JPH02255092A - 新規プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は新規プラスミドに関し、詳しくはクロストリジ
ウム・アセトブチリカム　（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａ
ｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）等の嫌気性菌を宿主とす
る遺伝子操作用ベクターとして有用な新規プラスミドに
関する。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］クロス
トリジウム・アセトブチリカム等の嫌気性菌は大量のア
セトン１ブタノールを生産することが知られており、工
業的に有用な微生物である。

近年、遺伝子操作法による工業用微生物の育種か犬膓菌
等について試みられている。これは、細菌のベクターＩ
が主として通性嫌気性菌や好気性菌において開発されて
いたからであり、従来はクロストリジウム　アセトブチ
リカム等の嫌気性菌を宿主とするベクターについては未
開発であった。

遺伝子操作法によるクロストリジウム　アセトブチリカ
ムの育種については、好気性菌であるスタフィロコッカ
ス菌由来のプラスミドｐ［ｌ８１１０　（分子量４．５
ｋｂ　、カナマイシン耐性）を用いた例がある（Ａｐｐ
ｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４８，７３
７．１９８４）。しかし、この方（去によるクロストリ
ジウム　アセトブチリカムの形質転換頻度は２８７μｇ
ＤＮ八という低いものである。その上、特殊な形質転換
法（５５℃１５分処理、条件が厳密である）を採用しな
けれはならず、コピー数（増幅）や安定性についても満
足しつる結果が得られていない。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、クロストリジウム　アセトブチリカム等
の嫌気性菌の遺伝子操作用ベクターを開発すべく検討を
重ね、大腸菌プラスミドｐＫＫ２３２−８とクロストリ
ジウム・アセトブチリカムのプラスミドｐｃｓ８６　と
のＢａｍＨＩ部位を介した組換えプラスミドｐＴＹ１０
を構築し、クロストリジウム・アセトブチリカムの形質
転換を行い、形質転換体から分離したプラスミドが上記
目的に適合することを見出し、かかる知見に基いて本発
明を完成したのである。

すなわち本発明は、分子量が４．Ｏｋｂであり、クロラ
ムフェニコール耐性の遺伝子を内部に保有し、図に示す
制限酵素地図を有する新規プラスミドを）是供するもの
である。

本発明のプラスミドは、大腸菌プラスミドｐＫＫ２３２
−８とクロストリジウム・アセトブチリカムのプラスミ
ドｐｃｓｓｅをＢａｍＨＩ部位で結合して組換えプラス
ミドｐＴＹ１０を構築し、このプラスミドｐＴＹ１０を
用いてクロストリジウム・アセトブチリカムの形質転換
を行い、形質転換体から分離することにより得られる。

以下に、本発明の詳細な説明する。

大腸菌プラスミドｐＫＫ２３２−８は市販（たとえはフ
ァルマシア製）されており、容易に人手できる。また、
クロストリジウム・アセトブチリカムのプラスミドｐｃ
ｓａｅは以下の方法によって調製することかできる。

（１）培養法 天川大学保存株クロストリジウム・アセトブチリカム（
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕ
ｍ）Ｎｏ、８ｔｉ株（ＦＥＢＭ　Ｐ−１０５７１）を２
００ｍＡ＋の下記組成のＴＹＡ培地で３０℃にて１５時
間静置培養したものをプラスミド抽出用の菌体浮遊を夜
とした。

ＴＹＡ培地 グルコース　　　　　　　　　４０　　ｇＫｌｈＰ０４
．　　　　　　　　　０．５　ｇＭｇＳＯ４・７Ｎ２０
　　　　　　　　　　０．３　ｇＦａＳＧ４・７Ｈ２Ｑ
　　　　　　　　　　１０　　ｍｇ酢酸アンモニウム　
　　　　　　３ｇ 酵母エキス　　　　　　　　　　２ｇ バタトートリプトン（Ｄｉｆｃｏ）　　　６　　ｇ（寒
天　　　　　　　　　　　　１６　ｇ）１０００ｍｌ＋
にしたのち、ＩＮ　　ＮａＯＨでｐＨ６，５に調整殺菌
条件：　０．７５ｋｇ／ｃｍ２で１５ｍ１ｎ。

（２）プラスミド分離法 上記（１）の培養液を冷却遠心分離機にて１０，０００
ｘｇで１０分間遠心分離を行フて集菌し、リゾチーム（
２ｍｇ／ｍＩりを溶解した１５％シュクロースを含むＴ
ＥＳバッフｙ　−（５０ｍＭ　ｆ−リス　塩酸、　　１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ５０ｍＭ　ＮａＣρ）８ｍ２に懸濁後
、水中に１０分分間−た。

次に、６８℃恒温槽に１５分間装いた後、アルカリＳＯ
５（０，２Ｎ　ＮａＯＨ，１％５ＤＳ）　１２ｍｆを添
加して溶菌し、水中に１０分分間−た。３Ｍ酢酸アンモ
ニウム１５ｍＮで中和後、フェノール−クロロホルム処
理を２回、クロロホルム処理を２回行った。その後、０
．６容のイソプロパツールを添加し、常温で３０分放置
し、室温で１５，０００ｘ　ｇで３０分間遠心分離して
沈澱を回収する。これを粗プラスミド画分とし、以下常
法に従いセシウムクロライド密度勾配遠心およびゲル２
戸適法によりプラスミドの精製を行った。

（３）プラスミド特性 プラスミドｐＣ５８６を１（ｉｎｄ［Ｉｒ　、　Ｅｃｏ
ＲＩ　、　　Ｒａｎ　Ｉ等の制限酵素で開裂させたＤＮ
Ａについて、ラムダファージＤＮＡ　０′）Ｈｉｎｄｌ
ｌｒ分解分子量標準品を対照としてアガロースゲル電気
泳動したところ、分子量は３．０ｋｂ　と算出された。

また、プラスミドｐｃｓａａを各種の制限酵素で切断し
、アガロースゲル電気泳動により各ＤＮＡ断片の分子量
を求め、制限酵素切断パターンから制限酵素地図は第１
図のようになった。

次に、プラスミドｐＴＹ１０は上記のプラスミドｐＫＫ
２３２−８とプラスミドｐｃｓａｅを用いて、例えば以
下の方法により構築することができる。

（１）プラスミドの切断およびライゲーションプラスミ
ドｐｃｓｓａをＢａｎ　Ｉ部位で切断後、−末鎖部分を
ｌｌｕｎｇ　ｂｅａｎヌクレアーゼで分解除去した。そ
の後、ＢａｍＨＩリンカ−を結合した。一方、大腸菌プ
ラスミドｐＫＫ２３２−８　（ファルマシア製）は、そ
のポリリンカ一部位のＢａｍＨＩ部位で分解後、アルカ
リフォスファターゼ処理した。各々の断片を５：１の量
比で混和し４℃で１６時間ライゲーションした。第２図
はプラスミドｐＴＹ１０の構築方法の概要とその制限酵
素地図を示す。

用い、形質転換法としてＣａ／Ｒｂ法（Ｋｕｓｈｎｅｒ
Ｓ、Ｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を用いた。形質転換体はクロラムフ
ェニコール３０μｇ／ｌｌ１ｐを含むＬＢ培地上で検出
した。すなわち、構築したプラスミドｐＴＹ１０を含む
菌体は、プラスミドｐｃｓａｅ上のプＯ−［−一ターに
よりｐＫＫ２３２−８）ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅ
ｎｉｃｏｌ　ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓａ）活
性を発現するので、クロラムフェニコール耐性を有して
いる。

（３）プラスミドｐＴＹ１０の特性 プラスミドの抽出はアルカリ−５ＤＳ法［Ｂｉｒｎ−ｂ
ｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，＆　Ｊ、Ｄｏｌｙ、　Ｎｕｃｋｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、７１５１３　（１９７９）］
　に従って行なった。プラスミドｐＴＹ１０は分子量８
．１ｋｂで、上記１−（３）と同様の方法で制限酵素地
図を調べたところ、第２図のようになった。得られたプ
ラスミドｐＴＹ１０は、第２図に示す方向性でｐＫＫ２
３２−８のマルチクローニングサイトに組み込まれてい
た。また、反対方向の挿入はクロラムフェニコール耐性
を示さなかった。第３図においてｂｌａはβ−ラクタマ
ーゼを、ＣＡＴはクロラムフェニコール　アセチルトラ
ンス−フェラーゼを示す。

上記の如くして得られたプラスミドｐＴＹｌｏを用い、
クロストリジウム・アセトブチリカムを受容菌として形
質転換を行い、得られたクロラムフェニコール耐性の形
質転換体から常法により分離すルコトによって本発明の
新規プラスミドを得ることができる。

［実施例］ 次に、本発明を実施例により説明する。

実施例１ （１）プラスミドｐＴＹ１０によるクロストリジウムア
セトブチリカムの形質転換 天川大学保存株クロストリジウム・アセトブチリカムＮ
ｏ、２２０株（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０１５で３）（クロラ
ムフェニコール感受性菌）を５１のＴＹＡ培地（前記プ
ラスミドｐｃｓｓ６の調製の際に用いたものと同じ）で
０Ｄ６６゜＝０．６の濁度となるまで３０℃で培養した
。

この培養液を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行フ
て集菌し、５ｍｊ）の５０ｍＭｔ−リス塩酸緩衝液（ｐ
ｌ（８，５）　に懸濁後、再び３５００ｒｐｍで５分間
遠心分離を行って集菌し、再び５ｍｆの同緩衝液に懸濁
した。これを３０℃で６０分間放置後、３５００ｒｐｍ
で１０分間遠心分離を行って集菌し、０．５ｎ＋ｊ！の
ＴＹＡ培地に懸濁した。

この懸濁液に０．１ｍｌ＋のプラスミドＤＮＡを添加し
て３０℃で３０分間放置後、さらに１．５１の４０％Ｐ
ＥＧｅ、ｏｏｏ　　（ポリエチレングリコール）を添加
して３０℃で６０分間放置した。次いで、３ｍρのＴＹ
Ａ培地を添加後、３５０Ｏｒｐｍで５分間遠心分離を行
って集菌し、これを５ｍρのＴＹＡ培地に懸濁して３０
℃で４時間培養した。これを１０ｔＬｇ／ｍ＊のクロラ
ムフェニコールを添加したＴＹＡ培地のプレート上に塗
布し、３０℃で２〜３日放置したところ、クロラムフェ
ニコール耐性の形質転換株のコロニーが出現した。以上
のすべての作業は窒素ガス雰囲気下の嫌気条件で行フた
。

（２）プラスミドｐＴＹＤ１０１およびｐＴＹＤ１０４
の確認上記（１）の形質転換により得られたクロラムフ
ェニコール耐性の形質転換株についてアルカリＳＤＳ法
によりプラスミドを抽出しプラスミドｐＴＹＤ１０１　
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０３ｉシ）を確認した。また、同様
にして別の形質転換株からプラスミドｐＴＹＤ１０４を
確認した。

（３）プラスミドｐＴＹＤ１０１およびｐＴＹＤ１０４
の調製上記（１）の形質転換により得られたクロラムフ
ェニコール耐性の形質転換株から、前述のプラスミドｐ
ｃｓａｅの調製法と同様にして、目的とするプラスミド
ｐＴＹＤ１０１を得た。また、同様にして別の形質転換
株からｐＴＹＤ１０４を得た。

プラスミドｐＴＹＤ１０１は分子量が４．０ｋｂで、第
３図に示した制限酵素地図を有していた。また、プラス
ミドｐＴＹＤ１０４は分子量が７．５ｋｂで、第３図に
示した制限酵素地図を有していた。これらプラスミド構
築の概要を第３図に示した。

なお、プラスミドｐＴＹＤ１０１の制限酵素分解部位に
ついて調べたところ、プラスミドｐｃｓａｅ由来部位に
存在するＨｈａ　ＩおよびＨｐａ　Ｉにユニークサイト
を有していることが判明した。

実施例２ （１）プラスミドｐＴＹＤ１０１の形質転換効率実施例
１（１）に記載したクロストリジウム　アセトブチリカ
ムの形質転換法に従いプラスミドｐＴＹＤ１０１を用い
てクロストリジウム・アセトブチリカムＮｏ、２２０株
（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５７３）の形質転換を行い、プラ
スミドｐＴＹ１０の場合と形質転換効率を比較した。結
果を第１表に示す。

第　　１　　表 ＴＹ１０ 〈１０１ ｐＴＹＤｌｏｌ　　　　　　　　　　　５　Ｘ　１０３
＊クロラムフエニコール含有ＴＹＡ寒天培地にて検出 （２）プラスミドｐＴＹＤ１０１のクロストリジウム・
アセトブチリカム内でのコピー数 次に、プラスミドｐＴＹＤ１０１のクロストリジウム・
アセトブチリカム内でのコピー数をデンシトメーターを
用いた簡易法で算出したところ、プラスミドｐＴＹＤ１
０１は１００コピー／ｃｅｌｌ　　以上であった。一方
、プラスミドｐＴＹＤ１０４は２０コピー／ｃｅｌｌで
あった。このことから、プラスミドｐＴＹＤ１０１　は
プラスミドｐＴＹＤ１０４よりもコピー数が極めて増大
していることが判明した。

（３）プラスミドｐＴＹＤ１０１の保持安定性プラスミ
ドｐＴＹＤ１０１　とｐＴＹＤ１０４のクロストリジウ
ム・アセトブチリカム中での保持安定性を比較した。す
なわち、クロラムフェニコールを含まないＴＹ＾液体培
地にクロストリジウム・アセトブチリカムを継代培養し
、クロラムフェニコール耐性コロニーの数を測定するこ
とにより保持安定性を比較した。結果を第２表に示す。

表から明らかなように、プラスミドｐＴＹＤ１０１はク
ロラムフェニコールを含まないＴＹＡ液体培地に継代培
養しても１日約５世代以上の分裂にも拘らず、８０％の
菌株にクロラムフェニコール耐性が保持されており、ク
ロストリジウム・アセトブチリカム中に安定に保持され
る。一方、プラスミドｐＴＹＤ１０４を保持した菌株で
は速やかにクロラムフェニコール耐性が失われた。

第　　２　　表 継代培養 プラスミド　　０日　　１日　　２日　　３日ｐＴＹＤ
１０１　　　１００　　　８０　　６０　　　４５ｐＴ
ＹＤ１０４　　　１００　　　１　　０．０１　　　Ｎ
Ｄ［発明の効果コ 本発明の新規プラスミドは、クロストリジウム・アセト
ブチリカムを高頻度に形質転換でき、かつ該微生物中で
のコピー数が大である。しかも、該微生物中での安定性
が高く、選択マーカを有していることからクロストリジ
ウム・アセトブチリカム等の嫌気性菌の遺伝子操作用ベ
クターとして有用である。したがって、本発明は工業的
に有用なブタノール等の生産に用いられる微生物の育種
に有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐｃ５８Ｂの制限酵素地図を示し、
第２図はプラスミドｐＴＹ１０の構築方法の概要とその
制限酵素地図を示す。 第３図はプラスミド ９ＴＹＤ１０１ およびｐＴＹＤ１０４ の構築方法の概要とその 制限酵素地図を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量が４．０ｋｂであり、クロラムフェニコー
   ル耐性の遺伝子を内部に保有し、図に示す制限酵素地図
   を有する新規プラスミド。 ▲数式、化学式、表等があります▼