的突变即可，没有特别限制。作为“特定的突变”，可以列举：C末端侧突变、跨膜结构域的突变(WO2006/070944)。另外，“特定的突变”也可以是这些突变的组合。

(1)C末端侧突变

C末端侧突变是野生型yggB基因中编码野生型YggB蛋白质419～533位氨基酸残基的区域中的突变。C末端侧突变可以在该区域中的1个或1个以上位点导入。由C末端侧突变引起的氨基酸序列变化的种类没有特别限制。C末端侧突变可以是引起如下情况的突变，例如，氨基酸残基的取代(错义突变)、氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失、终止密码子的出现(无义突变)、移码突变、或者这些的组合。作为C末端侧突变，例如，优选插入序列(以下也称为“IS”)、转座子等核苷酸序列的插入。

(1-1)核苷酸序列的插入

作为C末端侧突变，可以举出例如，在编码野生型YggB蛋白质419位缬氨酸残基的位点插入核苷酸序列的突变(2A-1型突变)。2A-1型突变例如可以是野生型YggB蛋白质419～533位氨基酸残基的一部分或全部发生缺失或取代引起的。作为具有2A-1型突变的突变型yggB基因，具体而言可以举出例如，在序列号11的1255位“G”的下一位插入IS，且编码比原来的野生型YggB蛋白质(序列号12)更短的全长423个氨基残基的突变型YggB蛋白质的yggB基因。将该突变型yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列和该基因所编码的突变型YggB蛋白质(V419::IS)的氨基酸序列分别表示于序列号13和14。在序列号13中，1～1269位为突变型YggB蛋白质(V419::IS)的CDS。

(1-2)脯氨酸残基的取代

作为C末端侧突变，可以举出例如，将存在于野生型YggB蛋白质419～533位的脯氨酸残基取代为其它氨基酸的突变。作为这样的脯氨酸残基，可以例举：野生型YggB蛋白质的424位、437位、453位、457位、462位、469位、484位、489位、497位、515位、529位及533位的脯氨酸残基。其中，优选将424位和/或437位的脯氨酸残基取代为其它氨基酸。“其它氨基酸”只要是脯氨酸以外的天然氨基酸即可，没有特别限制。作为“其它氨基酸”，可以列举：Lys、Glu、Thr、Val、Leu、Ile、Ser、Asp、Asn、Gln、Arg、Cys、Met、Phe、Trp、Tyr、Gly、Ala、His。例如，424位的脯氨酸残基可以优选取代为疏水性氨基酸(Ala、Gly、Val、Leu或Ile)，可以更优选取代为支链氨基酸(Leu、Val或Ile)。另外，例如，437位的脯氨酸残基可以优选取代为在支链具有羟基的氨基酸(Thr、Ser或Tyr)，更优选取代为Ser。

(2)跨膜结构域的突变

推测YggB蛋白质具有5个跨膜结构域。跨膜结构域分别相当于野生型YggB蛋白质的1～23位(第1跨膜结构域)、25～47位(第2跨膜结构域)、62～84位(第3跨膜结构域)、86～108位(第4跨膜结构域)、110～132位(第5跨膜结构域)的氨基酸残基。跨膜结构域的突变是野生型yggB基因中编码这些跨膜结构域的区域的突变。跨膜结构域的突变可以在该区域中的1个或1个以上位点导入。跨膜结构域的突变优选为引起1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加、插入或倒位的突变，且不包括移码突变和无义突变。“1个或多个”是指优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个的意思。作为跨膜结构域的突变，可以列举：在野生型YggB蛋白质的14位亮氨酸残基与15位色氨酸残基之间插入1或多个氨基酸残基(例如Cys-Ser-Leu)的突变、将100位的丙氨酸残基取代为其它氨基酸残基(例如，在支链具有羟基的氨基酸(Thr、Ser或Tyr)，优选为Thr)的突变、将111位的丙氨酸残基取代为其它氨基酸残基(例如，在支链具有羟基的氨基酸(Thr、Ser或Tyr)，优选为Thr)的突变等。

在本发明中，“野生型YggB蛋白质的X位的氨基酸残基”只要没有特别说明，就是指相当于序列号12中的X位氨基酸残基的氨基酸残基。氨基酸序列中的“X位”是指从该氨基酸序列的N末端起计数，第X号位置的意思，N末端的氨基酸残基为1位的氨基酸残基。需要说明的是，氨基酸残基的位置表示相对位置，根据氨基酸的缺失、插入、添加等，其绝对位置有时发生前后变化。例如，“野生型YggB蛋白质的419位的氨基酸残基”是指相当于序列号12中的419位氨基酸残基的氨基酸残基的意思，在比419位更靠近N末端侧的1个氨基酸残基缺失的情况下，从N末端起第418号氨基酸残基为“野生型YggB蛋白质的419位的氨基酸残基”。另外，在比419位更靠近N末端侧插入了1个氨基酸残基的情况下，从N末端起第420号氨基酸残基为“野生型YggB蛋白质的419位的氨基酸残基”。具体而言，例如，在谷氨酸棒杆菌ATCC14967株的YggB蛋白质中，419～529位的氨基酸残基相当于野生型YggB蛋白质的419～533位的氨基酸残基。

在任意的YggB蛋白质的氨基酸序列中，哪一个氨基酸残基是“相当于序列号12中的X位氨基酸残基的氨基酸残基”可以通过对该YggB蛋白质的氨基酸序列与序列号12的氨基酸序列进行比对来确定。比对可以利用例如公知的基因分析软件来进行。作为具体的软件，可以列举：Hitachi Solutions公司制DNASIS、GENETYX公司制GENETYX等(ElizabethC.Tyler et al.,Computers and Biomedical Research,24(1),72-96,1991；Barton GJet al.,Journal of molecular biology,198(2),327-37.1987)。

突变型yggB基因可以通过对野生型yggB基因进行修饰使其具有上述“特定的突变”而获得。DNA的改变可以通过公知的方法来进行。具体而言，例如，作为在DNA的目标位点导入目标突变的位点特异性突变法，可以列举：使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCRtechnology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))、使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.in Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。另外，突变型yggB基因也可以通过化学合成而获得。

对细菌进行改变使其具有突变型yggB基因可以通过将突变型yggB基因导入细菌来实现。另外，对细菌进行改变使其具有突变型yggB基因也可以通过利用自然突变、突变原处理向细菌所具有的yggB基因中导入突变来实现。

＜L-谷氨酰胺生产菌＞

作为用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，可以举出例如，对细菌进行改变以使选自L-谷氨酰胺生物合成酶中的1种或1种以上酶的活性增高的方法。作为这样的酶，没有特别限制，可以列举：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)。需要说明的是，谷氨酰胺合成酶的活性可以通过谷氨酰胺腺苷酰转移酶基因(glnE)的破坏、PII控制蛋白质基因(glnB)的破坏而增高(EP1229121)。

另外，作为用于赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，可以列举例如，对细菌进行改变以使选自下述酶中的1种或1种以上的酶活性降低的方法，所述酶是催化从L-谷氨酰胺的生物合成路径分支出生成L-谷氨酰胺以外的化合物的反应的酶。作为这样的酶，没有特别限制，可以举出谷氨酰胺酶。

作为L-谷氨酰胺生产菌或用于诱导L-谷氨酰胺生产菌的亲本株，具体而言，可以列举例如：增强了谷氨酸脱氢酶(gdhA)和/或谷氨酰胺合成酶(glnA)的活性的棒杆菌型细菌(EP1229121,EP1424398)、谷氨酰胺酶活性降低了的棒杆菌型细菌(日本特开2004-187684)。

另外，对于棒杆菌型细菌，作为赋予或增强L-谷氨酰胺生产能力的方法，可以列举：赋予6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸耐受性的方法(日本特开平3-232497)、赋予嘌呤类似物耐受性和蛋氨酸亚砜耐受性的方法(日本特开昭61-202694)、赋予α-酮基马来酸耐受性的方法(日本特开昭56-151495)。作为具有L-谷氨酰胺生产能力的棒杆菌型细菌，具体而言，可以列举例如以下菌株。

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11573(FERM P-5492；日本特开昭56-161495)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11576(FERM BP-10381；日本特开昭56-161495)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ12212(FERM P-8123；日本特开昭61-202694)

＜L-脯氨酸生产菌＞

作为用于赋予或增强L-脯氨酸生产能力的方法，可以举出例如，对细菌进行改变以使选自L-脯氨酸生物合成酶中的1种或1种以上酶的活性增加的方法。作为这样的酶，可以列举：谷氨酸-5-激酶(proB)、γ-谷氨酰磷酸还原酶、5-吡咯啉羧酸还原酶(putA)。酶活性的增加可以使用例如proB基因(德国专利第3127361号)，所述proB基因编码对由L-脯氨酸引起的反馈抑制脱敏的谷氨酸-5-激酶。

另外，作为用于赋予或增强L-脯氨酸生产能力的方法，可以举出例如，对细菌进行改变以使与L-脯氨酸分解相关的酶的活性降低的方法。作为这样的酶，可以列举：脯氨酸脱氢酶、鸟氨酸转氨酶。

＜L-精氨酸生产菌＞

作为用于赋予或增强L-精氨酸生产能力的方法，可以举出例如，对细菌进行改变以使选自L-精氨酸生物合成酶中的1种或1种以上酶的活性的增加的方法。作为这样的酶，没有特别限制，可以列举：N-乙酰谷氨酸合成酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨基琥珀酸合成酶(argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argH)、氨甲酰磷酸合成酶(carAB)。作为N-乙酰谷氨酸合成酶(argA)基因，优选使用例如下述编码突变型N-乙酰谷氨酸合成酶的基因，所述突变型N-乙酰谷氨酸合成酶中相当于野生型的15位～19位的氨基酸残基被取代，且对由L-精氨酸引起的反馈抑制脱敏(欧洲申请公开1170361号说明书)。

另外，作为L-精氨酸生产菌或用于诱导L-精氨酸生产菌的亲本株，可以列举：缺失了作为精氨酸阻抑物的ArgR的菌株(美国专利申请公开2002-0045223号)、使细胞内的谷氨酰胺合成酶活性增高了的菌株(美国专利申请公开2005-0014236号公报)等棒杆菌型细菌。

另外，作为L-精氨酸生产菌或用于诱导L-精氨酸生产菌的亲本株，可以举出具有对氨基酸类似物等的耐受性的棒杆菌型细菌的突变株。作为这样的菌株，可以列举例如：除了具有2-噻唑丙氨酸耐受性，还具有L-组氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸或L-色氨酸缺陷性的菌株(日本特开昭54-44096号公报)；具有对酮基丙二酸、氟代丙二酸或单氟乙酸的耐受性的菌株(日本特开昭57-18989号公报)；具有对精氨醇的耐受性的菌株(日本特公昭62-24075号公报)；具有对X-胍(X为脂肪链或其衍生物)的耐受性的菌株(日本特开平2-186995号公报)；具有对精氨酸氧肟酸盐和6-氮尿嘧啶的耐受性的菌株(日本特开昭57-150381号公报)。作为具有L-精氨酸生产能力的棒杆菌型细菌的具体例子，可以列举下述菌株。

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11169(FERM BP-6892)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)AJ12092(FERM BP-6906)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11336(FERM BP-6893)

谷氨酸棒杆菌(黄色短杆菌)AJ11345(FERM BP-6894)

谷氨酸棒杆菌(乳糖发酵短杆菌)AJ12430(FERM BP-2228)

＜L-瓜氨酸生产菌和L-鸟氨酸生产菌＞

L-瓜氨酸和L-鸟氨酸与L-精氨酸具有共同的生物合成路径。因此，通过使N-乙酰谷氨酸合成酶(argA)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)和/或乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)的酶活性增加，能够赋予或增强L-瓜氨酸和/或L-鸟氨酸的生产能力(国际公开2006-35831号小册子)。

需要说明的是，为了赋予或增强这些以L-谷氨酸为中间体进行生物合成的L-氨基酸(例如，L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-鸟氨酸)的生产能力，赋予或增强L-谷氨酸的生产能力的方法也是有效的。即，具有这些以L-谷氨酸为中间体进行生物合成的L-氨基酸的生产能力的细菌可以适当具有上述那样的L-谷氨酸生产菌所具有的性质。例如，可以对具有这些以L-谷氨酸为中间体进行生物合成的L-氨基酸的生产能力的细菌进行改变，使其α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性降低。

另外，作为用于赋予或增强L-谷氨酸等谷氨酸类L-氨基酸生产能力的方法，可以举出例如对细菌进行改变以使磷酸转酮酶的活性增加的方法(WO2006/016705)。即，可以对本发明的细菌进行改变，以使磷酸转酮酶的活性增加。作为磷酸转酮酶，可以列举：D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶、果糖-6-磷酸磷酸转酮酶。可以对D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶活性和果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性中任一者进行增强，也可以对两种进行增强。

作为D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶活性，是指消耗磷酸将木酮糖-5-磷酸转变为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸并释放一分子H₂O的活性。该活性可以根据Goldberg,M.等的文献(Methods Enzymol.,9,515-520(1966))或L.Meile的文献(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)中记载的方法来测定。作为D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶，可以列举下述D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶：属于醋杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、硫杆菌属、链球菌属、甲基球菌属、丁酸弧菌属或丝状杆菌属的细菌的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶；属于念珠菌属、红酵母属、红冬孢酵母属、毕赤酵母属、亚罗酵母(Yarrowia)属、汉森酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、毛孢子菌属或温酵母(Wingea)属的酵母的D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶。WO2006/016705中公开了D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶及编码其的基因的具体例子。

另外，作为果糖-6-磷酸磷酸转酮酶活性，是指消耗磷酸将果糖6-磷酸转变为赤藓糖-4-磷酸和乙酰磷酸并排出一分子H₂O的活性。该活性可以根据Racker,E的文献(MethodsEnzymol.,5,276-280(1962))或L.Meile的文献(J.Bacteriol.(2001)183；2929-2936)中记载的方法来测定。作为果糖-6-磷酸磷酸转酮酶，可以列举下述果糖-6-磷酸磷酸转酮酶：属于醋杆菌属、双歧杆菌属、绿菌属、布鲁氏菌属、甲基球菌属或加德纳氏菌属的细菌的果糖-6-磷酸磷酸转酮酶；属于红酵母属、念珠菌属、酵母属等的酵母的果糖-6-磷酸磷酸转酮酶。WO2006/016705中公开了果糖-6-磷酸磷酸转酮酶及编码其的基因的具体例子。

可以由单一的酶(D-木酮糖-5-磷酸/果糖-6-磷酸磷酸转酮酶)保持两种磷酸转酮酶活性。

将长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217的磷酸转酮酶基因(xfp基因)的核苷酸序列及编码该基因的磷酸转酮酶(Xfp蛋白质)的氨基酸序列分别示于序列号9和10。

另外，作为赋予或增强L-氨基酸生产能力的方法，可以举出例如，对细菌进行改变以使一种或多种与糖代谢相关的蛋白质、与能量代谢相关的蛋白质的活性增加的方法。

作为与糖代谢相关的蛋白质，可以列举与糖的摄取相关的蛋白质、糖酵解系统酶。作为编码与糖代谢相关的蛋白质的基因，可以列举：葡萄糖6-磷酸异构酶基因(pgi；国际公开第01/02542号小册子)、丙酮酸羧化酶基因(pyc；国际公开99/18228号小册子、欧洲申请公开1092776号说明书)、葡糖磷酸变位酶基因(pgm；国际公开03/04598号小册子)、果糖二磷酸醛缩酶基因(pfkB,fbp；国际公开03/04664号小册子)、转醛酶(talB；国际公开03/008611号小册子)、延胡索酸酶基因(fum；国际公开01/02545号小册子)、non-PTS、蔗糖摄取基因(csc；欧洲申请公开1149911号小册子)、蔗糖同化性基因(scrAB操纵子；美国专利7,179,623号说明书)。

作为编码与能量代谢相关的蛋白质的基因，可以列举：转氢酶基因(pntAB；美国专利5,830,716号说明书)、细胞色素bo型氧化酶(cytochromoe bo-type oxidase)基因(cyoB；欧洲专利申请公开1070376号说明书)。

L-氨基酸生产菌的育种所使用的基因和蛋白质可以分别具有例如上述例示出的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列。另外，L-氨基酸生产菌的育种所使用的基因和蛋白质还可以分别是上述例示出的基因和蛋白质等公知的基因和蛋白质的保守变异体。具体而言，例如，对于L-氨基酸生产菌的育种所使用的基因而言，只要保持了原本功能即可，可以是编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中于1个或多个位置取代、缺失、插入和/或添加了1或多个氨基酸的氨基酸序列。对于基因和蛋白质的保守变异体，可以适用后面叙述的与α-KG摄入载体基因和α-KG摄入载体的保守变异体相关的记载。

＜1-2＞α-KG摄入载体的活性增加

以增加α-KG摄入载体的活性的方式对本发明的细菌进行了改变。具体的，对本发明的细菌进行了改变使得α-KG摄入载体的活性(α-KG摄入载体活性)相比于非改变株增加。本发明的细菌可以通过以增加α-KG摄入载体的活性的方式对具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌进行改变而获得。另外，本发明的细菌可以通过以增加α-KG摄入载体的活性的方式对棒杆菌型细菌进行改变，然后，赋予或增强L-氨基酸生产能力而获得。需要说明的是，本发明的细菌可以是以增加α-KG摄入载体的活性的方式进行改变而获得L-氨基酸生产能力的细菌。对于本发明的细菌而言，不仅以增加α-KG摄入载体的活性的方式进行了改变，而且还可以适当具有例如上述那样的L-氨基酸生产菌所具有的性质。例如，可以以增加磷酸转酮酶的活性的方式对本发明的细菌进行改变。用于构建本发明的细菌的改变可以以任意顺序来进行。

通过以增加α-KG摄入载体的活性的方式改变棒杆菌型细菌，能够使棒杆菌型细菌的L-氨基酸生产能力得到提高，也就是说，通过使用所述棒杆菌型细菌，L-氨基酸的生产提高。特别是通过以增加α-KG摄入载体的活性的方式改变棒杆菌型细菌，可以在产生α-KG副产物的条件下使棒杆菌型细菌的L-氨基酸生产能力得到提高。

以下对α-KG摄入载体及编码其的基因进行说明。

“α-KG摄入载体”是指具有α-KG摄入活性的蛋白质。“α-KG摄入活性”是指从细胞外将α-KG摄入至细胞内的活性。另外，将编码α-KG摄入载体的基因称为“α-KG摄入载体基因”。

作为α-KG摄入载体，可以举出由kgtP基因编码的KgtP蛋白质。作为kgtP基因，可以列举：大肠杆菌、菠萝泛菌、肠沙门氏菌、弗氏贺志氏菌、痢疾贺志氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌、高效固氮慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)、空肠弯曲杆菌、茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)的kgtP基因。这些源自各种生物的kgtP基因的核苷酸序列和由它们编码的KgtP蛋白质的氨基酸序列可以通过例如NCBI等公开数据库获得。大肠埃希氏菌K-12MG1655株的kgtP基因相当于NCBI数据库中以GenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.3GI：556503834)登记的基因组序列中2724448～2725746位序列的互补序列。另外，大肠埃希氏菌K-12MG1655株的KgtP蛋白质登记为GenBank accession NP_417082(version NP_417082.1GI：16130512)。将MG1655株的kgtP基因的核苷酸序列及该基因所编码的KgtP蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号7和8。即，α-KG摄入载体基因例如可以是具有上述例示出的kgtP基因核苷酸序列(例如，序列号7所示的核苷酸序列)的基因。另外，α-KG摄入载体例如可以是具有上述例示出的KgtP蛋白质氨基酸序列(例如，序列号8所示的氨基酸序列)的蛋白质。需要说明的是，“具有(氨基酸或碱基)序列”这样的表述包括“包含该(氨基酸或碱基)序列”的情况和“由该(氨基酸或碱基)序列构成”的情况。

α-KG摄入载体基因只要保持了原本功能即可，可以是上述例示出的α-KG摄入载体基因的变异体，例如上述例示出的kgtP基因的变异体。同样地，α-KG摄入载体只要保持了原本功能即可，可以是上述例示出的α-KG摄入载体的变异体，例如上述例示出的KgtP蛋白质的变异体。需要说明的是，有时将这样保持了原本功能的变异体称为“保守变异体”。“kgtP基因”这样的用语用于不仅表示上述例示出的kgtP基因，还包括它们的保守变异体。同样地，“KgtP蛋白质”这样的用语不仅表示上述例示出的KgtP蛋白质，还包括它们的保守变异体。作为保守变异体，可以列举例如：上述例示出的α-KG摄入载体基因、α-KG摄入载体的同源性修饰体或人工修饰体。

“保持了原本功能”是指基因或蛋白质的变异体具有与原来的基因或蛋白质的功能(活性、性质)相对应的功能(活性、性质)。对于基因而言，“保持了原本功能”是指基因的变异体编码保持了原本功能的蛋白质。对于α-KG摄入载体基因而言，“保持了原本功能”是指基因的变异体编码具有α-KG摄入活性的蛋白质。另外，对于α-KG摄入载体而言，“保持了原本功能”是指蛋白质的变异体具有α-KG摄入活性。

蛋白质的α-KG摄入活性可以通过如下方式测定：将表达该蛋白质的菌体与α-KG一起培养，对该蛋白质依赖性的α-KG向菌体内的摄入进行测定(Seol W,ShatkinAJ.Escherichia coli kgtP encodes an alpha-ketoglutarate transporter.Proc NatlAcad Sci U S A.1991May 1；88(9)：3802-6.)。

以下，对保守变异体进行例示。

α-KG摄入载体基因的同源物或α-KG摄入载体的同源物例如可以通过使用以上述例示出的α-KG摄入载体基因的核苷酸序列或上述例示出的α-KG摄入载体的氨基酸序列作为查询序列的BLAST检索、FASTA检索从公开数据库中容易地获得。另外，α-KG摄入载体基因的同源物例如可以通过PCR来获得，所述PCR以各种生物的染色体为模板，以基于这些公知的α-KG摄入载体基因的核苷酸序列制成的寡核苷酸作为引物。

α-KG摄入载体基因，可以是编码下述蛋白质的基因，所述蛋白质具有在上述氨基酸序列(例如，序列号8所示的氨基酸序列)中1个或多个位置取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸而成的氨基酸序列，只要保持了原本功能即可。例如，对于所编码的蛋白质而言，其N末端和/或C末端可以延长或缩短。需要说明的是，上述“1个或多个”可以由于氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置、种类而不同，具体而言，例如为1～50个、1～40个、1～30个，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，特别优选为1～3个。

上述取代、缺失、插入和/或添加1个或多个氨基酸的每一个蛋白质的功能保持正常的保守突变。保守突变的代表性突变是保守取代。保守取代是指：在取代部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变；在取代部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变；在极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn之间相互取代的突变；在碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His之间相互取代的突变；在酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu之间相互取代的突变；在具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr之间相互取代的突变。作为可以视为保守取代的取代，具体而言可以列举：由Ala取代为Ser或Thr；由Arg取代为Gln、His或Lys；由Asn取代为Glu、Gln、Lys、His或Asp；由Asp取代为Asn、Glu或Gln；由Cys取代为Ser或Ala；由Gln取代为Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg；由Glu取代为Gly、Asn、Gln、Lys或Asp；由Gly取代为Pro；由His取代为Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr；由Ile取代为Leu、Met、Val或Phe；由Leu取代为Ile、Met、Val或Phe；由Lys取代为Asn、Glu、Gln、His或Arg；由Met取代为Ile、Leu、Val或Phe；由Phe取代为Trp、Tyr、Met、Ile或Leu；由Ser取代为Thr或Ala；由Thr取代为Ser或Ala；由Trp取代为Phe或Tyr；由Tyr取代为His、Phe或Trp；以及由Val取代为Met、Ile或Leu。另外，上述这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等也包括：基于源自基因的生物个体差、物种差别的情况等而天然产生的突变(突变或变异)所发生的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等。

另外，α-KG摄入载体基因，可以是编码具有下述氨基酸序列的蛋白质的基因，所述氨基酸序列对于任意上述氨基酸序列的总体氨基酸序列具有例如50％以上、65％以上、80％以上的同源性，优选为90％以上的同源性，更优选为95％以上的同源性，进一步优选为97％以上的同源性，特别优选为99％以上的同源性，只要保持了原本功能即可。需要说明的是，在本说明书中，“同源性”(homology)是指“同一性”(identity)的意思。

另外，α-KG摄入载体基因，可以是如下的基因，例如DNA：其与由上述核苷酸序列(例如，序列号7所示的核苷酸序列)制成的探针，例如，相对于上述核苷酸序列的总体或一部分的互补序列在严谨条件下进行杂交，只要保持了原本功能即可。“严谨条件”是指所谓的形成特异性杂交物而不形成非特异性杂交物的条件。可以举出一个例子：高同源性的DNA彼此杂交，例如具有50％以上、65％以上、80％以上的同源性的DNA彼此杂交，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为97％以上，特别优选为99％以上，而比上述同源性低的DNA彼此不进行杂交的条件；或者在作为通常DNA杂交(Southern hybridization)的清洗条件的相当于60℃、1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下清洗1次，优选清洗2～3次的条件，优选相当于为60℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度，更优选相当于68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度。

如上所述，上述杂交所用的探针可以是基因的互补序列的一部分。这样的探针可以通过以基于公知的基因序列制成的寡核苷酸作为引物，且以含有上述基因的DNA片段作为模板的PCR来制作。例如，可以使用300bp左右长度的DNA片段作为探针。可以使用300bp左右长度的DNA片段作为探针的情况下，作为杂交的清洗条件，可以举出50℃、2×SSC、0.1％SDS。

另外，由于根据宿主不同密码子的简并性不同，因此α-KG摄入载体基因可以是将任意密码子取代为与其等价的密码子而形成的基因。也就是说，所述α-KG摄入载体基因可以是以上示例的任意α-KG摄入载体基因的由于遗传密码子的简并性的变体。例如，可以对α-KG摄入载体基因进行修饰，以使其具有与待使用的宿主的密码子使用频率对应的最适合的密码子。

2个序列之间的序列同一性的百分率例如可以使用数学算法来确定。作为这样的数学算法的不受限定的例子，可以列举：Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11 17的算法、Smith et al(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443 453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444 2448的检索类似性的方法、Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873 5877中记载的改良后的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法。

利用基于这些数学算法的程序可以进行用于确定序列同一性的序列比较(比对)。程序利用适当的电脑运行。作为这样的程序，没有特别限定，可以列举：PC/Gene程序的CLUSTAL(可以由Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得)、ALIGN程序(Version2.0)、以及Wisconsin Genetics Software Package,Version 8(可以由GeneticsComputer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得)的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。使用这些程序的比对例如可以使用初始参数来进行。对应CLUSTAL程序，HigGlns et al.(1988)Gene 73：237 244(1988)、HigGlns et al.(1989)CABIOS5：151 153、Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16：10881 90、Huang et al.(1992)CABIOS 8：155 65、以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307331中有详细记载。

为了获得与编码对象蛋白质的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列，具体而言，例如可以在BLASTN程序、得分＝100、字段长度＝12的条件下进行BLAST核苷酸检索。为了获得与对象蛋白质具有同源性的氨基酸序列，具体而言，例如可以在BLASTX程序、得分＝50、字段长度＝3的条件下进行BLAST蛋白质检索。对于BLAST核苷酸检索、BLAST蛋白质检索，可以参考http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，为了得到以比较为目的而加入了间隙的比对，可以利用Gapped BLAST(BLAST 2.0)。另外，可以将PSI-BLAST(BLAST 2.0)用于检测序列之间的背离关系的反复检索。对于Gapped BLAST和PSI-BLAST，可以参考Altschul etal.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。在使用BLAST、Gapped BLAST或PSI-BLAST时，例如，可以使用各程序(例如，对于核苷酸序列的BLASTN、对于氨基酸序列的BLASTX)的初始参数。比对也可以手动进行。

2个序列之间的序列同一性通过将2个序列最大程度排列为一致时2个序列之间一致的残基比率来计算。

需要说明的是，上述与基因、蛋白质的保守变异体相关的记载也可以适用L-氨基酸生物合成系统酶等任意蛋白质及编码这些蛋白质的基因。

＜1-3＞使蛋白质的活性增加的方法

以下对使α-KG摄入载体等蛋白质的活性增加的方法进行说明。

“蛋白质的活性增加”是指蛋白质的活性相比于非改变株增加。具体的，“蛋白质的活性增加”可以表示该蛋白质在每个细胞中的活性相对于非改变株有所增加的意思。这里所谓的“非改变株”是指未以增加靶蛋白质的活性的方式进行改变的对照株。作为非改变株，可以列举野生株、亲本株。非改变株的具体例子包括细菌物种的相应模式菌株。非改变株的例子还包括上述与细菌的说明相关例示的菌株。也就是说，在实施方案中，蛋白质的活性可以相比于模式菌株(即棒杆菌型细菌所属物种的模式菌株)增加。在另一个实施方案中，蛋白质的活性可以相比于C.glutamicum ATCC 13869增加。在另一个实施方案中，蛋白质的活性可以相比于C.glutamicum ATCC 13032增加。需要说明的是，将“蛋白质的活性增加”称为“蛋白质的活性增强”。更具体的，“蛋白质的活性增加”具体而言可以指与非改变株相比增加了该蛋白质在每个细胞中的分子数和/或增加了该蛋白质每个分子的功能。即，“蛋白质的活性增加”的情况中的“活性”不仅限于蛋白质的催化剂活性，也表示编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)的意思。另外，“蛋白质的活性增加”不仅包括在原本具有靶蛋白质活性的菌株中使该蛋白质的活性增加，还包括对原本不具有靶蛋白质活性的菌株赋予该蛋白质的活性。另外，作为结果，只要蛋白质的活性增加即可，可以在使宿主原本具有的靶蛋白质的活性降低或消失之后赋予合适的靶蛋白质的活性。

对于蛋白质的活性的增加程度而言，只要蛋白质的活性比非改变株有所增加即可，没有特别限制。蛋白质的活性例如可以提高至，例如非改变株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，在非改变株不具有靶蛋白质的活性的情况下，只要通过导入编码该蛋白质的基因来生成该蛋白质即可，例如，可以生产该蛋白质至能够测定其活性的程度。

蛋白质的活性增加这样的改变例如可以通过例如使编码该蛋白质的基因的表达增高而实现。“基因的表达增高”是指与野生株、亲本株等非改变株相比，基因的表达增加。具体的，“基因的表达增高”可以表示与非改变株相比，该基因在每个细胞中的表达量增加。更具体的，“基因的表达增高”是指基因的转录量(mRNA量)增加和/或基因的翻译量(蛋白质的量)增加。需要说明的是，将“基因的表达增高”也称为“基因的表达增强”。基因的表达例如可以增高至非改变株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。另外，“基因的表达增高”不仅包括在原本表达了靶基因的菌株中使该基因的表达量增高，还包括在原本不表达靶基因的菌株中使该基因表达。即，“基因的表达增高”包括例如向不具有靶基因的菌株导入该基因并使该基因表达。

基因表达的增高例如可以通过使基因的拷贝数增加来实现。

基因的拷贝数的增加可以通过向宿主的染色体导入该基因而实现。向染色体导入基因例如可以利用同源重组来进行(MillerI,J.H.Experiments in Molecular Genetics,1972,Cold Spring Harbor Laboratory)。作为利用同源重组的基因导入法，可以列举例如：Red驱动整合(Red-driven integration)法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))等使用直链状DNA的方法、使用包含温度敏感复制起点的质粒的方法、使用能够接合转移的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体(suicide vector)的方法、使用了噬菌体的转导法。基因可以仅导入1个拷贝，也可以导入2个或2个以上的拷贝。例如，通过以在染色体上存在多个拷贝的序列作为靶标进行同源重组，可以向染色体导入基因的多个拷贝。作为在染色体上存在多个拷贝的序列，可以列举：重复DNA序列(repetitive DNA)、存在于转座子两端的反向重复序列(inverted repeat)。另外，也可以以目标物质的生产所不需要的基因等染色体上适当的序列作为靶标进行同源重组。另外，基因也可以使用转座子、Mini-Mu随机地导入染色体上(日本特开平2-109985号公报、US5,882,888、EP805867B1)。

在染色体上导入靶基因可以通过使用了具有与该基因的全部或一部分互补的序列的探针的DNA杂交(Southern hybridization)来确认，或者通过使用了基于该基因序列制成的引物的PCR等来确认。

另外，基因的拷贝数的增加可以通过向宿主导入包含该基因的载体来实现。例如，将包含靶基因的DNA片段与在宿主内发挥功能的载体连接，构建该基因的表达载体，并用该表达载体对宿主进行转化，由此可以使该基因的拷贝数增加。包含靶基因的DNA片段例如可以通过以具有靶基因的微生物的基因组DNA为模板的PCR而获得。作为载体，可以使用在宿主的细胞内能够自主复制的载体。载体优选为多拷贝载体。另外，为了选择转化体，载体优选具有抗生素耐受性基因等标记物。另外，载体还可以具备用于表达而插入的基因的启动子、终止子。载体可以是例如：源自细菌质粒的载体、源自酵母质粒的载体、源自噬菌体的载体、粘粒(cosmid)或噬粒(phagemid)等。作为在棒杆菌型细菌中能够自主复制的载体，具体而言可以列举例如：pHM1519(Agric,Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；对它们进行了改良而具有耐药性基因的质粒；日本特开平3-210184号公报中记载的质粒pCRY30；日本特开平2-72876号公报及美国专利5,185,262号说明书公报中记载的质粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及pCRY3KX；日本特开平1-191686号公报中记载的质粒pCRY2和pCRY3；日本特开昭58-192900号公报中记载的pAJ655、pAJ611及pAJ1844；日本特开昭57-134500号公报中记载的pCG1；日本特开昭58-35197号公报中记载的pCG2；日本特开昭57-183799号公报中记载的pCG4和pCG11；日本特开平10-215883号公报中记载的pVK7；WO2007/046389中记载的pVK9；WO2013/069634中记载的pVS4；日本特开平9-070291号公报中记载的pVC7。

在导入基因的情况下，基因只要以能够表达的状态保持于宿主中即可。具体而言，基因只要以受到在宿主中发挥功能的启动子的控制而表达的方式由宿主保持即可。术语“在宿主中发挥功能”表示在所述宿主中表现出启动子活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子，也可以是源自其它物种的启动子。启动子可以是待导入的基因的固有启动子，也可以是其它基因的启动子。作为启动子，例如，可以利用后面叙述的那样更强的启动子。

基因的下游可以设置转录终止用的终止子。终止子只要在宿主发挥功能即可，没有特别限制。终止子可以是源自宿主的终止子，也可以是源自其它物种的终止子。终止子可以是待导入的基因的固有终止子，也可以是其它基因的终止子。

关于在各种微生物中可以利用的载体、启动子、终止子，例如在“微生物学基础讲座8(微生物学基礎講座)基因工学、共立出版、1987年”中有详细记载，可以利用这些载体、启动子、终止子。

另外，在导入2个或2个以上基因的情况下，各基因只要以能够表达的状态保持于宿主中即可。例如，各基因可以全部保持于单一的表达载体上，也可以全部保持于染色体上。另外，各基因可以分别保持于多个表达载体上，还可以分别保持于单一或多个表达载体上和染色体上。另外，可以由2个或2个以上基因构成操纵子而导入。作为“导入2个或2个以上基因的情况”，可以列举例如：导入分别编码2个或2个以上蛋白质(例如酶)的基因的情况、导入分别编码构成单一蛋白质复合体(例如酶复合体)的2个或2个以上亚基的基因的情况、以及上述情况的组合。

导入的基因只要是编码在宿主内发挥功能的蛋白质的基因即可，没有特别限制。导入的基因可以是源自宿主的基因，也可以是源自不同物种的基因。导入的基因例如可以使用基于该基因的核苷酸序列设计而成的引物，以具有该基因的生物的基因组DNA、搭载该基因的质粒等作为模板，通过PCR来获得。另外，导入的基因例如可以基于该基因的核苷酸序列进行全合成(Gene,60(1),115-127(1987))。获得的基因可以直接利用，或者经过适当改变而利用。也就是说，可以通过修饰基因获得基因的变体。可以通过已知的技术修饰基因。例如，可以通过位点特异性突变方法在DNA的目标位点引入目标突变。也就是说，可以通过位点特异性突变方法修饰基因的编码区使得编码的蛋白质的特定位点包括氨基酸残基的取代、缺失、插入或增加。位点特异性突变方法的例子包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press(1989)；Carter,P.,Meth.inEnzymol.,154,382(1987))，和利用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或者，可以整个合成基因的变体。

需要说明的是，在蛋白质以由多个亚基形成的复合体的形式发挥功能的情况下，作为结果，只要蛋白质的活性增加即可，可以对这些多个亚基全部进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如在通过使基因的表达增高而使蛋白质的活性增加的情况下，可以使编码这些亚基的多个基因的全部表达增高，也可以仅使一部分的表达增高。通常，优选使编码这些亚基的多个基因的全部表达增高。另外，对于构成复合体的各亚基而言，只要复合体具有目标蛋白质的功能即可，可以源自1种生物，也可以源自2种或2种以上的不同生物。即，例如可以向宿主导入编码多个亚基且源自同一生物的基因，可以向宿主导入分别源自不同生物的基因。

另外，基因的表达的增高可以通过使基因的转录效率提高而实现。另外，基因的表达的增高可以通过使基因的翻译效率提高而实现。基因的转录效率、翻译效率的提高例如可以通过表达调节序列的改变而实现。“表达调节序列”是指影响基因表达的部位的总称。作为表达调节序列，可以列举例如：启动子、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))、以及RBS与起始密码子之间的间隔区域。表达调节序列可以使用启动子检索载体、GENETYX等基因分析软件来确定。这些表达调节序列的修饰例如可以通过使用了温度敏感性载体的方法、Red驱动整合法(WO2005/010175)来进行。

基因的转录效率的提高例如可以通过将染色体上的基因的启动子取代为更强的启动子来实现。“更强的启动子”是指与原本存在的野生型启动子相比，基因的转录得到提高的启动子。作为能够在棒杆菌型细菌中利用的更强的启动子，可以列举：人工设计变更而成的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000))、可以在棒杆菌型细菌内用乙酸、乙醇、丙酮酸等诱导的pta、aceA、aceB、adh、amyE启动子、在棒杆菌型细菌内表达量大的强启动子cspB、SOD、tuf(EF-Tu)启动子(Journal of Biotechnology 104(2003)311-323,Appl Environ Microbiol.2005Dec；71(12)：8587-96.)、lac启动子、tac启动子、trc启动子。另外，作为更强的启动子，可以通过使用各种报告基因来获得原有启动子的高活性型基因。例如，通过将启动子区域内的-35、-10区域接近共有序列，可以提高启动子的活性(国际公开第00/18935号)。作为高活性型启动子，可以举出各种tac样启动子(Katashkina JI et al.Russian Federation Patent application 2006134574)。启动子的强度的评价方法和强启动子的例子记载于Goldstein等的论文(Prokaryotic promotersin biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))等。

基因的翻译效率的提高例如可以通过将染色体上的基因的夏因-达尔加诺(SD)序列(也成为核糖体结合部位(RBS))取代为更强的SD序列来实现。“更强的SD序列”是指与原本存在的野生型SD序列相比，mRNA的翻译得到提高的SD序列。作为更强的SD序列，可以举出例如源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。另外，已知RBS与起始密码子之间的间隔区域、特别是起始密码子紧邻上游的序列(5’-UTR)中的多个核苷酸的取代或插入或缺失对mRNA的稳定性和翻译效率有非常大的影响，可以通过改变它们来使基因的翻译效率提高。

基因的翻译效率的提高例如可以通过密码子的改变来实现。例如，通过将存在于基因中的稀有密码子取代为可以以更高频率使用的同义密码子，能够使基因的翻译效率提高。即，例如可以根据待使用的宿主的密码子使用频率对导入的基因进行修饰，以使其具有最适合的密码子。密码子的取代例如可以通过在DNA的目标部位导入目标突变的部位特异性突变法来进行。另外，还可以对进行了密码子取代的基因片段进行全合成。在“密码子使用数据库”(http：//www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中公开了各种生物中的密码子的使用频率。

另外，基因的表达的提高可以通过对使基因表达提高的调节子进行扩增，或者使降低基因表达的调节子缺失或弱化来实现。

上述这样使基因的表达增高的方法可以单独使用，也可以任意组合使用。

另外，增加蛋白质的活性这样的改变例如可以通过增加蛋白质的比活性来实现。比活性的增加也包括对反馈抑制的脱敏。也就是说，当蛋白质受到代谢物的反馈抑制时，可以通过使得宿主保持编码对反馈抑制脱敏的突变蛋白质的基因，增加蛋白质的比活性。“对反馈抑制的脱敏”包括反馈抑制的降低和消除。增加了比活性的蛋白质例如可以探索各种生物而获得。另外，通过在原有的蛋白质中导入突变可以获得高活性型的蛋白质。导入的突变例如可以是蛋白质的1个或多个位置的1个或多个氨基酸残基取代、缺失、插入或添加。突变的导入例如可以通过上述那样的位点特异性突变法来进行。另外，突变的导入例如可以通过突变处理来进行。作为突变处理，可以列举：X射线照射、紫外线照射、以及利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂的处理。另外，体外(in vitro)直接用羟胺对DNA进行处理也可以诱发随机突变。比活性的增加可以单独使用，也可以与上述那样的增加基因表达的方法任意组合使用。

转化的方法没有特别限定，可以使用以往已知的方法。棒杆菌型细菌的转化可以通过例如原生质体法(Gene,39,281-286(1985))、电穿孔法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))、电脉冲法(日本特开平2-207791号公报)来进行。

蛋白质的活性增加可以通过对该蛋白质的活性进行测定来确认。

蛋白质的活性增加可以通过确认编码该蛋白质的基因表达增高来确认。基因表达增高可以通过确认该基因的转录量增高、确认由该基因表达的蛋白质的量增高来确认。

基因的转录量增高的确认可以通过将由该基因转录的mRNA的量与野生株或亲本株等非改变株比较来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以列举：RNA杂交(Northernhybridization)、RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A LaboratoryManual/Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量例如可以增高至非改变株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。

蛋白质的量增加的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法(Western Blot)来进行(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。蛋白质的量例如可以增高至非改变株的1.5倍以上、2倍以上或3倍以上。

上述使蛋白质的活性增加的方法除了用于α-KG摄入载体的活性增加以外，还可以用于任意蛋白质例如L-氨基酸生物合成酶的活性增强、任意基因例如上述编码任意蛋白质的基因的表达增强。

＜1-4＞使蛋白质的活性降低的方法

以下，对使蛋白质的活性降低的方法进行说明。

“蛋白质的活性降低”是指该蛋白质的活性相比于非改变株降低。具体的，“蛋白质的活性降低”可以表示在每个细胞中的活性比非改变株降低。这里所谓的“非改变株”是指未以降低目标蛋白质的活性的方式进行改变的对照株。作为非改变株，可以列举野生株、亲本株。非改变株的具体例子包括细菌物种的相应模式菌株。非改变株的例子还包括上述与细菌的说明相关例示的菌株。也就是说，在实施方案中，蛋白质的活性可以相比于模式菌株(即棒杆菌型细菌所属物种的模式菌株)降低。在另一个实施方案中，蛋白质的活性可以相比于C.glutamicum ATCC 13869降低。在另一个实施方案中，蛋白质的活性可以相比于C.glutamicum ATCC 13032降低。“蛋白质的活性降低”也包括活性完全消失的情况。“蛋白质的活性降低”具体而言可以指与非改变株相比，该蛋白质在每个细胞中的分子数降低和/或该蛋白质的每个分子的功能降低。即，“蛋白质的活性降低”的情况中的“活性”不仅限于蛋白质的催化剂活性，也表示编码蛋白质的基因的转录量(mRNA量)或翻译量(蛋白质的量)的意思。需要说明的是，“蛋白质在每个细胞中的分子数降低”包括该蛋白质完全不存在的情况。另外，“蛋白质的每个分子的功能降低”包括该蛋白质的每个分子的功能完全消失的情况。对于蛋白质的活性降低的程度而言，只要蛋白质的活性比非改变株低即可，没有特别限制。蛋白质的活性例如可以降低至非改变株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

降低蛋白质的活性这样的改变例如可以通使编码该蛋白质的基因的表达降低来实现。“基因的表达降低”是指该基因的表达相比于野生株、亲本株等非改变株降低。具体的，“基因的表达降低”可以表示在每个细胞中的表达量比野生株、亲本株等非改变株低。更具体的，“基因的表达降低”可以表示基因的转录量(mRNA量)降低和/或基因的翻译量(蛋白质的量)降低。“基因的表达降低”包括该基因完全不表达的情况。需要说明的是，将“基因的表达降低”称为“基因的表达弱化”。基因的表达例如可以降低至非改变株的50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因的表达降低例如可以是由转录效率降低引起的，也可以是由翻译效率降低引起的，还可以是它们的组合引起的。基因的表达降低例如可以通过对基因的启动子、夏因-达尔加诺(SD)序列(也称为核糖体结合部位(RBS))、RBS与起始密码子之间的间隔区域等表达调节序列进行修饰来实现。在修饰表达调节序列的情况下，表达调节序列优选改变1个以上碱基，更优选改变2个以上碱基，特别优选改变3个以上碱基。例如，可以通过例如使用较弱的启动子替代染色体上的基因的启动子，降低基因的转录效率。术语“较弱的启动子”表示与基因固有存在的野生型启动子相比，提供减弱的基因转录的启动子。较弱的启动子的例子包括，例如，可诱导启动子。也就是说，可诱导启动子可以作为非诱导条件下的较弱启动子发挥功能，例如在缺少对应诱导子的条件下。另外，可以使表达调节序列的一部分或全部缺失。另外，基因的表达降低例如可以通过对与控制表达相关的因子进行操作来实现。作为与控制表达相关的因子，可以列举：与控制转录、翻译相关的低分子(诱导物质、抑制物质等)、蛋白质(转录因子等)、核酸(siRNA等)等。另外，基因的表达降低例如可以通过在基因的编码区域导入降低基因表达的突变来实现。例如，通过将基因的编码区域的密码子取代为宿主中以更低频率使用的同义密码子，可以使基因的表达降低。另外，例如，通过后面叙述的那样的基因破坏，可以使基因表达本身降低。

另外，降低蛋白质的活性这样的改变例如可以通过破坏编码该蛋白质的基因来实现。“破坏基因”是指对该基因进行修饰以使其不产生正常发挥功能的蛋白质。“不产生正常发挥功能的蛋白质”包括由该基因完全不产生蛋白质的情况、由该基因产生每个分子的功能(活性、性质)降低或消失的蛋白质。

基因的破坏例如可以通过使染色体上基因的编码区域的一部分或全部缺失而实现。并且，包括染色体上的基因的前后序列在内，可以使基因全部缺失。只要能够实现蛋白质的活性降低，缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域等任意区域。通常，缺失的区域较长能够可靠地使基因失活。另外，优选缺失的区域的前后序列的阅读框不一致。

另外，基因的破坏例如可以通过在染色体上的基因的编码区域导入氨基酸取代(错义突变)、导入终止密码子(无义突变)、或者导入添加或缺失1～2个碱基的移码突变等来实现(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997),Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA 955511-5515(1998),Journal of BiologicalChemistry 26 116,20833-20839(1991))。

另外，基因的破坏例如也可以通过在染色体上的基因的编码区域插入其他序列来实现。插入部位可以是基因的任意区域，但待插入的序列较长者能够可靠地使基因失活。另外，插入部位的前后序列优选与阅读框不一致。作为其它序列，只要是使编码的蛋白质的活性降低或消失的序列即可，没有特别限制，可以举出例如：抗生素耐受性基因等标记物基因，用于目标物质的生产的基因。

对染色体上的基因进行上述那样的改变可以通过以下方式实现：例如，制作进行了修饰的缺陷型基因，以使其不产生正常发挥功能的蛋白质，用包含该缺陷型基因的重组DNA对宿主进行转化，使缺陷型基因和染色体上的野生型基因发生同源重组，由此将染色体上的野生型基因取代为缺陷型基因。此时，对于重组DNA而言，如果根据宿主的营养缺陷性等性质而预先含有标记物基因，则易于操作。作为缺陷型基因，可以列举：缺失了基因的全部区域或一部分区域的基因、导入了错义突变的基因、导入了无义突变的基因、导入了移码突变的基因、导入了转座子或标记物基因等的插入序列的基因。即使生成了由缺陷型基因编码的蛋白质，也具有与野生型蛋白质不同的立体结构，功能降低或消失。这样的通过利用同源重组的基因取代来进行的基因破坏的方法已经建立，有如下方法：被称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、Red驱动整合法与源自λ噬菌体的切除系统(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))组合而成的方法(参照WO2005/010175号)等使用直链状DNA的方法；使用包含温度敏感性复制起点的质粒的方法、使用能够转移复制的质粒的方法、使用不具有在宿主内发挥功能的复制起点的自杀载体的方法等(美国专利第6303383号、日本特开平05-007491号)。

另外，降低蛋白质的活性这样的改变例如可以通过突变处理来进行。作为突变处理，可以列举：X射线照射、紫外线照射、以及利用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、甲磺酸乙酯(EMS)及甲磺酸甲酯(MMS)等突变剂的处理。

需要说明的是，在蛋白质以由多个亚基形成的复合体的形式发挥功能的情况下，作为结果，只要蛋白质的活性降低即可，可以对这些多个亚基全部进行修饰，也可以仅对一部分进行修饰。即，例如可以对编码这些亚基的多个基因全部进行破坏等，也可以仅对一部分进行破坏等。另外，在蛋白质中存在多个同工酶的情况下，作为结果，只要蛋白质的活性降低即可，可以使多个同工酶全部活性降低，也可以仅使一部分的活性降低。即，例如可以对编码这些同工酶的多个基因全部进行破坏等，也可以仅对一部分进行破坏等。

蛋白质的活性降低可以通过对该蛋白质的活性进行测定来确认。

蛋白质的活性降低可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达降低来确认。基因的表达降低可以通过确认该基因的转录量降低、确认由该基因表达的蛋白质的量降低来确认。

基因的转录量降低的确认可以通过将由该基因转录的mRNA的量与非改变株比较来进行。作为评价mRNA的量的方法，可以例举：：RNA杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。与非改变株相比，mRNA的量例如可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

蛋白质的量降低的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹法(Western Blot)来进行(Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001))。与非改变株相比，蛋白质的量例如可以降低至50％以下、20％以下、10％以下、5％以下或0％。

基因破坏可以根据破坏所使用的方法通过确定该基因的一部分或全部核苷酸序列、限制酶图谱或全长等来确认。

上述使蛋白质的活性降低的方法可以用于任意蛋白质例如催化从目标L-氨基酸的生物合成路径分支出生成目标L-氨基酸以外的化合物的反应的酶的活性降低、任意基因例如编码任意蛋白质的基因的表达降低。

＜2＞本发明的L-氨基酸的制造方法

本发明的方法是L-氨基酸的制造方法，该方法包括：用培养基对本发明的细菌进行培养及从该培养基采集L-氨基酸。在本发明中，制造的L-氨基酸为谷氨酸类L-氨基酸。在本发明中，可以制造1种L-氨基酸，也可以制造2种或2种以上L-氨基酸。

使用的培养基只要能够繁殖本发明的细菌并生产目标L-氨基酸即可，没有特别限制。作为培养基，例如可以使用能用于棒杆菌型细菌等细菌的培养的通常的培养基。作为培养基，例如可以使用根据需要含有选自碳源、氮源、磷酸源、硫源、其它各种有机成分、无机成分中的成分的培养基。培养基成分的种类、浓度可以根据使用的棒杆菌型细菌的种类等各条件而适当设定。

作为碳源，具体而言可以列举例如：葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、糖蜜(molasses)、淀粉水解物、生物质的水解物等糖类、乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类、甘油、粗甘油、乙醇等醇类、脂肪酸类。需要说明的是，作为碳源，可以优选使用源自植物的原料。作为植物，可以列举例如：玉米、稻、小麦、大豆、甘蔗、甜菜、棉。作为源自植物的原料，可以列举例如：根、茎、杆、枝、叶、花、种子等器官、包含这些器官的植物体、这些植物器官的分解产物。源自植物的原料的利用方式没有特别限制，例如，可以以未加工品、榨汁、粉碎物、纯化物等任意形式加以利用。另外，木糖等5碳糖、葡萄糖等6碳糖或它们的混合物例如可以由植物生物质获得而加以利用。具体而言，这些糖类可以通过将植物生物质供于水蒸汽处理、浓酸水解、稀酸水解、利用纤维素酶等酶的水解、碱处理等处理来获得。需要说明的是，半纤维素通常比纤维素更容易水解，因此，可以将植物生物质中的半纤维素预先水解使5碳糖游离，接着水解纤维素而生成6碳糖。另外，木糖例如可以通过在本发明的细菌中具有从葡萄糖等6碳糖转变为木糖的路径，从6碳糖转变而供给。作为碳源，可以使用1种碳源，也可以组合使用2种或2种以上的碳源。

作为氮源，具体而言可以列举例如：硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐、胨、酵母提取物、肉提取物、大豆蛋白质分解物等有机氮源、氨、尿素。可以使用调节pH用的氨气、氨水作为氮源。作为氮源，可以使用1种氮源，也可以组合使用2种或2种以上的氮源。

作为磷酸源，具体而言可以列举例如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐、焦磷酸等磷酸聚合物。作为磷酸源，可以使用1种磷酸源，也可以组合使用2种或2种以上的磷酸源。

作为硫源，具体而言可以列举例如：硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐等无机硫化合物、半胱氨酸、胱氨酸、谷胱甘肽等含硫氨基酸。作为硫源，可以使用1种硫源，也可以组合使用2种或2种以上的硫源。

作为其它各种有机成分、无机成分，具体而言可以列举例如：氯化钠、氯化钾等无机盐类；铁、锰、镁、钙等微量金属类；维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、烟酰胺、维生素B12等维生素类；氨基酸类；核酸类；含有上述成分的胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白质分解物等有机成分。作为其它各种有机成分、无机成分，可以使用1种成分，也可以组合使用2种或2种以上的成分。

另外，在使用繁殖需要营养素例如氨基酸的营养缺陷性突变株的情况下，优选在培养基中补充需要的营养素。

另外，优选限制培养基中的生物素量、在培养基中添加表面活性剂或青霉素。

培养条件只要能够繁殖本发明的细菌并生产目标L-氨基酸即可，没有特别限制。培养例如可以在用于棒杆菌型细菌等细菌的培养的通常条件下进行。培养条件可以根据使用的棒杆菌型细菌的种类等各条件而适当设定。

培养可以使用液体培养基来进行。在培养时，例如，可以将用琼脂培养基等固体培养基培养本发明的细菌而得到的菌直接接种于液体培养基，也可以将用液体培养基种子培养(seed culture)本发明的细菌而得到的菌接种于正式培养用的液体培养基。即，培养可以分为种子培养和正式培养来进行。在这种情况下，种子培养和正式培养的培养条件可以相同，也可以不同。培养开始时培养基中含有的本发明的细菌的量没有特别限制。正式培养例如可以在正式培养的培养基中移植1～50％(v/v)的种子培养液来进行。

培养可以通过分批培养(batch culture)、流加培养(Fed-batch culture)、连续培养(continuous culture)或它们的组合来实施。需要说明的是，也将培养开始时的培养基称为“初始培养基”。另外，将在流加培养或连续培养中供给于培养体系(发酵槽)的培养基称为“流加培养基”。另外，将在流加培养或连续培养中向培养体系供给流加培养基称为“流加”。需要说明的是，在培养分为种子培养和正式培养的情况下，例如可以一起以分批培养的方式进行种子培养和正式培养。另外，例如可以以分批培养进行种子培养，以流加培养或连续培养进行正式培养。

培养例如可以在好氧条件下进行。好氧条件是指液体培养基中的溶解氧浓度为基于氧膜电极的检出界限的0.33ppm以上，或可以优选指液体培养基中的溶解氧浓度为1.5ppm以上。氧浓度例如可以控制为饱和氧浓度的5～50％，优选控制为10％左右。好氧条件下的培养具体而言可以通过通气培养、振荡培养、搅拌培养或它们的组合来进行。培养基的pH可以为例如pH3～10，优选为pH4.0～9.5。在培养中，可以根据需要调节培养基的pH。培养基的pH可以使用氨气、氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化镁等各种碱性或酸性物质来调节。培养温度例如可以为20～40℃，优选为25℃～37℃。培养期间例如为10小时～120小时。培养例如可以持续至培养基中的碳源消耗为止，或持续至本发明的细菌的活性消失为止。通过在这样的条件下培养本发明的细菌，可将L-氨基酸积蓄于培养基中。

另外，在制造L-谷氨酸的情况下，可以使用调整为析出L-谷氨酸的条件的液体培养基，一边使L-谷氨酸在培养基中析出，一边进行培养。作为析出L-谷氨酸的条件，可以列举例如：pH5.0～4.0的条件，优选为pH4.5～4.0的条件，进一步优选为pH4.3～4.0的条件，特别优选为pH4.0的条件(欧洲专利申请公开第1078989号说明书)。

L-氨基酸的生成可以通过化合物的检测或鉴定所使用的公知方法来确认。作为这样的方法，可以列举例如：HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR。这些方法可以单独使用，或者适当组合使用。

从发酵液中回收L-氨基酸可以通过化合物的分离纯化所使用的公知方法来进行。作为这样的方法，可以列举例如：离子交换树脂法(Nagai,H.et al.,Separation Scienceand Technology,39(16),3691-3710)、沉淀法、膜分离法(日本特开平9-164323号、日本特开平9-173792号)、结晶法(WO2008/078448、WO2008/078646)。这些方法可以单独使用，或者适当组合使用。需要说明的是，在L-氨基酸积蓄于菌体内的情况下，例如，可以用超音波等对菌体进行破碎，利用离子交换树脂法等从通过离心分离除去菌体而得到的上清液中回收L-氨基酸。回收的L-氨基酸可以是单体、其盐或它们的混合物。作为盐，可以列举例如：硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、钠盐、钾盐。在制造L-谷氨酸时，回收的L-谷氨酸具体而言可以是例如单体的L-谷氨酸、L-谷氨酸钠(monosodium L-glutamate；MSG)、L-谷氨酸铵(monoammonium L-glutamate)、或它们的混合物。例如，通过加入酸使发酵液中的L-谷氨酸铵结晶，并向结晶添加等摩尔的氢氧化钠，可以得到L-谷氨酸钠(MSG)。需要说明的是，可以在晶析前后加入活性炭来脱色(参照谷氨酸钠的工业结晶日本海水学会志56卷5号川喜田哲哉)。L-谷氨酸钠结晶例如可以作为鲜味调料使用。L-谷氨酸钠结晶也可以与同样具有鲜味的鸟苷酸钠(5’-GMP二钠盐)、肌苷酸钠(5’-IMP二钠盐)等核酸混合而作为调料使用。

另外，在L-氨基酸析出于培养基中的情况下，可以通过离心分离或过滤等来回收。另外，析出于培养基中的L-氨基酸也可以在将溶解于培养基中的L-氨基酸结晶后一起进行分离。

需要说明的是，回收的L-氨基酸除了L-氨基酸以外还含有细菌菌体、培养基成分、水分及细菌的代谢副产物等成分。可以将L-氨基酸纯化至希望的程度。回收的L-氨基酸的纯度例可以为50％(w/w)以上，优选为85％(w/w)以上，特别优选为95％(w/w)以上(JP1214636B,USP5,431,933,USP4,956,471,USP4,777,051,USP4,946,654,USP5,840,358,USP6,238,714,US2005/0025878)。

实施例

以下，通过实施例进一步具体地对本发明进行说明，但本发明并不限于这些例子。

实施例：使用了kgtP基因表达增强株的谷氨酸生产培养

在本实施例中，使用导入了源自大肠杆菌的kgtP基因的谷氨酸棒状杆菌(C.Glutamicum)的谷氨酸生产株来进行谷氨酸生产，对kgtP基因表达增强对谷氨酸生产造成的影响进行了评价。kgtP基因是编码α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的基因。

(1)材料

本实施例中使用的材料如下所述。

表1使用的引物

引物	序列号	核苷酸序列(5’→3’)
			1	1	ccaagcttgcatgcctgcagaggaggattataatggctgaaagtactgtaac
2	2	cggtacccggggatccctaaagacgcatccccttcc
			3	3	gaattcgagctcggtacccg
4	4	actggccgtcgttttacaac
			5	5	aaaacgacggccagtacatcacaacagttcgctttg
6	6	accgagctcgaattcccgttttgaaaaagtatgttg
			7	15	ctattctagaagcacaggaccgtttgccattgatattccccta
8	16	ctagtctagacggggtgctacgcgattaaaacatcacaacag

＜使用的质粒＞

pVK9

pVK9-kgtP

pVK9-BL_xfp

pVK9-kgtP-BL_xfp

＜使用的菌株＞

谷氨酸棒状杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB^*

谷氨酸棒状杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9

谷氨酸棒状杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-kgtP

谷氨酸棒状杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-BL_xfp

谷氨酸棒状杆菌2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-kgtP-BL_xfp

(2)质粒和菌株的构建

＜pVK9-kgtP的构建＞

以大肠杆菌K-12MG1655(ATCC 47076)的基因组DNA为模板进行使用引物1和2的PCR，将包含源自大肠杆菌的kgtP基因(GenBank：U00096.3kgtP-ORF(1299bp))的DNA片段进行了扩增。使用in-fusion(TaKaRa Inc.)将得到的DNA片段与用bamHI和pstI切断的pVK9(US2006-0141588)连接，由此构建了kgtP基因表达质粒pVK9-kgtP。将大肠杆菌K-12MG1655的kgtP基因的核苷酸序列及编码该基因的KgtP蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号7和8。

＜pVK9-BL_xfp的构建＞

以长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)JCM1217(ATCC 15707)的基因组DNA为模板进行使用引物7和8的PCR，将包含源自长双歧杆菌JCM1217的xfp基因(ORF编号BL0959)的DNA片段进行了扩增。用xbaI将得到的DNA片段切断，使用T4DNA连接酶连接于pVK9的xbaI位点，由此构建了xfp基因表达质粒pVK9-BL_xfp。xfp基因是编码磷酸转酮酶的基因。将长双歧杆菌JCM1217的xfp基因的核苷酸序列及编码该基因的Xfp蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号9和10。

＜pVK9-kgtP-BL_xfp的构建＞

以上述构建的质粒pVK9-kgtP为模板进行使用引物3和4的PCR，将包含载体和kgtP基因的DNA片段进行了扩增。另外，以上述构建的质粒pVK9-BL_xfp为模板进行使用引物5和6的PCR，将包含xfp基因的DNA片段进行了扩增。使用in-fusion(TaKaRa Inc.)将得到的2个DNA片段进行连接，由此构建了kgtP基因和xfp基因共表达质粒pVK9-kgtP-BL_xfp。

将各质粒导入C.glutamicum 2256ΔsucAΔldhA yggB^*株(WO2014/185430)，由此构建了kgtP和/或xfp表达增强株。2256ΔsucAΔldhA yggB^*株是由C.glutamicum 2256株(ATCC 13869)诱导得到的谷氨酸生产株，缺失ldhA基因和sucA基因，在yggB基因中有IS突变(V419::IS)。将该突变型yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列及编码该基因的突变型YggB蛋白质(V419::IS)的氨基酸序列分别示于序列号13和14。

(3)谷氨酸生产培养

使用各菌株进行了谷氨酸生产培养。将使用的培养基的组成示于表2。

表2使用的培养基

制作用KOH调节为pH8.0的上述组成的培养基，利用高压灭菌器(115℃、15分钟)进行灭菌。在灭菌后向培养基添加碳酸钙，使其为50g/L，进行培养。*Mameno是大豆蛋白水解物。

(3-1)培养1：kgtP单独强化造成的影响的评价

培养(预培养和正式培养)如下所述来进行：将上述培养基(含有50g/L碳酸钙)5ml装入粗试验管，用31.5℃的箱式振荡器(boxshaker)进行振荡。最初使用培养基1培养上述菌株24小时作为预培养。接着，将得到的预培养液0.5mL接种至培养基2进行正式培养。在接种起23小时后进行取样。使用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)对残留葡萄糖和谷氨酸进行了定量。

将结果示于表3。对于对照株(2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9)而言，确认了产生α-KG副产物。另一方面，对于kgtP强化株(2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-kgtP)而言，与对照株相比，可以确认到产生α-KG副产物量的减少和消耗单位糖的谷氨酸积蓄(谷氨酸收率)的提高。因此，可以认为kgtP是对于谷氨酸生产有效的因子。

表3kgtP单独强化造成的影响的评价

(3-2)培养2：xfp强化株中kgtP强化造成的影响的评价

培养(预培养和正式培养)如下所述来进行：将上述培养基(含有50g/L碳酸钙)5ml装入粗试验管，用31.5℃的箱式振荡器(boxshaker)进行振荡。最初使用培养基1培养上述菌株24小时作为预培养。接着，将得到的预培养液0.5mL接种至培养基1进行正式培养。在接种起16小时后进行取样。使用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)对残留葡萄糖和谷氨酸进行了定量。

将结果示于表4。对于xfp强化株(2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-BL_xfp)而言，与对照株(2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9)相比，确认了产生α-KG副产物量的增加。另一方面，对于kgtP和xfp双基因强化株(2256ΔsucAΔldhA yggB^*/pVK9-kgtP-BL_xfp)而言，与xfp强化株相比，可以确认产生α-KG副产物量的减少和消耗单位糖的谷氨酸积蓄(谷氨酸收率)的提高。因此，可以认为即使在xfp强化时，kgtP也是对于谷氨酸生产有效的因子。

表4xfp强化株中kgtP强化造成的影响的评价

〔序列表的说明〕

序列号1～6：引物

序列号7：大肠杆菌K-12MG1655的kgtP基因的核苷酸序列

序列号8：大肠杆菌K-12MG1655的KgtP蛋白质的氨基酸序列

序列号9：长双歧杆菌JCM1217的xfp基因的核苷酸序列

序列号10：长双歧杆菌JCM1217的Xfp蛋白质的氨基酸序列

序列号11：谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的yggB基因的核苷酸序列

序列号12：谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的YggB蛋白质的氨基酸序列

序列号13：源自谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的突变型yggB基因(V419::IS)的核苷酸序列

序列号14：源自谷氨酸棒杆菌2256(ATCC 13869)的突变型YggB蛋白质(V419::IS)的氨基酸序列

序列号15、16：引物

序列表

<110> 味之素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.)

<120> 谷氨酸类L-氨基酸的制造方法

<130> D784-16284

<150> JP2015-215052

<151> 2015-10-30

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

ccaagcttgc atgcctgcag aggaggatta taatggctga aagtactgta ac 52

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

cggtacccgg ggatccctaa agacgcatcc ccttcc 36

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 3

gaattcgagc tcggtacccg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

actggccgtc gttttacaac 20

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

aaaacgacgg ccagtacatc acaacagttc gctttg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

accgagctcg aattcccgtt ttgaaaaagt atgttg 36

<210> 7

<211> 1299

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 7

atggctgaaa gtactgtaac ggcagacagc aaactgacaa gtagtgatac tcgtcgccgc 60

atttgggcga ttgtgggggc ctcttcaggt aatctggtcg agtggttcga tttctatgtc 120

tactcgttct gttcactcta ctttgcccac atcttcttcc cttccgggaa cacgacgact 180

caactactac aaacagcagg tgtttttgct gcgggattcc tgatgcgccc aataggcggt 240

tggctatttg gccgcatagc cgataaacat ggtcgcaaaa aatcgatgct gttatcggtg 300

tgtatgatgt gtttcggatc gctggttatc gcctgcctcc caggttatga aactataggt 360

acgtgggctc cggcattatt gcttctcgct cgtttatttc agggattatc tgttggcgga 420

gaatatggca ccagcgccac ctatatgagt gaagttgccg ttgaagggcg caaaggtttt 480

tacgcatcat ttcagtatgt gacgttgatc ggcggacaac tgctagccct actggttgtc 540

gtggttttac aacacaccat ggaagacgct gcactcagag agtggggatg gcgtattcct 600

ttcgcgttag gagctgtgtt agctgttgtg gcgttgtggt tacgtcgtca gttagatgaa 660

acttcgcaac aagaaacgcg cgctttaaaa gaagctggat ctctgaaagg attatggcgc 720

aatcgccgtg cattcatcat ggttctcggt tttaccgctg cgggctccct ttgtttctat 780

accttcacta cttatatgca gaagtatctg gtaaatactg cgggaatgca tgccaacgtg 840

gcgagtggca ttatgactgc cgcattgttt gtattcatgc ttattcaacc actcattggc 900

gcgctgtcgg ataagattgg tcgccgtacc tcaatgttat gtttcggttc gctggcagcc 960

atttttaccg ttcctattct ctcagcattg caaaacgttt cctcgcctta tgccgctttt 1020

ggtctggtga tgtgtgccct gctgatagtg agtttttata catcaatcag tggaatactg 1080

aaggctgaga tgttcccggc acaggttcgc gcattaggcg ttggtctgtc atatgcggtc 1140

gctaatgcta tatttggtgg ttcggcggag tacgtagcgt tgtcgctgaa atcaatagga 1200

atggaaacag ccttcttctg gtatgtgacc ttgatggccg tggtggcgtt tctggtttct 1260

ttgatgctac atcgcaaagg gaaggggatg cgtctttag 1299

<210> 8

<211> 432

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌

<400> 8

Met Ala Glu Ser Thr Val Thr Ala Asp Ser Lys Leu Thr Ser Ser Asp

1 5 10 15

Thr Arg Arg Arg Ile Trp Ala Ile Val Gly Ala Ser Ser Gly Asn Leu

20 25 30

Val Glu Trp Phe Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Phe Cys Ser Leu Tyr Phe

35 40 45

Ala His Ile Phe Phe Pro Ser Gly Asn Thr Thr Thr Gln Leu Leu Gln

50 55 60

Thr Ala Gly Val Phe Ala Ala Gly Phe Leu Met Arg Pro Ile Gly Gly

65 70 75 80

Trp Leu Phe Gly Arg Ile Ala Asp Lys His Gly Arg Lys Lys Ser Met

85 90 95

Leu Leu Ser Val Cys Met Met Cys Phe Gly Ser Leu Val Ile Ala Cys

100 105 110

Leu Pro Gly Tyr Glu Thr Ile Gly Thr Trp Ala Pro Ala Leu Leu Leu

115 120 125

Leu Ala Arg Leu Phe Gln Gly Leu Ser Val Gly Gly Glu Tyr Gly Thr

130 135 140

Ser Ala Thr Tyr Met Ser Glu Val Ala Val Glu Gly Arg Lys Gly Phe

145 150 155 160

Tyr Ala Ser Phe Gln Tyr Val Thr Leu Ile Gly Gly Gln Leu Leu Ala

165 170 175

Leu Leu Val Val Val Val Leu Gln His Thr Met Glu Asp Ala Ala Leu

180 185 190

Arg Glu Trp Gly Trp Arg Ile Pro Phe Ala Leu Gly Ala Val Leu Ala

195 200 205

Val Val Ala Leu Trp Leu Arg Arg Gln Leu Asp Glu Thr Ser Gln Gln

210 215 220

Glu Thr Arg Ala Leu Lys Glu Ala Gly Ser Leu Lys Gly Leu Trp Arg

225 230 235 240

Asn Arg Arg Ala Phe Ile Met Val Leu Gly Phe Thr Ala Ala Gly Ser

245 250 255

Leu Cys Phe Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Met Gln Lys Tyr Leu Val Asn

260 265 270

Thr Ala Gly Met His Ala Asn Val Ala Ser Gly Ile Met Thr Ala Ala

275 280 285

Leu Phe Val Phe Met Leu Ile Gln Pro Leu Ile Gly Ala Leu Ser Asp

290 295 300

Lys Ile Gly Arg Arg Thr Ser Met Leu Cys Phe Gly Ser Leu Ala Ala

305 310 315 320

Ile Phe Thr Val Pro Ile Leu Ser Ala Leu Gln Asn Val Ser Ser Pro

325 330 335

Tyr Ala Ala Phe Gly Leu Val Met Cys Ala Leu Leu Ile Val Ser Phe

340 345 350

Tyr Thr Ser Ile Ser Gly Ile Leu Lys Ala Glu Met Phe Pro Ala Gln

355 360 365

Val Arg Ala Leu Gly Val Gly Leu Ser Tyr Ala Val Ala Asn Ala Ile

370 375 380

Phe Gly Gly Ser Ala Glu Tyr Val Ala Leu Ser Leu Lys Ser Ile Gly

385 390 395 400

Met Glu Thr Ala Phe Phe Trp Tyr Val Thr Leu Met Ala Val Val Ala

405 410 415

Phe Leu Val Ser Leu Met Leu His Arg Lys Gly Lys Gly Met Arg Leu

420 425 430

<210> 9

<211> 2478

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌

<400> 9

atgacgagtc ctgttattgg caccccttgg aagaagctca acgctccggt ttccgaggaa 60

gccctcgaag gcgttgacaa gtactggcgc gttgccaact acctttccat cggccagatt 120

tatctgcgtt ccaacccgct gatgaaggag cccttcaccc gcgaagatgt gaagcaccgt 180

ctggtgggcc actggggcac tacccctggc ctgaacttcc tcatcggcca catcaaccgt 240

ttcattgctg accacggcca gaacaccgtg atcatcatgg gcccgggcca cggtggcccg 300

gccggtacct cccagtccta cctggacggc acctacaccg agaccttccc gaagatcacc 360

aaggacgaag ctggtctgca gaagttcttc cgtcagttct cttacccggg cggcattccg 420

tcccacttcg ctccggagac cccgggctcc atccacgagg gtggtgagct gggttacgct 480

ctgtcccacg cttacggcgc catcatggac aacccgagcc tgtttgtccc ggccatcgtc 540

ggcgacggcg aggctgagac cggcccgctg gctaccggct ggcagtccaa caagctcgtg 600

aacccgcgca ccgacggtat cgtgctgccg atcctgcacc tcaacggcta caagatcgcc 660

aacccgacca tcctgtcccg catctccgac gaagagctcc acgagttctt ccacggcatg 720

ggttacgagc cctacgagtt cgtcgctggc ttcgatgatg aggaccacat gtccatccac 780

cgtcgcttcg ccgagctgtg ggagaccatc tgggacgaga tctgcgacat caaggccacc 840

gctcagaccg acaacgtgca ccgtccgttc tacccgatgc tgatcttccg caccccgaag 900

ggctggacct gcccgaagta catcgacggc aagaagaccg agggctcctg gcgttcccac 960

caggtgccgc tggcttccgc ccgcgacacc gaggcccact tcgaggttct caagaactgg 1020

ctcgagtcct acaagccgga agagctgttc gacgccaacg gtgctgtcaa ggacgacgtc 1080

cttgccttca tgccgaaggg cgagctgcgt atcggtgcca acccgaacgc caacggtggt 1140

gtgatccgca acgacctgaa gctgccgaac ctcgaggact acgaggtcaa ggaagtggct 1200

gagtacggcc acggctgggg ccagctcgag gccacccgta ccctgggtgc ctacactcgc 1260

gacatcatca agaacaaccc gcgcgacttc cgcatcttcg gaccggatga gaccgcttcc 1320

aaccgtctgc aggcttccta cgaagtcacc aacaagcagt gggatgccgg ctacatctcc 1380

gacgaggtcg acgagcacat gcacgtctcc ggccaggtcg ttgagcagct gtccgagcac 1440

cagatggaag gcttcctcga ggcttacctg ctgaccggtc gtcacggcat ctggagctcc 1500

tacgagtcct tcgtccacgt gatcgactcc atgctgaacc agcacgccaa gtggcttgag 1560

gctaccgtcc gcgagattcc gtggcgcaag ccgattgcct ccatgaacct gctggtctcc 1620

tcccacgttt ggcgtcagga ccacaacggc ttctcccacc aggatccggg tgtcacctcc 1680

gtcctgctga acaagtgctt ccacaacgac cacgtcatcg gcatctactt cgccaccgat 1740

gcgaacatgc tgctggccat cgccgagaag tgctacaagt ccaccaacaa gatcaacgcc 1800

atcatcgctg gtaagcagcc tgctgccacc tggctgaccc tggacgaggc tcgtgccgag 1860

ctcgagaagg gtgccgccgc ttgggattgg gcttccaccg ccaagaacaa cgatgaggcc 1920

gaggtcgtgc ttgccgccgc cggcgatgtc ccgactcagg agatcatggc tgcttccgac 1980

aagctgaagg aactgggcat caagttcaag gttgtgaacg ttgccgacct gctctccctg 2040

cagtccgcca aggagaacga cgaggctctg accgacgagg agttcgccga catcttcacc 2100

gccgacaagc cggtgctgtt cgcgtaccac tcctacgctc acgacgtgcg tggcctgatc 2160

tacgaccgtc cgaaccacga caacttcaac gtccacggct acgaggagga gggctccacc 2220

accaccccgt acgacatggt tcgtgtcaac cgcatcgacc gctacgagct gaccgctgag 2280

gctctgcgca tgatcgacgc cgacaagtac gccgacaaga tcgacgagct cgagaagttc 2340

cgtgatgagg ccttccagtt cgccgtcgac aacggctacg atcacccgga ctacaccgac 2400

tgggtgtact ccggcgtgaa caccgacaag aagggtgccg tcaccgctac cgccgctacc 2460

gctggcgaca acgagtga 2478

<210> 10

<211> 825

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌

<400> 10

Met Thr Ser Pro Val Ile Gly Thr Pro Trp Lys Lys Leu Asn Ala Pro

1 5 10 15

Val Ser Glu Glu Ala Leu Glu Gly Val Asp Lys Tyr Trp Arg Val Ala

20 25 30

Asn Tyr Leu Ser Ile Gly Gln Ile Tyr Leu Arg Ser Asn Pro Leu Met

35 40 45

Lys Glu Pro Phe Thr Arg Glu Asp Val Lys His Arg Leu Val Gly His

50 55 60

Trp Gly Thr Thr Pro Gly Leu Asn Phe Leu Ile Gly His Ile Asn Arg

65 70 75 80

Phe Ile Ala Asp His Gly Gln Asn Thr Val Ile Ile Met Gly Pro Gly

85 90 95

His Gly Gly Pro Ala Gly Thr Ser Gln Ser Tyr Leu Asp Gly Thr Tyr

100 105 110

Thr Glu Thr Phe Pro Lys Ile Thr Lys Asp Glu Ala Gly Leu Gln Lys

115 120 125

Phe Phe Arg Gln Phe Ser Tyr Pro Gly Gly Ile Pro Ser His Phe Ala

130 135 140

Pro Glu Thr Pro Gly Ser Ile His Glu Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala

145 150 155 160

Leu Ser His Ala Tyr Gly Ala Ile Met Asp Asn Pro Ser Leu Phe Val

165 170 175

Pro Ala Ile Val Gly Asp Gly Glu Ala Glu Thr Gly Pro Leu Ala Thr

180 185 190

Gly Trp Gln Ser Asn Lys Leu Val Asn Pro Arg Thr Asp Gly Ile Val

195 200 205

Leu Pro Ile Leu His Leu Asn Gly Tyr Lys Ile Ala Asn Pro Thr Ile

210 215 220

Leu Ser Arg Ile Ser Asp Glu Glu Leu His Glu Phe Phe His Gly Met

225 230 235 240

Gly Tyr Glu Pro Tyr Glu Phe Val Ala Gly Phe Asp Asp Glu Asp His

245 250 255

Met Ser Ile His Arg Arg Phe Ala Glu Leu Trp Glu Thr Ile Trp Asp

260 265 270

Glu Ile Cys Asp Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Asp Asn Val His Arg

275 280 285

Pro Phe Tyr Pro Met Leu Ile Phe Arg Thr Pro Lys Gly Trp Thr Cys

290 295 300

Pro Lys Tyr Ile Asp Gly Lys Lys Thr Glu Gly Ser Trp Arg Ser His

305 310 315 320

Gln Val Pro Leu Ala Ser Ala Arg Asp Thr Glu Ala His Phe Glu Val

325 330 335

Leu Lys Asn Trp Leu Glu Ser Tyr Lys Pro Glu Glu Leu Phe Asp Ala

340 345 350

Asn Gly Ala Val Lys Asp Asp Val Leu Ala Phe Met Pro Lys Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Ile Gly Ala Asn Pro Asn Ala Asn Gly Gly Val Ile Arg Asn

370 375 380

Asp Leu Lys Leu Pro Asn Leu Glu Asp Tyr Glu Val Lys Glu Val Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Gly His Gly Trp Gly Gln Leu Glu Ala Thr Arg Thr Leu Gly

405 410 415

Ala Tyr Thr Arg Asp Ile Ile Lys Asn Asn Pro Arg Asp Phe Arg Ile

420 425 430

Phe Gly Pro Asp Glu Thr Ala Ser Asn Arg Leu Gln Ala Ser Tyr Glu

435 440 445

Val Thr Asn Lys Gln Trp Asp Ala Gly Tyr Ile Ser Asp Glu Val Asp

450 455 460

Glu His Met His Val Ser Gly Gln Val Val Glu Gln Leu Ser Glu His

465 470 475 480

Gln Met Glu Gly Phe Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Thr Gly Arg His Gly

485 490 495

Ile Trp Ser Ser Tyr Glu Ser Phe Val His Val Ile Asp Ser Met Leu

500 505 510

Asn Gln His Ala Lys Trp Leu Glu Ala Thr Val Arg Glu Ile Pro Trp

515 520 525

Arg Lys Pro Ile Ala Ser Met Asn Leu Leu Val Ser Ser His Val Trp

530 535 540

Arg Gln Asp His Asn Gly Phe Ser His Gln Asp Pro Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Val Leu Leu Asn Lys Cys Phe His Asn Asp His Val Ile Gly Ile Tyr

565 570 575

Phe Ala Thr Asp Ala Asn Met Leu Leu Ala Ile Ala Glu Lys Cys Tyr

580 585 590

Lys Ser Thr Asn Lys Ile Asn Ala Ile Ile Ala Gly Lys Gln Pro Ala

595 600 605

Ala Thr Trp Leu Thr Leu Asp Glu Ala Arg Ala Glu Leu Glu Lys Gly

610 615 620

Ala Ala Ala Trp Asp Trp Ala Ser Thr Ala Lys Asn Asn Asp Glu Ala

625 630 635 640

Glu Val Val Leu Ala Ala Ala Gly Asp Val Pro Thr Gln Glu Ile Met

645 650 655

Ala Ala Ser Asp Lys Leu Lys Glu Leu Gly Ile Lys Phe Lys Val Val

660 665 670

Asn Val Ala Asp Leu Leu Ser Leu Gln Ser Ala Lys Glu Asn Asp Glu

675 680 685

Ala Leu Thr Asp Glu Glu Phe Ala Asp Ile Phe Thr Ala Asp Lys Pro

690 695 700

Val Leu Phe Ala Tyr His Ser Tyr Ala His Asp Val Arg Gly Leu Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Arg Pro Asn His Asp Asn Phe Asn Val His Gly Tyr Glu Glu

725 730 735

Glu Gly Ser Thr Thr Thr Pro Tyr Asp Met Val Arg Val Asn Arg Ile

740 745 750

Asp Arg Tyr Glu Leu Thr Ala Glu Ala Leu Arg Met Ile Asp Ala Asp

755 760 765

Lys Tyr Ala Asp Lys Ile Asp Glu Leu Glu Lys Phe Arg Asp Glu Ala

770 775 780

Phe Gln Phe Ala Val Asp Asn Gly Tyr Asp His Pro Asp Tyr Thr Asp

785 790 795 800

Trp Val Tyr Ser Gly Val Asn Thr Asp Lys Lys Gly Ala Val Thr Ala

805 810 815

Thr Ala Ala Thr Ala Gly Asp Asn Glu

820 825

<210> 11

<211> 1602

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 11

atgattttag gcgtacccat tcaatatttg ctctattcat tgtggaattg gattgtcgat 60

accggttttg atgtagcaat tatcctggtc ttggcgtttt tgattccacg tatcggccga 120

ctggccatgc gtattatcaa gcagcgagtg gagtctgcag ccgatgcgga caccactaag 180

aaccagctcg cgttcgctgg cgttggcgtt tatatcgcgc aaattgtggc gtttttcatg 240

cttgccgtct ccgcgatgca ggcttttggt ttctctctcg cgggcgctgc gattccggca 300

accattgcgt cagctgccat tggtcttggt gcgcagtcga ttgttgcgga cttcttggcc 360

ggatttttca tcctgacgga aaagcaattc ggcgtgggtg actgggtgcg ctttgagggc 420

aacggcatcg ttgttgaagg caccgtcatt gagatcacca tgcgcgcgac caaaattcgc 480

acgattgcac aagagaccgt gatcatcccg aactccacgg cgaaagtgtg catcaacaat 540

tctaataact ggtcgcgtgc ggttgtcgtt attccgatcc ccatgttggg ttctgaaaac 600

atcacagatg tcatcgcgcg ctctgaagct gcgactcgtc gcgcacttgg ccaggagaaa 660

atcgcaccgg aaatcctcgg tgaactcgat gtgcacccag ccacggaagt cacaccgcca 720

acggtggtcg gcatgccgtg gatggtcacc atgcgtttcc tcgtgcaagt caccgccggc 780

aatcaatggc tggtcgaacg cgccatccgc acagaaatca tcaacgaatt ctgggaagaa 840

tacggcagcg caaccactac atcgggaacc ctcattgatt ccttacacgt tgagcatgaa 900

gagccaaaga cctcgcttat cgacgcctcc ccccaggctc ttaaggaacc gaagccggag 960

gctgcggcga cggttgcatc gctagctgca tcgtctaacg acgatgcaga caatgcagac 1020

gcctcggcga tcaatgcagg caatccagag aaggaacttg attccgatgt gctggaacaa 1080

gaactctcca gcgaagaacc ggaagaaaca gcaaaaccag atcactctct ccgaggcttc 1140

ttccgcactg attactaccc aaatcggtgg cagaagatcc tgtcgtttgg cggacgtgtc 1200

cgcatgagca cttccctgtt gttgggtgcg ctgctcttgc tgtcactatt taaggtcatg 1260

actgtggaac caagtgagaa ttggcaaaac tccagtggat ggctgtcacc aagcactgcc 1320

acctcaactg cggtgaccac ctccgaaact tccgcgccag caagcacgcc ttcgatgaca 1380

gtgcccacta cggtggagga gaccccaacg atggaatcta gcgtcgaaac gcagcaggaa 1440

acctcaaccc ctgcaaccgc aacgccccag cgagccgaca ccatcgaacc gaccgaggaa 1500

gccacgtcgc aggaggaaac gactgcatcg cagacgcagt ctccagcagt ggaagcacca 1560

accgcggtcc aagaaacagt tgcgccgacg tccacccctt ag 1602

<210> 12

<211> 533

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 12

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn

1 5 10 15

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala

20 25 30

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln

35 40 45

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala

50 55 60

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln

100 105 110

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys

115 120 125

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val

130 135 140

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val

165 170 175

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro

180 185 190

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser

195 200 205

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu

210 215 220

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro

225 230 235 240

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln

245 250 255

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu

260 265 270

Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser

275 280 285

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr

290 295 300

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala

325 330 335

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu

355 360 365

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp

370 375 380

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val

385 390 395 400

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu

405 410 415

Phe Lys Val Met Thr Val Glu Pro Ser Glu Asn Trp Gln Asn Ser Ser

420 425 430

Gly Trp Leu Ser Pro Ser Thr Ala Thr Ser Thr Ala Val Thr Thr Ser

435 440 445

Glu Thr Ser Ala Pro Ala Ser Thr Pro Ser Met Thr Val Pro Thr Thr

450 455 460

Val Glu Glu Thr Pro Thr Met Glu Ser Ser Val Glu Thr Gln Gln Glu

465 470 475 480

Thr Ser Thr Pro Ala Thr Ala Thr Pro Gln Arg Ala Asp Thr Ile Glu

485 490 495

Pro Thr Glu Glu Ala Thr Ser Gln Glu Glu Thr Thr Ala Ser Gln Thr

500 505 510

Gln Ser Pro Ala Val Glu Ala Pro Thr Ala Val Gln Glu Thr Val Ala

515 520 525

Pro Thr Ser Thr Pro

530

<210> 13

<211> 3063

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1269)

<400> 13

atg att tta ggc gta ccc att caa tat ttg ctc tat tca ttg tgg aat 48

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn

1 5 10 15

tgg att gtc gat acc ggt ttt gat gta gca att atc ctg gtc ttg gcg 96

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala

20 25 30

ttt ttg att cca cgt atc ggc cga ctg gcc atg cgt att atc aag cag 144

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln

35 40 45

cga gtg gag tct gca gcc gat gcg gac acc act aag aac cag ctc gcg 192

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala

50 55 60

ttc gct ggc gtt ggc gtt tat atc gcg caa att gtg gcg ttt ttc atg 240

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met

65 70 75 80

ctt gcc gtc tcc gcg atg cag gct ttt ggt ttc tct ctc gcg ggc gct 288

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala

85 90 95

gcg att ccg gca acc att gcg tca gct gcc att ggt ctt ggt gcg cag 336

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln

100 105 110

tcg att gtt gcg gac ttc ttg gcc gga ttt ttc atc ctg acg gaa aag 384

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys

115 120 125

caa ttc ggc gtg ggt gac tgg gtg cgc ttt gag ggc aac ggc atc gtt 432

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val

130 135 140

gtt gaa ggc acc gtc att gag atc acc atg cgc gcg acc aaa att cgc 480

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg

145 150 155 160

acg att gca caa gag acc gtg atc atc ccg aac tcc acg gcg aaa gtg 528

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val

165 170 175

tgc atc aac aat tct aat aac tgg tcg cgt gcg gtt gtc gtt att ccg 576

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro

180 185 190

atc ccc atg ttg ggt tct gaa aac atc aca gat gtc atc gcg cgc tct 624

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser

195 200 205

gaa gct gcg act cgt cgc gca ctt ggc cag gag aaa atc gca ccg gaa 672

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu

210 215 220

atc ctc ggt gaa ctc gat gtg cac cca gcc acg gaa gtc aca ccg cca 720

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro

225 230 235 240

acg gtg gtc ggc atg ccg tgg atg gtc acc atg cgt ttc ctc gtg caa 768

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln

245 250 255

gtc acc gcc ggc aat caa tgg ctg gtc gaa cgc gcc atc cgc aca gaa 816

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu

260 265 270

atc atc aac gaa ttc tgg gaa gaa tac ggc agc gca acc act aca tcg 864

Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser

275 280 285

gga acc ctc att gat tcc tta cac gtt gag cat gaa gag cca aag acc 912

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr

290 295 300

tcg ctt atc gac gcc tcc ccc cag gct ctt aag gaa ccg aag ccg gag 960

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu

305 310 315 320

gct gcg gcg acg gtt gca tcg cta gct gca tcg tct aac gac gat gca 1008

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala

325 330 335

gac aat gca gac gcc tcg gcg atc aat gca ggc aat cca gag aag gaa 1056

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu

340 345 350

ctt gat tcc gat gtg ctg gaa caa gaa ctc tcc agc gaa gaa ccg gaa 1104

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu

355 360 365

gaa aca gca aaa cca gat cac tct ctc cga ggc ttc ttc cgc act gat 1152

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp

370 375 380

tac tac cca aat cgg tgg cag aag atc ctg tcg ttt ggc gga cgt gtc 1200

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val

385 390 395 400

cgc atg agc act tcc ctg ttg ttg ggt gcg ctg ctc ttg ctg tca cta 1248

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu

405 410 415

ttt aag ggg ctc ttc ctg ttt tagagtgcat tgatcttatg gaccaactgc 1299

Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe

420

cctgaatgga taaggcaccg cagaatgtag tggttcaaat tacggaaacc tagagcaatc 1359

ccacgcaaat gctccaaccg tccgttgatc gcttcgaccg gaccgttgga gacaccaaca 1419

tcgaaatacg ccaacacatc accaagtcgt ttaaacaaac tacgacccaa ctgcgcgagt 1479

tccttattcg gccccttcaa cacccgaagc tgatcaataa tggtccgcat tttcttcttc 1539

gcttcacgct tattacccat ctgataacaa tcaataatcg cctgatacgc aagccacgca 1599

agctttaaca ccccgtagtc tttgtcatac gcccacaact gctccaagct ttcttgctga 1659

cgaggactca accacttgtg cgtggtcaac aaggtcttcc ggtttttata caacggatcc 1719

tggcttaaac cacgacgctg gtatttctcc cgctggaggc gttgccggca ggcggtgagc 1779

ttgtcaccag caagccgcac aacatggaat ggatccatca cgcgacgagc agaaggaatg 1839

agttctttac ttgctgtggc gtagccttgg aacccatcca tggacacgat ccgtatctga 1899

ttgcggaact gttcaccgcg ggaaccaagc caggaccgta aagcatcagc actacgacct 1959

gggacgacat ctaataaccg ggcaggacac cgtgagtcat accgatgccc ggtcatatcg 2019

acaatcacgg tgacaaaccc atcaccatgc ttagccctat tatgtgacca cttatgctca 2079

tccaccccaa tgacatacac tccatcaaga tggtgaggat cgttatagac cagctcacgg 2139

cacatatcga gggctagttg gcaggttaaa tcccacccta gcccaagtgc tttcgcggtt 2199

gcgtgaacac tcatccggtc aatagcaagg cgttgcaaaa tccagcgggt gacccggtgg 2259

gtgacctttt taccgtggtc agcgcagctt agttctgctt ggaaatactt ttgcttacat 2319

gtcgggttgg tgcagcggta gcgaggtaga cggataaaca gtttggtggg aaacccgacg 2379

atgggtaaat caatgagcat ccggtgggtg tgatgacgaa acaccccagg ttgggagcat 2439

tctgggcagg tggaggtata gtcgagtgcg tctgcttcga tcagggtgta atcacctgca 2499

tcggaagcgc cggtgatggt gagtcctagt tccgcagtgc ggcagatggt gtcagcgatg 2559

atgttgccgg tagacttcat gggtagagcc ttttgttggt gtttggttag cttagatacc 2619

taaaccttaa ccctgacaaa aggctcgttt attttcgggt ctacaccgct agcccaggtt 2679

ctgtgatgta ccccaaaacc ggaagggcca tttaaggtca tgactgtgga accaagtgag 2739

aattggcaaa actccagtgg atggctgtca ccaagcactg ccacctcaac tgcggtgacc 2799

acctccgaaa cttccgcgcc agcaagcacg ccttcgatga cagtgcccac tacggtggag 2859

gagaccccaa cgatggaatc tagcgtcgaa acgcagcagg aaacctcaac ccctgcaacc 2919

gcaacgcccc agcgagccga caccatcgaa ccgaccgagg aagccacgtc gcaggaggaa 2979

acgactgcat cgcagacgca gtctccagca gtggaagcac caaccgcggt ccaagaaaca 3039

gttgcgccga cgtccacccc ttag 3063

<210> 14

<211> 423

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 14

Met Ile Leu Gly Val Pro Ile Gln Tyr Leu Leu Tyr Ser Leu Trp Asn

1 5 10 15

Trp Ile Val Asp Thr Gly Phe Asp Val Ala Ile Ile Leu Val Leu Ala

20 25 30

Phe Leu Ile Pro Arg Ile Gly Arg Leu Ala Met Arg Ile Ile Lys Gln

35 40 45

Arg Val Glu Ser Ala Ala Asp Ala Asp Thr Thr Lys Asn Gln Leu Ala

50 55 60

Phe Ala Gly Val Gly Val Tyr Ile Ala Gln Ile Val Ala Phe Phe Met

65 70 75 80

Leu Ala Val Ser Ala Met Gln Ala Phe Gly Phe Ser Leu Ala Gly Ala

85 90 95

Ala Ile Pro Ala Thr Ile Ala Ser Ala Ala Ile Gly Leu Gly Ala Gln

100 105 110

Ser Ile Val Ala Asp Phe Leu Ala Gly Phe Phe Ile Leu Thr Glu Lys

115 120 125

Gln Phe Gly Val Gly Asp Trp Val Arg Phe Glu Gly Asn Gly Ile Val

130 135 140

Val Glu Gly Thr Val Ile Glu Ile Thr Met Arg Ala Thr Lys Ile Arg

145 150 155 160

Thr Ile Ala Gln Glu Thr Val Ile Ile Pro Asn Ser Thr Ala Lys Val

165 170 175

Cys Ile Asn Asn Ser Asn Asn Trp Ser Arg Ala Val Val Val Ile Pro

180 185 190

Ile Pro Met Leu Gly Ser Glu Asn Ile Thr Asp Val Ile Ala Arg Ser

195 200 205

Glu Ala Ala Thr Arg Arg Ala Leu Gly Gln Glu Lys Ile Ala Pro Glu

210 215 220

Ile Leu Gly Glu Leu Asp Val His Pro Ala Thr Glu Val Thr Pro Pro

225 230 235 240

Thr Val Val Gly Met Pro Trp Met Val Thr Met Arg Phe Leu Val Gln

245 250 255

Val Thr Ala Gly Asn Gln Trp Leu Val Glu Arg Ala Ile Arg Thr Glu

260 265 270

Ile Ile Asn Glu Phe Trp Glu Glu Tyr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Ser

275 280 285

Gly Thr Leu Ile Asp Ser Leu His Val Glu His Glu Glu Pro Lys Thr

290 295 300

Ser Leu Ile Asp Ala Ser Pro Gln Ala Leu Lys Glu Pro Lys Pro Glu

305 310 315 320

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Leu Ala Ala Ser Ser Asn Asp Asp Ala

325 330 335

Asp Asn Ala Asp Ala Ser Ala Ile Asn Ala Gly Asn Pro Glu Lys Glu

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Val Leu Glu Gln Glu Leu Ser Ser Glu Glu Pro Glu

355 360 365

Glu Thr Ala Lys Pro Asp His Ser Leu Arg Gly Phe Phe Arg Thr Asp

370 375 380

Tyr Tyr Pro Asn Arg Trp Gln Lys Ile Leu Ser Phe Gly Gly Arg Val

385 390 395 400

Arg Met Ser Thr Ser Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Leu Ser Leu

405 410 415

Phe Lys Gly Leu Phe Leu Phe

420

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctattctaga agcacaggac cgtttgccat tgatattccc cta 43

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ctagtctaga cggggtgcta cgcgattaaa acatcacaac ag 42

Claims

1.L-氨基酸的制造方法，该方法包括：用培养基对具有L-氨基酸生产能力的棒杆菌型细菌进行培养，以及从该培养基采集L-氨基酸，其中，

对所述细菌进行了改变，使α-酮戊二酸(α-KG)摄入载体的活性相比于非改变株增加，

其中所述α-KG摄入载体是由kgtP基因编码的蛋白质，

其中所述细菌为棒杆菌属细菌，且

其中所述L-氨基酸为谷氨酸类L-氨基酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述α-KG摄入载体是包含序列号8所示的氨基酸序列的蛋白质。

3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，通过使编码α-KG摄入载体的基因的表达增高来增加α-KG摄入载体的活性。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述基因的表达通过提高该基因的拷贝数和/或改变该基因的表达调节序列而增高。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使磷酸转酮酶的活性相比于非改变株增加。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述磷酸转酮酶为D-木酮糖-5-磷酸磷酸转酮酶和/或果糖6-磷酸磷酸转酮酶。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，通过使编码磷酸转酮酶的基因的表达增高来增加磷酸转酮酶的活性。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使得α-酮戊二酸脱氢酶和/或琥珀酸脱氢酶的活性相比于非改变株降低。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒杆菌。

10.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，所述谷氨酸类L-氨基酸为选自L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鸟氨酸中的1种或1种以上的L-氨基酸。

11.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，所述谷氨酸类L-氨基酸为L-谷氨酸。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，所述L-谷氨酸为L-谷氨酸铵或L-谷氨酸钠。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，进一步对所述细菌进行了改变，使其保持突变型yggB基因,

其中，所述突变型yggB基因是具有使棒杆菌型细菌的L-谷氨酸生产能力提高的突变的yggB基因，和

其中，所述突变是下述(1)、(2)或(3)中记载的突变：

(2)编码野生型YggB蛋白质的跨膜结构域的区域中的突变；和

(3)上述(1)和(2)的组合。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述野生型YggB蛋白质是包含序列号12所示的氨基酸序列的蛋白质。