JP7318199B2 - 目的物質の製造方法 - Google Patents
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Description
目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、S-アデノシルメチオニンサイクル酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記S-アデノシルメチオニンサイクル酵素が、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、
前記目的物質が、下記からなる群より選択され:
(X)生合成にS-アデノシルメチオニンを要求する代謝物;
(Y)L-メチオニン;および
(Z)それらの組み合わせ、
ただし、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼの活性のみが増大する場合は、前記目的物質が前記代謝物(X)から選択される、方法を提供することである。
にコードされ、前記メチオニンシンターゼがmetH遺伝子および/またはmetE遺伝子にコードされ、前記5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼがmetF遺伝子にコードされる、前記方法を提供することである。
前記metK遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(1a)配列番号162に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1b)配列番号162に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(1c)配列番号162に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;
前記metH遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(2a)配列番号168または170に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2b)配列番号168または170に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;および
(2c)配列番号168または170に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;
前記metE遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(3a)配列番号166に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3b)配列番号166に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;および
(3c)配列番号166に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;
前記metF遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法を提供することである:
(4a)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;(4b)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するタンパク質;および
(4c)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するタンパク質。
細菌である、前記方法を提供することである。
前記方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法を提供することである。
本明細書に記載の微生物は、SAMサイクル酵素の活性が増大するように改変された、目的物質を生産する能力を有する微生物である。目的物質を生産する能力を、「目的物質生産能」ともいう。
「目的物質生産能を有する微生物」とは、目的物質を生産することができる微生物を意味してよい。
に蓄積することができる微生物を意味してよい。
ない。微生物としては、細菌や酵母が挙げられる。
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.)に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株(ATCC 27325)やMG1655株(ATCC 47076)等のエシェリヒア・コリK-12株;エシェリヒア・コリK5株(ATCC 23506);BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株;およびそれらの派生株が挙げられる。
ナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された(Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345(1989))。パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も包含されてよい。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)
コリネバクテリウム・アルカノリティカム(Corynebacterium alkanolyticum)
コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)
コリネバクテリウム・クレナタム(Corynebacterium crenatum)
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)
コリネバクテリウム・リリウム(Corynebacterium lilium)
コリネバクテリウム・メラセコーラ(Corynebacterium melassecola)
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシエンス)(Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
コリネバクテリウム・ハーキュリス(Corynebacterium herculis)
ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)(Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum))
ブレビバクテリウム・ロゼウム(Brevibacterium roseum)
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム(Brevibacterium saccharolyticum)
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス(Brevibacterium thiogenitalis)
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテリウム・スタティオニス)(Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis))
ブレビバクテリウム・アルバム(Brevibacterium album)
ブレビバクテリウム・セリナム(Brevibacterium cerinum)
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Americaまたはatcc.org)より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る(atcc.org/参照)。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
素を、「目的物質生合成酵素」ともいう。よって、微生物は、目的物質生合成酵素を有していてよい。言い換えると、微生物は、目的物質生合成酵素をコードする遺伝子を有していてよい。そのような遺伝子を、「目的物質生合成遺伝子」ともいう。微生物は、本来的に目的物質生合成遺伝子を有するものであってもよく、目的物質生合成遺伝子が導入されたものであってもよい。遺伝子を導入する手法については本明細書に記載する。
測定することにより、測定できる。
coli K-12 MG1655株のaroB遺伝子の塩基配列を配列番号3に、同遺伝子がコードするAroBタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4に示す。
dehydrataseとしては、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。3-dehydroquinate dehydrataseとして、具体的には、E. coliのAroDタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のaroD遺伝子の塩基配列を配列番号5に、同遺伝子がコードするAroDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号6に示す。
dehydratase等)をコードする遺伝子の発現は、tyrR遺伝子にコードされるチロシンリプレッサーTyrRにより抑制される。よって、シキミ酸経路の酵素の活性は、チロシンリプレッサーTyrRの活性を低下させることによっても、増大させることができる。チロシンリプレッサーTyrRとしては、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。チロシンリプレッサーTyrRとして、具体的には、E. coliのT
yrRタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655株のtyrR遺伝子の塩基配列を配列番号9に、同遺伝子がコードするTyrRタンパク質のアミノ酸配列を配列番号10に示す。
トカテクアルデヒドからバニリンを選択的に生成する」とは、OMTをプロトカテクアルデヒドに作用させた際に、例えば、モル比で、イソバニリンの3倍以上、5倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、または30倍以上のバニリンを生成することを意味してよい。また、「プロトカテクアルデヒドからバニリンを選択的に生成する」とは、OMTをプロトカテクアルデヒドに作用させた際に、例えば、モル比で、バニリンとイソバニリンの総量に対して、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、または95%以上のバニリンを生成することを意味してもよい。この比率、すなわちバニリンとイソバニリンの総量に対するバニリンの量を、「Vn/(Vn+iVn)比」ともいう。メタ位の水酸基のメチル化を選択的に触媒するOMTとしては、本明細書に記載の「特定の変異」を有するOMTが挙げられる。
or positive side-chain charge at pH 7.4)に置換される変異が挙げられる。変異型OMTは、これらの変異のいずれか一方を有していてもよく、両方を有していてもよい。
Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyrから選択されるアミノ酸残基が挙げられ、さらに特には、Tyrが挙げられる。
Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Valが挙げられる。「pH7.4において側鎖が無電荷または正電荷となるアミノ酸残基」としては、特に、AlaまたはGlnが挙げられる。
99」は、それぞれ、通常はロイシン残基およびグルタミン酸残基であるが、そうでなくてもよい。すなわち、「特定の変異」には、「L198」および「E199」がそれぞれロイシン残基およびグルタミン酸残基でない場合に、当該アミノ酸残基を上述した変異後のアミノ酸残基に置換する変異も包含されてよい。
al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991;Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987)。
おいて、これらの変異は、それぞれ、「配列番号131に示すアミノ酸配列における当該変異に相当する変異」を示す。「配列番号131に示すアミノ酸配列におけるX位のアミノ酸残基における変異に相当する変異」とは、「配列番号131に示すアミノ酸配列におけるX位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基における変異」と読み替えるものとする。すなわち、例えば、任意の野生型OMTにおいて、「D21Y」とは、配列番号131に示すアミノ酸配列における21位のD(Asp)残基に相当するアミノ酸残基がY(Tyr)残基に置換される変異を示す。
T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987))が挙げられる。
sp.、Neurospora sp.等の各種微生物のACARが挙げられる(J. Biol. Chem. 2007, Vol. 282, No.1, p478-485)。Nocardia sp. NRRL 5646株は、Nocardia iowensisに分類されている。ACARとしては、さらに、Nocardia brasiliensisやNocardia vulneris等の、他のNocardia属細菌のACARも挙げられる。Nocardia brasiliensis ATCC 700358株のACAR遺伝子の塩基配列を配列番号17に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号18に示す。また、Nocardia brasiliensis ATCC 700358株のバリアントACAR遺伝子の一例の塩基配列を配列番号19に、同遺伝子がコードするACARのアミノ酸配列を配列番号20に示す。
酸配列を配列番号24に、それぞれ示す。
sulfoxide)、ヘルシニル-L-システインスルホキシド(hercynyl-L-cysteine sulfoxide)、およびエルゴチオネインへと変換され得る。また、ヘルシニンは、egt1遺伝子にコードされるEgt1タンパク質の作用により、ヘルシニル-L-システインスルホキシドへと変換され得る。すなわち、L-ヒスチジンからエルゴチオネインへの変換を触媒する酵
素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、EgtDは、SAMをメチル基供与体としてヒスチジンをメチル化してヘルシニンを生成するSAM依存的ヒスチジン-N,N,N-メチルトランスフェラーゼ(S-adenosyl-l-methionine (SAM)-dependent histidine N,N,N-methyltransferase)である。
たL-オルニチン生合成酵素や、カルバモイルリン酸シンターゼ(carbamoyl phosphate synthetase;carAB)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ(ornithine carbamoyl transferase;argF, argI)、アルギニノコハク酸シンターゼ(argininosuccinate synthetase;argG)、アルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase;argH)が挙げられる。L-アルギニンは、アルギニンデカルボキシラーゼ(arginine decarboxylase;speA;EC 4.1.1.19)の作用によりアグマチン(agmatine)へ、次いでアグマチンウレオヒドロラーゼ(agmatine ureohydrolase;speB;EC 3.5.3.11)の作用によりプトレシン(putrescine)へと変換され得る。また、L-オルニチンは、オルニチンデカルボキシラーゼ(ornithine decarboxylase;speC;EC 4.1.1.17)の作用によりプトレシンへと変換され得る。プトレシンは、スペルミジンシンターゼ(spermidine synthase;speE;EC 2.5.1.16)の作用によりスペルミジンへ、次いでスペルミンシンターゼ(spermine synthase;EC 2.5.1.22)の作用によりスペルミンへと変換され得る。アグマチンは、また、アグマチン/トリアミンアミノプロピルトランスフェラーゼ(agmatine/triamine aminopropyl transferase)の作用によりアミノプロピルアグマチン(aminopropylagmatine)へ、次いでアミノプロピルアグマチンウレオヒドロラーゼ(aminopropylagmatine ureohydrolase)の作用によりスペルミジンへと変換され得る。すなわち、L-アルギニンまたはL-オルニチンからポリアミンへの変換を触媒する酵素としては、これらの酵素が挙げられる。なお、spermidine synthase、spermine synthase、およびagmatine/triamine aminopropyl transferaseは、いずれも、SAMの脱炭酸によって生じ得る脱炭酸SAM(decarboxylated S-adenosyl methionine;dcSAM)からプロピルアミン基を対応する基質へと転移する反応を触媒する。
ーゼ(cystathionine-gamma-synthase)やシスタチオニン-β-リアーゼ(cystathionine-beta-lyase)が挙げられる。
Env. Microbiol., 2009, Vol.75, p2765-2774.)。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、alcohol dehydrogenase(ADH)も挙げられる。また、バニリン生合成経路の中間体である3-デヒドロシキミ酸は、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(shikimate dehydrogenase)の作用によりシキミ酸へと変換され得る。すなわち、副生物生成酵素として、具体的には、shikimate dehydrogenaseも挙げられる。
ドする遺伝子を、「バニリン酸デメチラーゼ遺伝子」ともいう。バニリン酸デメチラーゼとしては、vanAB遺伝子にコードされるVanABタンパク質が挙げられる(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれ、バニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させる場合、例えば、vanAB遺伝子の両方を破壊等してもよく、片方のみを破壊等してもよい。C. glutamicum ATCC 13869株のvanAB遺伝子の塩基配列を配列番号29と31に、同遺伝子がコードするVanABタンパク質のアミノ酸配列を配列番号30と32に、それぞれ示す。なお、vanAB遺伝子は、通常、vanK遺伝子とvanABKオペロンを構成している。よって、バニリン酸デメチラーゼ活性を低下させるためにvanABKオペロンをまとめて破壊等(例えば、欠損)してもよい。その場合、改めて宿主にvanK遺伝子を導入してもよい。例えば、菌体外に存在するバニリン酸を利用する場合であって、vanABKオペロンをまとめて破壊等(例えば、欠損)した場合は、改めてvanK遺伝子を導入するのが好ましい。
質が挙げられる。yqhD遺伝子およびNCgl0324遺伝子は、いずれも、vanillyl alcohol dehydrogenaseをコードする。yqhD遺伝子は、例えば、E. coli等の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌に見出され得る。NCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子、NCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子は、例えば、C. glutamicum等のコリネ型細菌に見出され得る。E. coli K-12 MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列を配列番号37に、同遺伝子がコードするYqhDタンパク質のアミノ酸配列を配列番号38に示す。C. glutamicum ATCC 13869株のNCgl0324遺伝子、NCgl0313遺伝子、NCgl2709遺伝子の塩基配列を配列番号39、41、43に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号40、42、44に、それぞれ示す。また、C. glutamicum ATCC 13032株のNCgl0219遺伝子、NCgl2382遺伝子の塩基配列を配列番号45、47に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号46、48に、それぞれ示す。1種のADHの活性を低下させてもよく、2種またはそれ以上のADHの活性を低下させてもよい。例えば、NCgl0324タンパク質、NCgl2709タンパク質、およびNCgl0313タンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を低下させてよい。特に、少なくとも、NCgl0324タンパク質の活性を低下させてもよい。
MG1655のaroE遺伝子の塩基配列を配列番号49に、同遺伝子がコードするAroEタンパク質のアミノ酸配列を配列番号50に示す。
9、91、93、95、97、99、101、103に、それぞれ示す。1種のL-システイン生合成酵素の活性を増大させてもよく、2種またはそれ以上のL-システイン生合成酵素の活性を増大させてもよい。例えば、CysIXHDNYZタンパク質、Fpr2タンパク質、およびCysKタンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を増大させてもよく、CysIXHDNYZタンパク質およびFpr2タンパク質の内の1種またはそれ以上の活性を増大させてもよい。
活性を低下させる方法が挙げられる。
スフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼ(AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase)の活性を低下させる、又は、本明細書に記載の「特定の変異」を有するようにAICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseをコードする遺伝子を改変する方法が挙げられる。
記載する。AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseの活性は、例えば、AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseをコードする遺伝子の発現を弱化することにより、またはAICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseをコードする遺伝子を破壊することにより、低下させることができる。また、一態様においては、AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseの活性は、例えば、AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseをコードする遺伝子を「特定の変異」を有するように改変することにより、低下させることができる。このようなAICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolaseの活性を低下させる手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。
のいずれのアミノ酸残基であってもよい。改変後のアミノ酸残基として、具体的には、K(Lys)、R(Arg)、H(His)、A(Ala)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、G(Gly)、T(Thr)、P(Pro)、F(Phe)、W(Trp)、Y(Tyr)、C(Cys)、M(Met)、D(Asp)、E(Glu)、N(Asn)、Q(Gln)の内、改変前のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。改変後のアミノ酸残基としては、特に、F(Phe)が挙げられる。すなわち、「特定の変異」としては、特に、S37がFに置換される変異(S37F変異)が挙げられる。
組み合わせにより微生物の目的物質生産能が向上するように改変(例えば、破壊や欠損)されるものとする。例えば、生来の野生型AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子は、変異型AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子で置換されてもよく、変異型AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子の導入とは独立に破壊または欠損してもよい。あるいは、例えば、微生物の染色体等に存在する野生型AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子(例えば、生来の野生型AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子)に「特定の変異」を導入することにより、AICAR formyltransferase/IMP cyclohydrolase遺伝子が「特定の変異」を有するように微生物を改変することができる。変異は、例えば、自然変異、変異処理、または遺伝子工学により、染色体等に存在する遺伝子に導入することができる。
本明細に記載の微生物は、SAMサイクル酵素の活性が増大するように改変されている。微生物は、具体的には、非改変株と比較して、すなわち非改変微生物の株と比較して、SAMサイクル酵素の活性が増大するように改変されている。SAMサイクル酵素の活性が増大するように微生物を改変することによって、同微生物の目的物質生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物を用いた目的物質の生産を増大させることができる。また、SAMサイクル酵素の活性が増大するように微生物を改変することによって、同微生物のSAMを生成または再生する能力を向上させることができ得る。すなわち、微生物の目的物質生産能の増大は、具体的には、同微生物のSAMを生成または再生する能力の増大によるものであってもよい。
により、あるいはSAMサイクル酵素の活性の増大をもたらす改変と目的物質生産能を付与または増強するための他の改変との組み合わせにより、目的物質生産能を獲得したものであってもよい。微生物を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
reductaseであってもよい。そのような態様においては、S-adenosyl-L-homocysteine hydrolaseの活性が追加的に増大してもよい。1つのSAMサイクル酵素の活性が増大してもよく、2つまたはそれ以上のSAMサイクル酵素の活性が増大してもよい。
synthase活性」ともいう。methionine synthaseをコードする遺伝子を、「methionine synthase遺伝子」ともいう。methionine synthaseに利用されるメチル基供与体としては、5-メチルテトラヒドロプロピルモノ-L-グルタミン酸(5-methyltetrahydropteroyl-mono-L-glutamate(別名5-methyltetrahydrofolate;5-MTHF))や、5-メチルテトラヒドロプロピルトリ-L-グルタミン酸(5-methyltetrahydropteroyl-tri-L-glutamate)等のさらに2つのグルタミン酸残基を含むものが挙げられる。methionine synthaseとしては、metEおよびmetH遺伝子にそれぞれコードされるMetEおよびMetHタンパク質が挙げられる。MetEタンパク質は、ビタミンB12非依存的methionine synthase(vitamin-B12-independent methionine synthase)であってよい。MetHタンパク質は、ビタミンB12依存的methionine synthase(vitamin-B12-dependent methionine synthase)であってよい。MetEおよびMetHタンパク質等のmethionine synthaseとしては、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。methionine synthaseとして、具体的には、E. coliのMetEおよびMetHタンパク質が挙げられる。E. coli K-12 MG1655のmetEおよびmetH遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号165および167に、同遺伝子がコードするMetEおよびMetHタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号166および168に示す。C. glutamicum ATCC 13032株のmetH遺伝子(cg1701)の塩基配列を配列
番号169に、同遺伝子がコードするMetHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号170に示す。なお、Corynebacterium glutamicum等のコリネ型細菌は、E. coliのMetEおよびMetHタンパク質の両方に相同なタンパク質をコードするNCgl2048遺伝子を有する。NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質はデータベースによってはmethionine synthaseとアノテーションされている場合があるが、同タンパク質は本明細書に記載の「methionine synthase」からは除外されるものとする。
reductaseとしては、metF遺伝子にコードされるMetFタンパク質が挙げられる。電子供与体としては、NADHやNADPHが挙げられる。MetFタンパク質等の5,10-methylenetetrahydrofolate reductaseとしては、酵母、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の細菌、コリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。5,10-methylenetetrahydrofolate reductaseとして、具体的には、C. glutamicumやS. cerevisiaeのMetFタンパク質が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13869株のmetF遺伝子(NCgl2091)の塩基配列を配列番号183に、同遺伝子がコードするMetFタンパク質のアミノ酸配列を配列番号184に示す。S. cerevisiae S288c株のmetF遺伝子(MET13)の塩基配列を配列番号173に、同遺伝子がコードするMetFタンパク質のアミノ酸配列を配列番号174に示す。5,10-methylenetetrahydrofolate
reductaseとして、具体的には、実施例で用いたC. glutamicumの部分MetFタンパク質も挙げられる。この部分MetFタンパク質をコードする部分metF遺伝子の塩基配列を配列番号171に、この部分MetFタンパク質のアミノ酸配列を配列番号172に示す。「metF遺伝子」および「MetFタンパク質」とは、全長配列のものに限られず、これら部分metF遺伝子および部分MetFタンパク質も包含してよい。
AMサイクル酵素(例えば、SahH, MetE, MetH, MetK, およびMetFタンパク質)のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。上記遺伝子名で特定される遺伝子および上記タンパク質名で特定されるタンパク質には、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質に限られず、それらの保存的バリアントも包含されてよい。すなわち、例えば、「metK遺伝子(またはNCgl1541遺伝子)」という用語は、上記例示したmetK遺伝子(例えば、配列番号161に示す塩基配列を有する遺伝子)に加えて、それらの保存的バリアントを包含してよい。同様に、「MetKタンパク質(またはNCgl1541タンパク質)」という用語は、上記例示したMetKタンパク質(例えば、配列番号162に示すアミノ酸配列を有するタンパク質)に加えて、それらの保存的バリアントを包含してよい。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した遺伝子やタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
Mol Microbiol Biotechnol 2008, 15: 277-286)。
い。なお、本明細書に記載の他の全てのタンパク質についても、少なくとも1つの適切な条件下で測定される各活性を有していればよい。
3に示す塩基配列)から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子、例えばDNA、であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味してよい。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、または99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、1回、好ましくは2~3回洗浄する条件を挙げることができる。
スコア=50、ワード長=3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST(BLAST 2.0)を利用できる。また、PSI-BLASTを、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム(例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX)の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
以下に、SAMサイクル酵素等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
により、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むDNA断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムDNAを鋳型とするPCRにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであってよい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有していてよい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29(いずれもタカラバイオ社より入手可)、pACYC184、pMW219(ニッポンジーン社)、pTrc99A(ファルマシア社)、pPROK系ベクター(クロンテック社)、pKK233‐2(クロンテック社)、pET系ベクター(ノバジェン社)、pQE系ベクター(キアゲン社)、pCold TF DNA(TaKaRa)、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));pAM330(Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984));これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド;pCRY30(特開平3-210184);pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX(特開平2-72876、米国特許5,185,262号);pCRY2およびpCRY3(特開平1-191686);pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844(特開昭58-192900);pCG1(特開昭57-134500);pCG2(特開昭58-35197);pCG4およびpCG11(特開昭57-183799);pVK7(特開平10-215883);pVK9(WO2007/046389);pVS7(WO2013/069634);pVC7(特開平9-070291)が挙げられる。
のタンパク質(例えば、酵素)をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体(例えば、酵素複合体)を構成する2またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、またはそれらの組み合わせを導入してよい。
rAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター(Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679(2000))、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf(EF-Tu)プロモーター(Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.)、P2プロモーター(配列番号108の942-1034位)、P3プロモーター(配列番号111)、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる(国際公開第00/18935号)。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター(Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574)が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995))等に記載されている。
1988, 73, 227-235)。さらに、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
せることができる。なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」(すなわちフィードバック阻害が低減又は解除されている)ことを「フィードバック阻害に耐性」ともいう。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の1若しくは数個の位置での1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び/又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、X線の照射、紫外線の照射、ならびにN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(MNNG)、エチルメタンスルフォネート(EMS)、およびメチルメタンスルフォネート(MMS)等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
倍以上、1.5倍以上、2倍以上、または3倍以上に上昇してよい。
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
ボソーム結合部位(RBS)ともいう)、RBSと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、1塩基以上、2塩基以上、または3塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味してよい。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。より弱いプロモーターとしては、例えば、P4プロモーター(配列番号109の872-969位)やP8プロモーター(配列番号110の901-1046位)も挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下(例えば、誘導物質の非存在下)でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子(誘導物質、阻害物質など)、タンパク質(転写因子など)、核酸(siRNAなど)等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、本明細書に記載するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の微生物を利用して目的物質を製造する方法である。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物の発酵により製造することができる。すなわち、本明細書に記載の方法の一態様は、微生物の発酵により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、微生物の発酵により目的物質を製造する工程を、「発酵工程」ともいう。
有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および/または濃度の異なる2種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および/または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
目的物質は、例えば、本明細書に記載の微生物を利用した生物変換により製造することもできる。すなわち、本明細書に記載の方法の別の態様は、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また、微生物を利用した生物変換により目的物質を製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。
um)属に属する細菌を用いて酢酸を炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法(特開昭50-89592号公報)や、3-ジヒドロシキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が導入されたエシェリヒア(Escherichia)属またはクレブシエラ(Klebsiella)属に属する細菌を用いてグルコースを炭素源としてプロトカテク酸を製造する方法(米国特許第5,272,073号明細書)が挙げられる。また、プロトカテクアルデヒドは、プロトカテク酸を前駆体として、ACARを利用した酵素法またはACARを有する微生物を利用した生物変換法により製造することができる。製造された前駆体は、そのまま、あるいは、適宜、濃縮、希釈、乾燥、溶解、分画、抽出、精製等の処理に供してから、生物変換法に利用できる。すなわち、前駆体としては、例えば、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、前駆体を含有する素材を用いてもよい。前駆体を含有する素材は、微生物が前駆体を利用できる限り特に制限されない。前駆体を含有する素材として、具体的には、例えば、前駆体生産能を有する微生物を培養して得られた培養液、該培養液から分離した培養上清、それらの濃縮物(例えば、濃縮液)や乾燥物等の処理物が挙げられる。
含有されていればよい。すなわち、前駆体は、種培養の期間には培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。このような場合、培養についての記載(例えば、「培養期間(培養の期間)」や「培養開始」)は、本培養についてのものとして読み替えることができる。
、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、微生物の菌体と前駆体とを混合することにより、変換反応を実施できる。変換反応は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体を充填したカラムに前駆体を含有する反応液を通液することにより、変換反応を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体(水性溶媒)が挙げられる。
代謝活性が維持されている場合、炭素源を利用して微生物の菌体内でATP、電子供与体、メチル基供与体等の成分を生成または再生することができる。例えば、具体的には、微生物はSAMを生成または再生する増強された能力を有していてもよく、同微生物により生成または再生されたSAMが変換反応に用いられてもよい。SAMの生成または再生は、SAMを生成または再生する他の手法との組み合わせによってさらに増強され得る。また、ATPを生成または再生する方法としては、例えば、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法(Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997))、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法(Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005))、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(C. Aug’e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29:789-790 (1988))、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法(Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988))が挙げられる。「或る成分を反応液に添加する」という場合の「成分」には、反応液中で生成または再生するものも包含されてよい。
本明細書に記載の微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)目的物質が製造される場合、製造された目的物質をさらに他の目的物質に変換することができる。すなわち、本発明は、微生物を利用して(すなわち発酵法または生物変換法により)第1の目的物質を製造する工程、および製造された第1の目的物質を第2の目的物質に変換する工程を含む、第2の目的物質を製造する方法を提供する。
する成分(例えば、微生物や酵素)がバニリン酸を利用できる限り特に制限されない。バニリン酸を含有する素材として、具体的には、例えば、バニリン酸を含有する培養液または反応液、該培養液または反応液から分離した上清、それらの濃縮物(例えば、濃縮液)や乾燥物等の処理物が挙げられる。
バニリンが生成する限り、特に制限されない。酵素反応は、例えば、酵素や微生物菌体(例えば、静止菌体)を利用した物質変換に用いられる通常の条件で実施することができる。バニリン製造法における酵素反応については、例えば、生物変換法の第2の態様における変換反応に関する記載を準用できる。
本実施例では、Corynebacterium glutamicum 2256株(ATCC 13869)を親株として、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ(methionine adenosyltransferase)をコードするNCgl1541遺伝子(metK)の発現が増強された株を構築し、構築した株を用いてバニリン酸生産を実施した。
コリネ型細菌において、バニリンは、バニリン→バニリン酸→プロトカテク酸の順に代謝され、資化されることが報告されている(Current Microbiology, 2005, Vol.51, p59-65)。バニリン酸からプロトカテク酸への変換反応は、バニリン酸デメチラーゼにより触媒される。vanA遺伝子およびvanB遺伝子は、それぞれバニリン酸デメチラーゼのサブユニットAおよびサブユニットBをコードする。vanK遺伝子は、バニリン酸取り込み系をコードし、vanAB遺伝子とvanABKオペロンを構成している(M. T. Chaudhry, et al., Microbiology, 2007. 153:857-865)。よって、まず、vanABKオペロンを欠損させることにより、C.
glutamicum 2256株からバニリンやバニリン酸等の目的物質の資化能を欠損した株(FKS0165株)を構築した。手順を以下に示す。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号51および52の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、vanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号53および54の合成DNA
をプライマーとしてPCRを行い、vanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号52および53は一部が相補的な配列となっている。次にvanA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびvanK遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地(Yeast Extract 5 g/L、tryptone 10 g/L、NaCl 10 g/L、寒天 15 g/L)に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔvanABK56と命名した。
上記で得られたpBS4SΔvanABK56はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔvanABK56を電気パルス法にてC. glutamicum 2256株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地(グルコース 5 g/L、Polypeptone 10
g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、大豆加水分解物 1.2 g/L、ビオチン 10μg/L、寒天 15 g/L、NaOHでpH7.5に調整)に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔvanABK56が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のvanABK遺伝子群と欠損型のvanABK遺伝子群の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKS0165株を親株として、アルコールデヒドロゲナーゼホモログ遺伝子であるNCgl0324遺伝子(adhC)、NCgl0313遺伝子(adhE)、NCgl2709遺伝子(adhA)を欠損した株(FKFC14株)を以下の手順で構築した。
<2-1-1>NCgl0324遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhCの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号57および58の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号59および60の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号58および59は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0324遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0324遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。
このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhCと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhCはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhCを電気パルス法にてC. glutamicum FKS0165株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhCが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0324遺伝子と欠損型のNCgl0324遺伝子の両方を有する。
<2-2-1>NCgl0313遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhEの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号63および64の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号65および66の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号64および65は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0313遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl0313遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhEと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhEはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhEを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC5株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhEが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl0313遺伝子と欠損型のNCgl0313遺伝子の両方を有する。
純化した。純化した株よりゲノムDNAを調製し、配列番号67および68の合成DNAをプライマーとしてPCRを行うことによってNCgl0313遺伝子の欠損を確認し、該株をFKFC11株とした。
<2-3-1>NCgl2709遺伝子欠損用プラスミドpBS4SΔ2256adhAの構築
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号69および70の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号71および72の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号70および71は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2709遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびNCgl2709遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256adhAと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256adhAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256adhAを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC11株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256adhAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のNCgl2709遺伝子と欠損型のNCgl2709遺伝子の両方を有する。
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14株を親株として、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼαサブユニットおよびβサブユニットをコードするNCgl2314遺伝子(pcaG)およびNCgl2315遺伝子(pcaH)を欠損したFKFC14ΔpcaGH株を外注により構築した。FKFC14ΔpcaGH株は、以下の手順でも構築することができる。
pcaG遺伝子とpcaH遺伝子は隣接しており、まとめて欠損させることが可能である。C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号75および76の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号77および78の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物を得る。配列番号76および77は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2315遺伝子の上流領域を含むPCR産物およびNCgl2314遺伝子の下流領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混
合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256pcaGHと命名する。
上記で得られたpBS4SΔ2256pcaGHはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256pcaGHを電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256pcaGHが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。該1回組換え株は、野生型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子と、欠損型のNCgl2314およびNCgl2315遺伝子の両方を有する。
<4-1>Ap1_0007株(FKFC14ΔpcaGH P2::NCgl0120株)の構築
次いで、Corynebacterium glutamicum FKFC14ΔpcaGH株を親株として、Crpファミリーの発現制御タンパク質をコードするNCgl0120遺伝子(cysR)のプロモーター領域がP2プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が増強されたAp1_0007株を外注により構築した。同株におけるP2プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号108(942-1034位がP2プロモーターに相当)に示す。Ap1_0007株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号81および82の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C.
glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号83および84の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P2プロモーター領域を含む配列番号85のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号85のDNA断片を鋳型として、配列番号86および87の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P2プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号82および86は一部が相補的な配列となっている。配列番号83および87は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0120遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0120遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP2プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質
転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP2::NCgl0120と命名する。
上記で得られたpBS4SP2::NCgl0120はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP2::NCgl0120を電気パルス法にてC. glutamicum FKFC14ΔpcaGH株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP2::NCgl0120が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Ap1_0007株を親株として、NCgl2048遺伝子のプロモーター領域がP8プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が弱化されたBp1_0112株を外注により構築した。同株におけるP8プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号110(901-1046位がP8プロモーターに相当)に示す。Bp1_0112株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号112および113の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号114および115の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P8プロモーター領域を含む配列番号116のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号116のDNA断片を鋳型として、配列番号117および118の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P8プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号113および117は一部が相補的な配列となっている。配列番号114および118は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl2048遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl2048遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP8プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG
100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP8::NCgl2048と命名する。
上記で得られたpBS4SP8::NCgl2048はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP8::NCgl2048を電気パルス法にてC. glutamicum Ap1_0007株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP8::NCgl2048が組み
込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Bp1_0112株を親株として、エノラーゼをコードするNCgl0935遺伝子(eno)のプロモーター領域がP4プロモーターに置換され、以て該遺伝子の発現が弱化されたDp2_0340株を外注により構築した。同株におけるP4プロモーターを含むゲノム領域の塩基配列を配列番号109(872-969位がP4プロモーターに相当)に示す。Dp2_0340株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号121および122の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0935遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号123および124の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0935遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P4プロモーターを含む配列番号125のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号125のDNA断片を鋳型として、配列番号126および127の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P4プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号122および126は一部が相補的な配列となっている。配列番号123および127は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0935遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0935遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP4プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP4::NCgl0935と命名する。
上記で得られたpBS4SP4::NCgl0935はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP4::NCgl0935を電気パルス法にてC. glutamicum Bp1_0112株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP4::NCgl0935が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Dp2_0340株を親株として、S-アデノシル-L-ホモシステインハイドロラーゼをコードするNCgl0719遺伝子(sahH)のプロモーター領域がP3プロモーターに置換されたEp2_0055株を外注により構築した。P3プロモーターの塩基配列を配列番号111に示す。Ep2_0055株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号138および139の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0719遺伝子の上流領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号140および141の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、NCgl0719遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、P3プロモーターを含む配列番号111のDNA断片を人工遺伝子合成によって得る。次に、配列番号111のDNA断片を鋳型として、配列番号142および143の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、P3プロモーターを含むPCR産物を得る。配列番号139および142は一部が相補的な配列となっている。配列番号140および143は一部が相補的な配列となっている。次に、NCgl0719遺伝子の上流領域を含むPCR産物、NCgl0719遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、およびP3プロモーターを含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクター(WO2007/046389)に挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SP3::NCgl0719と命名する。
上記で得られたpBS4SP3::NCgl0719はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SP3::NCgl0719を電気パルス法にてC. glutamicum Dp2_0340株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SP3::NCgl0719が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。
次いで、Corynebacterium glutamicum Ep2_0055株を親株として、L-セリンデアミナーゼをコードするNCgl1583遺伝子(sdaA)を欠損したEp2_0055ΔsdaA株を構築した。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号148および149の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sdaA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得た。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号150および151の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sdaA遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得た。配列番号149および150は一部が相補的な配列となっている。次に、sdaA遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物およびsdaA遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR
産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入した。このDNAを用いてEscherichia coli JM109のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256sdaAと命名した。
上記で得られたpBS4SΔ2256sdaAはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256sdaAを電気パルス法にてC. glutamicum Ep2_0055株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256sdaAが組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認した。該1回組換え株は、野生型のsdaA遺伝子と欠損型のsdaA遺伝子の両方を有する。
Corynebacterium glutamicum FKFC14ΔpcaGH株を親株として、UV照射による突然変異誘発によりFKFC14ΔpcaGH purH(S37F)株を構築した。次いで、Corynebacterium glutamicum Ep2_0055ΔsdaA株を親株として、FKFC14ΔpcaGH purH(S37F)のゲノムDNAを利用した遺伝子組み換えにより、Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)株を構築した。FKFC14ΔpcaGH purH(S37F)株およびEp2_0055ΔsdaA purH(S37F)株は、野生型purH遺伝子に代えて、変異型purH遺伝子であるpurH(S37F)遺伝子を保持する。purH(S37F)遺伝子は、37位のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換される変異を有するPurH(S37F)タンパク質をコードする。対応する野生型purH遺伝子の塩基配列を配列番号134に、対応する野生型PurHタンパク質のアミノ酸配列を配列番号135に示す。purH(S37F)遺伝子の塩基配列を配列番号136に、PurH(S37F)タンパク質のアミノ酸配列を配列番号137に示す。Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)株は、以下の手順でも構築することができる。
C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号154および155の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、purH遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物を得る。一方、C. glutamicum 2256株のゲノムDNAを鋳型として、配列番号156および157の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、purH遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物を得る。また、配列番号158のDNA断片を人工遺伝子合成により得る。配列番号155および158は一部が相補的な配列となっている。配列番号156および158は一部が相補的な配列となっている。次に、purH遺伝子のN末端側コード領域を含むPCR産物、配列番号158のDNA断片、およびpurH遺伝子のC末端側コード領域を含むPCR産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、In Fusion HD cloning kit(Clontech)を用いて、BamHIとPstIで処理をしたpBS4Sベクターに挿入する。このDNAを用いてEscherichia coli JM10
9のコンピテントセル(タカラバイオ)を形質転換し、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mL、およびカナマイシン40μg/mLを含有するLB寒天培地に塗布し、一晩培養する。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4SΔ2256purH(S37F)と命名する。
上記で得られたpBS4SΔ2256purH(S37F)はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えによりゲノムに組み込まれた株が形質転換体として出現する。そこで、pBS4SΔ2256purH(S37F)を電気パルス法にてC. glutamicum Ep2_0055ΔsdaA株に導入する。菌体を、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養する。生育してきた株について、相同組換えによってゲノム上にpBS4SΔ2256purH(S37F)が組み込まれた1回組換え株であることをPCRで確認する。該1回組換え株は、野生型のpurH遺伝子とS37F型のpurH遺伝子の両方を有する。
プラスミドpVK9::PcspB-omt312を外注により得た。プラスミドpVK9::PcspB-omt312は、C. glutamicumのコドン使用にコドン最適化されたNiastella koreensisの変異型OMT遺伝子を保有する。この変異型OMT遺伝子は、Niastella koreensisの野生型OMTに二重変異M36K/L67Fが導入された(具体的には、36位のメチオニン残基(M)がコドン変化(ATG→AAG)によりリジン残基(K)に置換され、且つ67位のロイシン残基(L)がコドン変化(TTG→TTT)によりフェニルアラニン残基(F)に置換された)変異型OMTをコードする。この変異型OMT遺伝子を「omt312遺伝子」、この変異型OMTを「OMT312」ともいう。プラスミドpVK9::PcspB-omt312は、以下の手順でも構築することができる。pVK9::PcspB-omt312の塩基配列を配列番号132(4880-5545位がomt312遺伝子に相当)に示す。OMT312のアミノ酸配列を配列番号133に示す。pVK9::PcspB-omt312は、人工遺伝子合成によっても構築できる。
プラスミドpVS7::Plac-metKは、C. glutamicum 2256株(ATCC 13869)のmetK遺伝子を保有する。metK遺伝子の塩基配列を配列番号161に、MetKタンパク質のアミノ酸配列を配列番号162に示す。プラスミドpVS7::Plac-metKは、以下の手順でも構築することができる。
のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得る。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpVS7::Plac-metKと命名する。
プラスミドpVK9::PcspB-omt312とpVS7ベクターの混合物、およびプラスミドpVK9::PcspB-omt312とプラスミドpVS7::Plac-metKの混合物を、それぞれ、電気パルス法にてC. glutamicum Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)株に導入した。菌体を、カナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン50μg/mLを含有するCM-Dex寒天培地に塗布し、31.5℃にて培養した。生育してきた株を、それぞれ、Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7株およびEp2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7::Plac-metK株と命名した。
Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7株およびEp2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7::Plac-metK株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン50μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地(グルコース 5 g/L、Polypeptone 10 g/L、Yeast Extract 10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4・7H2O 0.4 g/L、FeSO4・7H2O 0.01 g/L、MnSO4・7H2O 0.01 g/L、尿素 3 g/L、biotin 10μg/L、KOHでpH7.5に調整)0.5 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、前培養として30℃で16時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.1 mLを、カナマイシン25μg/mLおよびスペクチノマイシン50μg/mLを含有するバニリン酸生産培地(グルコース 75 g/L、MgSO4・7H2O 0.6 g/L、(NH4)2SO46.3 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、FeSO4・7H2O 12.5 mg/L、MnSO4・4-5H2O 12.5 mg/L、Yeast Extract 2.5 g/L、Vitamin B1 150μg/L、Biotin
150μg/L、プロトカテク酸 6.9 g/L、KOHでpH7に調整後、CaCO3 30 g/L(180℃で3時間乾熱滅菌したもの)と混合)0.4 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、30℃で24時間振とう培養を行った。
カラム:KINETEX 2.6μm XB-C18 150 x 30 mm (Phenomenex)
オーブン温度: 40 ℃
移動相(A):0.1% トリフルオロ酢酸
移動相(B):0.1% トリフルオロ酢酸/80% アセトニトリル
グラジエントプログラム (time, A %, B %):(0, 90, 10)→(3, 80, 20)
流速:1.5 mL/min
バニリン酸濃度が1.04倍に増加した。また、Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7::Plac-metK株では、Ep2_0055ΔsdaA purH(S37F)/pVK9::PcspB-omt312+pVS7株
と比較して、OD当たりのバニリン酸の生産性が1.03倍に増加した。
本実施例では、Corynebacterium glutamicum 2256株(ATCC 13869)を親株として、メチオニンシンターゼ(methionine synthase)をコードするmetE遺伝子の発現が増強された株を構築し、構築した株を用いてバニリン酸生産を実施した。
Corynebacterium glutamicum Ns1_0003株(同株は、purH(S37F)遺伝子を有すること以外はC. glutamicum Ep2_0055株と同一)を外注により得た。Ns1_0003株は、以下の手順でも構築することができる。
<2-1>プラスミドpZK1::PcspB-OMT312の構築
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のtcg0610ターミネーター配列の導入と既知のtn10トランスポゾンのターゲット配列の除去のため、pVK9::PcspB-omt312からpZK1::PcspB-OMT312を構築した。pVK9::PcspB-omt312を鋳型として、配列番号175および176の合成DNAをプライマーとしてPCRを実施した。PCR産物をT4 polynucleotide kinase(New England Biolabs)でリン酸化し、生じたリン酸化平滑末端をQuick Ligation Kit(New
England Biolabs)でセルフライゲーションした。ライゲーション混合物でEscherichia coli 10-beta competent cells(New England Biolabs)を形質転換した。形質転換細胞混合物を、カナマイシン25μg/mLを含有するLB寒天培地に播種し、一夜培養した。シング
ルコロニーを、カナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、一夜培養し、プラスミドを抽出した。サンガー法により配列解析してプラスミドの配列が想定した通りであることを確認し、正しい配列のプラスミドをpZK1::PcspB-OMT312と名付けた。
pZK1::PcspB-OMT312を鋳型として、配列番号177および178の合成DNAをプライマーとしてPCRを実施し、ベクター骨格を増幅した。配列番号179の合成DNA(cspBプロモーター、Escherichia coliのmetE遺伝子、およびCorynebacterium glutamicum ATCC 13032のターミネーターtcg0610を含む)を外注により得た。コドンバイアスは、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のコドン使用テーブルを用いた重み付けランダムセレクション(weighted random selections)により最適化した。この合成DNAを、Gibson Assembly
Cloning Kit(New England Biolabs)を用いて製造元のプロトコルに従ってベクター骨格にクローニングした。アセンブリー混合物(assembly mix)でEscherichia coli 10-beta competent cells(New England Biolabs)を形質転換した。形質転換細胞混合物を、カナマイシン25μg/mLを含有するLB寒天培地に播種し、一夜培養した。シングルコロニーを、カナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、一夜培養し、プラスミドを抽出した。サンガー法により配列解析してプラスミドの配列が想定した通りであることを確認し、正しい配列のプラスミドをpZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetE-ECと名付けた。
Corynebacterium glutamicumバニリン酸生産株Ns1_0003_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-omt312)およびPh2_0011_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetE-EC)を外注により得た。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
Ns1_0003_Rg株およびPh2_0011_Rg株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地0.5 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、前培養として30℃で16時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.1 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地0.4 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、30℃で24時間振とう培養を行った。
本実施例では、Corynebacterium glutamicum 2256株(ATCC 13869)を親株として、メチオニンシンターゼ(methionine synthase)をコードするmetH遺伝子の発現が増強された株を構築し、構築した株を用いてバニリン酸生産を実施した。
pZK1::PcspB-OMT312を鋳型として、配列番号177および178の合成DNAをプライマーとしてPCRを実施し、ベクター骨格を増幅した。配列番号180の合成DNA(cspBプロモーター、Corynebacterium glutamicumのmetH遺伝子(cg1701)、およびCorynebacterium glutamicum ATCC 13032のターミネーターtcg0610を含む)を外注により得た。コドンバイアスは、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のコドン使用テーブルを用いた重み付けランダムセレクション(weighted random selections)により最適化した。この合成DNAを、Gibson Assembly Cloning Kit(New England Biolabs)を用いて製造元のプロトコルに従ってベクター骨格にクローニングした。アセンブリー混合物(assembly mix)でEscherichia coli 10-beta competent cells(New England Biolabs)を形質転換した。形質転換細胞混合物を、カナマイシン25μg/mLを含有するLB寒天培地に播種し、一夜培養した。シングルコロニーを、カナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、一夜培養し、プラスミドを抽出した。サンガー法により配列解析してプラスミドの配列が想定した通りであることを確認し、正しい配列のプラスミドをpZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetH-CGと名付けた。
Corynebacterium glutamicumバニリン酸生産株Ns1_0003_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-omt312)およびPh2_0003_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetH-CG)を外注により得た。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
セロール水溶液0.8 mLと混合してグリセロールストックとし、-80℃で保存した。
Ns1_0003_Rg株およびPh2_0003_Rg株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地0.5 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、前培養として30℃で16時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.1 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地0.4 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、30℃で24時間振とう培養を行った。
本実施例では、Corynebacterium glutamicum 2256株(ATCC 13869)を親株として、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)をコードするmetF遺伝子の発現が増強された株を構築し、構築した株を用いてバニリン酸生産を実施した。
<1-1>プラスミドpZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetF-CGの構築
pZK1::PcspB-OMT312を鋳型として、配列番号177および178の合成DNAをプライマーとしてPCRを実施し、ベクター骨格を増幅した。配列番号181の合成DNA(cspBプロモーター、Corynebacterium glutamicumのmetF遺伝子(NCgl2091;部分配列)、およびCorynebacterium glutamicum ATCC 13032のターミネーターtcg0610を含む)を外注により得た。コドンバイアスは、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のコドン使用テーブルを用いた重み付けランダムセレクション(weighted random selections)により最適化した。このmetF遺伝子は、C. glutamicum ATCC 13869株のMetFタンパク質の部分アミノ酸配列である配列番号172のアミノ酸配列をコードする。この合成DNAを、Gibson Assembly C
loning Kit(New England Biolabs)を用いて製造元のプロトコルに従ってベクター骨格にクローニングした。アセンブリー混合物(assembly mix)でEscherichia coli 10-beta
competent cells(New England Biolabs)を形質転換した。形質転換細胞混合物を、カナマイシン25μg/mLを含有するLB寒天培地に播種し、一夜培養した。シングルコロニーを、カナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、一夜培養し、プラスミドを抽出した。サンガー法により配列解析してプラスミドの配列が想定した通りであることを確認し、正しい配列のプラスミドをpZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetF-CGと名付けた。
pZK1::PcspB-OMT312を鋳型として、配列番号177および178の合成DNAをプライマーとしてPCRを実施し、ベクター骨格を増幅した。配列番号182の合成DNA(cspBプロモーター、Saccharomyces cerevisiaeのmetF遺伝子(MET13)、およびCorynebacterium glutamicum ATCC 13032のターミネーターtcg0610を含む)を外注により得た。コドンバイアスは、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のコドン使用テーブルを用いた重み付けランダムセレクション(weighted random selections)により最適化した。この合成DNAを、Gibson Assembly Cloning Kit(New England Biolabs)を用いて製造元のプロトコルに従ってベクター骨格にクローニングした。アセンブリー混合物(assembly mix)でEscherichia coli 10-beta competent cells(New England Biolabs)を形質転換した。形質転換細胞混合物を、カナマイシン25μg/mLを含有するLB寒天培地に播種し、一夜培養した。シングルコロニーを、カナマイシンを含有するLB液体培地に接種し、一夜培養し、プラスミドを抽出した。サンガー法により配列解析してプラスミドの配列が想定した通りであることを確認し、正しい配列のプラスミドをpZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetF-SCと名付けた。
Corynebacterium glutamicumバニリン酸生産株Ns1_0003_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-omt312)、Ph2_0028_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetF-CG)、およびPh2_0009_Rg (Ns1_0003/pZK1::PcspB-OMT312-PmsrA-MetF-SC)を外注により得た。これらの株は、以下の手順でも構築することができる。
Ns1_0003_Rg株、Ph2_0028_Rg株、およびPh2_0009_Rg株のグリセロールストック5μLを、それぞれ、カナマイシン25μg/mLを含有するCM-Dex w/o mameno培地0.5 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、前培養として30℃で16時間振とう培養を行った。得られた前培養液0.1 mLを、カナマイシン25μg/mLを含有するバニリン酸生産培地0.4 mLを含む2.0 mL DEEP WELL PLATEに接種し、30℃で24時間振とう培養を行った。
はSpectra Max 190(Molecular Devices)により600 nmで測定した。
配列番号1:Escherichia coli MG1655のaroG遺伝子の塩基配列
配列番号2:Escherichia coli MG1655のAroGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Escherichia coli MG1655のaroB遺伝子の塩基配列
配列番号4:Escherichia coli MG1655のAroBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli MG1655のaroD遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli MG1655のAroDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7:Bacillus thuringiensis BMB171のasbF遺伝子の塩基配列
配列番号8:Bacillus thuringiensis BMB171のAsbFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号9:Escherichia coli MG1655のtyrR遺伝子の塩基配列
配列番号10:Escherichia coli MG1655のTyrRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号11~14:Homo sapiensのOMT遺伝子の転写バリアント1~4の塩基配列
配列番号15:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(MB-COMT)のアミノ酸配列
配列番号16:Homo sapiensのOMTアイソフォーム(S-COMT)のアミノ酸配列
配列番号17:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号18:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号19:Nocardia brasiliensisのACAR遺伝子の塩基配列
配列番号20:Nocardia brasiliensisのACARタンパク質のアミノ酸配列
配列番号21:Escherichia coli MG1655のentD遺伝子の塩基配列
配列番号22:Escherichia coli MG1655のEntDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号23:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPT遺伝子の塩基配列
配列番号24:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPPTタンパク質のアミノ酸配列配列番号25:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanK遺伝子の塩基配列配列番号26:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号27:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpcaK遺伝子の塩基配列配列番号28:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPcaKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号29:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanA遺伝子の塩基配列配列番号30:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号31:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のvanB遺伝子の塩基配列配列番号32:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のVanBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号33:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaG遺伝子の塩基配列
配列番号34:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号35:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のpcaH遺伝子の塩基配列
配列番号36:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のPcaHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号37:Escherichia coli MG1655のyqhD遺伝子の塩基配列
配列番号38:Escherichia coli MG1655のYqhDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号39:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324遺伝子の塩基配列
配列番号40:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0324タンパク質のアミノ酸配列
配列番号41:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313遺伝子の塩基配列
配列番号42:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl0313タンパク質のアミノ酸配列
配列番号43:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709遺伝子の塩基配列
配列番号44:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2709タンパク質のアミノ酸配列
配列番号45:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219遺伝子の塩基配列
配列番号46:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl0219タンパク質のアミノ酸配列
配列番号47:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382遺伝子の塩基配列
配列番号48:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のNCgl2382タンパク質のアミノ酸配列
配列番号49:Escherichia coli MG1655のaroE遺伝子の塩基配列
配列番号50:Escherichia coli MG1655のAroEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号51~84:プライマー
配列番号85:P2プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号86および87:プライマー
配列番号88:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysI遺伝子の塩基配列配列番号89:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号90:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysX遺伝子の塩基配列配列番号91:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysXタンパク質のアミノ酸配列
配列番号92:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysH遺伝子の塩基配列配列番号93:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号94:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysD遺伝子の塩基配列配列番号95:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号96:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysN遺伝子の塩基配列配列番号97:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysNタンパク質のアミノ酸配列
配列番号98:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysY遺伝子の塩基配列配列番号99:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysYタンパク質のアミノ酸配列
配列番号100:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysZ遺伝子の塩基配列
配列番号101:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysZタンパク質のアミノ酸配列
配列番号102:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のfpr2遺伝子の塩基配列
配列番号103:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のFpr2タンパク質のアミノ酸配列
配列番号104:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のcysR遺伝子の塩基配列
配列番号105:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のCysRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号106:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のssuR遺伝子の塩基配列
配列番号107:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のSsuRタンパク質のアミノ酸配列
配列番号108:P2プロモーターの塩基配列
配列番号109:P4プロモーターの塩基配列
配列番号110:P8プロモーターの塩基配列
配列番号111:P3プロモーターの塩基配列
配列番号112~115:プライマー
配列番号116:P8プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号117および118:プライマー
配列番号119:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048遺伝子の塩基配列
配列番号120:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のNCgl2048タンパク質のアミノ酸配列
配列番号121~124:プライマー
配列番号125:P4プロモーター領域を含むDNA断片の塩基配列
配列番号126および127:プライマー
配列番号128:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のeno遺伝子の塩基配列
配列番号129:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のEnoタンパク質のアミノ酸配列
配列番号130:Niastella koreensisのOMT遺伝子の塩基配列
配列番号131:Niastella koreensisのOMTのアミノ酸配列
配列番号132:pVK9::PcspB-omt312の塩基配列
配列番号133:OMT312のアミノ酸配列
配列番号134:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のpurH遺伝子の塩基配列
配列番号135:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のPurHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号136:purH(S37F)遺伝子(変異型purH遺伝子)の塩基配列
配列番号137:purH(S37F)タンパク質(変異型purHタンパク質)のアミノ酸配列
配列番号138~143:プライマー
配列番号144:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のsahH遺伝子の塩基配列
配列番号145:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のSahHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号146:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のsdaA遺伝子の塩基配列
配列番号147:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のSdaAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号148~157:プライマー
配列番号158:DNA断片の塩基配列
配列番号159および160:プライマー
配列番号161:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のmetK遺伝子の塩基配列
配列番号162:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のMetKタンパク質のアミノ酸配列
配列番号163および164:プライマー
配列番号165:Escherichia coli MG1655のmetE遺伝子の塩基配列
配列番号166:Escherichia coli MG1655のMetEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号167:Escherichia coli MG1655のmetH遺伝子の塩基配列
配列番号168:Escherichia coli MG1655のMetHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号169:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のmetH遺伝子の塩基配列
配列番号170:Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のMetHタンパク質のアミノ酸配列
配列番号171:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)の部分metF遺伝子の塩基配列
配列番号172:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)の部分MetFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号173:Saccharomyces cerevisiae S288cのmetF遺伝子の塩基配列
配列番号174:Saccharomyces cerevisiae S288cのMetFタンパク質のアミノ酸配列
配列番号175-178:プライマー
配列番号179-182:DNA断片の塩基配列
配列番号183:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のmetF遺伝子の塩基配列
配列番号184:Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869)のMetFタンパク質のアミノ酸配列
Claims (25)
- 目的物質の製造方法であって、
目的物質を生産する能力を有する微生物を利用して目的物質を製造すること
を含み、
前記微生物が、コリネ型細菌であり、
前記微生物が、S-アデノシルメチオニンサイクル酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されており、
前記S-アデノシルメチオニンサイクル酵素が、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼおよび5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの組み合わせであるか、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ、メチオニンシンターゼ、および5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼの組み合わせであり、
前記目的物質が、バニリン酸であり、
前記製造が、下記(1)または(2)により前記目的物質の前駆体を該目的物質に変換することを含み、
前記前駆体が、プロトカテク酸である、方法:
(1)炭素源と前記前駆体を含有する培地で前記微生物を培養し、前記目的物質を該培地中に生成蓄積させること;
(2)前記微生物の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、前記目的物質を該反応液中に生成蓄積させること。 - 前記菌体が、前記微生物の培養液に含まれる菌体、該培養液から回収された菌体、該培養液の処理物に含まれる菌体、該回収された菌体の処理物に含まれる菌体、またはそれらの組み合わせである、請求項1に記載の方法。
- さらに、前記目的物質を回収することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記メチオニンアデノシルトランスフェラーゼがmetK遺伝子にコードされ、前記メチオニンシンターゼがmetH遺伝子および/またはmetE遺伝子にコードされ、前記5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼがmetF遺伝子にコードされる、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項4に記載の方法であって、
前記metK遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(1a)配列番号162に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(1b)配列番号162に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;および
(1c)配列番号162に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質;
前記metH遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(2a)配列番号168または170に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(2b)配列番号168または170に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;および
(2c)配列番号168または170に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;
前記metE遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードし:
(3a)配列番号166に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(3b)配列番号166に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;および
(3c)配列番号166に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、メチオニンシンターゼ活性を有するタンパク質;
前記metF遺伝子が、下記からなる群より選択されるタンパク質をコードする、方法:
(4a)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;(4b)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列において、1~10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するタンパク質;および
(4c)配列番号172、174、または184に示すアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するタンパク質。 - 前記S-アデノシルメチオニンサイクル酵素の活性が、該S-アデノシルメチオニンサイクル酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることにより増大した、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記S-アデノシルメチオニンサイクル酵素をコードする遺伝子の発現が、該遺伝子のコピー数を増大させること、および/または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、請求項6に記載の方法。
- 前記微生物が、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌である、請求項1~7
のいずれか1項に記載の方法。 - 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)である、請求項8に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質の生合成に関与する酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質の生合成に関与する酵素が、3-デオキシ-D-アラビノ-ヘプツロソン酸-7-リン酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸シンターゼ、3-デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、3-デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ、O-メチルトランスフェラーゼ、芳香族アルデヒドオキシドレダクターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記目的物質以外の物質の副生に関与する酵素が、バニリン酸デメチラーゼ、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、L-システイン生合成酵素の活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記L-システイン生合成酵素が、cysI遺伝子、cysX遺伝子、cysH遺伝子、cysD遺伝子、cysN遺伝子、cysY遺伝子、cysZ遺伝子、fpr2遺伝子、およびそれらの組み合わせにコードされるタンパク質からなる群より選択される、請求項15記載の方法。
- 前記L-システイン生合成酵素の活性が、cysR遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増大させることにより、増大した、請求項15または16に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、NCgl2048遺伝子にコードされるタンパク質の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、エノラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、L-セリンデアミナーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、さらに、AICARホルミルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように、且つ/又は、AICARホルミルトランスフェラ
ーゼ/IMPシクロヒドロラーゼをコードする遺伝子が前記微生物の目的物質を生産する能
力を向上させる変異を有するように改変されている、請求項1~20のいずれか1項に記載の方法。 - AICARホルミルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼの活性が、AICARホルミル
トランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼをコードする遺伝子を、前記微生物の目的
物質を生産する能力を向上させる変異を有するように改変することによって低下した、請求項21に記載の方法。 - 前記微生物の目的物質を生産する能力を向上させる変異が、コードされるAICARホルミ
ルトランスフェラーゼ/IMPシクロヒドロラーゼの37位のセリン残基に相当するアミノ酸
残基が他のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項21または22に記載の方法。 - 前記他のアミノ酸残基が、フェニルアラニン残基である、請求項23に記載の方法。
- バニリンの製造方法であって、
請求項1~24のいずれか1項に記載の方法によりバニリン酸を製造すること;および
前記バニリン酸をバニリンに変換すること
を含む、方法。
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