JP7188385B2 - L-メチオニンまたは合成にs-アデノシルメチオニンを要求する代謝物の製造方法 - Google Patents
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Description
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記目的物質が、L-メチオニン、生合成にS-アデノシルメチオニンを要求する代謝物、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法を提供することである。
該目的物質に変換することを含む、前記方法を提供することである。
(a)配列番号93に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号93に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、微生物において活性を低下させることにより目的物質の生産が増大する性質を有するタンパク質;および
(c)配列番号93に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、微生物において活性を低下させることにより目的物質の生産が増大する性質を有するタンパク質。
前記方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法を提供することである。
本明細書に記載の微生物は、NCgl2048遺伝子にコードされるNCgl2048タンパク質の活性が低下するように改変された、目的物質を生産する能力を有する微生物である。目的物質を生産する能力を、「目的物質生産能」ともいう。
「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を生産することができる微生物を意味してよい。
を意味してよい。「目的物質生産能を有する微生物」とは、具体的には、培地(例えば、炭素源を含有する培地)で培養したときに、目的物質を生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる微生物を意味してよい。
nella)等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株(ATCC 27325)やMG1655株(ATCC 47076)等のエシェリヒア・コリK-12株;エシェリヒア・コリK5株(ATCC 23506);BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられる。
ウム(Brevibacterium)属、およびミクロバクテリウム(Microbacterium)属等の属に属する細菌が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Americaまたはatcc.org)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
合成酵素の活性が増大するように改変されてよい。1種の目的物質生合成酵素の活性が増大してもよく、2種またはそれ以上の目的物質生合成酵素の活性が増大してもよい。タンパク質(酵素等)の活性を増大させる手法については本明細書に記載する。タンパク質(酵素等)の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大させることができる。
に、同遺伝子がコードするAroBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。
dehydratase等)をコードする遺伝子の発現は、tyrR遺伝子にコードされるチロシンリプレッサーTyrRにより抑制される。よって、シキミ酸経路の酵素の活性は、チロシンリプレッサーTyrRの活性を低下させることによっても、増大させることができる。E. coli K-12
MG1655株のtyrR遺伝子の塩基配列を配列番号9に、同遺伝子がコードするTyrRタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
および/またはプロトカテクアルデヒドをメチル化してバニリン酸および/またはバニリンを生成する反応(すなわちメタ位の水酸基のメチル化)を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい。OMTは、通常はプロトカテク酸とプロトカテクアルデヒドの両方に特異的であってよいが、それには限られない。メチル基供与体としては、S-アデノシルメチオニン(SAM)が挙げられる。OMTとしては、各種生物のOMT、例えば、Homo sapiens(Hs)のOMT(GenBank Accession No. NP_000745, NP_009294)、Arabidopsis thalianaのOMT(GenBank Accession No. NP_200227, NP_009294)、Fragaria x ananassaのOMT(GenBank Accession No. AAF28353)、その他WO2013/022881A1に例示されている哺乳動物、植物、微生物の各種OMTが挙げられる。Homo sapiensのOMT遺伝子には4つの転写バリアントおよび2種のOMTアイソフォームが知られている。それら4つの転写バリアント(transcript variant 1-4;GenBank Accession No. NM_000754.3, NM_001135161.1, NM_001135162.1, NM_007310.2)の塩基配列を配列番号11~14に、長いOMTアイソフォーム(MB-COMT;GenBank Accession No. NP_000745.1)のアミノ酸配列を配列番号15に、短いOMTアイソフォーム(S-COMT;GenBank Accession No. NP_009294.1)のアミノ酸配列を配列番号16に、それぞれ示す。配列番号16は、配列番号15のN末端50アミノ酸残基を欠くアミノ酸配列に相当する。
or positive side-chain charge at pH 7.4)に置換される変異が挙げられる。変異型OMTは、これらの変異のいずれか一方を有していてもよく、両方を有していてもよい。
Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrから選択されるアミノ酸残基が挙げられ、さらに特には、Tyrが挙げられる。
Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、特に、AlaやGlnが挙げられる。
al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991;Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987)。
T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。
バニリン酸またはバニリン)の生成を測定することにより、測定できる(WO2013/022881A1)。また、同様の条件下でのバイプロダクト(例えば、イソバニリン酸またはイソバニリン)の生成を測定し、プロダクトの生成と比較することにより、OMTがプロダクトを選択的に生成するかどうかを決定できる。
No.1, p478-485)。Nocardia sp. NRRL 5646株は、Nocardia iowensisに分類されている。ACARとしては、さらに、Nocardia brasiliensisやNocardia vulneris等の、他のNocardia属細菌のACARも挙げられる。Nocardia brasiliensis ATCC 700358のACAR遺伝子の塩基配列を配列番号17に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号18に示す。また、Nocardia brasiliensis ATCC 700358のバリアントACAR遺伝子の一例の塩基配列を配列番号19に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号20に示す。
dia brasiliensisのPPT、Nocardia farcinica IFM10152のPPT(J. Biol. Chem. 2007, Vol. 282, No.1, pp.478-485)、Corynebacterium glutamicumのPPT(App. Env. Microbiol. 2009, Vol.75, No.9, pp.2765-2774)も挙げられる。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032株のPPT遺伝子の塩基配列を配列番号23に、同遺伝子がコードするPPTのアミノ酸配列を配列番号24に、それぞれ示す。
sulfoxide)、ヘルシニル-L-システインスルホキシド(hercynyl-L-cysteine sulfoxide)、およびエルゴチオネインへと変換され得る。また、ヘルシニンは、egt1遺伝子にコードされるEgt1タンパク質の作用により、ヘルシニル-L-システインスルホキシドへと変換され得る。すなわち、L-ヒスチジンからエルゴチオネインへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、EgtDは、SAMをメチル基供与体としてヒスチジンをメチル化してヘルシニンを生成するSAM依存的ヒスチジン-N,N,N-メチルトランスフェラーゼ(S-adenosyl-l-methionine (SAM)-dependent histidine N,N,N-methyltransferase)である。
ylglutamate kinase;argB)、N-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(N-acetylglutamyl phosphate reductase;argC)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(acetylornithine transaminase;argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(acetylornithine deacetylase;argE)が挙げられる。L-アルギニン生合成酵素としては、上記例示したL-オルニチン生合成酵素や、カルバモイルリン酸シンターゼ(carbamoyl phosphate synthetase;carAB)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyl transferase;argF, argI)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argininosuccinate synthetase;argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase;argH)が挙げられる。L-アルギニンは、アルギニンデカルボキシラーゼ(arginine decarboxylase;speA;EC 4.1.1.19)の作用によりアグマチン(agmatine)へ、次いでアグマチンウレオヒドロラーゼ(agmatine ureohydrolase;speB;EC 3.5.3.11)の作用によりプトレシン(putrescine)へと変換され得る。また、L-オルニチンは、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase;speC;EC 4.1.1.17)の作用によりプトレシンへと変換され得る。プトレシンは、スペルミジンシンターゼ(spermidine synthase;speE;EC 2.5.1.16)の作用によりスペルミジンへ、次いでスペルミンシンターゼ(spermine synthase;EC 2.5.1.22)の作用によりスペルミンへと変換され得る。アグマチンは、また、アグマチン/トリアミンアミノプロピルトランスフェラーゼ(agmatine/triamine aminopropyl transferase)の作用によりアミノプロピルアグマチン(aminopropylagmatine)へ、次いでアミノプロピルアグマチンウレオヒドロラーゼ(aminopropylagmatine ureohydrolase)の作用によりスペルミジンへと変換され得る。すなわち、L-アルギニンまたはL-オルニチンからポリアミンへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、spermidine synthase、spermine synthase、およびagmatine/triamine aminopropyl transferaseは、いずれも、SAMの脱炭酸によって生じ得る脱炭酸SAM(decarboxylated S-adenosyl methionine;dcSAM)からプロピルアミン基を対応する基質へと転移する反応を触媒する。
しては、例えば、L-システイン生合成酵素や、L-システインからL-メチオニンへの変換を触媒する酵素も挙げられる。L-システイン生合成酵素としては、cysIXHDNYZ遺伝子、fpr2遺伝子、およびcysK遺伝子にそれぞれコードされる、CysIXHDNYZタンパク質、Fpr2タンパク質、CysKタンパク質が挙げられる。L-システインからL-メチオニンへの変換を触媒する酵素としては、シスタチオニン-γ-シンターゼ(cystathionine-gamma-synthase)やシスタチオニン-β-リアーゼ(cystathionine-beta-lyase)が挙げられる。
Env. Microbiol., 2009, Vol.75, p2765-2774.)。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、alcohol dehydrogenase(ADH)も挙げられる。また、バニリン生合成経路の中間体である3-デヒドロシキミ酸は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(shikimate dehydrogenase)の作用によりシキミ酸へと変換され得る。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、shikimate dehydrogenaseも挙げられる。
MG1655のaroE遺伝子の塩基配列を配列番号49に、同遺伝子がコードするAroEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
は数個の位置での1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述するNCgl2048遺伝子およびNCgl2048タンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
微生物は、NCgl2048タンパク質の活性が低下するように改変できる。具体的には、微生物は、NCgl2048タンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変できる。NCgl2048タンパク質の活性が低下するように微生物を改変することによって、同微生物の目的物質生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物を用いた目的物質の生産を増大させることができる。また、NCgl2048タンパク質の活性が低下するように微生物を改変することによって、同微生物のSAMを生成または再生する能力を向上させることができ得る。すなわち、微生物の目的物質生産能の増大は、具体的には、同微生物のSAMを生成または再生する能力の増大によるものであってもよい。
失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異(mutant又はvariant)によって生じるものも含まれる。
ムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
ンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
っても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むDNA断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むDNA断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムDNAを鋳型とするPCRにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであってよい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有していてよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(いずれもタカラバイオ社より入手可)、pACYC184、pMW219(ニッポンジーン社)、pTrc99A(ファルマシア社)、pPROK系ベクター(クロンテック社)、pKK233‐2(クロンテック社)、pET系ベクター(ノバジェン社)、pQE系ベクター(キアゲン社)、pCold TF DNA(TaKaRa)、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド;pCRY30(特開平3-210184);pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX(特開平2-72876、米国特許5,185,262号);pCRY2およびpCRY3(特開平1-191686);pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844(特開昭58-192900);pCG1(特開昭57-134500);pCG2(特開昭58-35197);pCG4およびpCG11(特開昭57-183799);pVK7(特開平10-215883);pVK9(WO2007/046389);pVS7(WO2013/069634);pVC7(特開平9-070291)が挙げられる。
ていてもよい。また、2またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「2またはそれ以上の遺伝子を導入する」とは、例えば、2またはそれ以上のタンパク質(例えば、酵素)をそれぞれコードする遺伝子を導入すること、単一のタンパク質複合体(例えば、酵素複合体)を構成する2またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入すること、およびそれらの組み合わせを意味してよい。
るT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター(Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000))、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf(EF-Tu)プロモーター(Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.)、P2プロモーター(配列番号81の942-1034位)、P3プロモーター(配列番号84)、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters
in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
1988, 73, 227-235)。さらに、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が脱感作されるよう遺伝子またはタンパク質を宿主において変異させることにより、タンパク質の活性を増大させることができる。なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」(すなわちフィードバック阻害が低減又は解除されている)ことを「フィードバック阻害に耐性」ともいう。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の1若しくは数個の位置での1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、X線の照射、紫外線の照射、ならびにN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、およびメチルメタンスルフォネート(MMS)等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)。mRNAの量は、例えば、非改変株の、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
ば、非改変株の、1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
以下に、NCgl2048タンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ(SD)配列(リボソーム結合部位(RBS)ともいう)、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、1塩基以上、2塩基以上、または3塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味してよい。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。より弱いプロモーターとしては、例えば、P4プロモーター(配列番号82の872-969位)やP8プロモーター(配列番号83の901-1046位)も挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下(例えば、誘導物質の非存在下)でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子(誘導物質、阻害物質など)、タンパク質(転写因子など)、核酸(siRNAなど)等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、本明細書に記載するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化し得る。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の微生物を利用して目的物質を製造する方法である。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物の発酵により製造することができる。すなわち、本明細書に記載の方法の一態様は、微生物の発酵により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、本明細書に記載の微生物の発酵により目的物質を製造する工程を、「発酵工程」ともいう。
そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および/または濃度の異なる2種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および/または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物を利用した生物変換により製造することもできる。すなわち、本明細書に記載の方法の別の態様は、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。
とができる。より具体的には、生物変換工程において、目的物質は、微生物を利用して該目的物質の前駆体を該目的物質に変換することにより製造することができる。すなわち、生物変換工程は、微生物を利用して目的物質の前駆体を該目的物質に変換する工程であってよい。
50-89592号公報)や、3-ジヒドロシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されたエシェリヒア(Escherichia)属またはクレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌を用いてグルコースを炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法(米国特許第5,272,073号明細書)が挙げられる。また、プロトカテクアルデヒドは、プロトカテク酸を前駆体として、ACARを利用した酵素法またはACARを有する微生物を利用した生物変換法により製造することができる。製造された前駆体は、そのまま、あるいは、適宜、濃縮、希釈、乾燥、溶解、分画、抽出、精製等の処理に供してから、生物変換法に利用できる。すなわち、前駆体としては、例えば、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、前駆体を含有する素材を用いてもよい。前駆体を含有する素材は、微生物が前駆体を利用できる限り特に制限されない。前駆体を含有する素材として、具体的には、例えば、前駆体生産能を有する微生物を培養して得られた培養液、該培養液から分離した培養上清、それらの濃縮物(例えば、濃縮液)や乾燥物等の処理物が挙げられる。
開始」)は、本培養についてのものとして読み替えることができる。
ることにより、変換反応を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体(水性溶媒)が挙げられる。
g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。反応液中の菌体の濃度は、例えば、600nmにおける光学密度(OD)に換算して、1以上であってもよく、300以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。
成または再生する方法としては、例えば、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法(Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997))、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法(Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005))、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29:789-790 (1988))、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988))が挙げられる。
本明細書に記載の微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)目的物質が製造される場合、製造された目的物質をさらに他の目的物質に変換することができる。すなわち、本発明は、微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)第1の目的物質(すなわち、目的物質A)を製造する工程、および製造された第1の目的物質Aを第2の目的物質(すなわち、目的物質B)に変換する工程を含む、第2の目的物質Bを製造する方法を提供する。
ニリンが生成したことの確認やバニリンの回収は、いずれも、上述した発酵法と同様に実施することができる。すなわち、バニリン製造法は、さらに、反応液からバニリンを回収する工程を含んでいてよい。尚、回収されるバニリンは、バニリン以外に、例えば、微生物菌体、培地成分、反応液成分、ACAR、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。回収されたバニリンの純度は、例えば、30%(w/w)以上、50%(w/w)以上、70%(w/w)以上、80%(w/w)以上、90%(w/w)以上、または95%(w/w)以上であってよい。
コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。バニリン酸からプロトカテク酸への変換反応は、バニリン酸デメチラーゼにより触媒される。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれバニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードし、vanAB遺伝子とvanABKオペロンを構成している(M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865)。よって、まず、vanABKオペロンを欠損させることにより、C.
glutamicum 2256株からバニリンやバニリン酸等の目的物質の資化能を欠損した株(FKS0165株)を構築した。手順を以下に示す。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号51および52の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号53および54の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号52および53は一部が相補的な配列となっている。次にvanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびvanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをp
BS4SΔvanABK56と命名した。
上記で得られたpBS4SΔvanABK56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔvanABK56を電気パルス法にてC. glutamicum 2256株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地(グルコース 5 g/L、Polypeptone 10
g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 15 g/L、NaOHでpH7.5に調整)に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔvanABK56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のvanABK遺伝子群と欠損型のvanABK遺伝子群の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKS0165株を親株として、アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子であるNCgl0324遺伝子(adhC)、NCgl0313遺伝子(adhE)、NCgl2709遺伝子(adhA)を欠損した株(FKFC14株)を以下の手順で構築した。
<2-1-1>NCgl0324遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhCの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号57および58の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号59および60の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号58および59は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhCと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。
そこで、pBS4SΔ2256adhCを電気パルス法にてC. glutamicum FKS0165株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhCが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0324遺伝子と欠損型のNCgl0324遺伝子の両方を有する。
<2-2-1>NCgl0313遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhEの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号63および64の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号65および66の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号64および65は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhEと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhEはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhEを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC5株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhEが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0313遺伝子と欠損型のNCgl0313遺伝子の両方を有する。
<2-3-1>NCgl2709遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhAの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号69および70の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号71および72の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物
を得た。配列番号70および71は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhAと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhAを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC11株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl2709遺伝子と欠損型のNCgl2709遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14株を親株として、プロトカテク酸ジオキシゲナーゼαサブユニットおよびβサブユニットをコードするNCgl2314遺伝子(pcaG)およびNCgl2315遺伝子(pcaH)を欠損したFKFC14ΔpcaGH株を外注により構築した。FKFC14ΔpcaGH株は、以下の手順でも構築することができる。
pcaG遺伝子とpcaH遺伝子は隣接しており、まとめて欠損させることが可能である。C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号75および76の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号77および78の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物を得る。配列番号76および77は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物およびNCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256pcaGHと命名する。
上記で得られたpBS4SΔ2256pcaGHはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を
含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256pcaGHを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256pcaGHが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。該1回組換え株は、野生型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子と、欠損型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14ΔpcaGH株を親株として、NCgl2048遺伝子のプロモーター領域がP8プロモーターに置換されたAp1_0112株を外注により構築した。同株におけるP8プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号83(901-1046位がP8プロモーターに相当)に示す。Ap1_0112株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号85および86の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C.
glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号87および88の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P8プロモーター領域を含む配列番号89のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号89のDNA断片を鋳型として、配列番号90および91の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P8プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号86および90は一部が相補的な配列となっている。配列番号87および91は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP8プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP8::NCgl2048と命名する。
上記で得られたpBS4SP8::NCgl2048はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP8::NCgl2048を電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP8::NCgl2048が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
純化する。純化した株よりゲノムDNAを調製し、シーケンス解析によりNCgl2048遺伝子上流にP8プロモーターが存在することを確認し、該株をAp1_0112株とする。
<5-1>プラスミドpEPlac-COMT2の構築
Homo sapiensのOMT遺伝子には2種のOMTアイソフォーム(すなわち、短いOMTアイソフォーム(S-COMT)と長いOMTアイソフォーム(MB-COMT))が知られている。S-COMTのアミノ酸配列を配列番号16に、S-COMTをコードする野生型cDNAの塩基配列を配列番号94に、それぞれ示す。S-COMTの野生型cDNAをEscherichia coli(E. coli)での発現用にコドン最適化し、ATG Service Gen(Russian Federation, Saint-Petersburg)のサービスを利用して化学合成した。後のクローニングを容易にするため、遺伝子のDNA断片は、3’末端および5’末端にそれぞれNdeIおよびSacIの制限酵素サイトを付加して合成した。このコドン最適化されたS-COMTのcDNAを「COMT2遺伝子」ともいう。COMT2遺伝子を含む合成されたDNA断片の塩基配列を配列番号95に示す。COMT2遺伝子を含む合成されたDNA断片は、pUC57ベクター(GenScript)に挿入された状態で得た。
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rded.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)に塗布し、37℃で一晩培養した。得られたコロニーをPCR解析により試験し、要求されるクローンを選択した。COMT2遺伝子を含むコロニーの選択には、プライマーP1およびP2(配列番号97および98)を利用した。ベクター特異的プライマーP1とCOMT2遺伝子の末端用のリバースプライマーP2を用いることにより、713 bpのDNA断片が得られた。こうして、ベクターpEPlac-COMT2を構築した。クローニングされたCOMT2遺伝子の配列は、プライマーP1およびP3(配列番号97および99)を利用して決定した。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号100および101の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、cspB遺伝子のプロモーター領域とSD配列を含むPCR産物を得た。一方、プラスミドpEPlac-COMT2を鋳型として、配列番号102および103の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、COMT2遺伝子を含むPCR産物を得た。次に、これらの断片をIn Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpVK9ベクター(WO2007/046389)に挿入した。なお、pVK9はコリネ型細菌とE. coliのシャトル
ベクターである。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン25μg/mLを含有するLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVK9::PcspB-hsomtと命名した。
プラスミドpVK9::PcspB-hsomtを有するC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株を外注により構築した。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地4 mLを含む試験管に接種し、前培養として31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地50 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で20時間振とう培養を行った。得られた培養液を8000 rpmで5分間遠心し、上清を除去し、菌体を滅菌生理食塩水に懸濁した。菌体懸濁液の光学密度(OD)を測定し、600 nmでのODが50になるように生理食塩水で菌体懸濁液を希釈した。希釈した菌体懸濁液5 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地(グルコース 75 g/L、MgSO4・7H2O 0.6 g/L、(NH4)2SO4 6.3 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、FeSO4・7H2O 12.5 mg/L、MnSO4・4-5H2O 12.5 mg/L、Yeast Extract 2.5 g/L、Vitamin B1 150μg/L、Biotin 150μg/L、プロトカテク酸 6.9 g/L、KOHでpH7に調整後、CaCO3 37.5 g/L(180℃で3時間乾熱滅菌したもの)と混合)20 mLを含むバッフル付き三角フラスコに接種し、31.5℃で24時間振とう培養を行った。
UPLC分析条件
カラム:KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex)
オーブン温度: 40 ℃
移動相(A):0.1% トリフルオロ酢酸
移動相(B):0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %):(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速:1.5 mL/min
次いで、FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株におけるNCgl2048遺伝子の発現量を定量PCRにより解析した。
FKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株およびAp1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株について実施例<7>で培養開始から5時間後に取得した250μLの菌体を含む培養液を500μLのRNA Protect Bacteria Reagent(QIAGEN)と混合し、-80℃に一旦保存した。凍結混合物を室温で融解後、リゾチームを含有する200μLのTE緩衝液(10mM トリス、1mM EDTA、pH8.0)お
よび10μLのプロテアーゼK(20mg/mL)を添加して混合した後、室温で40分間インキュベートした。この後の作業はRNeasy Mini Kit(QIAGEN)を用いて実施した。処理物に1%2-メルカプトエタノールを含有するRLT緩衝液を700μL添加して混合し、遠心して上清を得た。上清に500μLのエタノールを添加して混合し、キット付属のカラムにアプライし、カラムを遠心した。カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄後、80μLのDNaseI溶液をカラムにアプライし、室温で15分間DNase処理を実施した。さらに、カラムを350μLのRW1緩衝液で洗浄し、500μLのRPE緩衝液で2回洗浄した後、RNaseフリーの滅菌水で溶出し、RNAを取た。得られたRNAをNanoDrop(Thermo Fisher Scientific)を用いて定量し、BioAnalyer(Agilent Technologies)とRNA 6000 Nano Kit(Agilent Technologies)を用いた電気泳動により分析し、得られたRNAが十分な純度であることを確認した。
逆転写には、PrimeScript RT Reatent Kit with gDNA Eraser(タカラバイオ)を用いた。RNA 1μgに1μLのgDNA Eraser、2μLの5×DNA Eraser Bufferを添加し、滅菌水で総量10μLにした後、42℃で2分間インキュベートし、染色体DNAを分解した。反応液に4μLの5×PrimeScript Buffer2、1μLのPrimeScript RT Emzyme MixI、1μLのRT Primer Mix、および4μLの滅菌水を加え、37℃で15分および85℃で5秒インキュベートし、cDNAを取た。
目的遺伝子としてNCgl2048遺伝子を以下の手順によりcDNAから増幅した:2μLのcDNA、10μLのPower SYBR Green PCR Master Mix(Life Technologies)、配列番号104と105のプライマー(それぞれ終濃度500nM)、および滅菌水を混合して総量20μLにした;7000 Real Time PCR(Applied Bio Systems)を用いてPCR(95℃で10分変性後、95℃で15秒および60℃で1分を40サイクル)を実施した。加えて、ハウスキーピング遺伝子として16SリボソーマルRNA遺伝子を、目的遺伝子の増幅と同一の手順(ただし、32倍希釈したcDNA2μLを鋳型とし、配列番号106と107のプライマーを用いた)によりcDNAから増幅した。増幅反応後、PCR産物を乖離曲線分析に供し、均一性を確認した。さらに、PCR産物をアガロース電気泳動により分析し、使用したプライマーで得られる長さであることを確認した。
NCgl2048遺伝子の発現量の解析には、ΔΔCt法(METHODS, 25, 402(2001))を用いた。NCgl2048遺伝子のCt値からハウスキーピング遺伝子のCt値を引いた値をΔCt値とした。ただし、ハウスキーピング遺伝子の増幅には32倍希釈(すなわち25倍希釈)したcDNAを用いたため、ハウスキーピング遺伝子のCt値としては、測定したハウスキーピング遺伝子のCt値に5を足した値を用いた。Ap1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株のΔCt値からFKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株のΔCt値を引いた値をΔΔCt値とした。Ap1_0112/pVK9::PcspB-hsomt株におけるNCgl2048遺伝子のFKFC14ΔpcaGH/pVK9::PcspB-hsomt株に対する相対発現量を、2-ΔΔCtとして算出した。
配列番号1:Escherichia coli MG1655のaroG遺伝子の塩基配列
配列番号2:Escherichia coli MG1655のAroGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Escherichia coli MG1655のaroB遺伝子の塩基配列
配列番号4:Escherichia coli MG1655のAroBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli MG1655のaroD遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli MG1655のAroDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:Bacillus thuringiensis BMB171のasbF遺伝子の塩基配列
配列番号8:Bacillus thuringiensis BMB171のAsbFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:Escherichia coli MG1655のtyrR遺伝子の塩基配列
配列番号10:Escherichia coli MG1655のTyrRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11~14:Homo sapiensのOMT遺伝子の転写バリアント1~4の塩基配列
配列番号15:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(MB-COMT)のアミノ酸配列
配列番号16:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(S-COMT)のアミノ酸配列
配列番号17:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号18:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号20:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Escherichia coli MG1655のentD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Escherichia coli MG1655のEntDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPT遺伝子の塩基配列
配列番号24:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPTタンパク質のアミノ酸配列配列番号25:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanK遺伝子の塩基配列配列番号26:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpcaK遺伝子の塩基配列配列番号28:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPcaKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanA遺伝子の塩基配列配列番号30:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanB遺伝子の塩基配列配列番号32:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaG遺伝子の塩基配列
配列番号34:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaH遺伝子の塩基配列
配列番号36:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Escherichia coli MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Escherichia coli MG1655のYqhDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324遺伝子の塩基配列
配列番号40:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324タンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313遺伝子の塩基配列
配列番号42:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313タンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709遺伝子の塩基配列
配列番号44:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709タンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219遺伝子の塩基配列
配列番号46:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219タンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382遺伝子の塩基配列
配列番号48:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382タンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Escherichia coli MG1655のaroE遺伝子の塩基配列
配列番号50:Escherichia coli MG1655のAroEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51~80:プライマー
配列番号81:P2プロモーターを含む塩基配列
配列番号82:P4プロモーターを含む塩基配列
配列番号83:P8プロモーターを含む塩基配列
配列番号84:P3プロモーターを含む塩基配列
配列番号85~88:プライマー
配列番号89:P8プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号90~91:プライマー
配列番号92:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048遺伝子の塩基配列
配列番号93:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048タンパク質のアミノ酸配列
配列番号94:Homo sapiensのS-COMTをコードするcDNAの塩基配列
配列番号95:COMT2遺伝子を含む合成DNA断片の塩基配列
配列番号96:pELACベクター
配列番号97~107:プライマー
Claims (16)
- 目的物質の製造方法であって、
以下の工程:目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造することを含み、
前記微生物が、NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質の活性が、該NCgl2048遺伝子のプロモーターを誘導型のプロモーター、P4プロモーター、またはP8プロモーターに置換することによって該NCgl2048遺伝子の発現を弱化させること、または該NCgl2048遺伝子を破壊することにより低下しており、
前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌であり、
前記目的物質が、バニリン酸であり、
前記NCgl2048遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法:
(a)配列番号93に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号93に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、微生物において活性を低下させることにより目的物質の生産が増大する性質を有するタンパク質;および
(c)配列番号93に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、微生物において活性を低下させることにより目的物質の生産が増大する性質を有するタンパク質。 - 前記製造が、炭素源を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記製造が、前記微生物を利用して前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記変換が、前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させることを含む、請求項3に記載の方法。
- 前記菌体が、前記微生物の培養液に含まれる菌体、該培養液から回収された菌体、該培養液の処理物に含まれる菌体、該回収された菌体の処理物に含まれる菌体、またはそれらの組み合わせである、請求項5に記載の方法。
- 前記前駆体が、プロトカテク酸である、請求項3~6のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記目的物質を回収することを含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質の生合成に関与する酵素が、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- バニリンの製造方法であって、
請求項1~14のいずれか1項に記載の方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項15に記載の方法。
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