JP2558249B2 - 正のレトロレギユレーシヨン因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は組換DNAの分野に関する。さらに詳しく
は、この発明は、遺伝子産物をコードする選択されたDN
A配列に連結された場合に該遺伝子産物の発現を増強す
る正のレトロレギュレーション因子（positive retrore
gulatory element）に関する。選択されたDNA配列に連
結された正のレトロレギュレーション因子を担持するプ
ラスミド及びこのプラスミドにより形質転換された細胞
が提供される。さらに、この発明は、所望の遺伝子産物
を発現することができる選択されたDNA配列に正のレト
ロレギュレーション因子を連結することにより遺伝子産
物の発現を増強する方法に関する。

（従来の技術） 組換DNA技法の商業的利用の基礎を成す基本的な方策
の１つは、非常に低い濃度又は容量で天然に通常存在す
るポリペプチド又は蛋白質の形で遺伝子産物を比較的高
容量で製造することである。比較的短い世代時間又は倍
化時間を有する細胞を一般にプラスミドの形である組換
体分子で形質転換することにより、有意量の所望の遺伝
子産物を得ることができる。組換体DNAを有する各細胞
は実際に非常に少量のみの所望の遺伝子産物を産生する
が、細胞の急速な増加が所望の遺伝子産物の有意量の製
造を可能にする。

一般に、選択された遺伝子産物を多量に製造するとい
う目標は、所望の遺伝子産物を産生する形質転換された
細胞の増殖のために必要とされる培地容積の程度により
限定される。目的とする遺伝子産物の収量を増加するこ
とは、目的とする遺伝子産物の商業的製造において、明
らかに大きな関心事である。収量を増加するための１つ
の方法は、形質転換された細胞により産生される生成物
の量を変えないで、該細胞又は培地からの目的遺伝子産
物の回収率を改良することである。この方法は、所与の
発酵からの目的遺伝子産物の回収を増加するための加工
（processing）段階の追加を課する。このような追加の
加工段階は、加えられる装置及び職員のために大きなコ
ストを必要とする場合がある。

目的の遺伝子産物の収量を増加するための他の方法
は、形質転換された細胞による目的遺伝子産物の発現を
増加することである。各細胞による目的遺伝子産物の産
生におけるこのような増加は、特定の発酵についての収
率の増加と共に製造された生成物の純度の改良を導き、
そして追加の加工が必要でないため単位生成物当たりの
コストの低下を導く。

細胞当たりの目的遺伝子産物の収量を改良するための
重要な一般的方法の１つは、細胞に最適培養条件を与え
ることである。例えば、培地の栄養素含量を富化し、発
酵のための最適温度を与え、微量因子の最適量を与え、
そして培地に要求されるアミノ酸を補充することによ
り、収量を有意に改良することができる。

細胞当り目的遺伝子産物の収量を増加する問題に対す
る第２の一般的方法は、細胞による遺伝子産物の発現を
調節する制御因子を操作することである。目的遺伝子産
物の発現を調節する制御因子を操作する１つの方法は、
強力なプロモーターの選択による方法である。プロモー
ターは一般に、遺伝子産物をコードするDNA配列からの
メッセンージャーRNA（mRNA）の転写を開始するためにR
NAポリメラーゼが結合するDNA分子の領域として定義さ
れる。強力なプロモーターは、弱いプロモーターよりも
一層高頻度でRNAポリメラーゼによるRNA転写を開始し、
その結果、そのプロモーターと関連するDNA配列が転写
されて目的遺伝子産物をコードする一層多くのmRNA転写
物が形成される。

組換DNAの分野においては、強力なプロモーターを、
該強力なプロモーターから開始されるmRNA転写物が産生
されるように適切なリーディングフレーム内に、目的遺
伝子産物をコードする選択されたDNA配列に連結するこ
とは常法となっている。多数のプロモーターを選択され
たDNA配列に連結し、それによってRNAポリメラーゼがDN
A配列に結合する機会を増加し、そしてDNA配列から一層
多くのmRNA転写物を産生せしめることができる。この最
後の方法の例は、目的遺伝子産物をコードするDNA配列
の始めにタンデムlacオペロンプロモーターを使用する
ことである。

一層高レベルのmRNAの転写をもたらすためにRNAポリ
メラーゼの結合を増加するための他の方法は、目的遺伝
子産物をコードするDNA配列からmRNAを転写するRNAポリ
メラーゼの能力を低下せしめる傾向を有する制御因子
（regulatory factors）を除去することである。幾つか
の強力なプロモーターはそれと関連するアテヌエーター
領域を有し、この領域はある条件下で、結合したRNAポ
リメラーゼをして該アテヌエーター領域と関連するDNA
配列の転写を停止せしめる。１つのこのようなアテヌエ
ーター領域は、強力なプロモーターとして知られている
プロモーターの１つであるトリプトファンオペロンのプ
ロモーターと関連している。トリプトファンオペロンの
プロモーターのアテヌエーター領域を除去することによ
り、トリプトファンプロモーターは害されていない強力
なプロモーターとして機能することができる。

目的の遺伝子産物の収量を増加するための他の方法
は、選択されたDNA配列から転写されたmRNA転写物にリ
ボゾームが高い効率で結合するように、選択されたDNA
配列内に強力なリボゾーム結合部位を連結することであ
る。このような強力なリボゾーム結合部位を介してリボ
ゾームに対するmRNA転写物の親和性を増加することによ
り、mRNA転写物の翻訳が一層高頻度で生じ、従って目的
遺伝子産物の産生が増加すると信じられる。

目的遺伝子産物の発現を増加するための上記の技法の
すべては、目的遺伝子産物をコードするDNA配列の５′
−端に存在する制御配列の操作に関する。すべての場合
において、これらの制御配列は目的遺伝子産物をコード
するDNA配列の転写の開始、又は目的遺伝子産物をコー
ドするDNA配列に対応するmRNA転写物の翻訳の開始のい
ずれかに関する。

遺伝子の発現の他の形は種々のウィルス系において観
察されている。“レトロレギュレーション（retroregul
ation）”なる語はこの形の発現調節のために造られた
造語である。Court等、後記（1983）を参照のこと。先
行技術に記載されているように、レトロレギュレーショ
ンの既知の形は、レトロレギュレーションがその効果を
及ぼす遺伝子産物の発現を減少せしめることが常に見出
される。従って、既知の形のレトロレギュレーションは
負の（negative）レトロレギュレーションである。

バクテリオファージλにおいて、sibと称する３′−
末端配列によるインテグラーゼ（integrase）遺伝子（i
nt）mRNA配列の発現の制御がSohindler及びEchols“
バクテリオファージλのint遺伝子の制御：翻訳完了の
調節”、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acd.of S
ci.（USA），78:4475-4479（1981）に記載されている。
Schindler及びEcholsは、sib領域が発現の翻訳レベルに
おいてintmRNAからの蛋白質の合成の正常な完了を阻害
することにより作用すると仮定している。さらに、sib
制御領域がステムアンドループ（stem and loop）二次
構造デュプレックスを形成することができるmRNA領域に
対応することが仮定されている。sib領域はさらに、そ
れが制御する遺伝子の末端に近い、RNアーゼIIIのため
の開裂部位を与える領域を含むと信じられている。RNア
ーゼIIIのためのこの開裂部位は種々のエキソヌクレア
ーゼによる分解に対してmRNAを感受性にする。著者は、
mRNA転写物の分解によりint遺伝子産物の蛋白質合成が
早すぎる時期に停止されると仮定している。すなわち、
参照文献は、int遺伝子によりコードされるポリペプチ
ドの産生が減少する。sib制御配列の負の制御の役割を
開示している。Guarneros等、“遺伝子に遠位の部位か
らのバクテリオファージλint遺伝子発現の転写後調
節”、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ・オブ・アメリカ〔（Proc.Natl.Acd.of S
cl.(USA)〕、79:238-242（1982）は、機能的RNアーゼII
Iを欠く細菌宿主においてsib制御は不完全であることを
開示している。参照文献はさらに、sibレトロレギュレ
ーション因子に転写後に機能してintmRNAの分解を増加
せしめることによりmRNAの翻訳を阻害するとするSchind
ler及びEchols、前掲、に同意している。Court等、“λ
int遺伝子についてのレトロレギュレーション部部位の
検出分析”ジャーナル・オブ・モレキュラー・ビオロジ
ー（J.Mol.Biol.），166:233-240（1983）は、Guarnero
s等、前掲、の一般的教示に同意し、そしてさらに、sib
部位をコードするレトロレギュレーション因子のRNアー
ゼIII感受性構造は、エシュリシャ・コリ（Eschericha
coli）及びファージ中に見出される他のRNアーゼIII感
受性部位に類似していることを示唆している。

E.コリ（E.coli）における転写停止についての一般的
検討において、Holmes等、“E.コリにおける転写停
止”、セル（Gell）、32、1029-1032（1983）は、転写
ターミネーターをコードするDNAの一次構造は、対称的
グアニン−シトシン高含有配列のいずれかの側にアデニ
ン及びチミン塩基対の列を含有することを開示してい
る。これらの配列からのmRNA転写物は、いずれかの側に
ウリジン残基の列が続くステムアンドループ二次構造又
はヘアピンループ二次構造を形成する。このようなター
ミネーターはいずれかの方向においてターミネーターと
して機能する。しかしながら、文献はこの２方向ターミ
ネーター活性の意義は明らかでないことを強調してい
る。文献はさらに、ステムアンドループ構造を欠く転写
ターミネーターをコードするDNA配列のRNA転写物はその
ような構造を有するターミネーターより急速に分解され
るという事実を検討している。Platt及びBear、“転写
停止におけるRNAポリメラーゼ、ρファクター及びリボ
ゾームの役割”、ジーン・ファンクション・イン・プロ
カリオツ（Gene Function in Prokaryots）、Beckwith
等編、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、ニ
ューヨーク（1983）は、転写停止、及び転写停止の制御
におけるRNA転写物の末端の二次構造の役割について総
説している。著者はmRNA中の二次構造の幾つかの機能の
可能性を推論しており、その１つは完成されたmRNA転写
物のある点から後の３′エキソヌクレアーゼによる分解
に対する安定化を含む。しかしながら、mRNA転写物がコ
ードする遺伝子産物の発現の増強が見られるとする示唆
は存在しない。

Gents、R.“RNA停止シグナルの下流の置き換えによる
強力なプロモーターのクローニング及び分析が可能とな
る”、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッ
ド・ステイツ〔Proc.Natl.Acad.of Sci(usa)〕、78 493
6-4940（1981）は、プラスミドpLBU3において、バクテ
リオファージfd由来の強力な転写ターミネーターの、la
cプロモーター領域を欠くβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
のα−断片への付加がファージT5のための強力なプロモ
ーターのクローニングを可能にしたことを示している。
強力なプロモーターが、M15（lacα断片欠損株）補完検
定（complementation assay）における増加したβ−ガ
ラクトシダーゼ活性により単離された。dyad対称の領域
を有するfdターミネーターにより強力な転写停止活性が
示されたが、この強力な転写停止活性はGentz等により
記載された系において、fdゲノム中の本来の方法とは反
対の方向においてのみ報告された。pLUB3中のfd断片
は、fdゲノム中でのその活性と異り、ρファクターと共
働して転写を効果的に停止せしめる。しかしながら、fd
転写ターミネーターそれ自体がβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子の発現に対して増強効果を有することは、Gentz等
によって教示されておらず、又なんらの証明も示されて
いない。Gentz等は、測定可能なβ−ガラクトシダーゼ
活性を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−断片をコー
ドするDNA配列の５′末端に連結されたファージT5由来
の強力なプロモーターに帰している。

Flock等、“合成リボゾーム結合部位を用いるヒト−
ウロガストロンの遺伝子バシルス・ズブチリス（Bacill
us subtilis）における発現”、モレキュラー・アンド
・ゼネラル・ゼネティクス（Molecular and Genaral Ge
netics）195、246-251（1984）は、“（プラスミド）pF
F810中でバクテリオファージからの転写ターミネーター
fdをウロンガステロン遺伝子のすぐ後に置くことが、E.
コリにおいて全体的な発現を約５〜10倍改良する”と述
べている。fd転写ターミネーターシグナル、その配列、
ウロガステロン遺伝子の直接末端に対する方向及び配置
の詳細は記載されていない。Floch等のfd転写ターミネ
ーターは、B.ズブチリスにおいて非常に活性が高いと予
想される推定上強力なプロモーターと共に使用される。

幾つかの細菌において、多量に存在する細菌性蛋白質
又はリポプロテインと関連すると思われる比較的安定な
高コピー数mRNAが観察されている。例えば、バシルス・
チュリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）のcry
遺伝子からのmRNAが胞子形成中に発現される遺伝子の他
のmRNAよりも長い半減期を有することが報告されてい
る。Petit-Galtron,M.F.及びRapport,G.,“E.コリから
の無細胞系におけるB.チュリンジェシスの胞子形成細胞
からの安定なmRNAの翻訳",ビオケミー（Biochmie），5
8,119-129（1976）。この増加したmRNA安定性は胞子形
成中における結晶蛋白質の多量合成に寄与する因子とし
て長い間仮定されていた。

さらに、主要外層膜蛋白質の合成を指令するE.コリの
リポプロテイン（lpp）遺伝子からのmRNAは相対的に安
定であることが知られており、そして約−0.4〜約−21.
1kcal/moleの範囲ΔＧ°を有するステムアンドループ構
造の形で広範な二次構造を形成することができる配列を
有することが示されている。ナカムラ等，“E.コリ外層
膜IIのリポプロテインのメッセンジャーリボ核酸．完全
ヌクレオチド配列",ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）255:210-216（198
0）。ナカムラ等及びPetit-Galtron等のいずれも、これ
らの構造が目的遺伝子産物の発現を増強するために使用
することができることを示唆していない。さらに、クロ
ーン化されたcry遺伝子のヌクレオチド配列は、後に記
載するように、lpp遺伝子のmRNAと関連する広範な二次
構造を欠いている。

要約すると、一般にレトロレギュレーションに関する
従来技術は、既知のレトロレギュレーション配列は、そ
れらがレトロレギュレートする遺伝子の発現に対して負
の効果を有することを示している。ターミネーターに関
して、Gentz及びFlock等は、強力なプロモーターの調節
のもとにあるDNA配列については該DNA配列がコードする
遺伝子の効果的な発現が得られるが、そのような強力な
ターミネーターの非存在下では仮定の強力なプロモータ
ーの活性は明確に示され得ないことを示唆している。

（本発明の記載） 本発明者等は、選択された遺伝子産物をコードするDN
A配列に連結された場合に該選択された遺伝子産物の産
生を増加せしめる正のレトロレギュレーション因子を発
見した。

この明細書において、「選択された」又は「目的の遺
伝子産物」なる語は、ポリペプチド又は蛋白質をコード
するDNA配列を含んで成る組換DNA分子による原核生物宿
主又は真核生物宿主の形質転換によりそれらの宿主によ
り産生されるポリペプチド又は蛋白質を意味する。この
ような選択された又は目的の遺伝子産物は、宿主により
通常に、宿主以外の原核生物により、又は宿主以外の真
核生物により生産されるものである。この明細書におい
て「遺伝子」なる語は、ポリペプチド又は蛋白質をコー
ドするDNA配列を意味する。「発現」なる語は、DNA配列
又は遺伝子によりコードされているポリペプチド又は蛋
白質の産生について用いる。一般に、正のレトロレギュ
レーション因子は選択された遺伝子産物をコードするDN
A配列の下流に連結される。この明細書において、「下
流」なる語はDNA配列が対応するメッセンジャーRNAの転
写の方向に関して使用され、転写は上流から下流に進行
する。

正のレトロレギュレーション因子の位置は一般に、選
択された遺伝子産物をコードするDNA配列のコード鎖の
３′末端例である。遺伝子が発現されるために、選択さ
れた遺伝子産物をコードするDNA配列の３′末端に翻訳
終止コドンが一般に存在することがよく知られている。
典型的には、正のレトロレギュレーション因子は、選択
された遺伝子産物をコードするDNA配列に、該選択され
た遺伝子のための該DNA配列と関連する翻訳終止配列へ
の３′側に連結される。既知の翻訳終止配列は一般にヌ
クレオチドのトリプレットである。このような翻訳終止
コドンは配列TAG、TAA、及びTGAを用いるコドンを包含
し、ここで文字はDNA分子の構成成分であるチミン残
基、アデニン残基及びグアニン残基に相当する。翻訳終
止コドンは単独で、連続して対を成して、又は間に多数
のヌクレオチドを有する対として存在することができ
る。例えば、Watson J.D.,モレキュラー・バイオロジー
・オブ・ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gen
e）,W.A.Benjanin社，メンロパーク，カリホルニア（第
３版,1977）を参照のこと。翻訳終止シグナルは選択さ
れた遺伝子産物をコードするDNA配列に本来的なもので
あってもよく、あるいは、所望の位置に翻訳終止シグナ
ルを設けるために、選択された遺伝子産物をコードする
DNA配列の３′末端にそのシグナル自体が連結されても
よい。

正のレトロレギュレーション因子が連結される遺伝子
の３′末端から該因子までの距離は、該遺伝子の発現に
対する正の効果又は増強効果を及ぼす限りにおいて変化
することができる。後で非常に詳細に説明するように、
B.チュリンジェンシス結晶蛋白質をコードする遺伝子の
３′フランキング領域から単離された正のレトロレギュ
レーション因子の、選択された遺伝のmRNA転写物の末端
において「ステムアンドループ構造を形成すると信じら
れる特定の領域が、選択された遺伝子の３′末端から約
30〜約300ヌクレオチドの位置に連結された。両構成物
において、前記正のレトロレギュレーション因子が連結
された遺伝子の発現に対する正のレトロレギュレーショ
ン効果が示される。

後で例において詳細に示すように、正のレトロレギュ
レーション因子は、該正のレトロレギュレーション因子
の方向（orientation）とは無関係に、それらが連結さ
れた遺伝子の発現を増強することが示された。正のレト
ロレギュレーション因子が選択された遺伝子の３′末端
に連結される限り、該正のレトロレギュレーション因子
は３′−５′方向又は５′−３′方向を有することがで
きそしてなお選択された遺伝子の発現に対する増強効果
を発揮することが示された。

この発明の正のレトロレギュレーション因子は、Tino
co,I.等，ネイチュアー・ニュー・バイオロジー（Natue
r New Biology），246,40-41（1973）の方法により決定
された場合に約−30.4kcalのGibbsの自由エネルギー含
量（ΔＧ°）を有するステムアンドレープ構造を形成す
ることができる対応するRNA転写物を転写するDNA配列、
として構造的に特徴付けることができる。１つの効果的
な態様において、この発明の正のレトロレギュレーショ
ン因子は、約43％のグアニン−シトシン残基含量を有す
るステムアンドループ構造を形成することができる対応
するRNA転写物を転写するDNA配列である。約40％〜約45
％のグアニン−シトシン含量を有するそのようなステム
アンドループ構造もまた効果的な正のレトロレギュレー
ション因子であると予想される。このような正のレトロ
レギュレーション因子はこの発明の範囲内のものと意図
される。

この発明の好ましい態様において、正のレトロレギュ
レーション因子は、デオキシリボヌクレオ配列：AAAACG
GACATCACCTCCATTGAAACGGAGTGATGTCCGTTTT（この配列
中、下線を付した配列部分は逆方向反復塩基配列を構成
する）を含む逆方向反復塩基配列を有するDNA配列とし
て特徴付けられる。上記の逆方向反復塩基配列に対応す
るmRNA転写物はリボヌクレオチド配列：AAAACGGAAUCACC
UCCAUUGAAACGGAGUGAUGUCCGUUUU（この配列中、下線を付
したリボヌクレオチド配列部分は逆方向反復塩基配列で
ある）を有する。

上記のデオキシヌクレオチド配列及び対応するRNA転
写物の、ランダム変異、点変異、付加変異、欠失変異、
合成オリゴヌクレオチド指令変異又は合成オリゴヌクレ
オチドの造成により生ずる変形物が、正のレトロレギュ
レーション因子の正のレトロレギュレーション効果を維
持するであろう逆方向反復塩基配列を有することが予想
される。正のレトロレギュレーション因子の正のレトロ
レギュレーション効果を維持するそのような変形物は明
らかにこの発明の範囲内にある。

後で非常に詳細に記載するように、この発明の正のレ
トロレギュレーション因子は、B.チュリンジェンシス結
晶蛋白質をコードする遺伝子（cry遺伝子）の３′フラ
ンキング領域の部分から単離することができる。この
３′フランキング領域は、常用のゲル電気泳動法により
精製し、そして増幅のために適当な宿主にクローン化す
ることができる。この発明の１つの態様においては、後
で例においてさらに記載するように、その転写停止シグ
ナルを含むcry遺伝子の３′フランキング配列の部分が
単離され、精製され、そしてクローン化された。cry遺
伝子のこの部分は、約382ヌクレオチドの長さを有し、
すでに前記した正のレトロレギュレーション因子及びcr
y遺伝子の３′フランキング領域の部分を含み、そして
正のレトロレギュレーション効果を有する。

正のレトロレギュレーション因子が選択された遺伝子
産物を発現することができるDNA配列に前記のように適
切な関係に連結された場合、選択された遺伝子産物の発
現が増強される。従って、この発明は、選択された遺伝
子産物の発現を増強する方法を包含する。この明細書に
おいて、「選択された遺伝子産物を発現することができ
るDNA配列」とは、選択された遺伝子、例えばβ−ラク
タマーゼ又はインターロイキン−２の遺伝子であって、
それと関連するプロモーター、転写開始シグナル、リボ
ゾーム結合部位、翻訳開始シグナル及び翻訳終止シグナ
ルを有し、これらのすべてが、DNA配列がコードする生
成物が発現され得るように適切な関連及びリーディング
フレームにあるものを意味すると意図される。多くの適
切なプロモーターが当業者により知られており、これに
はE.コリ由来のプロモーター（トリプトファンプロモー
ター、lacプロモーター／オペレーター及び当業者によ
り知られているその他の多くのプロモーターを包含す
る）；バシルスのプロモーター（penＰプロモーターを
包含する）；並びに種々のウィルスプロモーター、例え
ばファージλのSp82プロモーター及びPLプロモーターが
含まれる。ウィルスプロモーターは、該ウィルスが一般
に感染する特定の細胞に依存して種々の細胞により認識
され得る。選択されたDNA配列はさらに、発現された遺
伝子産物が分泌されるようにシグナル配列、例えばpen
Ｐシグナル配列を含有することができる。シグナル配列
を含有する選択されたDNAがE.コリにおいて発現される
場合、発現生成物は一般にその細胞のペリプラズム空間
に分泌され、そして超音波処理によりペリプラズム空間
から放出され得るであろう。シグナル配列を含有する選
択されたDNAが例えばB.ズブチリスにより発現される場
合、選択された遺伝子産物は一般に培地に分泌され、該
培地から回収され得るであろう。

「選択された遺伝子産物を発現することができるDNA
配列」なる語はさらに、DNA配列がコードする遺伝子産
物の発現のために必要な因子、例えば酵素類（機能的RN
Aポリメラーゼを包含する）、トランスファーRNA、アミ
ノ酸、リボゾーム、並びに選択されたDNA配列の転写及
び翻訳のために必要な他の因子を含むことが意図され
る。

前記のことから、「選択された遺伝子産物を発現する
ことができるDNA配列」はベクター、例えばプラスミ
ド、及びこれにより形質転換された宿主細胞であって、
遺伝子を発現しそして該遺伝子によりコードされた遺伝
子産物を生成することができるものを包含することが理
解されよう。このようなプラスミド及び宿主の例は当業
者によりよく知られており、そして後記の例において詳
細に例示される。選択された遺伝子産物を発現すること
ができるDNA配列を担持するプラスミドのための適当な
宿主は原核細胞及び真核細胞である。原核生物は、真核
（true nucleus）を欠く生物と定義することができ、核
膜が存在せず、そして核構造が核領域又はヌクレオイド
（nucleoid）に集められている。原核生物の染色体は一
般に蛋白質と会合していない。

プラスミドのための適当な原核細胞は、グラム陰性細
菌及びグラム陽性細菌の両者である。グラム陽性又はグ
ラム陰性なる語は、それぞれグラム染料を取り込みそし
て維持することができる細胞及びグラム染料を維持する
ことができない細胞を意味する。適当なグラム陽性細菌
はバシルス（Bacillus）属に属するもの、そして特にB.
ズブチリスである。B.ズブチリスPSL1株（BGSC No IA51
0）が特に好ましい。

適当なグラム陰性細菌はエシェリシャ（Escherichi
a）属に属するものであり、そして特にE.コリMM294株及
びCS412株である。

真核細胞は、核膜により結合されており、そして中に
一般に蛋白質に結合している染色体が存在する真核を有
する細胞と定義することができる。真核細胞には植物細
胞、動物細胞及び菌類細胞が包含される。菌類細胞の
内、酵母、そして特にサッカロミセス（Saccharomyce
s）、そして特にサッカロミセス・セレビシエー（Sacch
aromyces cerevisiae）がこの発明の実施において有用
である。

選択された遺伝子産物を発現することができるDNA配
列を担持するための適当なプラスミドは、DNA配列がそ
れによって発現されるように宿主細胞を形質転換するこ
とができるプラスミドである。一般に、正のレトロレギ
ュレーション因子に連結された選択された遺伝子産物を
発現することができるDNA配列を、適当な形質転換され
た宿主中で発現することができる任意のプラスミド中に
配置することができる。従って、この発明は、正のレト
ロレギュレーション因子に連結された、選択された遺伝
子産物を発現することができるDNA配列を担持するプラ
スミド、及び該プラスミドにより形質転換された宿主細
胞を包含する。

E.コリを形質転換することができるプラスミドには、
例えばCol E1タイプのプラスミドが一般に含まれる。E.
コリを形質転換することができる他の適当なプラスミド
には、pSC101、pSF2124、pMB8、pMB9、pACYC184、pACYC
177、pCK1、R6K、pBR312、pBR313、pBR317、pBR318、pB
R320、pBR321、pBR322、pBR333、pBR341、pBR345、pBR3
50、pBR351、pML2、pML21、ColE1AP、RSF1010、pVH51、
pVH151、及びpVH153が含まれる。リコンビナント・モレ
キュラス・インパクト・オン・サイエンス・アンド・ソ
シェティー（Recombinant Molecules Inpact on Scienc
e and Society）,Beers.R.F.及びBassett,E.G.編，ラベ
ンプレス，ニューヨーク（1977）を参照のこと。pBRタ
イプのプラスミドにはpBR325、pBR327、及びpBR328が含
まれる。Soberon等，ジーン（Gene）,9:287-305（198
0）を参照のこと。他の適当なプラスミドが、DNAインサ
ーション・エレメンツ，プラスミズ・アンド・エピゾー
ムス（DNA Insertion Elements，Plasmids and Episome
s）,Bukhari等編，コールドスプリングハーバーラボラ
トリー（1976）を参照のこと。

B.ズブチリスを形質転換することができるプラスミド
には、pC194、pC221、pC223、pUB112、pT127、pE194、p
UB110、pSA0501、pSA2100、pTP4、pTP5〔Gryczan,T.J.,
“B.ズブチリス中での分子クローニング，ザ・モレキュ
ラー・バイオロジー・イン・ザ・バシリ（The Molecula
r Biology of the Bacilli）,Dubnau,D.編,310頁〕、及
びこれらの誘導体が含まれる。

この発明の実施において使用することができる、B.ズ
ブチリス及びE.コリの両者を形質転換することができる
プラスミドにはpDH5060、pLP1201（Ostroff等，後
記）、pO62165〔Gray,O.及びChang,S.,“E.コリ及びB.
ズブチリスにおけるB.リケニホルミス（B.licheniformi
s）β−ラクタマーゼ遺伝子の分子クローニング及び発
現",ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacterio
l．），145,422-428（1982）〕、pHV11、pHV12、pHV1
4、pHV16〔Ehrlich,S.D.,“B.ズブチリスにおけるDNAク
ローニング",プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシス・オブ・ザ・
ユナイテッド・ステイツ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），
75:1433-1436（1978）〕、及びpSYC130−２〔McLaughli
n等，後記；さらにOld,R.W.及びPrimrose,S.B.,“E.コ
リ以外の微生物中でクローニングするためのプラスミド
ベクター",プリンシプルス・オブ・ジーン・マニュプレ
ーション（Principles of Gene Manipulation）第２版,
Carr,N.6,Ingraham,L.L.,及びRittenberg,S.C.,編，カ
リホルニア大学出版，バークレイ,1981,48頁を参照のこ
と〕が含まれる。

S.セレビシエーを形質転換することができるプラスミ
ドには、pMP78、YEp13、pBTI1、pLC544、YEp2、YRp17、
pRB8（YIp30）、pBTI7、pBTI9、pBTI10、pAC1、pSLe1、
pJDB219、pDB248、及びYRp7が含まれる。

正のレトロレギュレーション因子に連結された、発現
可能な遺伝子産物をコードするDNA配列は、シストロン
的、すなわち単一のポリペプチドをコードするものであ
ってもよく、又はポリシストロン的、すなわち多数のポ
リペプチドをコードするものであってもよい。ポリシス
トロン的DNAに対するmRNAは単一のプロモーターの調節
のもとにある。このようなポリシストロン的DNA配列は
当業者によく知られており、そしてこれには例えば、E.
コリにおいてトリプトファンオペロンの調節のもとにあ
るトリプトファン生合成用遺伝子が含まれる。ポリシス
トロン的遺伝子はまた、一連の複数の目的遺伝子を単一
のプロモーターの調節のもとに連結することにより人工
的に形成することもできる。例えば、Flock,J.等，前掲
（1984）を参照のこと。

正のレトロレギュレーション因子に連結された、目的
遺伝子産物を発現することができる選択されたDNA配列
は、宿主のDNAに対して同種性（homologous）であって
もよく、又はこれとは異り、宿主のDNAに対して異種性
（heterologous）であってもよい。すなわち、例えば、
選択されたDNA配列が遺伝子産物を発現するために形質
転換された宿主細胞と同一の種であることができ、この
場合、ここで使用される選択されたDNA配列は同種性で
あると称する。例えば、この発明の選択された遺伝子産
物を発現することができる同種性遺伝子配列は、E.コリ
にとって本来的な遺伝子を担持するプラスミドにより形
質転換されたE.コリ宿主中で増強された発現を示す。１
つの例はE.コリβ−ガラクトシダーゼの産生であり、こ
こでは、増強された発現がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
の３′末端における正のレトロレギュレーション因子の
連結により介在される。

前記のように、正のレトロレギュレーション因子に連
結された、目的ポリペプチドを発現することができる選
択されたDNA配列は宿主にとって異種性であってもよ
い。このような異種性の増強された発現の多くの例が後
に詳細に記載されており、そしてこれには、B.ズブチリ
スにおけるB.リケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子
の、正のレトロレギュレーション因子に介在された増強
された発現;B.ズブチリス及びE.コリのごとき原核性微
生物における哺乳動物インターロイキン−２及び変異し
たインターロイキン−２遺伝子のごとき真核性遺伝子の
同様な発現、が含まれる。

この発明の他の観点においては、正のレトロレギュレ
ーション因子が、選択されたDNA配列によりコードされ
るmRNA転写物の半減期を延長する方法において使用され
る。例に詳細に示すように、正のレトロレギュレーショ
ン因子が選択されたDNA配列の３′未満に連結される場
合、該選択されたDNA配列によりコードされるmRNA転写
物の半減期が延長される。正のレトロレギュレーション
因子がこのmRNA半減期延長を行う機作は完全に理解され
ていない。観察されるmRNA半減期延長についての可能性
ある説明は、正のレトロレギュレーション因子のRNA転
写物が転写物の３′末端において開始されるmRNA転写物
の酵素的加水分解を防止する二次構造を担当するという
ことである。mRNA転写物の半減期を延長する方法は、正
のレトロレギュレーション因子をその３′−５′方向及
び５′−３′方向の両方において使用して証明された。

正のレトロレギュレーション因子は、選択されたDNA
配列が宿主生物にとって異種性である場合に、該DNA配
列によりコードされるmRNA転写物の半減期を延長するた
めに使用することができる。さらに、正のレトロレギュ
レーション因子の使用によって供されるmRNA転写物の半
減期の延長は、プロモーター、選択されたDNA配列及び
正のレトロレギュレーターがすべて宿主生物にとって異
種性である場合にも生ずる。プロモーター、選択された
DNA、又は正のレトロレギュレーション因子がそれぞれ
１つだけ、又は一緒に、宿主生物にとって異種性でない
場合のmRNAの半減期延長法もこの発明の範囲に入ると意
図される。

その３′末端に正のレトロレギュレーション因子を有
する選択されたDNA配列によりコードされたmRNA転写物
はそれらが転写された微生物内で延長された半減期を有
することが証明された。従って、このような微生物は選
択されたDNAをRNAに転写するための手段を提供する。選
択されたDNAをRNAに転写するための他の手段はこの発明
の範囲内で有用であると考えられる。すなわち、真核細
胞、例えばサッカロミセス又はキセノプス（Xenopus）
卵母細胞がDNAを転写するためのそのような手段と考え
られる。さらに、RNA転写に必要な成分、例えば緩衝
剤、DNA依存性RNAポリメラーゼ、イオン及びリボヌクレ
オチドトリホスフェートをその中に有する無細胞系がそ
の３′末端に連結された正のレトロレギュレーション因
子を有する選択されたDNA配列を転写して延長された半
減期を有するRNAを生成せしめるために有用であると考
えられる。

その３′末端に正のレトロレギュレーション因子を有
する選択されたDNA配列から転写されたmRNAの半減期の
延長は、リファンピシンのごとき転写阻害剤により処理
された細胞のmRNAに放射性ラベルされたDNAプローブを
ハイブリダイズせしめることにより直接測定することが
できる。正のレトロレギュレーション因子の使用により
得られる選択されたDNAの増強された発現が該選択され
たDNA配列によりコードされたmRNAの半減期の延長と実
質的に相互関連することが示された。

この発明の以上の要約から、正のレトロレギュレーシ
ョン因子、選択された遺伝子産物の発現が増強されるよ
うに選択された遺伝子産物を発現することができるDNA
配列に連結された正のレトロレギュレーション因子を担
持するプラスミド、増強されたレベルにおいて選択され
た遺伝子産物を発現するそのようなプラスミドにより形
質転換された細胞、及びこうして発現された選択された
遺伝子産物を本発明者等が提供したことが、当業者にと
って明らかであろう。

さらに、選択された遺伝子産物を発現することができ
るDNA配列を用意し、そして正のレトロレギュレーショ
ン因子を該DNA配列に、前記選択された遺伝子産物の発
現が増強されるような関連に連結することを含んで成
る、選択された遺伝子産物の発現を増強するための一般
的方法を提供したことが、当業者にとって明らかであろ
う。上記の、そして後で例において一層詳細に記載する
一般的方法は、目的とする遺伝子産物をコードするDNA
配列の原核性宿主又は真核性宿主における発現するため
に効果的であり、そして発現されるべきDNA配列がそれ
を発現する宿主細胞にとって同種性であっても又は異種
性であっても効果的であるように思われる。

次に、例によりこの発明を具体的に説明するが、これ
によりこの発明の範囲を限定するものではない。前記の
ごとく、この明細書に記載される発明は、種々のタイプ
の細胞による種々の遺伝子産物の発現の増強のために広
く適用することができ、このことは当業者にとって容易
に明らかであろう。下記の例は単に、以下に例示される
細胞又はプラスミド適用する場合のこの発明の詳細且つ
実際的な記載を提供することを意図するものである。

次に、後記の例において使用された制限エンドヌクレ
アーゼのリストを記載する。このリストの左欄は特定の
エンドヌクレアーゼの一般に使用されている名称であ
り、そして右欄はそれらが由来する生物である。挙げら
れた制限エンドヌクレアーゼは供給者により推奨される
緩衝液条件及び温度条件下で使用した。制限エンドヌク
レアーゼは、ニューイングランドビオラブス，ベドリ
ー，マサチューセッツ，米国；及びベセスダリサーチラ
ボラトリース，ガイザースベルグ，メリーランド，米国
を含む多くの商業的供給者から入手することができる。
特定の制限エンドヌクレアーゼが切断するヌクレオ配列
の特定は酵素供給者の製造カタログ、及び標準的参考書
中に見出すことができる。

この明細書において幾つかの慣用語及び略号を使用す
る。特にことわらない限り、これらは次の意味を有す
る。

“penP"なる語は、B.リケニホルミス（B.licheniform
is）749/C株のプレペニシリナーゼ遺伝子、又は文脈か
ら明らかな場合はその関連部分を意味する。penＰのス
クレオチド配列はKroyer,J.及びChang,S.,ジーン（Gen
e），15,343-347（1981）；及びNeugebauer,K.Sprenge
l,R.、及びSchaller,H.,ヌクレイック・アシズ・リサー
チ（Nucl.Acids Res．），9,2577-2589（1981）により
公表されている。

“コドン”は、相互交換可能に、（１）ポリペプチド
中のアミノ酸に翻訳されるmRNA中のリポヌクレオチドの
トリプレット、又は翻訳の開始又は終止のためのコー
ド、あるいは（ii）遺伝子中のデオキシリボヌクレオチ
ドのトリプレット（この対応するトリプレットがmRNA中
のリボヌクレアーゼのトリプレットに転写され、今度は
これがポリペプチド中のアミノ酸に翻訳される）、ある
いは翻訳の開始又は終止のためのコードを意味する。従
って、例えば、この明細書において“コドン”なる語を
使用する場合、５′−TCC−３′及び５′−UCC−３′は
いずれもセリンの“コドン”である。

“ヌクレオチド”、“デオキシヌクレオチド”、及び
“デオキシリボヌクレオチド”なる語はいずれもデオキ
シリボヌクレオチドを意味する。

“dNTP"又は“NTP"は、デオキシリボヌクレオチドト
リホスフェートのいずれか、すなわちATP、GTP、CTP又
はTTPを意味する。

“bp"は塩基対を意味し、そして“kd"はキロ塩基対を
意味する。

“ポリペプチド”は２個又はそれより多くのアミノ酸
から成る任意のペプチドを意味し、これには蛋白質が包
含される。

“コード配列”又は“DNAコード配列”は、ポリペプ
チドをコードするDNA配列を意味する。

“ATCC"は、アメリカン・タイプ・カルチュアー・コ
レクション，ロックビル，メリーランド，米国を意味す
る。番号を共に、例えば“ATCC37017"として使用される
場合、ATCCはATCCに寄託された生物のためのアメリカン
・タイプ・カルチュアー・コレクションの受託番号を意
味する。

“作動可能に連続された（operably linked）”なる
語は、DNA配列に関して使用される場合、それが通常の
機能を発揮することを許容するように該配列が並置され
た状態を意味する。例えば、コード配列に作動可能に連
結されたプロモーターは、該プロモーターが該配列の発
現を調節することができる場合のそれらの連結に関す
る。リボゾーム結合コード配列に作動可能に連結された
プロモーターは同じ意味をする。すなわち、それは、リ
ボゾーム結合部位（RBS）がRNA転写物の翻訳の開始に寄
与するように転写物中に位置することを許容する。開始
コドンに作動可能に連結されたRBSはこのコドンにおけ
る翻訳の開始を許容するように位置する。

この発明の方法は、遺伝子工学及び分子クローニング
の技法を用いる。遺伝子工学及び分子クローニングの一
般的技法は、Maniatis,T,、Fritach,E.F.、及びSambroo
k,J.,モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー
・マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l），コールドスプリングハーバーラボラトリー、1982:
及びメソズ・イン・エンチモロジー（Methods in Enzym
ology）Vol68,リコンビナントDNA,（Wu,R.編），アカデ
ミックプレス，ニューヨーク,1979に記載されている。

オリゴヌクレオチドの合成は、米国特許第4,415,734
号、並びにMatteuci等，ジャーナル・オブ・アメリカン
・ケミカル・ソシエテイー（J.Am.Chem.Soc.）103（1
1）:3185-3191（1981）;Adams等，ジャーナル・オブ・
アメリカン・ケミカル・ソシエテイー（J.Am.Chem.So
c.）105，（３）:661-663（1983）；及びBemcage等，テ
トラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Letters），22
（20）:1859-1867（1981）に記載されている方法を含む
多くの方法により実施することができる。

例1.3′−発現増強断片の調製 A.pES1 プラスミドpES1は、ヨーロッパ特許出願公開No 823 0
2 137.3（これを引用によりこの明細書に組み入れる）
に記載されている方法と同様にして、プラスミドpBR322
（ATCC 37017）と、B.チュリンジエンシス・バラエティ
ー・クリスタキHD−１（B.thuringiensis var.Kurstaki
HD−１の大プラスミド断片消化物とから調製された。p
ES1はまた、H.Schnepf及びH.Whiteley,プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・
アメリカ〔Proe.Natl.Acad.Scl.（USA）〕，78:2893-28
97（1981）、及び米国特許請求第4,448,885号（引用に
よりこの明細書に組み入れる）にも記載されている。E.
コリＫ−12/HB101中のpES1は、上記ヨーロッパ特許出願
の出願人により、ブタペスト条約に基いて、アメリカン
・タイプ・カルチュアー・コレクション，ロックビル，
メリーランドに寄託されている。その寄託番号はATCC31
995である。B.チュリンジエンシス・バラエティー・ク
ルスタキHD−１−Dipe1株は、ノーサン・レジョナル・
リサーチ・ラボラトリー・カルチェア・コレクション
（Northern Regional Research Laboratory Culture Co
llection,ペオリア，イリノイから、No B3792として入
手することができる。B.チュリンジエンシス・バラエテ
ィー・クルスタキHD−１は、アメリカン・タイプ・カル
チュア・コレクションからNo1615と入手することができ
る。

Schnepf及びWhiteley,前掲，及びH.Wong等，ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Jour.Biol.
Chem.），258,1960（1983）に記載されているように、p
ES1は、そのpBR322親のBamHI部位に挿入された、B.チュ
リンジエンシスからの30メガダルトンプラスミド、47メ
ガダルトンプラスミド、又はこれらのプラスミドの両方
からのSau3A1断片を有する。このSau3A1断片は、B.チュ
リンジエンシスのδ−エンドトキシン結晶蛋白質をコー
ドする遺伝子（cry遺伝子）を含有する。この遺伝子は
発現されて、プラスミドpES1により形質転換されたE.コ
リ中で、生物学的に活性な結晶蛋白質を生成する。

B.M13mp8EP1-cry遺伝子の３′末端のクローンプラスミ
ドpES1をPvuII及びEcoRIにより消化し、そして生じた2k
b断片をアガロースゲル電気泳動により単離した。この
方法は、Maniatis等，前掲,1982,164頁に従って行った
が、緩衝液として1/10×TEA（4mM Tris,0.1mM NaEDTA・
2H₂O,0.5mM酢酸ナトリウム）を使用した。この断片は、
結晶蛋白質遺伝子の３′末端から始まり、そして結晶蛋
白質遺伝子の転写停止シグナルを含む。

制限地図配置、及び転写停止シグナルがすぐ後に続く
翻訳終止コドンを含む断片の配列部分を第１図に示す。

次に、常用の連結法を用いて、2kb断片をファージM13
mp8（ベセスダリサーチラボラトリーズ社，ガイザーベ
ルグ，メリーランド，米国から入手することができる）
の複製型（RF）DNAをあらかじめSmaＩ及びEcoRIで消化
したものにクローン化した。得られたプラスミドをM13m
p8EP1と称する。E.コリJM103株をM13mp8EP1プラスミド
で形質転換した。

C.M13mp9NP3−cry遺伝子の３′−末端のサブクローニン
グ M13mp9NP3を次のようにして調製した。M13mp8 EP1 RF
DNAをNdeＩにより消化した。このNdeＩ末端を、E.コリ
DNAポリメラーゼＩクレノウ断片及びdNTPにより平滑末
端化した。この平滑末端化されたDNA分子をBamHIにより
さらに消化した。次に、cry遺伝子の転写停止シグナル
を担持する、NP3と称する385bpの断片を、Maxim等，プ
ロシーデイングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），7
4:560-564（1979）に記載されている方法を用いてアク
リルアミドゲル電気泳動により単離した。NP3をBamHI-S
maＩ消化したM13mp9 RF DNAにサブクローニングし、M13
mp9 NP3を形成した。

E.コリJM103を、M13mp9 NP3により形質転換した。

M13mp9 NP3中にクローン化されているNP3と称する断
片を第１図に示す。この図からわかるように、M13mp9 N
P3中にクローン化された断片は、M13mp8 EP1中の転写停
止シグナルの下流のNdeＩ部位とEcoRI部位の間に存在す
る約1.6kbのDNAを欠いている。

例2.正のレトロレギュレーション因子を含む合成遺伝子 A.pSYC667 プラスミドpSYC667はE.コリ中及びB.ズブチリス中で
複製することができる（第３図を参照のこと）。このプ
ラスミドは、E.リケニホルミス749/C由来プレペニシリ
ナーゼ（penＰ）の遺伝子を含有し、この遺伝子は、こ
のプラスミドにより形質転換されたE.コリ及びB.ズブチ
リス中で、penＰのために特に変異されたシグナル配列
の影響のもとで発現される。pSYC667により形質転換さ
れたB.ズブチリスにより、成熟ペニシリナーゼは細胞外
に培地中に分泌される。成熟ペニシリナーゼはpSYC667
により形質転換されたE.コリのペリプラズム空間に分泌
され、そしてNose1及びHeppe1,ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），241,3055
-3062（1966）、又はLunn及びPigiet,ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.），25
7,11424-11430（1962）の方法による超音波処理によっ
てペリプラズムから放出される。

pSYC667を次のようにして造成した。

B.リケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子は配列決定
されている。Kroyer,J.、及びChang,S.ジーン（Gen
e），15,343-347（1981）、並びにNeugebauer,K.等，ヌ
クレイック・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Res.），
9:2577-2588（1981）を参照のこと。本来のシグナル配
列は、アミノ酸位置27にシステインをコードするコドン
TGCを含有する。位置27のシステイン残基は、ペニシリ
ナーゼの膜結合リポプロテイン形の形成を導く事象の配
列部分として修飾される。Nielsen,J.B.K.,、Caulfiel
d,M.P.、及びLampen,J.O.,プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・サイエンシス
・オブ・ザ・ユニイテッド・ステイツ〔Proc.Natl.Aca.
Sci.(USA)〕，78:3511-3515（1981）；並びにLai,J.S.,
Sarvas,M.、Brammar,M.J.、Neugebauer,K、及びWu,H.
C.,プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・ザ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステイツ・オブ・アメリカ〔Proc.Natl.Aca.Sci.
(USA)〕，78:3506-3510（1981）。この生合成経路を特
異的に変化せしめるため、及びより多くの蛋白質を細胞
から分泌される（グラム陽性細菌、例えばB.ズブチリス
の場合）又はペリプラズム空間に分泌される（グラム陰
性細菌、例えばE.コリの場合）細胞外形に変えるため、
ペニシリナーゼシグナル配列遺伝子中のこの位置にシス
テインをコードする配列を変異せしめることが必要であ
る。

その簡単さと効率の高さの故に、システインからセリ
ンへの変異の造成のためにプライマー指令変異誘発法
〔Zoller,M.J.、及びSmith,M.,ヌクレイック・アシズ・
リサーチ（Nucl.Acids.Res.,），10,6487-6500（198）
を参照のこと〕を使用した。野性型ペニシリナーゼ（pe
nＰ）遺伝子配列を含有するDNA断片を単離した。具体的
には、HindIII部位及びBamHI部位間に位置するDNA断片
をプラスミドpSYC310−２から切り出した。McLaughlin
等，ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Re
s.）,3905-3919（1982）を参照のこと。プラスミドpSYC
310−２はB.ズブチリス及びE.コリのいずれにおいても
複製することができる。このプラスミドは、HindIII-Ba
mHI断片上にB.リケニホルミス749/Cからの野性型penＰ
遺伝子を担持する。当業者は、野性型penＰ遺伝子を、
それを担持する他の操作された組換体プラスミドから切
り出すこともできることを認識するであろう。このよう
なプラスミドの１つがB.ズブチリスのプラスミドpOG216
5である。pSYC310−２から切り出されたHindIII-BamHI
DNA断片を、アクリルアミドゲル溶出により精製し、そ
して次にコリファージM13mp9のRF DNAに連結した。Vier
a,J.,及びMessing,J.,ジーン（Gene），19:259-268（19
82）；及びMessing,J.、及びViera,J.、ジーン（Gen
e），19:269-276（1982）を参照のこと。

詳しくは、pSYC310−２からの精製されたHindIII-Bam
HI断片を、ベセスダリサーチラボラトリーズ社,P.O.Box
577,ガイザーブルグ,MDから得られたM13mp9をあらかじ
め制限エンドヌクレアーゼHindIII及びBamHIで消化した
ものに連結した。この２本鎖ファージDNAをE.コリJM103
に形質転換し、そして細胞を培養した。penＰ遺伝子を
担持する組換体ファージ、すなわち組換体ファージM13-
CM1を同定し、そしてこのクローンから単鎖DNAを調製し
た。使用した方法は、Zoller,M.J.及びSmith,M.,ヌクレ
イック・アシズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）,10:
6487-6500（1982）に記載されている。

Narang,S.A.,Hsiung,H.M.、及びBrousseau,R.,メソズ
・イン・エンチモロジー（Methods in Enzymology），6
8:90-97（R.Wu編）アカデミックプレス（1979）に記載
されているホスホトリエステル法により調製された15−
ヌクレオチド合成断片５′−GTTAGCGGATCCTGC−３′
を、まずATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて
５′−末端においてリン酸化し、そして次に５′−リン
酸化されたプライマーを鋳型M13-CM1 DNAにアニールさ
せた後、これをプライマーとして用いて相補鎖のイン−
ビトロ合成を開始した。DNAポリメラーゼエクレノウ断
片を用いて、T4リガーゼの存在下４種類すべてのdNTPと
共にプライマーを延長した。このプライマーは、25位〜
29位の５個のアミノ酸のコドンに対応するpenＰシグナ
ル配列セグメントのアンチ−センス鎖に相補的である
が、但し、合成スクレオチド中の中央のヌクレオチドが
ミスマッチヌクレオチドであり、このものは野性型pen
Ｐ遺伝子鋳型中の対応ヌクレオチドＧと相補的でない。
penＰ遺伝子へのミスマッチ配列の導入が27位における
システイン（TGCコドン）からセリン（TCCコドン）への
転換を生じさせる。

コードされたペプチド上での変化は、本質上、システ
イン₂₇の−SH基からセリン₂₇の−OH基への転換である。
ヌクレオチドのレベルにおいては、変異体は変異座にお
いてBamHI部位（GGATCC）を得、そしてHhaＩ部位（GCG
C）を失う。新たなBamHI部位は“ＧからＣへ”のヌクレ
オチド変異を有する変異体を同定するために使用される
表現型である。

システインからセリンへの変異の造成において、相補
鎖（マイナス鎖）はE.コリDNAポリメラーゼＩのクレノ
ウ断片を用いるM13-CM1ファージDNA鋳型上でのプライマ
ー延長反応により合成された・Zoller,M.J.及びSmith,
M.,ヌクレイック・アシズ・リサーチ（Nucl.Acids Re
s），10:6487-6500（1982）を参照のこと。この反応中T
4-DNAリガーゼの存在下で、DNA分子のフラクションは２
本鎖の共有結合的に閉じられたリラックスサークルに転
換した。これらの分子を、ポリメラーゼにより不完全に
延長されたか又はプライマーの不完全なキナーゼ反応の
ために連結されなかった他の分子から分離した。この分
離はアガロースゲル電気泳動により行った。この電気泳
動は、２μg/mlのエチジウムプロミドの存在下0.8％ア
ガロースゲル上に反応混合物を適用することにより行っ
た。共有結合的に閉じられた環状DNAを含有するバンド
を切り出し、そしてDNAを回収した。

プラスミドpSYC667は次の点を除きpSYC660と同じであ
る。すなわち、pSYC660中の約1320bpHindIII-BamHI断片
の末端におけるBamHI認識配列（５′−GGATCC−３′）
の代わりに、pSYC667は配列５′−GGATCCATCC−３′を
有する。

プラスミドpSYC667はプラスミドpSYC660のPatＩ及びB
glII認識部位を保持している。同様に、penPS₂₇Ｐ₂₈遺
伝子を含有するM13penPS₂₇Ｐ₂₈のHindIII-BamHI断片
は、pSYC667中のHindIII-BamHI-penPS₂₇含有断片中のPa
tＩ部位及びBglII部位と同じ位置に、それぞれPatＩ部
位及びBglII部位を有する。

pSYC667はATCC No39758として、ブタペスト条件に基
きATCCに寄託される。

B.pHCW3-A3 プラスミドpSYC667をBclＩで消化した。BclＩはB.リ
ケニホルミスのペニシリナーゼ遺伝子中の翻訳終止コド
ンと転写停止シグナルとの間を切断する。BclＩ末端
を、DNAポリメラーゼエクレノウ断片及び４種類のdNTP
を用いてフィル−インした。この方法は当業者によく知
られている（Maniatis等，前掲（1982）を参照のこ
と）。酸素をフェノール抽出により不活性化し、そして
DNAをエタノール沈澱により回収した。

次に、DNAをさらにNruＩにより消化し、そしてフェノ
ールで２回抽出し、そして次にエーテルで２回抽出し
た。NruＩは、pSYC667中のB.リケニホルミスのペリシリ
ナーゼ遺伝子の転写停止シグナルの下流を切断する。従
って、pSYC667の大NruI-BclＩ切断断片は翻訳終止コド
ンまでの完全なペニシリナーゼ遺伝子を含有するが、転
写停止シグナルを含有しない（第３図を参照のこと）。

M13mp9 NP3をEcoRI及びBamHIで切断し、そして400bp
断片を１％アガロースゲルを用いて標準的方法により単
離し、そしてDE-52クロマトグラフィーにより精製し
た。このような方法はManiatis等，前掲,104（1982）に
記載されている。

次に、M13mp9 NP3からのEcoRI-BamHI 400bp断片を、
標準的方法を用いてpSYC667の大NruI-BclＩ断片に連結
した。得られたプラスミドを、Cohen等の方法〔プロシ
ーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ
・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),69:211
0（1973）〕（さらに、Maniatis等，前掲,1982,250頁を
参照のこと）の方法によりE.コリＫ−12/CS412に形質転
換した。50μg/mlのアンピシリンを含有するLB培地プレ
ート上で、形質転換体を耐性について選択した。Maniat
is等，前掲,440（1982）。選択された形質転換体から、
Birnboim及びDoly〔ヌクレイック・アシズ・リサーチ
（Ncul.Acids Res.）,1:1513（1979）〕のミニ−プレプ
法によりプラスミドDNAを調製し、そして予想される1.6
kbEcoRI断片、すなわちM13mp9 NP3由来の約0.4kbの断片
及びpSYC667からの約1.2kbの断片、を有するプラスミド
についてスクリーニングした。１つの形質転換体がpHCW
-A3と称するプラスミドを有していた。

B.1.pHCW-A3によるB.ズブチリスの形質転換pHCW-A3をさ
らに、B.ズブチリスPSL1,バシルス・ゼネティック・ス
トック・センターNoIA510（オヒオ州立大学微生物学部
バシルス・ゼネティック・ストック・センター，コロン
ビア・オヒオ・米国）に形質転換した。B.ズブチリスPS
L1はLeu^-,Arg^-,Thr^-，及びrecE4である。

B.ズブチリスPSL1細胞の培養物を、Anagnostopoulos
及びSpizizen,ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（J.Bacteriol.）,741-746（1961）により記載されてい
る技法に関連する技法を用いて形質転換のためにコンピ
テントにした。

20gの（NH₄）₂SO₄,140gのＫ₂HPO₄,60gのKH₂PO₄及び10
gのクエン酸ナトリウムに蒸留水を加えて全容１にし
て混合することにより、10×SpizizenI最少溶液を調製
した。

SpizizenI培地は、2.05mlの1M MgSO₄;6mlの50v/v％グ
ルコース;5mlの10w/v％酵母エキス;5mlの2w/w％カゼイ
ン加水分解物；形質転換されるべき菌株により要求され
る各アミノ酸のために、アミノ酸の1w/w％溶液2.5ml;50
mlの10×SpizizenI最少溶液；及び溶液の容積を500mlに
するのに十分な蒸留水を混合することにより調製した。
B.ズブチリスPSL1のために必要なアミノ酸はスレオニ
ン、アルギニン及びロイシンである。

SpizizenII培地を、500mlのSpizizenI培地に0.25mlの
1MCaCl₂及び1mlの1MMgCl₂を添加することにより調製し
た。

30mlのSpizizenI培地に形質転換されるべきB.ズブチ
リスの株の胞子懸濁液を接種し、そして37℃にて一夜
（16〜20時間）増殖せしめた。

次に、15mlの一夜培養物を、2800mlのフラスコ中135m
lのSpizizenI培地に接種し、そして37℃にて増殖せしめ
た。この培養物の600nm（O.D.）における光学濃度を1.5
〜２時間後に測定し、そしてさらに、15分間のO.D.の読
み値の増加が５％未満となることを基礎にして培養物が
後期対数増殖期にあることが見出されるまで、15分ごと
に測定した。

次に、50mlの後期対数増殖期培養物を2800mlのフラス
コ中450mlのSpizizenII培地に接種し、そして37℃にて
1.5時間増殖せしめた。1.5時間の増殖の後、４℃にて10
分間5000rpmで遠心分離することにより細胞を回転沈澱
せしめた。

次に遠心分離からのペレットを45mlの上清液に再懸濁
し、次にこの懸濁液に6mlの80v/v％無菌グリセリンを加
え、その直後にドライアイス−エタノール浴（−70℃）
中で培養物を凍結した。凍結した培養物中の細胞はコン
ピテント細胞であり、次のようにして所望のプラスミド
により形質転換するために適当であった。

0.5ml〜0.6mlの凍結されたコンピテント細胞含有培養
物を氷上で解凍し、そして該細胞に形質転換されるべき
プラスミドを含有する溶液５μl50μｌを、上記の解凍
した培養物と一緒にした。得られた混合物を37℃にて２
時間振とうし、この間にプラスミドの形質転換及び遺伝
子の発現が生じた。

最後に、選択のため、小アリコート、例えば約５〜約
200μｌの形質転換された細胞の培養物を、選択のため
に望ましい抗性物質（１種類又は複数種類）を含有する
プレートに移した。

プラスミドにより形質転換されたE.コリＫ−12/CS4-1
2から前記のようにしてプラスミドpHCW-A3のミニ−プレ
プを調製した。コンピテントB.ズブチリスPSL1の培養物
1mlに５μｌのミニ−プレプ−プラスミドDNA溶液を加え
た。この混合物を37℃にて２時間インキュベートした。
次に、混合物のアリコートをプレートし、そして５μg/
mlのクロラムフェニコールを加えた富栄養寒天プレート
（牛肉エキス1.5g/l;酵母エキス3.0g/l;ペプトン6.0g/
l;寒天15.0g/l）上で37℃にて一夜インキュベートし
た。クロラムフェニコール耐性コロニーを拾い上げ、そ
して５μg/mlのクロラムフェニコールを含有する5mlの
２×LB培地に接種し、そしてこの培養物を振とうしなが
ら37℃にて一夜インキュベートした。

上記のようにして調製された、pHCW-A3により形質転
換されたB.ズブチリスPSL1の培養物のサブカルチュアー
はNo2120としてCMCCに寄託されている。

C.pLW1 プラスミドpLW1はE.コリ中で複製することができるpB
R322誘導体であり、テトラサイクリン耐性遺伝子、E.コ
リtrpプロモーター、リボゾーム結合部位（RBS）断片、
及びヒト−インターロイキン−２（IL−２）の遺伝子を
含有する706bp HindIII-PstI DNA断片を含有する〔Rose
nberg,S.A.等，サイエンス（Science），223:1412-1415
（1984）〕。pLW1はブタペスト条約に基き、ATCC No394
05としてATCCに寄託されている。

D.pLW45 プラスミドpLW45はE.コリ中で複製することができるp
BR322の誘導体であり、テトラサイクリン耐性遺伝子及
びE.コリtrpプロモーターを含有する。このプラスミド
は706bp HindIII-PstＩ断片上に変形されたLI−２蛋白
質の遺伝子を含有する。

pLW45はブタペスト条約に基きATCC No39629としてATC
Cに寄託されている。

pLW45によりコードされた変形されたIL−２、及び免
疫系の抑制を含むヒトの疾患の治療におけるこのような
変形されたIL−２蛋白質の使用は1983年11月14日に発行
されたベルギー特許No898,016に記載されている。この
記載を引用によりこの明細書に組み入れる。

E.pHCW701及びpHCW702 供給者により示唆された緩衝液条件下でEcoRI及びBam
HI制限エンドヌクレアーゼで消化することにより、M13m
p90 NP3からcry遺伝子の転写停止シグナルを担持する40
0bp_EcoRI-BamHI制限断片を切り出した。この断片のEcoR
I-BamHI末端をクレノウPolI断片及びdNTPにより平滑末
端化した。crp遺伝子の転写停止シグナルを含有する平
滑末端化された断片をアクリルアミドゲル電気泳動によ
り単離した。この単離された平滑末端化断片を電気溶出
し、そしてT4リガーゼ及びATPを用いて、StuＩ制限エン
ドヌクレアーゼであらかじめ消化されたプラスミドpLW1
に連結した。

転写停止シグナルを担持する平滑末端化断片がpLW1の
StuＩ末端に組み換えられる方向付けには無関係に、も
とのEcoRI部位及びBamHI部位の両者が再形成されるであ
ろう。１つの方向付けが、BamHI部位がIL−２の３′末
端に近い方に位置する結果をもたらし、そしてこのよう
に特徴付けられたプラスミドをpHCW701と称する。（こ
の方向付けは、cry遺伝子自体の中に見出されるそれに
類似する。）他の方向付けは、EcoRI部位がIL−２遺伝
子の３′末端に近い方に位置する結果をもたらし、そし
てこの組換プラスミドをpHCW702と称する（第３図）。
第１図に示すようにEcoRI-BamHI断片中の逆方向反復塩
基配列の非対称的配置のため、pHCW701においては正の
レトロレギュレーション因子のステムアンドループ構造
はIL−２遺伝子の３′末端のBam部位の約310bp下流に位
置する。pHCW702においては、正のレトロレギュレーシ
ョン因子のステムアンドループ構造はIL−２遺伝子の
３′末端のEcoRI部位の約30bp下流にある。

pHCW701及びpHCW702は、プラスミドDNAを制限酵素Eco
RIで消化しそしてアクリルアミド又はアガロースゲル電
気泳動を用いて制限断片のサイズを決定することにより
容易に区別することができる。EcoRIで消化されたpHCW7
01は、trpプロモーター−RBSカセット（108bp）、IL−
２遺伝子（450bp）及びターミネーター（400bp）を含有
する960bp制限断片を放出する。しかしながら、EcoRIで
消化されたpHCW702は、trpプロモーター−RBSカセット
（108bp）及びIL−２遺伝子（450bp）のみを含有する56
0bp制限断片を放出する。

F.pHCW801の造成 プラスミドpLW45による変形されたIL−２の製造に対
する正のレトロレギュレーション因子の効果を評価する
ためにpHCW801を造成した。プラスミドpHCW701をBamHI
で消化し、そして前記のようにしてクレノウPolI断片及
びdNTPにより末端を平滑末端化した。平滑末端化BamHI
断片をAvaＩにより消化した。得られる最大断片は2.7kb
であり、そして１つの平滑BamHI末端及び１つのAvaＩ末
端を有していた。この断片を0.8％アガロースゲル電気
泳動により精製した。このものは３′発現増強配列を含
有する。

プラスミドpLW45をStuＩ制限エンドヌクレアーゼによ
り、そして次にAvaＩ制限エンドヌクレアーゼにより消
化した。約2.3kbの断片を、アガロースゲル電気泳動に
より消化物から精製し、電気溶出し、そしてT4リガーゼ
及びATPを用いて、プラスミドpHCW701由来のBam平滑末
端とAvaＩ末端とを有する断片（正のレトロレギュレー
ション因子を含有する）に連結した。テトラサイクリン
耐性形質転換体をプラスミドDNAのミニ−プレプ単離に
より分析し、そして、変形されたIL−２遺伝子及びレト
ロレギュレーション因子の両者を含有するEcoRI断片の
存在についてスクリーニングした。Birnbam及びDoly,前
掲（1979）。

G.pHCW301 1.プロモーター156: バクテリオファージSP82の240bpHhaＩ制限断片上に位
置する、B.ズブチリス栄養細胞RNAポリメラーゼにより
認識されるプロモーターは最近、DNA制限断片プローブ
分析及びB.ズブチリスRNAポリメラーゼ結合及び開始ア
ッセイにより発見された。Jones,B.B.、Chan,H.、Roths
tein,S.、Wells,R.D.及びReznikoff,W.S.,プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ
・アメリカ〔Proc.Natl.Acad.Scl.(USA)〕，74,4914-49
18（1979）。240bp HhaＩ断片をHhaＩにより消化された
SP82からゲル電気泳動により単離し、そして300mM NaC
l,60mM SO₄及び50mM酢酸ナトリウムを含有する緩衝液
（pH4.6）中2200/mlのS1ヌクレアーゼを用いて不対合ヌ
クレオチドを除去することにより末端を平滑化した。Ma
niatis等，前掲,140頁。次に、この平滑末端断片を、あ
らかじめHincIIにより消化されたM13mp7 RF DNA（ベセ
スダリサーチラブスから得られる）のHincII部位にクロ
ーン化した。DNA配列分析は、RBC配列が、プロモーター
配列を担持するHhaＩ制限断片の３′末端に位置するこ
とを示した。RBS配列を取り出すため、240bpHhaＩ断片
をAluＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。150bp Hha
I-AluＩ制限断片をアクリルアミドゲル電気泳動により
単離した。プロモーターがこの150bp制限断片上に存在
することがDNA配列分析により知られた。次にこの150bp
制限断片を、あらかじめHincII制限エンドヌクレアーゼ
で消化されたM13mp7 RF DNAのHincII部位にサブクロー
ン化することによりM13mp7-p156と称するファージを形
成した。

2.リボゾーム結合部位： 次に配列：（１）５′−CGATAAGAGGAGGTA−３′、及
び（２）５′−AGCTTACCTCCTCTTAT−３′を有する２つ
の合成オリゴヌクレオチドを調製した。

500pmoleずつの各オリゴヌクレオチドを混合し、そし
てポリヌクレオキナーゼ及びATPによりリン酸化した。
次に、リン酸化されたオリゴヌクレオチドを68℃にて１
時間、そして次に37℃にて３時間アニールした。次に、
次の配列： を有するアニールしたオリゴマーをpUC8-41のClaI-Hind
III部位に、T4リガーゼを用いて、オリゴマーとベクタ
ーの比が約10:1の連結条件下でクローン化した。pUC8は
商業的に入手可能であり（ベセスダリサーチラボラトリ
ーズ，ガイザーベルグ，メリーランド，米国）、これを
次のようにして変形してpUC8-41を得た。pUC8をBamHIで
消化し、そして末端をクレノウPolI断片により平滑化し
た。再環化された、BamHIが修復されたpUC8を含有する
E.コリJM103の白色コロニーを選択した。これらの形質
転換体からのプラスミドDNAをPatIにより線状化し、そ
して末端をクレノウPolI断片により切り取った。この方
法によりlacＺについての正しいリーディングフレーム
が回復し、そして連結の後JM103の青色形質転換体が選
択された。BamHI部位の修復により、DNAメチラーゼ欠損
（Dam ^-）E.コリ宿主から調製されたDNA中にClaＩ部位が
生ずるので、pUC8-41は、ClaＩによる線状化により確認
された。制限酵素分析及びヌクレオチド配列決定を用い
て、pUC8-41-RBS1と称する造成された組換プラスミドが
合成リボゾーム結合部位の１つのコピーを確かに担持し
ていることが決定された。

3.pLP1201-p156-RBS1の造成 pUC8-41-RBS1中の合成リボゾーム結合部位を、このプ
ラスミドのEcoRI-HindIII 2重消化により回収し、そし
てアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。EcoRI-
HindIII断片を、EcoRI及びHindIII制限エンドヌクレア
ーゼであらかじめ消化したプラスミドpLP1201にサブク
ローン化しpLP1201-RBS1を形成した。Ostroff,G.R.及び
Pene,J.M.,モレキュラー・アンド・ゼネラル・ゼネティ
クス（Mol.Gen.Genet.），193:306-311（1984）。E.コ
リCS412株を常法によりプラスミドpLP1201-RBS1で形質
転換した。Cohen等、前掲（1973）。プラスミドpLP1201
-RBS1を担持するE.コリ形質転換体はアンピシリン耐性
でありそしてテトラサイクリン感受性であった。

次に、プロモーターp156をM13mp7-p156 RF DNAからEc
oRI制限エンドヌクレアーゼを用いて切り出し、そし
て、EcoRI制限エンドヌクレアーゼによりあらかじめ消
化されたpLP1201-RBS1のEcoRI部位にサブクローン化し
た。望ましい組換プラスミドpLP1201-p156-RBS1は、こ
のプラスミドにより形質転換されたE.コリ宿主にアンピ
シリン及びテトラサイクリン耐性を付与する。

4.プラスミドpHCW300（pLP1201-p156-IL−２）の造成 PHCW300をpLW21及びpLP1201-RBC1-p156から造成し
た。pLW21はpBR322に由来し、そしてIL−２をコードす
る領域を含む570bpEcoRI-BanII配列を含有する。pLW1を
EcoRI及びBanIIエンドヌクレアーゼで消化することによ
り得られた570bpEcoRI-BanII配列をEcoRI及びBanIIによ
りあらかじめ完全消化したpBR322に連結することにより
pLW21を造成した。このEcoRI-BanII断片がテトラサイク
リン耐性遺伝子の部分を含むpBR322中の485bpEcoRI-Ban
II断片と置き換わることにより、テトラサイクリン感受
性のpLW21が生ずる。pLW21をHindIII制限エンドヌクレ
アーゼで消化し、次にNruＩ制限エンドヌクレアーゼで
消化した。２つの断片が生じ、そして約400bpの長さのH
indIII−NruＩ断片をアクリルアミドゲル電気泳動によ
り単離した。プラスミドpLP1201-RBC1-p156をHindIII及
びNruＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、除去された
テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する領域を有する線
状化されたプラスミドを形成した。この線状化されたプ
ラスミドをpLW21からの400bpHindIII-NruＩ断片と混合
し、そしてT4リガーゼを用いて連結して、そして、p156
プロモータ、前記のRBS及びIL−２をコードするDNA配列
を有する400bp配列を有する400bp配列を有するpHCW300
と称するプラスミドを生成せしめた。アンピシリン耐性
形質転換体のレプリカプレートによりE.コリのテトラサ
イクリン感受性形質転換体を得、そしてHindIII及びAva
Ｉ制限エンドヌクレアーゼを用いて約7kb及び0.85kbの
２個の断片を生成するプラスミドpHCW300の存在につい
てスクリーニングした。

5.プラスミドpHCW301（pLP1201-RBC1-p156-IL−２−レ
トロレギュレーター）の造成 プラスミドpHCW701をEcoRI制限エンドヌクレアーゼで
消化し、そして末端をクレノウPolI断片及びdNTPで平滑
化した。HindIII制限エンドヌクレアーゼで消化した
後、IL−２遺伝子及び正のレトロレギュレーション因子
を含有する約0.85kb断片をアガロースゲル電気泳動によ
り単離した。プラスミドpLP1201-RBS1-p156をHindIII及
びNruＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、テトラサ
イクリン耐性遺伝子を含有する領域を切除した。IL−２
遺伝子及び正のレトロレギュレーション因子を含有する
0.85kb EcoRI（平滑）−HindIII断片を、連結条件下T4
リガーゼを用いて、HindIII-NruＩで消化されたpLP1201
-RBS1-p156ベクターに連結した。アンピシリン耐性形質
転換体をレプリカプレートすることによりE.コリのテト
ラサイクリン感受性形質転換体を得、そしてEcoRI制限
エンドヌクレアーゼを用いてプラスミドpHCW301につい
てスクリーニングした。pLP1201-RBS1断片、IL−２遺伝
子−正のレトロレギュレーション因子断片、及びプロモ
ーター断片の予想されるサイズにそれぞれ対応する約7k
b、0.88kb、及び156bpの３つの断片が生じた。

例3.正のレトロレギュレーション因子が挿入された遺伝
子による増強された蛋白質の発現 A.B.リケニホルミスのペニシリナーゼの発現のアッセイ
法 1.E.コリにおいて 50μg/mlのアンピシリンを含有する5mlのYTブロス（8
g/lトリプトン,5g/l酵母エキス,5g/l NaCl）に、pSYC66
7又はpHCW-A3を担持するE.コリＫ−12/CS412の個々のコ
ロニーを接種し、そしてニユーブランスウィックロータ
リーインキュベーター中で振とうしながら37℃にて一夜
増殖せしめた。次に、ベックマンモデルＪ−21C遠心機
のJA-20ローター中で5,000rpmにて10分間、細胞をペレ
ット化した。細胞ペレットを5mlの氷冷した50mMリン酸
緩衝液pH7.0により洗浄した。洗浄された細胞ペレット
を0.5mlの50mMリン酸緩衝液に再懸濁し、そしてブラン
ソン350ソニファーを用いて、最高出力にて３分間０℃
にて0.5秒バーストで超音波処理した。超音波処理物を
エッペンドルフミクロフェージ中で２分間回転せしめ
た。得られた上清を酵素活性の測定のために使用した。

B.リケニホルミスのペニシリナーゼの産生を、Schind
ler及びHuberの方法により色原体β−ラクタマーゼ基質
PADAC（カル・ビオケムから商業的に入手できる）を用
いて測定した。Schindler,P.及びHuber,G.,“β．−ラ
クタマーゼ生産生物の検出及びβ−ラクタマーゼ阻害剤
／不活性化剤の測定のためのPADAC,新規な色原体β−ラ
クタマーゼ基質，の使用",エンザイム・インヒビターズ
（Enzyme Inhibitors）,Brodbeck,U.編，ウァインハイ
ム：フェルラークケミー,1980,169-176頁。リン酸緩衝
液（pH7.0）中OD₅₇₃＝１（約27.4μＭ）を有する溶液を
作ることによりPADAC基質（MW562.7）を調製した。細胞
抽出物を添加した後、573nmにおける吸収の減少を室温
にてCary219分光光度計を用いて測定した。結果を第１
表に示す。

2.B.ズブチリスにおいて B.ズブチリスを、Anagnostopolus及びSpizizen,前掲
（1961）に関連する方法に従ってpSYC667又はpHCW-A3に
より形質転換し、そして前記の富栄養培地寒天上にプレ
ートし、そして37℃にて一夜増強せしめた。５μg/mlの
クロラムフェニコールを含有する２×LB培地5mlに個々
の形質転換体を接種し、そしてニューブランスウィック
ロータリーインキュベーター上で振とうしながら37℃に
て一夜増殖せしめた。次に、上記のようにして、JA-20
ローター中で10分間5000rpmにて細胞をペレット化し
た。この上清液を用いて、E.コリについて上記したのと
同じ方法により、ペニシリナーゼの測定を行った。結果
を第１表に示す。

B.IL−２の発現の測定法 1.E.コリにおいて pHCW701、pHCW702、又はpLW1により形質転換されたE.
コリK12/MM294の振とうフラスコ培養物をトリプトファ
ン（trp）含有Ｎ培地（0.7％Na₂PO₄,0.3％KH₂PO₄,0.5％
NaCl,0.1％NH₄Cl,0.2％グルコース,0.5％カザミノ酸,40
μg/ml trp,及び10μg/mlテトラサイクリン）10ml中
で、ニューブランスウィックロータリーインキュベータ
ー中で振とうしながら37℃にて一夜増殖せしめた。5ml
の一夜培養物からの細胞をJA-20ローター中で10分間500
0rpmにて遠心することによりペレット化した。この細胞
ペレットを、２μg/mgのチアミンを含有しtrpを含有し
ないＮ培地5ml中に懸濁した。分光光度計中での600nmに
おける吸収（OD₆₀₀）により光学濃度を決定した。trpを
含まないＮ培地中で0.05のOD₆₀₀を有するサブカルチュ
アー25mlを調製し、そして37℃にて振とうしながら約0.
3の最終OD₆₀₀まで増殖せしめた。対照を調製し、そして
Ｎ培地がトリプトファンを欠くほか同じ条件下で増殖せ
しめた。次に細胞をペレット化し、そしてIL−２超音波
処理緩衝液（50mM Tris,pH7.5,50mM EDTA,15％シューク
ロース,1％SDS）中に再懸濁して最終Ob₆₀₀が10となるよ
うにした。細胞を前記のようにして超音波処理した。Gi
llis,S.等，ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immun
ol.），120,2027-2032（1978）に記載されている方法に
より上清液をIN−２活性の存在について測定した。結果
を第２表に示す。

2.発酵培養 pHCW801又はpLW45で形質転換されたE.コリＫ−12/MM2
94−１を、10lの発酵槽中で、37℃、350〜1200rpm、０
〜2l/m（1pm）の空気及び０〜5lpmの酸素（溶存酸素約4
0％）にて発酵させた。培地は72mM（NH₄）₂SO₄,21.6mM
KH₂PO₄,1.5mMクエン酸ナトリウム,1.5mg/l TK−９微量
元素、及び次の無菌添加物:3mM0.5％MgSO₄,20mg/l 1％
チアミン−HCl,72mM0.2M FeSO₄,5g/l 50％グルコース,7
0mg/l 0.5％Ｌ−トリプトファン、5mg/l 1％テトラサイ
クリン，及び100ml/l 20％カザミノ酸（OD₆₈₀＝15〜20
において添加）から成る。接種物は20mg/lであり、そし
てpHは5N KOHにより6.8に制御した。グルコース濃度を
５〜10g/lに維持するためにグルコースのフィードを行
った。

全細胞蛋白質のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
用の培養サンプルを、13.7〜19.7時間の間で１時間ごと
に採取した。ゲルの蛋白質バンドのデンシトメーター測
定は、IL−２の最大産生が17.7時間目において全細胞蛋
白質の17.2％であることを示した。これらのサンプルか
らのIL−２の生物学的活性を、E.コリにおけるIL−２発
明についてすでに記載した方法により決定した。結果を
第２表に示す。

3.B.ズブチリスにおいて ５μg/mlのクロラムフェニコールを含有する２×LB培
地5mlに単一コロニーを接種した後、pHCW301又はpHCW30
0により上記のようにして形質転換されたB.ズブチリス1
A510の培養物を、37℃にて振とうしながらOD₆₀₀＝1.0ま
で増殖せしめた。細胞をペレット化し、IL−２超音波処
理緩衝蚊に再懸濁し、超音波処理し、そしてE.コリにつ
いて記載したようにして、IL−２活性を測定した。結果
を第２表に示す。

例4.正のレトロレギュレーション因子の欠失地図 正のレトロレギュレーション効果を担当するcryター
ミネーター領域内の配列を一層正確に定義するために欠
失研究を行った。Zoller,M.及びSmith,M.,“M13ベクタ
ーにクローン化されたDNA断片のオリゴヌクレオチド指
令変異誘発",メンズ・イン・エンチモロジー（Methods
in Enzymology），100,468-500（1983）の方法に従うオ
リゴデオキシリボヌクレオチド指令部位特異的変異誘発
を用いて、第１図においてそれぞれB1及びB2として示し
た。cryターミネーター断片内の逆方向反復塩基配列か
ら80bp及び20bp上流の位置に別々に２個のBglIII制限部
位を導入した。これらの短縮されたターミネーター含有
断片を、BglII-EcoRI消化により対応する変形されたM13
mp9 NP3ファージゲノムから切り出すことができる。こ
れらを、pHCW-A3の造成のために用いたのと同様の方法
によりpSYC667にBclI-NruＩ部位にクローン化し、そし
てプラスミドpHCW-A4及びpHCW-A5を形成した。これらの
プラスミドを有するB.ズブチリス及びE.コリの、クロー
ン化penＰ遺伝子を発現せしめる能力についての分析の
データを第３表に示す。短縮された断片がなお、もとの
断片中に観察された正のレトロレギュレーション因子を
含有していることが明らかである。２個の新たに形成さ
れたBglII部位はcryコード配列の外側にあるから、この
データは、増強された活性を付与する座はcry遺伝子の
非コード領域に位置すること、及びおそらくcry遺伝子
のターミネーターとオーバーラップすることを示してい
る。

B.ズブチリスPSC1株及びE.コリSC412株を、プラスミ
ドPHCW-A3、pHCW-A4、又はpHCW-A5により上記のように
して形質転換した。前記のようにして測定されたペニシ
リナーゼ活性を第３表に示す。

例5.正のレトロレギュレーション因子の挿入は温度制御
ColE1コピー変異株プラスミドベクター中のポータブル
温度制御調節カセットを用いて新規な組換IL−２ムテイ
ンの生産レベルを増強する A.プラスミドpFC54,tの造成 プラスミドpF54はバクテリオファージλＰ_Lプロモー
ター及び遺伝子Ｎリボゾーム結合部位（Ｐ_LＮ_RBS）の調
節のもとにdes-Alanyl,serine₁₂₅インターロイキン−２
をコードする。ColE1プラスミドベクターは、温度感受
性コピー数現象をプラスミドに付与する２つの変異を含
有する。このプラスミドを有するE.コリ細胞は熱的に誘
導されて全蛋白質の20％を新規なIL−２ムテインとして
蓄積する。

プラスミドpFC54をSphＩで完全消化し、そして25μM
dGTPの存在下でDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で
処理することにより３′突出単鎖テイルを除去する。次
に、平滑末端DNAをXbaＩにより消化する。

プラスミドpHCW801をEcoRIにより完全消化し、dNTPの
存在下でDNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で処理
し、そして次にXbaＩで消化する。ser¹²⁵IL−２のＣ−
末端225bp、36bpの３′非翻訳IL-2cDNA、及び正のレト
ロレギュレーション因子を担持する394bpの断片からな
る655bpDNA断片をゲル電気泳動によって精製する。pFC5
4ベクターDNA断片及び精製されたpHCW801断片を、1:3の
モル比で、30μg DNA/mlのDNA濃度においてT4DNAリガー
ゼを用いて接着末端の連結に好都合な条件下で連結し、
2.5倍に稀釈し、そして次にT4 DNAリガーゼを用いて分
子内環形成に好都合な平滑末端条件下で連結する。連結
されたDNAをBanIIで消化することにより、pFC54の小及
び大XbaI-SphＩ断片を含んで成る不所望の連結生成物を
不活性化する。

この連結されそして消化処理されたDNA60ngを用いて
E.コリK12株DG95（λＮ₇Ｎ₅₃cI857susP80）をAmp^Rに形
質転換する。この株は、低温（30℃〜32℃）において活
性な温度感受性λcIレプレッサーをコードするλプロフ
ァージを含有する。しかしながら、高温（36℃〜42℃）
においてはこのレプレッサーが不活性でありＰ_Lプロモ
ーターからの転写が進行し得る。この株の他の特徴とし
て、上昇した温度においてプロファージは誘導しない。
形質転換体をAmp^Rについて選択し、そしてAmp^Rコロニー
を所望の5.6kbプラスミドについて選択した。候補プラ
スミドを1182bp EcoRI断片の放出（正のレトロレギュレ
ーション因子を担持する断片中の修復されたEcoRI部位
とベクター断片中の修復されたSphＩ部位との連結がEco
RI部位を再形成すると予想された）、IL−２コード配列
中のXbaＩ部位の保持、ユニークBamHI部位の獲得（ター
ミネーター断片中）、及びpFC54中のユニークBanII部位
の喪失についてスクリーニングした。望ましい組換プラ
スミドを単離し、そしてpF54.tと命名した。

後に示すように、プラスミドpFC54.tを有するE.コリK
12株DG95（λＮ₇Ｎ₅₃cI857susP80）が温度誘導される場
合、全細胞蛋白質の34％がdes-Alanyl,Ser¹²⁵IL−２で
ある。

プラスミドpFC54.tは、ブタペスト条約に基きATCC No
39789として寄託されている。

プラスミドpFC54.tを第６図に示す。5.61/0で示すEco
RI制限エンドヌクレアーゼ部位から出発しそして時計方
向に移動しながら、プラスミドpFC54.tは下記に示す成
分を含んで成る。

座標０−0.35kbはバクテリオファージλＰ_Lプロモー
ターの温度制御プロモーター／オペレーター及び隣接す
る遺伝子Ｎリボゾーム結合部位を含んで成る。λ座標35
715のBglII認識部位〔Sanger,F.等，ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.），162:7
29-773（1982）〕はEcoRI認識部位に転換されており、
そしてλ座標35366のHinfI認識部位はプラスミドpFC54.
tに挿入するためにHindIII認識部位に転換されている。

座標0.35-0.794kbは成熟ヒトdes Alanyl,Ser¹²⁵IL−
２ムテインをコードするプラスミドpLW46の444bp HindI
II-StuＩ断片を含んで成る。Wang,A.等，サイエンス（S
cience），224,1431-1433（1984）。

５′HindIII部位が変形されたムテインのATG開始コド
ンにすぐ先行し〔Rosenberg,S.A.等、サイエンス（Scie
nce）,223,1412-1416（1984）〕そしてStuＩ認識部位
（ヒトIL−２中のopal終止コドンに36bp遠位）はpFC54.
tにおいてはBamHI認識部位に転換されている。

座標0.794-1.188kbは、プラスミドpHCW801からの394b
p BamHI-EcoRI DNA断片を含んで成り、そしてB.チュリ
ンジエンシスδエンドトキシン遺伝子からの正のレトロ
レギュレーション因子を含有する。

座標1.188-2.05kbは863bpのSphＩ（修復）／AvaＩ
（修復）pBR322 DNA断片（それぞれpBR322座標567-142
9）を含んでなる。

座標2.05-3.48kbは、細菌トランスポゾンTn3のβ−ラ
クタマーゼ遺伝子をコードする、プラスミドpOP6〔Gelf
and,D.H.等，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナ
イテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Prc.Natl.Acad.
Sci.USA），75,5869-5873,1978;Muesing,M.等，セル（C
ell），24,235-242,1981〕からの1.43kb PvuII-BamHI D
NA断片を含んで成る。Heffron,F.等，セル（Cell）,18:
1153-1163（1979）。

座標3.48-3.95kbはpOP6（Gelfand,前掲,1978）の0.47
kb SstI-PvuII DNA断片を含んで成る。このDNA断片は細
菌トランスポゾンTn3の左境界（座標１−270,Heffron,
F.等，前掲,1979）及び隣接Col E1 HaeIIC断片の部分を
含有する。

座標3.95-5.61kbはプラスミドpEW27〔Wong,E.M.等，
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,7
9:3570-3574（1982）〕からの1.66kb PvuII-EcoRI DNA
断片を含んで成る。この断片はプラスミドColE1のコリ
シンE1免疫領域及びプライマープロモーター領域、RNA
I領域、及び複製開始点をコードする。pBGP120〔Polisk
y,B.等，プロシーディングス・オブ・ザ・ナシュナル・
アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Prc.Natl.Acad.Sci.
USA），73:3900-3904（1976）及びGelfand,D.H.等，前
掲,1978〕の野性型Col E1 DNA配列が２ケ所（プライマ
ーRNA転写物のヌクレオチド125及び135に対応するDNA鎖
中のＧ→Ａトランジション）で変えられており、プラス
ミドpFC54.tに温度感受性Cop−表現型を付与する。

B.形質転換された株により産生されたIL−２ムテイン 上記の方法を用いてpFC54又はpFC54.tにより形質転換
されたE.コリK12株DG95（λＮ₇Ｎ₅₃cI857susP80）を10l
発酵槽中で、上記と同じ条件下で、18.5時間、OD₆₈₀が
それぞれ28.7又は28.1になるまで増殖せしめた。18.5時
間目に測定した後、形質転換された微生物を含有する培
地の温度を42℃に上昇せしめて温度感受性コピー数プラ
スミド及びプロモーターを誘導した。誘導後４時間にわ
たり、0.5時間又は１時間の間隔でサンプルを採取し
た。各サンプルを遠心分離によりペレット化し、そして
リン酸緩衝化塩（PBS）中に10mg乾燥重量/mlの濃度に再
懸濁した。次に、各サンプルを１％ドデシル硫酸ナトリ
ウム/PBS中に10倍稀釈し、ヒートシステムモデルＷ−37
5ソニケーター中で細胞を完全に破砕するのに十分な時
間超音波処理し、そして測定した。IL−２ムテインのユ
ニット/mlを前記のようにして決定した。蛋白質mg/mlを
Lowry法により決定した。ユニットIL−２ムテイン/mg蛋
白質を決定した。第４表にこれを示す。

IL−２の産生を、各サンプルについて産生された全細
胞蛋白質の％として、SDSアクリルアミドゲル電気泳動
により決定した。Lowryアッセイーにより決定されたの
と同じ量の蛋白質をゲルに負荷した。バンドをクマーシ
ーブルー染剤により染色し、そしてヒウレットパッカー
ド3390Aインテグレーターを付加したツァイネースキュ
ンニングデンシトメーターを用いて読み取った。IL−２
ムテインの％を積分プログラムにより決定した。全細胞
蛋白質に対する％としてIL−２テイン生産を下の第５表
に示す。IL−２の増加％は、正のレトロレギュレーショ
ン因子を担持する株により産生されるIL−２ムテインの
正味増加を決定し、そしてその増加を、正のレトロレギ
ュレーション因子を有しない株により産生されたIL−２
ムテインに対する％として示すことにより見出された。

pFC54.tにより形質転換されたE.コリ株K12DG95（λＮ
₇Ｎ₅₃cI857susP80）を前記と同じ条件下で増殖せしめ
た。但し、培養物を、先行する例におけるようにOD₆₈₀
＝28.1においてではなく14.0において温度誘導した。全
細胞蛋白質に対する％としてのIL−２ムテインの生産
が、全細胞蛋白質の34％であると決定された。正のレト
ロレギュレーション因子を各担持するプラスミドで形質
転換された微生物によるIL−２の増加した産生は、高い
細胞濃度OD₆₈₀（28.1）よりも低い細胞濃度OD₆₈₀（14）
において温度誘導した場合に最もよく達成された。

例6.正のレトロレギュレーション因子によるmRNA転写物
の半減期の延長 正のレトロレギュレーション因子に連結された選択さ
れたDNA配列の発現の増強が選択されたDNA列によりコー
ドされたmRNA転写物の増加した安定性及び延長された半
減期の結果であるか否かを決定するため、E.コリ及びB.
ズブチリスの両者においてプラスミドpHCW-A3及びその
親プラスミドpSYC667により産生されたpenＰ転写物の崩
壊速度を測定した。E.コリ株CS412及びB.ズブチリス株1
A510はそれぞれプラスミドpHCW-A3又はその親プラスミ
ドpSSYC667を含有する。これらをＬ−培地中37℃にて振
とうしながら増殖せしめた。培養物が対数増殖中期（Ａ
₆₀₀＝0.7）に達したとき、1mg/mlのリファンピシンを加
えてRNAポリメラーゼによるその後の転写の開始をブロ
ックした。次に、7mlのサンプルを１分間の間隔で培養
物から採取し、そしてこのサンプルを収容したチューブ
を氷水上で急速に冷却した。細胞を遠心分離により集
め、そして1mM EDT A及び10％（w/v）SDSを含有する酢
酸カリウム緩衝液（pH5.5）500μｌ中に再懸濁した。Ga
bain等，プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Prc.Nat.Acad.Sci.U
SA），80:653-657（1983）に記載されている方法に従っ
てE.コリから全細胞RNAを抽出し、そして精製した。

B.ズブチリスからのRNA調製物は次のようにして抽出
した。凍結した細胞ペレット（1g）を、0.05mg/mlのベ
ントナイトを含有する0.05M酢酸カリウム（pH5.0）4ml
中に懸濁し、そして2mlの新たに蒸留したフェノール
（同じ酢酸カリウム緩衝液で飽和したもの）を加えた。
この懸濁液を、ミクロチップを備えたブランソンソニフ
ィアー（ヒートシステム−ウルトラソニクス社，プレイ
ンビュー，ロングアイランド，ニューヨーク）を用いて
３分間超音波処理し、そして60℃にて10分間抽出し、そ
してエタノールで一夜沈澱せしめた。沈澱した物質を遠
心分離により集め、−20℃のエタノールで洗浄し、そし
て4mlの0.104M Tris,pH7.0,0.01M MgCl₂に溶解した。DN
Aアーゼ（30μg/ml,ウオーシントン,RNAアーゼ不含）を
加えた。この調製物を、37℃にて４時間、400容量の0.0
4M Tris,pH7.0,0.01M MgCl₂に対して透析した。次にRNA
をフェノールにより２回室温にて４分間抽出し、エタノ
ールにより一夜沈澱せしめ、エタノールで洗浄し、そし
て水に溶解した。

精製されたmRNAを82mmのニトロセルロースフィルター
（銘柄BA85,シュライケル・アンド・シュエル社）上に
固定化した。メソズ・イン・エンチモロジー（Methods
in Enzymology），68,389（1979）に記載されているよ
うにしてWoo等の方法を用いて、前記フィルターの前ハ
イブリダイゼーションを行った。

次に、処理されたフィルターを、10mlのハイブリダイ
ゼーション緩衝液（５×デンハート溶液,50mMリン酸ナ
トリウム,pH7.0,100μg/mlの剪断された単鎖E.コリDNA,
1％SDS）中68℃にて一夜、penＰ−特異的プローブ（20
μg/フィルター）とハイブリダイズせしめた。

このハイブリダイゼーションに使用したプローブは、
プラスミドpSYC795をClaＩにより完全消化し、そして末
端をdNTP及びDNAポリメラーゼ大断片により修復して線
状化プラスミドを形成することによって作った。プラス
ミドpSYC795はプラスミドpSYC423の誘導体であり、これ
はHyashi等，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（J.Biol.Chemistry）,259:10448-10454（198
4）に記載されており、penＰ遺伝子のコード領域のヌク
レオチド80にＧ→Ｃ変換を含有する。次に、線状化され
たプラスミドをEcoRIによりさらに消化した。プラスミ
ド消化物を５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動せし
め、そしてpenＰ遺伝子の５′部分を含む727bp EcoRI-C
laＩ断片を回収した。この断片をM13mp11のSmaI-EcoRI
部位にサグクローニングした。これらの組換ファージか
らの単鎖DNAをMissing,メソズ・イン・エンチモロジー
（Methods in Enzymology）Vol 101:20-78（1983）の方
法に従って単離し、そして環状DNAをDNAアーゼＩ（0.05
μg/μg DNA）により37℃にて20分間消化した。単鎖DNA
断片をフェノール／エーテル抽出し、エタノール沈澱せ
しめ、50mM Tris緩衝液（pH8）に再懸濁し、細菌アルカ
リ性ホスファターゼにより脱リン酸化し、そして〔γ
^-32Ｐ〕−ATP及びポリヌクレオチドキナーゼによりラベ
ルして比活性３×10⁶cpm/μg DNAとした。ハイブリダイ
ゼーションの後、２×SSC、1.0％SDSを含有する１×SSC
によりそれぞれ68℃にて15分間ずつ、次々と洗浄し、ホ
ットランプの下で乾燥し、そして液体シンチレーション
液中で計数した。ハイブリダイゼーション溶液中に過剰
のDNAプローブが存在することを保証するため、異る量
の固定化mRNAサンプルを含有する複数のフィルターを調
製した。これらのハイブリダイゼーション実験の結果を
第7A図及び第7B図に要約する。E.コリ又はB.ズブチリス
中でプラスミドpSYC667から産生されたpenP mRNAの半減
期は約２分であり、pHCW-A3からのそれは約６分である
と算定された。この分析はさらに、プラスミドpHCW-A3
を担持する細胞は、プラスミドpSYC667を有する細胞に
比べてpenP mRNAの高い定常状態レベルを有することを
示した。この結果は、正のレトロレギュレーション因子
が同時に転写された遺伝子を安定化する場合に予想され
るものである。mRNAのレベルの上昇が、前記の例３に示
されるようにこれらの細胞菌宿主の両者におけるペニシ
リナーゼ酵素の増加の程度と一致するから、正のレトロ
レギュレーション因子はmRNAの安定性に対するその影響
を通して遺伝子発現を増強する。

寄託された菌株 次の第６表に挙げる菌株の寄託物が、この出願の出願
人であるシタス・コーポレーション，エメリービル，カ
リホルニア，米国，のマスター・カルチュアー・コレク
ションに保存されており番号が付されている。これらの
菌株はまたシタス・コーポレーションにより、アメリカ
ン・タイプ・カルチュアー・コレクション（ATCC），ロ
ックビル，メリーランド，米国に寄託され、表に示す番
号が与えられている。ATCCへの寄託は、特許手続上の微
生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約及びそ
の規則のに基いてなされており、そして該条約及びその
規則に従って公衆に対して手入可能にされるであろう。

この明細書において記載し又は例示したように、この
発明の種々の変法が当業者にとって明らかであろう。こ
のような変法はすべてこの発明の範囲に属する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、B.チュリンジェンシスからのクローン化cry
遺伝子を担持する組換プラスミドpES1の制限地図の概略
を示す。cry遺伝子の転写は第４番目のEcoRI部位の350b
p上流の部位から始まり第３番目のPvuIIの約360bp下流
で終る。第１図にはさらにcryの転写ターミネーターを
担持するPvuII-NdeＩ制限断片のヌクレオチド配列も示
されている。NdeＩ部位の約40bp上流に逆方向反復塩基
配列が存在する。この領域から作られたmRNA転写物はス
テムアンドループ構造を形成することが潜在的に可能で
ある。 第２図は、第１図に示した逆方向反復塩基配列によりコ
ードされたRNAの予想されるステムアンドループ構造を
示す。このステムアンドループ構造は比較的G/Cに富
み、約44％のG/Cを含有し、そしてTinoco等，前掲，の
ルールにより計算した場合約−30.4kcalの予想ΔＧ°を
有する。 第３図は、プラスミドpSYC667の概略図である。 第４図は、プラスミドpHYC70及びpHCW70の概略図であ
る。 第５図は、プラスミドpHCW300及びpHCW301、並びにこれ
らのプラスミドの造成に使用されたプラスミドの概略図
である。 第６図は、プラスミドpFC54.tの概略図である。図面に
示されたプラスミドの大きさは同一の比率ではない。エ
ンドヌクレアーゼ部位の相対位置及びプラスミドの該当
コード領域が示されている。 第7A図及び第7B図は、プラスミドpSYC667及びpHCW-A3を
有するE.コリ及びB.ズブチリスにより産生されるpenP m
RNAの崩壊のグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/86 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 デビツド ハロウ ジエルフアンド アメリカ合衆国，カリフオルニア 94611，オークランド，シエルトン ド ライブ 6208

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】選択された遺伝子産物を細菌又は酵母細胞
   において発現することができるDNA配列の下流に連結さ
   れた場合に該選択された遺伝子産物の前記細胞での発現
   を増強する正のレトロレギュレーション因子であって、 （１） 次の塩基配列:AAAACGGACATCACCTCCATTGAAACGGA
   GTGATGTCCGTTTTを含んで成る核酸；又は （２） 次の性質： （ａ） 前記塩基配列に対して、１個又は複数個のヌク
   レオチドが除去、付加又は置換されている塩基配列を有
   し、 （ｂ） ステムアンドループ構造を形成する能力を実質
   的に保持しており、且つ （ｃ） 正のレトロレギュレーション活性を維持してい
   る、 を有する核酸。
2. 【請求項２】選択された遺伝子産物を発現することがで
   きるDNA配列の３′末端に連結された場合に該選択され
   た遺伝子産物の発現を増強する特許請求の範囲第１項記
   載の正のレトロレギュレーション因子。
3. 【請求項３】B.チュリンジェンシス結晶性蛋白質遺伝子
   の３′−フランキング配列の部分を含んで成り、該フラ
   ンキング配列が逆方向反復塩基配列を含有する特許請求
   の範囲第１項記載の正のレトロレギュレーション因子。
4. 【請求項４】次のDNA配列AGATCTAAGTAATTTGTTGTAATGAAA
   AACGGACATCACCTCCATTGAAACGGAGTGATGTCCGTTTTACTATGTTA
   TTTTCTAGTAATACATATGTATAGAGAの部分を含んで成る特許
   請求の範囲第１項記載の正のレトロレギュレーション因
   子。
5. 【請求項５】RNA転写物に対応し、該RNA転写物がステム
   ・アンド・ループ構造を形成し、該ステム・アンド・ル
   ープ構造が約−30.4Kcal/molのΔＧ°を有する特許請求
   の範囲第１項記載の正のレトロレギュレーション因子。
6. 【請求項６】前記ステム・アンド・ループ構造が40〜45
   ％のグアノシン及びシトシンを含んで成る特許請求の範
   囲第５項記載の正のレトロレギュレーション因子。
7. 【請求項７】前記ステム・アンド・ループ構造が約43％
   のグアノシン及びシトシンを含んで成る特許請求の範囲
   第５項記載の正のレトロレギュレーション因子。
8. 【請求項８】選択された遺伝子産物を細菌又は酵母細胞
   において発現することができるDNA配列、及び該選択さ
   れた遺伝子産物の該細胞での発現が増強されるような関
   係に該DNA配列に連結された正のレトロレギュレーショ
   ン因子を含んで成るプラスミドであって、該正のレトロ
   レギュレーション因子が、 （１） 次の塩基配列:AAAACGGACATCACCTCCATTGAAACGGA
   GTGATGTCCGTTTTを含んで成る核酸；又は （２） 次の性質： （ａ） 前記塩基配列に対して、１個又は複数個のヌク
   レオチドが除去、付加又は置換されている塩基配列を有
   し、 （ｂ） ステムアンドループ構造を形成する能力を実質
   的に保持しており、且つ （ｃ） 正のレトロレギュレーション活性を維持してい
   る、を有する核酸、 であることを特徴とするプラスミド。
9. 【請求項９】前記正のレトロレギュレーション因子が選
   択された遺伝子産物を発現することができる前記DNA配
   列の下流に連結されている特許請求の範囲第８項記載の
   プラスミド。
10. 【請求項１０】正のレトロレギュレーション因子が選択
    された遺伝子産物を発現することができる前記DNA配列
    の下流に連結されており、そして翻訳終止シグナルが該
    正のレトロレギュレーション因子と前記選択された遺伝
    子産物を発現することができる前記DNA配列との間に位
    置する特許請求の範囲第８項記載のプラスミド。
11. 【請求項１１】正のレトロレギュレーション因子がB.チ
    ュリンジェンシス結晶性蛋白質遺伝子の３′−フランキ
    ング配列の部分を含んで成り、そして該フランキング配
    列が逆方向反復塩基配列を含有する特許請求の範囲第10
    項記載のプラスミド。
12. 【請求項１２】選択された遺伝子産物を細菌又は酵母細
    胞において発現することができるDNA配列及び該選択さ
    れた遺伝子産物の該細胞での発現が増強される様な関係
    に該DNA配列に連結された正のレトロレギュレーション
    因子を含んで成るプラスミドにより形質転換された細菌
    又は酵母細胞であって、該正のレトロレギュレーション
    因子が、 （１） 次の塩基配列:AAAACGGACATCACCTCCATTGAAACGGA
    GTGATGTCCGTTTTを含んで成る核酸；又は （２） 次の性質： （ａ） 前記塩基配列に対して、１個又は複数個のヌク
    レオチドが除去、付加又は置換されている塩基配列を有
    し、 （ｂ） ステムアンドループ構造を形成する能力を実質
    的に保持しており、且つ （ｃ） 正のレトロレギュレーション活性を維持してい
    る、を有する核酸、 であることを特徴とする細菌又は酵母細胞。
13. 【請求項１３】前記細菌細胞がE.コリ（E.coli）の細胞
    である特許請求の範囲第12項記載の細胞。
14. 【請求項１４】前記細菌細胞がB.ズブチリス（B.subitl
    is）の細胞である特許請求の範囲第12項記載の細胞。