JPH01191686A - 複合プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な複合プラスミドに関し、更に詳しくは、
コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡ領域と、
エシエリヒア・コリ内で複製可能なプラスミドＤＮＡ領
域とを含有する新規な複合プラスミドに関する。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、アミ
ノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等ヲ生産する工業的
に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ技術の導入によ
る菌株の育種改良は、エシエリヒア・コリ等に比べてま
だ遅れており、特に、コリネ型細菌を宿主とする工業的
に有用なベクターの開発が強く望まれている。

工業的にを用なブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ
型細菌から得られる天然型ブラ体ミドは本菌属を遺伝的
に改良するにたる可能性は秘めているもののほとんどが
プラスミドのマーカーとなりえるような薬剤耐性遺伝子
をもっておらず、また、有用な遺伝子を結合させること
が可能なりローニングサイトがないプラスミドであり、
天然型のプラスミドのままではコリネ型細菌の育種改良
には不適合である。

本発明者らは、天然型プラスミドｐＢＹ５０２又はｐＢ
Ｙ５０３にプラスミドマーカーとなりうる薬剤耐性遺伝
子、クローニングサイト及びエシエリヒア・コリ内で複
製するのに必要な遺伝子領域を導入することにより、工
業的に有用なプラスミドベクターを創成することができ
ることを見い出し、本発明を完成した。

かくして、本発明によれば、 （Ａ）　　コリネ型細菌に属する菌株細胞内で複製増殖
可能なプラスミドＤＮＡ領Ｍと、 （Ｂ）　　エシエリヒア・コリ細胞内で複製増殖可能な
プラスミドＤＮＡ領域と、 （Ｃ）　　プラスミドの存在を示唆する薬剤耐性遺伝子
を含むＤＮＡ領域 とからなることを特徴とする複合プラスミドが提供され
る。

コリネ型細菌内で複製増殖しうるプラスミドとしては、
例えば、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３　　
［ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７、（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３
０６８）、特公昭５７−２６７５５号公報参照］由来の
ｐＢＹ５０２（特願昭６ｌ−１７９７５１）、ブレビバ
クテリウム・スタチオニスＩＦＯ１２１４４由来のｐＢ
Ｙ５０３（特願昭６２−２５３７９）が挙げられる。こ
れらのプラスミドの複製増殖可能なＤＮＡ領域としては
コリネ型細菌内で複製増殖が可能であれば、該プラスミ
ド全体であってもよく、或いは一部断片であってもよい
。

また、エシエリヒア・コリ内で複製増殖しうるプラスミ
ドとしては、例えば、ｐＢＲ３２５、ｐＨＳＧ３９８、
ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９など
を用いることが可能であり、これらのプラスミドのＤＮ
Ａ領域も、エシエリヒア・コリ内で複製増殖可能であれ
ば、プラスミド全体であってもよく、或いは一部断片で
あってもよい。

さらに、薬剤耐性遺伝子としては、クロラムフェニコー
ル耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子などが好適に用
いられるが、宿主とするコリネ型細菌内及びエシエリヒ
ア・コリ細菌内で発現し、宿主に薬剤耐性能を与えるこ
とができ、両菌属の間で、薬剤耐性能により理、プラス
ミドの存在が示唆される限り、薬剤の種類は限られるも
のではなく、また一種類でも複数存在してもよい。

以上のような特性をもつ本発明の複合プラスミドは、コ
リネ型細菌としては、ブレビバクテリウム・フラバムＭ
Ｊ２３３由来菌株を宿主とすることが可能であり、また
、エシエリヒア・コリとしては、エシエリヒア・コリに
一１２系株を宿主とすることが可能である。

本発明の複合プラスミドをブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ２３３由来菌株を宿主として用いる場合には、本
菌株が保有するｐＢＹ５０２（特願昭６１−１７９７５
１号明細書参照）により離型質転換が困難になる場合が
あるので、そのような場合には、本菌株よりｐＢＹ５０
２を除去することが望ましい。そのようなプラスミドを
除去する方法としては、例えば、継代培養を繰り返すこ
とにより自然に失なわすことも可能であるし、人為的に
除去することも可能である［Ｂａｃｔ、Ｒｅｖ、３６ｐ
３６１〜４０５（１９７２）参照］。

プラスミドを人為的に除去する方法の一例を示せば以下
のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３の生育を
不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度：０
．２〜５０μｇ／　ｍＱ）もしくはエチジウムプロミド
（濃度二０．２〜５０μｇ／ｍ（２）等を含む培地に、
ｌ　ｍＱ当り約ｌＯ細胞になるように植菌し、生育を不
完全に阻害しながら、約２４時間３５°Ｃで培養する。

培養液を希釈後寒天培地に塗布し、３５°Ｃで約２日培
養する。出現したコロニーから各々独立にプラスミド抽
出操作を行ない、プラスミドが除去されている株を選択
する。この操作によりｐＢＹ５０２が除去されたブレビ
バクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株が得られる。

以上に本発明の複合プラスミドを概括的に説明したが、
次に実施例によりさらに具体的に説明する。しかしなが
ら、下記の実施例は本発明について具体的な認識を得る
一助としてのみ挙げたものであり、これによって本発明
の範囲を限定するものではない。

実施例１ Ａ）　プラスミドｐＢＹ５０２の調製 プラスミドｐＢＹ５０２は、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　　Ｐ−３０６８）から新た
に分離された分子量約３０メガダルトンのプラスミドで
あり、特願昭６１−１７９７５１号明細書記載のプラス
ミドである。プラスミドｐＢＹ５０２は次のようにし調
製した。

半合成培地Ａ培地＜ｍ成：尿素２ｇ、　（ＮＨ４）２Ｓ
ｏ４７ｇ、に２ＨＰＯ，０，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ，Ｑ。

５ｇ、Ｍｇ５Ｏ＋　０．５ｇ５ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０６
ｍｇ。

Ｍｎ５Ｏａ　４〜６Ｈ２０６ｍｇ、酵母エキス２．５ｇ
１力ザミノ酸５ｇ１ビオチン２００μｇ１塩酸チアミン
２００μｇ、グルコース２０ｇ１純水１（２）ＩＱに、
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−３０６８）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を
集めた。得られた菌体をｌ　Ｏｍｇ／　ｍＱの濃度にリ
ゾチームを含む緩衝液［２５ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン、ｌｏｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭグル
コース］２０ｍ１２に懸濁し、３７℃で１時間反応させ
た。反応液にアルカリ−３ＤＳ液［０，２Ｎ　　ＮａＯ
Ｈ，１％（ｗ／ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓ　］４４０ｍを添加し、
緩やかに混和して室温にて１５分間静置した。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍＬ酢酸１１．５ｍ１２．純水２８．５ｍｆ
２の混合液１３０ｍＣを添加し、充分混和してから氷水
中に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４°Ｃで１０分間、１５　
、ＯＯＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルムｌ／ｌ混和液）を加え懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、−２０°ＣでＩＢ？′間静置後、４°Ｃで１０分間
、１５．０００Ｘｇの遠心分離にかけ、沈殿を回収した
。

沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリスｌＯｍＭＸＥＤ
ＴＡ　　１ｍＭ、ＨＣＱにてｐＨ＝　８．０に調整］２
ｍ１２に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃
度のＴＥ緩衝液１００ｍ＜＋に塩化セシウム１７０ｇを
溶解させた液］１５ｍｆｆと１０　ｍｇ／　ｍＱエチジ
ウムブロマイド溶液１ｍ１２を加えて、密度を１．３９
２ｇ／ｍＱに合わせた。この溶液を１２°Ｃで４２時間
、１１６．０００Ｘｇの遠心分離を行なった。

プラスミドｐＢＹ−５０２は紫外線照射により遠心管内
で下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射
器で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミド
ｐＢＹ−５０２を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を当量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドｐＢ　Ｙ　−５０２を含む透析液に３
Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後
、２倍量のエタノールを加え、−２０℃１時間静置した
。この溶液を１５，０００Ｘｇの遠心分離にかけてＤＮ
Ａを沈降させ、プラスミドｐＢｙ−５０２を約２０μｇ
得Ｉこ　。

Ｂ）　プラスミドｐＨＳＧ３９８の準備プラスミドｐＨ
３Ｇ３９８は、エシエリヒア・コリ内で複製し、クロラ
ムフェニコール耐性を発現する分子量約１．４メガダル
トンのプラスミドであり、市販品として宝酒造より購入
が可能である。

Ｃ）　複合プラスミドｐｃ　ＲＹ　−２の造成プラスミ
ドｐＨ５ｃ、３９８（宝酒造製）０．５μｇに制限酵素
Ｈ１ｎｄＩ［［（５ｕｎｉｔｓ）を３７°Ｃ１時間反応
させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

前記Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０２２μ已に
制限酵素Ｈ１ｎｄＴ［ｌ　（ｌ　ｕｎｉｔｓ）を３７°
Ｃで３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解し
　ｔこ　。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために６５°Ｃで１０分間加熱処理した後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ１−リ
ス緩衝液ｐＨ７，６、ｌＯｍＭＭｇＣＱｔ、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕ
ｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時
間保温した。この溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ
Ｉ０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／ｍＱｃ最終濃度）のクロラムフ
ェニコール、ｌ　ＯＯｐ　ｇ／ｍＱｃ最終濃度）ＩＰＴ
Ｇ（インプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノンド）、１
００　ｐｇ／ｍＱＣ最終濃度）Ｘ−ｇａｆ２（５−ブロ
モ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄガラクトピラノ
シド）を含むし培地（トリプトン１０ｇ１酵母エキス５
ｇ、　ＮａＣＱ　５ｇ、純水１’Ｑ　１ｐＨ７，２）で
３７°Ｃにて２４時間培養し、生育株として得られた。

これら生育株のうち、白いコロニーで生育してきたもの
を選択し、各々プラスミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ　
、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、Ｆ　、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ
、　　Ｊ　。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏ
ｎｉｎｇ”　（１９８２）Ｐ９０〜９１参照］により抽
出した。

Ｄ）　プロトプラストの調製 ブレビバクテリウム・７ラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　
　ｐ−３０６８）プラスミド除去株をｌＯＱｍＣの前記
Ａ培地で対数増殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを０
．２ユニツト／ｍＱになるように添加し、さらに２時間
振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５
Ｍコハク酸ナトリウム、２０ｍＭトリス、２０ｍＭ塩化
カルシウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ７，５）
から成るＴＳＭＣ５ＭＣ緩衝液５０で洗浄し、次いで４
ｍｇ／ｍＱリゾチーム（生化学工業）、１０００ユニツ
ト／ｍＱアクロモペプチダーゼ（ＴＢＬ−１和光純薬）
を含むＴＳＭＣ，緩衝液１０ｍＱに懸濁し、３０°Ｃで
１６時間反応によりプロトプラスト化を図った。反応終
了後、３００　Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離後、プロト
プラストをＴＳＭＣ緩衝液２０ｍ（２で洗浄し、３ｍＱ
のＴＳＭＧ緩衝液に再度懸濁した。

Ｅ）　複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換 上記Ｄ）項で得られたプロトプラスト２００μαと、前
記Ｃ）項で得られたプラスミドＤＮＡを混合し、水冷後
ポリエチレングリコール６０００を最終濃度２０％にな
るように添加し、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ緩衝液５ｍ
１２を加え、遠心分離（３００Ｏｒｐｍ、　　ｌ　０分
間）後、０．５Ｍシュークロースを含むＡ培地３ｍＱに
再懸濁し、３０°Ｃで２時間培養した。

この培養液をクロラムフェニコール７μｇ／ｍ１２（Ｉ
ｔ終濃度）を含む再生培地［尿素２　ｇｌ（Ｎ　Ｈ４）
Ｓ　Ｏ４７ｇ５ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０
，５ｇ。

ＭｇＳＯ４−７Ｈ２００，５ｇ、ＦｅＳＯ４−７Ｈ！０
５ｍｇ１Ｍｎ３０．４〜６Ｈ２０６ｍｇｖ酵母エキス２
．５ｇ、カザミノ酸７．５ｇ、ビオチン２００μｇ１塩
酸チアミンｌｏｍｇ、シュークロース１７１ｇ。

グルコース５ｇ、ゼラチン１５ｇ、寒天（ＤＩＦＣ○）
８ｇ１純粋で全量をｌ＋２とした］に植菌し、３０°Ｃ
で３〜１５日間培養後出現したコロニーを、クロラムフ
ェニコール７μｇ／ｍＱを含むＡ培地に植菌し、クロラ
ムフェニコール耐性能を確認した。

Ｆ）　　上記Ｅ）項で得たクロラムフェニコール耐性株
より、上記Ａ）項の方法を用いてプラスミドを得た。こ
のプラスミドを各種制限酵素で分子量を測定した。その
結果を下記の表１に示す。

表１ Ｈ１ｎｄｎＩ　　　　　２　　　２．７（４，１）１．
４（２，２）Ｋ　ｐｎ　Ｉ　　　　　ｌ　　　　　　４
−１（６，３）ＥｃｏＲＩ　　　　　ｌ　　　　　　４
．１（６，３）ＢａｍＨＩ　　　　　１　　　２．２（
３，４）１．９（２，９）Ｓ　ｍａ　Ｉ　　　　　　　
２　　　　　４．０（６，１）０．１（０，２）＊０内
はｋｂを示す。

上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドを“ｐＣ
ＲＹ−２”と命名した。

Ｇ）　上記Ｆ）項で得たプラスミドｐＣＲＹ−−２を用
いてエシエリヒア・コリＨＢＩＯＩコンピテントセル（
宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は、最終濃度３０μｇ／ｍ（１のクロラムフ
ェニコールを含むし培地で選択したところ、ｐＣＲＹ−
２１μｇ当りｌ　Ｏ５ｃｅｌｌｓの頻度でクロラムフェ
ニコール耐性能を示す形質転換株が得られた。これらの
形質転換株のうち１０株を、アルカリ−３ＤＳ法にてプ
ラスミドを抽出し、各種制限酵素により切断し、その分
子量をアガロースゲル電気泳動により測定したところ、
ブレビバクテリウム・フラバムの形質転換株から得たプ
ラスミドｐＣＲＹ−２（表１）と同等のものであった。

このことはｐｃ　ＲＹ　−２がコリネ型細菌の一種であ
るブレビバクテリウム・フラバムＭＪ　２３３由来株と
エシエリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドで
あることを示し、さらにプラスミドの存在を示唆する薬
剤耐性遺伝子が両者菌属間にて発現することを示すもの
であり、工業的に有用なベクターであると考えられる。

なお、複合プラスミドｐｃ　ＲＹ　−２により形質転換
されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥＩ
Ｏ１は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工
業技術院微生物工業技術研究所に、昭和６３年１月８日
付で受託番号：微工研条寄第９８０１号（ＦＥＲＭ　　
ｐ−９８０１）として寄託されている。

実施例２ ８とから成る複合プラスミドｐＣＲＹ　−３の造成Ａ）
　プラスミドｐＢＹ５０３の調製 プラスミドｐＢＹ５０３は、ブレビバクテリウム・スタ
チオニスＩＦＯ１２１４４から新たに分離された分子量
約ｌθメガダルトンのプラスミドであり、特願昭６２−
２５２３７９記載のプラスミドである。プラスミドｐＢ
Ｙ５０３は次のようにし調製した。

半合成培地Ａ培地（尿素２ｇ、（ＮＨ４）２５０４７ｇ
、に２ＨＰＯ４０，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ。

Ｍｇ５Ｏ＋　０．５ｇ％Ｆｅ５Ｏａ・７ｌ−１２ｏ　　
６ｍｇ、　Ｍｎ３Ｏ４４−６Ｈ２０５ｍｇ、酵母エキス
２．５　ｇｓカザミノ酸５ｇ１ビオチン２００μｇ１塩
酸チアミン２００μｇ１　グルコース２０ｇ、純水１Ｑ
）ｌＱに、ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦＯ１
２１４４を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。

得られた菌体をｌ　Ｏｍｇ／　ｍＱの濃度にリゾチーム
を含む緩衝液［２５ｍＭ１−リス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン、ｌ　ＯｍＭ　　ＥＤＴＡ、５０ｍＭグル
コース］２０ｍＱに懸濁し、３７°Ｃで１時間反応させ
た。反応液にアルカリ−５ＤＳ液［０，２ＮＮａ０ＨＸ
　１％（ｗ／ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓ　］　　４０　ｍＱを添加
し、紛やかに混和して室温にて１５分間静置した。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍ１２．酢酸１１．５ｍＬ純水２８．５ｍＱ
の混合液１３０ｍαを添加し、充分混和してから氷水中
に１５分間静置した。

溶菌物全量を遠心管に移し、４°Ｃで１０分間、１５、
ｏｏＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量の７エノールークロロホルム液（フェノール
／クロロホルムｌ／ｌ混和液）を加え懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５，０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。水層に２倍量のエタノールを加
え、〜２０°Ｃで１時間静置後、４°Ｃで１０分間、１
５．ＯＯＯＸｇの遠心分離にかけ、沈殿を回収した。

沈殿を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリス１０ｍＭ、ＥＤ
ＴＡ　　１ｍＭ、ＨＣＱにてｐＨ＝８．０に調整］２ｍ
４に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃度の
ＴＥ緩衝液１００ｍ１２に塩化セシウム１７０ｇを溶解
させた液］１５ｍ（２と１０　ｍｇ／　ｍＱエチジウム
ブロマイド溶液１ｍ（＋を加えて、密度を１．３９２ｇ
／ｍＱに合わせた。この溶液を１２℃で４２時間、１１
６．ｏｏＯＸｇの遠心分離を行なった。

プラスミドｐＢＹ−５０３は紫外線照射により遠心管内
で下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射
器で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミド
ｐＢＹ−５０３を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥ緩衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドｐＢＹ−５０３を含む透析液に３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２
倍量エタノールを加え、−２０°Ｃ１時間静置した。こ
の溶液を１５、ＯＯＯＸｇの遠心分離にかけてＤＮＡを
沈降させ、プラスミドｐＢＹ−５０３を５０μｇ得た。

Ｂ）　プラスミドｐＨＳＧ３９８の準備プラスミドｐＨ
３Ｇ３９８は、エシエリヒア・コリ内で複製し、クロラ
ムフェニコール耐性ヲ発現する分子量約１．４メガダル
トンのプラスミドであり、市販品として宝酒造より購入
が可能である。

Ｃ）　複合プラスミドｐｃ　ＲＹ　−３の造成プラスミ
ドｐＨ３Ｇ３９８（宝酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｋ
　ｐｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７℃１時間反応させ
、プラスミドＤＮＡを完全に分解した。

前記Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０３２ｐｇに
制限酵素ＫｐｎＩ（ｌｕｎｉしＳ）を３７°Ｃで３０分
間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解しｌこ　。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活化するために６５°Ｃで１０分間加熱処理した後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス
緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣＱ２．１０ｍＭジチ
オスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎ
ｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間
保温した。この溶液を用いてエシエリヒア・コリＪＭ１
０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は３０μｇ／ｍ（２（最終濃度）のクロラム
フェニコール、１００　ｐｇ／ｍＱ（最終濃度）ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）
、１００μｇ／ｍＱｃ最終濃度）Ｘ−ｇａＱ　（５−ブ
ロモ−４−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド）を含むし培地（トリプトンｌＯｇ、酵母エキ
ス５ｇ、ＮａＣＱ　５ｇ、純水ＩＱ、ｐＨ７，２）で３
７°Ｃにて２４時間培養し、生育株として得られた。こ
れら生育株のうち、白いコロニーで生育してきたものを
選択し、各々プラスミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ　、
Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｅ　、Ｆ　、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ
。

Ｊ　、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ｃｌｏｎｉｎｇ”　（１９ｇ２）Ｐ９０〜９１参照コに
より抽出した。

Ｄ）　プロトプラストの調製 ブレビバクテリウム・７ラバムＭＪ２３３（ＦＥＲＭ　
　Ｐ−３０６８）プラスミド除去株を１００ｍαの前記
Ａ培地で対数増殖期初期まで培養し、ペニシリンＧを０
．２ユニツト／ｍＱになるように添加し、さらに２時間
振盪培養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を０．５
Ｍコハク酸ナトリウム、２０ｍＭトリス（ヒドロキシメ
チルアミノメタン）、２０ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ７，５）から成るＴＳＭＣ３
ＭＣ緩衝液５０洗浄し、次いで４ｍｇ／ｍＱリゾチーム
（生化学工ｉ）、１０００ユニツト／ｍＱアクロモペプ
チダーゼ（ＴＢＬ−１和光純薬）を含むＴＳＭＣ緩衝液
ｌＱｍｆ２に懸濁し、３０°Ｃで１６時間反応によりプ
ロトプラスト化を図った。反応終了後、３０００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離後、プロトプラストをＴＳＭＣ緩衝
液２０ｍ１２で洗浄し、３ｍ（ｉのＴＳＭＣ緩衝液に再
度懸濁した。

Ｅ）　複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換 上記Ｄ）項で得られたプロトプラスト２００μＱと、前
記Ｃ）項で得られたプラスミドＤＮＡを混合し、水冷後
ポリエチレングリコール６０００を最終濃度２０％にな
るように添加し、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ３ＭＣ緩衝
液を加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、　　ｌ　０分間
）後、０．５Ｍシュークロースを含むＡ培地３ｍＣに再
懸濁し、３０°Ｃで２時間培養した。

、：の培ｉｉをクロラムフェニコール７μｇ／ｍ１２（
Ｆｘ終濃度）を含む再生培地［尿素２ｇ、（ＮＨ，）Ｓ
ｏ。

７ｇ、ＫＨ，Ｐｏ、０．５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５ｇ。

Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２００，５ｇＳＦｅＳＯ４−７Ｈ２０
６ｍｇ％ＭｎＳＯ４４〜６Ｈｚ０　６ｍｇ１酵母エキス
２．５ｇ、カザ、ミノ酸７．５ｇ、　　ビオチン２００
μｇ１塩酸チアミン１０ｍｇ、シュークロース１７１ｇ
、グルコース５ｇ１ゼラチン１５ｇ、寒天ＣＤＩＦＣＯ
）８ｇ、純粋で全量を１４とした］に植菌し、３０°Ｃ
で３〜１５日間培養後出現したコロニーを、クロラムフ
ェニコール７μｇ／ｍＱを含むＡ培地に植菌し、クロラ
ムフェニコール耐性能を確認した。

Ｆ）　上記Ｅ）項で得たクロラムフェニコール耐性株よ
り、上記Ａ）項の方法を用いてプラスミドを抽出し、各
種制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動で分子量
を測定した。その結果を下記の表２に示す。

表２ Ｓ　ａｌ　Ｉ　　　　　　１　　　　　５．３（８，２
）Ｈ１ｎｄＩＩ［３３，６（５，５）１．６（２，５）
０．１（０，２） Ｓ　ｍａ　１　　　　　　２　　　　　５．１（７，８
）、帆２（０，４）Ｋ　ｐｎ　Ｉ　　　　　　２　　　
　３．９（６，０）、１．４（２，２）＊０内はｋｂを
示す。

上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドを’ｐＣ
ＲＹ−３”　と命名した。

Ｇ）　上記Ｆ）項で得たプラスミドｐｃ　ＲＹ　−３を
用いてエシエリヒア・コリＨＢＩＯＩコンピテントセル
（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は、最終濃度３０μｇ、／ｍＱのタロラムフ
ェニコールを含むＬ培地で選択したところ、ｐＣＲＹ−
３１μｇ当りＩ　Ｏ５ｃｅｌｌｓの頻度でクロラムフェ
ニコール耐性能を示す形質転換株が得られた。これらの
形質転換株のうち１０株を、アルカリ−３ＤＳ法にてプ
ラスミドを抽出し、各種制限酵素により切断し、その分
子量をアガロースゲル電気泳動により測定したところ、
ブレビバクテリウム・７ラバム形質転換株から得たプラ
スミドｐＣＲＹ−３（表２）と同等のものであった。こ
のことはｐｃ　ＲＹ　−３がコリネ型細菌の一種である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株とエシ
エリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドである
ことを示し、さらにプラスミドの存在を示唆する薬剤耐
性遺伝子が両者菌属間にて発現することを示すものであ
り、工業的に有用なベクターであると考えられる。

なお、複合プラスミドｐＣＲＹ　−３により形質転換さ
れたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０
２は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、昭和６３年１月８日付
で受託番号：微工研条寄第９８０２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ
−９８０２）として寄託されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（Ａ）コリネ型細菌に属する菌株細胞内で複製増殖
   可能なプラスミドＤＮＡ領域と、 （Ｂ）エシエリヒア・コリ細胞内で複製増殖可能なプラ
   スミドＤＮＡ領域と、 （Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域 とから成ることを特徴とする複合プラスミド。 ２、ＤＮＡ領域（Ｃ）が、薬剤耐性遺伝子の他に、コリ
   ネ型細菌またはエシエリヒア・コリ細胞内で複製増殖可
   能なＤＮＡ断片を有する特許請求の範囲第１項記載の複
   合プラスミド。 ３、プラスミドＤＮＡ領域（Ａ）がｐＢＹ５０２である
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の複合プラスミ
   ド。 ４、プラスミドＤＮＡ領域（Ｂ）がｐＢＲ３２５、ｐＨ
   ＳＧ３９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ２９９及びｐＨ
   ＳＧ２９８から選ばれる特許請求の範囲第１〜３項記載
   の複合プラスミド。 ５、コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
   ２３３由来株である特許請求の範囲第１項記載の複合プ
   ラスミド。 ６、複合プラスミドがｐＣＲＹ−２である特許請求の範
   囲第１〜５項のいずれか１項に記載の複合プラスミド。 ７、複合プラスミドｐＣＲＹ−２により形質転換された
   ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株。 ８、ＤＮＡ領域（Ｃ）が、薬剤耐性遺伝子の他に、コリ
   ネ型細菌またはエシエリヒア・コリ細胞内で複製増殖可
   能なＤＮＡ断片を有する特許請求の範囲第１項記載の複
   合プラスミド。 ９、プラスミドＤＮＡ領域（Ａ）がｐＢＹ５０３ズある
   特許請求の範囲第１項または第８項記載の複合プラスミ
   ド。 １０、プラスミドＤＮＡ領域（Ｂ）がｐＢＲ３２５、ｐ
   ＨＳＧ３９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ２９９及びｐ
   ＨＳＧ２９８から選ばれる特許請求の範囲第１項または
   第８〜９項のいずれか１項に記載の複合プラスミド。 １１、コリネ型細菌がブレビバクテリウム・フラバムＭ
   Ｊ２３３由来株である特許請求の範囲第１項記載の複合
   プラスミド。 １２、複合プラスミドがｐＣＲＹ−３である特許請求の
   範囲第１項または第９〜１１項記載の複合プラスミド。 １３、複合プラスミドｐＣＲＹ−３により形質転換され
   たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株。