NO853313L

NO853313L - 3`-ekspresjonsforbedrende fragmenter og metode.

Info

Publication number: NO853313L
Application number: NO853313A
Authority: NO
Inventors: Hing Cheung Wong; Shing Chang; David Harrow Gelfand
Original assignee: Cetus Corp
Priority date: 1984-08-31
Filing date: 1985-08-22
Publication date: 1986-03-03
Also published as: DE3571647D1; EP0174785B1; CA1275954C; DK397485A; JPS6170990A; FI853346A0; EP0174785A1; FI853346L; JP2558249B2; DK397485D0

Description

Foreliggende oppfinnelse: angår -det tekniske område i kombinant DNA. spesielt, angår oppfinnelsen positive retroregulatoriske elementer som, når de ligeres til utvalgte DNA sekvenser som koder for et geneprodukt, forbedrer ekspresjonen av geneproduktet. Det tilveiebringes plasmider som bærer det positive retroregulatoriske element ligert til den valgte DNA sekvens og celler transformert ved slike plasmider. I tillegg angår oppfinnelsen en metode for å forbedre ekspresjonen av et geneprodukt ved ligering av et positivt retroregulatorisk element til en utvalgt DNA sekvens som er eksprimerbar for et ønsket geneprodukt.

En av de fundamentale strategier som danner basis for kommersiell anvendelse av rekombinant DNA teknologi er produksjon i relativt store volumer av geneprodukter i form av polypeptider eller proteiner som vanligvis opptrer i naturen ved meget lave konsentrasjoner eller volumer. Ved å transformere celler som har relativt kort generings- eller for-doblingstid med rekombinante molekyler som generelt foreligger i form av plasmider, kan betydelige mengder av et ønsket geneprodukt fremstilles. Selv om hver celle som bærer det rekombinante DNA molekyl kun kan gi en meget liten mengde av det ønskede geneprodukt, tillater den hurtige multiplikering av cellen fremstilling av betydelige mengder av det ønskede geneprodukt.

Generelt er hensikten å fremstille større mengder av et utvalgt geneprodukt begrenset av størrelsen av kulturmediumvolumer som er nød-vendige for å dyrke den transformerte celle som produserer det ønskede geneprodukt. Å øke utbytte av et ønsket geneprodukt er klart et hovedmål ved den kommersielle fremstilling av et ønsket geneprodukt. En tilnærmelse til økning av utbytte er å forbedre gjenvinningsgraden av det ønskede produkt oppnådd fra den transformerte celle eller kulturmediet mens man lar mengden produkt som produseres av cellen uforandret. Dette medfører ytterligere behandlingstrinn for å øke gjenvinningen av det ønskede geneprodukt fra en gitt fermentering. Slike ytterligere prosesstrinn kan kreve enorme omkostninger med henblikk på ytterligere utstyr og personale.

En ytterligere tilnærmelse til økning av utbytte av et ønsket geneprodukt er å øke eksprimeringen av det ønskede geneprodukt av den transformerte celle. Slike økninger i produksjonen av det ønskede geneprodukt av hver celle kan føre til utbytteøkninger for en spesiell fermentering såvel som forbedringer i renheten av produktet som fremstilles og en reduksjon av omkostningene pr. produktenhet fordi ytterligere prosesstrinn kan være unødvendige.

En av de viktige generelle tilnærmelser for å forbedre utbytte av et ønsket geneprodukt pr. celle er å tilveiebringe optimale kulturbetingelser for cellen. Ved å anrike næringsinnholdet i mediet, tilveiebringe optimale fermenteringstemperaturer og tilveiebringe optimale mengder sporfaktorer og å supplere kulturmediet med de nødvendige aminosyrer kan f.eks. føre til sterkt forbedrede utbytter.

En annen generell tilnærmelse til problemet med å øke utbyttet av et ønsket geneprodukt pr. celle er å manipulere de regulatoriske elementer som kontrollerer ekspresjonen av geneproduktet av cellen. En metode for å manipulere de regulatoriske elementer som kontrollerer eksprimeringen for et ønsket geneprodukt er ved utvalg av sterke promotore. Promotore kan generelt defineres som områder av et DNA molekyl hvortil RNA polymerase bindes for å initiere transkripsjon av meddeler RNA, mRNA, fra en DNA sekvens som koder for et geneprodukt. Sterke promotore har det karakteristikum at de initierer et RNA transkript ved RNA polymerase med høyere frekvens enn svakere promotore med det resultat at DNA sekvensen med hvilken promotoren er forbundet transkriberes for å danne mere mRNA transkript som koder for det ønskede geneprodukt.

Det er blitt konvensjonelt i rekombinant DNA området å ligere en sterk promotor til en selektert DNA sekvens som koder for et ønsket geneprodukt, i egnet avlesningsramme slik at mRNA transkriptene som er initiert fra den sterke promotor, fremstilles. Multippelsterke promotorer kan ligeres ned til en selektert DNA sekvens, for derved å øke muligheten for å binde RNA polymerase til DNA sekvensen og produsere mere mRNA transkript fra DNA sekvensen. Et eksempel på denne siste metode er bruken av tandem lac operon promotore ved begynnelsen av DNA sekvensen som koder for det ønskede geneprodukt.

En annen tilnærmelse for å øke bindingen av RNA polymerase for å tilveiebringe høyere nivåer av mRNA transkript er elimineringen av regulatoriske faktorer som har en tendens til å redusere evnen til RNA polymerase til å transkribere mRNA fra en DNA sekvens som koder for et ønsket geneprodukt. Visse sterke promotore er forbundet med de attenuatorområder som under visse betingelser forårsaker en bundet RNA polymerase til å slutte transkribering av DNA sekvenser med hvilke attenuatorområdene er forbundet. Et slikt attenuatorområde er forbundet med promotoren av tryprofanoperon, en promotor som er kjent som en sterk promotor. Ved å eliminere attenuatorområdet i promotoren av tryptofanoperon kan tryptofanpromotoren tjene som en uforringet sterk promotor.

En annen tilnærmelse for å øke utbyttet av et ønsket geneprodukt er å ligere sterke ribosombindeseter i en selektert DNA sekvens slik at robosomer binder med høy effektivitet til mRNA transkriptet som er transkribert fra den selekterte DNA sekvens. Ved å øke affiniteten for et mRNA transkript for ribosomet via sterke ribosombindeseter er det antatt at translatering av mRNA transkriptet skjer med høyere frekvens, noe som øker produksjonen av det ønskede geneprodukt.

Alle de ovenfor nevnte teknikker for å øke ekspriemering av et ønsket geneprodukt involverer manipulering av regulatoriske sekvenser som opptrer i 5'-enden av DNA sekvensen som koder for det ønskede geneprodukt. I alle tilfeller er disse regulatoriske sekvenser involvert i enten initieringtav transkripsjon av DNA sekvensen som koder for det ønskede geneprodukt, eller initiering av translatering av mRNA transkriptet tilsvarende DNA sekvensen som koder for det ønskede geneprodukt.

En annen form for regulering av ekpremeringen av en gen er observert i forskjellige viralsystemer. Uttrykket "retroregulering" er preget for denne form for ekspresjonskontroll. Court et al. inf r a (1983). Som beskrevet i den kjente teknikk blir den kjente form for retroregulering enhetlig funnet å redusere eksprimeringen av geneproduktet på hvilken retroregulatoren utøver sin virkning. Således er kjente former for retroregulering negativ retroregulering.

I bakteriofage X er reguleringen av ekspresjonen av integrasegenet tnt mRNA sekvensen ved en 3' terminalsekvens kalt sib, beskrevet i Schindler og Echols, "Retroregulation of the int gene og bacteriaphage X: Control of translation completion", Proe. Nati. Acd. of Sei. (USA), 78:4475-4479 (1981). Schindler og Echols postulerer at sib regionen virker på translasjonsnivået for ekprimering ved å forhindre normal fullstendig-gjøring av proteinsyntese fra int mRNA. Det er videre postulert at den sib regulatoriske region tilsvarer en mRNA region som er istand til å danne en stamme og sløyfe sekundær strukturduplex. Sib regionen er også antatt å inkludere en region nær enden av genet som det regulerer og som tilveiebringer et spaltesete for RNase III. Dette spaltesete for RNase III gjør mRNA sensitivt for nedbrytning for forskjellig eksonukleaser. Forfatteren postulerer at ved å bryte ned mRNA transkriptet blir proteinsyntesen av int gene produktet avsluttet for tidlig. Således beskriver referansen en negativ regulatorisk rolle for den sib regulatoriske sekvens, hvorved produksjonen av polypeptidet som er kodet av int genet reduseres. Guarner5os et al., Posttranscriptional Control of Bacteriophage X int Gene Expression From a Site Distal to the Gene, Proe. Nati. Acd. of Sei. (USA), 79:242 (1982) beskriver at i bakterieverter som mangler funksjonell RNase III er sib regulering defektiv. Referansen er videre enig med Schindler og Echols, supra, at det sib retroregulatoriske element virker posttranskripsjonelt for å forhindre mRNA translatering ved å øke nedbrytningen av int mRNA. Court et al., Detection Analysis of the Retroregualtory Site for the X int Gene, J. Mol. Biol., 166:233-240 (1983) er enig med den generelle lære til Guarneros et al. supra og foreslår videre at den RNase III sensitive struktur av det retroregulatoriske element som koder sib sete er lik andre RNas III sensitive seter funnet i Escherichia coli og fager.

I en generell diskusjon om termineringen av transkripsjon i E. coli, beskriver Holmes et al., Termination of Transcription in E. coli, Cell, 32:1029-1032 (1983), at den primære struktur av DNA sekvenser som koder for transkripsjonsterminatorer inkluderer løp av adenin og tymin basepar på hver side av symmetriske guanin- cytosinrike sekvenser. mRNA transkripter fra disse sekvenser danner sekundære hårnålssløyfer eller stamme- og sløyfestrukturer som følges av løp av uradinrester på begge Referansen fremhever imidlertid at betydningen av denne toveister-minatoraktivitet er uklar. Referansen beskriver også det faktum at RNA transkripter av DNA sekvenser som koder for transkripsjonsterminatorer som mangler en stamme og sløyfestruktur, brytes ned hurtigere enn terminatorer med slike strukturer. Platt og Beer diskuterer generelt i "Role of RNA Polymerase, p Factor and Ribosomes in Transcription Termination", Gene Function in Prokaryots, Beckwith, et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1983) trankripsjonstermineringen og rollen til sekundære strukturer ved enden av RNA transkripter i reguleringen av transkripsjonsavslutningen. Forfatterne spekulerer på muligheten av flere funksjoner for sekundære strukturer i mRNA, en av hvilke inkluderer stabilisering mot nedbrytning utover et visst punkt ved 3' eksonukleaser av ferdige mRNA transkripter. Det er imidlertid intet forslag om at en forbedring av eksprimeringen av geneproduktet for hvilket mRNA transkriptet koder, oppnås.

Gentz, R., Cloning and Analysis of strong promotors is made pOssible by the downstream placement of a RNA termination signal, Proe. Nati. Acad. of Sei. (USA), 78:4936-4940 (1981) viser at de plasmid pLBU3 muliggjorde addisjon av en sterk transkripsjonsterminator avledet fra bakteriofagen fd, til alfafragmentet fra p-galaktosidasegene som manglet lackpromotor-regionen, kloning av sterke promotorer for fagen T5. Sterke promotorer ble isolert ved øket p-galaktosidaseaktivitet i en M15 (en lac a fragment deleteringsmutant) komplementeringsanalyse. Sterk transkripsjonstermineringsaktivitet ble vist av fd terminatoren som har en region av dyadesymmetri, men denne sterke transkripsjonstermineringsaktivitet ble kun rapportert i en orientering motsatt dets opprinnelige orientering i fd genomet i det system som er beskrevet av Gentz et al. fd fragmentet i pLUB3 samarbeider, ulikt aktiviteten i fd genomet, med p faktoren for å terminere transkripsjonen effektivt. Det finnes imidlertid ingen lære eller noe bevis hos Gentz et al. at fd transkripsjonsterminator en selv har en forbedrende virkning på ekssprimeringen av p-galaktosidasegenet. Gentz et al. bidrar til den analyserbare3-galaktosidaseaktivitet til de sterke promotore avledet fra fagen T5 som er ligert til 5'-enden av DNA sekvensen som koder for a-fragmentet av p<->galaktosidasegenet.

Flock et al., Expression in Bacillus subtilis of the gene for human urogastrdne using synthetic ribosome binding sites, Molecular and General Genetics, 195:246-251 (1984) og anbringe en transkripsjonsterminator fra bakteriofagen fd umiddelbart etter urogasterone i (plasmid) pFF810 forbedrer den totale ekpremering ved ca. 5-10 ganger i E. coli." Ingen detaljer om hvilket fd transkripsjonsterminatorsignal, dess sekvens, orientering eller plassering i forhold til den umiddelbare enden av urogasterongenet er gitt. fd transkripsjonsterminatoren til Flock et al. benyttes i forbindelse med en putativt sterk promotor som er ventet å være meget aktiv i B.subtilis.

I enkelte bakterier er relativt stabile høykopiantall mRNA observert og som synes å være forbundet med bakterielle proteiner eller lipoproteiner som opptrer i store mengder. F.eks. er det angitt at mRNA fra krygen av Bacillus thuringiensis har en lengere halveringstid enn andre mRNA fra gener ekspremert under sporulering, se Petit-Galtron, M.F. og Rapoport, G., Translation of a stable mRNA fraction from sporulatin cells of B. thuringiensis in cell-free system from E. coli, Biochimie, 58:119-129

(1976). Denne økede mRNA stabilitet har lenge vært ansett som den bidragende faktor for den massive syntese av krystallprotein under sporulering.

{ tillegg er mRNA fra lipoprotein (lpp) genet fra E. coli som retter syntesen av et hovedsakelig ytre membranprotein, kjent å være relativt stabilt og er vist å ha sekvenser istand til å danne eksistensive sekun-dærstrukturer i form av stamme og ssløyfestruktur med aG° verdier innen området -0,4 til ca. -21,1 kgkal/mol, se Nakamura, K. et al., Messenger ribonucleic acid of the lipoprotein of the E. coli outer membrane II. The complete nucleotide sequence, J. Biol. Chem., 255:210-216 (1980). Hverken Nakumura et al. eller Petit-Galtron et al. foreslår at disse strukturer kan benyttes for å fremme eksprimeringen av et ønsket geneprodukt. Videre mangler nukleotidsekvensen for det klonede krygen, slik det skal beskrives nedenfor, den ekstensive sekundærstruktur som forbindes med mRNA til lpp genet.

Som en oppsummering viser den kjente teknikk med henblikk på retroregulering generelt at kjente retroregulatoriske sekvenser har en negativ virkning på eksprimering av gener de retroregulerer. Med henblikk på terminatorer indikerer Gentz et al, og Flock et al. at i forbindelse med en DNA sekvens under kontroll av en sterk promotor kan det oppnås effektiv ekprimering av genet for hvilket DNA sekvensen koder, men at i fravær av slike sterke terminatorer kan aktiviteten for en putativ sterk promotor ikke klart demonstreres.

Det er nu oppdaget positive retroregulatoriske elementer som, når de ligeres til en DNA sekvens som koder for et selektert geneprodukt, signifikant øker produksjonen av det selekterte geneprodukt.

Som benyttet heri er uttrykket "selektert" eller "ønsket geneprodukt" ment å angi et polypeptid eller protein fremstilt av en prokariotisk eller eller eukariotisk vert ved hjelp av dens transformasjon med et rekombinant DNA molekyl omfattende en DNA sekvens som koder for polypeptidet eller proteinet. Et slikt selektert eller ønsket geneprodukt kan være et som vanligvis produseres av verten, av en prokariotisk organisme forskjellig fra verten, eller av en aukariotisk organisme forskjellig fra verten. Uttrykket "gen" slik det her benyttes betyr en DNA sekvens som koder for et polypeptid eller et protein. Uttrykket "ekprimering" slik det benyttes nedenfor henviser til produksjon av et polypeptid eller et protein det er kodet for av en DNA sekvens eller et gen. Generelt er det positive retroregulatoriske element legert nedstrøms DNA sekvensen som koder for det selekterte geneprodukt. Slik det benyttes heri benyttes uttrykket "nedstrøms" med henblikk på trankripsjonsretningen for meddeler RNA hvortil DNA sekvensen tilsvarer, transkripsjonen skjer fra oppstrøms mot nedstrøms.

Lokaliseringen av det positive retroregulatoriske element er generelt 3' i forhold til enden av den kodede streng av DNA sekvensen som koder for det selekterte geneprodukt. Det er velkjent at for at et gen skal eksprimeres blir en translasjonsterminasjonskodon vanligvis funnet i 3'-enden av DNA sekvensen som koder for det selekterte geneprodukt. Karakteristisk er det positive retroregulatoriske element ligert til en DNA sekvens som koder for et selektert geneprodukt 3' til translasjons-terminasjonssekvensen forbundet med DNA sekvensen for det selekterte gen. Kjente translasjonsterminasjonssekvenser er generelt nukleotid- tripletter. Et" eksempel på slike translasjonsterminasjonskodoner inkluderer de som har sekvensene TAG, TAA og TGA, hvori den sistnevnte tilsvarer tymin-, adenin- og guaninrester som er komponenter i DNA . molekylet. Translasjonsterminasjonskodonene kan opptre enkeltvis, parret sekvensielt eller i par med et antall nukleotider mellom, se f.eks. Watson, J.D., Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (3. ed. 1977). Translasjonsterminasjonssignalet kan være negativt til den DNA sekvens som koder for det valgte geneprodukt eller kan i seg selv være ligert ved 3'-enden av DNA sekvensen som koder for det selekterte geneprodukt for derved å gi et translasjonsterminasjonssignal i en ønsket lokalisering.

Avstanden mellom det positive retroregulatoriske element og 3'-enden av genet hvortil det er ligert kan varieres men mans fremdeles utøver en positiv eller økende virkning på eksprimeringen av genet. Slik det skal forklares i større detalj nedenfor isoleres en spesiell region av det positive retroregulatoriske element som er isolert fra 3' flankerings-regionen av genet som koder for B. thuringiensiskrystallprotein, som antas å danne en "stamme og sløyfe"-struktur ved enden av mRNA transkriptet for det selekterte gen, er blitt ligert fra ca. 30 til ca. 300 nukleotider fra 3'-enden av det selekterte gen. I begge konstruksjoner vises en positiv retroregulatorisk effekt på eksprimeringen av genet hvortil det positive retroregulatoriske element var ligert.

Slik det skal vises i detalj i eksemplene nedenfor er positive retroregulatoriske elementer vist å øke eksprimeringen av genet hvortil de er ligert uansett orienteringen av det positive retroregulatoriske element. Det er vist at så lenge det positive retroregulatoriske element er lilgert på 3'-enden av et selektert gen, kan det positive retroregulatoriske element ha en 3' -5' orientering eller en 5' -3' orientering og fremdeles utvise en fremmende effekt på eksprimeringen av det selekterte gen.

Det positive retroregulatoriske element ifølge oppfinnelsen kan karakteriseres strukturelt som en DNA sekvens som transkriberer for et tilsvarende RNA transkript som er istand til å danne en stamme og sløyfestruk-tur med en Gibbs fri energikonstant, aG°på ca. -30,4 kgkal, bestemt i henhold til Tinoco, I. et al., Nature New Biology, 246:40-41 (1973). I en effektiv utførelsesform er det positive retroregulatoriske element ifølge oppfinnelsen en DNA sekvens som transkriberer for et •'tilsvarende RNA transkript som er istand til å danne en stamme og sløyfestruktur som har et guanin-cytosinrestinnhold på ca. 43%. Det er forvbentet at slike stamme og sløyfestrukturer med guanincytosin innhold på fra ca. 40 til 45% også vil være effektive positive retroregulatoriske elementer. Slike positive retroregulatoriske elementer er ment å ligge innenfor oppfinnelsens ramme.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen karakteriseres det positive retroregulatoriske element som en DNA sekvens med en invertert gjentage lsessekv ens inkludert det deoksyribonukleotidsekvensen AAAACGGACATCACCTCCATTGAAAC GGAGTGATGTCCGTTTT hvori den understrekede del av sekvensen omfatter den inverterte gjentagelsessekvens. Det tilsvarende mRNA transkript for den ovenfor nevnte inverterte gje nt age Ise ss ekv ens har ribonukleotidsekvensen AAAACGAAUCACCUCAUUGAAAC GGAGUGAUGUCCGUUUU hvori den understrekede del av ribonukleotidsekvensen er den inverterte gjentagelsessekvens.

Det er ventet at enkelte varianter av den ovenfor beskrevne deoksy-nukleotidsekvens og det tilsvarende RNA transkript som kan oppstå enten ved tilfeldig mutasjon, punktmutasjon, addisjonsmutasjon, utlatelsesmuta-sjon, syntetisk oligonyuklotidrettet mutagenese eller konstruksjon av syntetiske oligonukleotider, kan ha inverterte gjentagelsessekvenser som vil bevare den positive retroregulatoriske virkning til det positive retroregulatoriske element. Slike varianter som bevarer den positive retroregulatoriske virkning til det positive retroregulatoriske element ligger klart innenfor oppfinnelsens ramme.

Slik det skal beskrives i større detalj nedenfor kan det positive retroregulatoriske element ifølge oppfinnelsen isoleres fra en del av 3' flankeregionen av genet som koder for B. thuringiensiskrystallprotein (krygen). 3' flankeregionen kan renses ved bruk av konvensjonelle gel-elektroforeseteknikker og klones inn i en egnet vert for multiplikering. I en utførelsesform av oppfinnelsen som ytterligere beskrevet nedenfor i eksemplene, ble en del av 3' flankesekvensen av krygenet som inkluderte transkriptsjonsterminatorsignalet til dette,, isolert, renset og klonet. Denne del av krygen, selv om det var 382 nukleotider langt, inkluderte et positivt retroregulatorisk element som beskrevet ovenfor og deler av 3' flankeregionen av krygenet hadde således en positiv retroregulatorisk effekt.

Når det positive retroregulatoriske element ligeres til en DNA sekvens som er eksprimerbar for et valgt geneprodukt i egnet forhold dertil, som beskrevet ovenfor, blir eksprimering av det selekterte geneprodukt fremmet. Således inkluderer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremme eksprimeringen av et selektert geneprodukt. Som benyttet heri er uttrykket "DNA sekvens som er ekprimerbar for et selektert geneprodukt" ment å bety et selektert gen, f.eks. betalaktamase eller interleukin-2, med dertil forbundet en promotor, transkripsjonsstartsignal, ribosombindingssete, translasjonsstartsignal og translasjonsterminasjonssignal, alle de riktige forhold og avlesningsrammer slik at produktet for hvilket DNA sekvensen koder kan eksprimeres. Tallrike egnede promotore er velkjente for fagmannen og omfatter: promotore avledet fra E. coli inkludert tryptofanpromotoren, lakk promotoroperator og tallrike andre promotore som er kjent for fagmannen; Bacillus promotore inkludert penP promotoren; og tallrike viralpromotore slik som f.eks. Sp82 promotoren og PL promotoren til fag X. Viralpromotore kan erkjennes ved forskjellige celler avhengig av den spesielle celle som vanligvis infiseres. Den selekterte DNA sekvens kan videre inkludere en signalsekvens, f.eks. penP saignalsekvensen slik at det eksprimerte geneprodukt utskilles. Hvis det selekterte DNA inkludert en signalsekvens eksprimeres i E. coli vil geneproduktet vanligvis skilles ut i det periplasmiske rom i cellen og kan frigis fra det periplasmiske rom ved sonikering. Hvis det selekterte DNA inkludert en signalsekvens uttrykkes f.eks. ved B. subtilis vil det selekterte geneprodukt generelt skilles ut i kulturmediet og kan gjen-vinnes derfra.

Uttrykket "DNA sekvens eksprimerbar for et valgt geneprodukt" er videre ment å inkludere faktorer som er nødvendige for eksprimering av geneproduktet for hvilket DNA sekvensenkoder, slik som enzymer inkludert funksjonell RNA polymerase, ogverførings RNA, aminosyrer, ribosomer og andre elementer som er nødvendige for transkribering og translasjon av den selekterte DNA sekvens.

Ut fra det foregående vil det være klart at en "DNA sekvens som eksprimerbar for et selektert geneprodukt" inkluderer en vektor slik som et palsmid og en vertscelle transformert derav som er istand til å eksprimere genet og å danne geneproduktet kodet av genet. Eksempler på slike plasmider og verter er velkjente for fagmannen og eksemplifiserer i detalj i eksemplene nedenfor. Blant egnede verter for plasmider som bærer en DNA sekvens eksprimerbar for et selektert geneprodukt er prokariotiske og aukariotiske celler. Prokariotene kan defineres som organismer som mangler en virkelig kjerne, kjernemembranet er ikke tilstede og kjernestrukturen er samlet i en kjerneregion eller nukleoid. Kromosomene til prokaryoter er generelt ikke forbundet med proteiner.

Blant egnede prokaryotiske celler som verter for plasmider er både gram-positive og gram-negative bakterier. Med uttrykkene gram-positive og gram-negative er ment celler som er istand til å ta opp å beholde gram flekking henholdsvis celler som ikke er istand til å beholde gramflekking. Blant egnede gram-positive bakterier er de som hører til genus Bacillus og spesielt B. subtilis. B. subtilisstammen PSLI (BGSC nr. IA510) er spesielt foretrukket.

Blant egnede gram-negative bakterier er de som hører til genus Escherichia og spesielt E. colistammene MM2994 og CS412.

Eukaryotiske celler kan defineres som celler med en sann kjerne bundet sammen av et kjernemembran hvori man finner kromosomene vanligvis bundet til proteiner. Inkludert i de eukaryotiske celler er plante-, animalske og fungalceller. Blant fungalcellene regnes gjær og spesielt Saccharomyces, i særdeleshet Saccharomyces cervisiae er brukbare ved oppfinnelsens gjennomføring.

Egnede plasmider for bæring av DNA sekvensene som er eksprimerbare for et selektert geneprodukt er de som er istand til å transformere en vertscelle slik at DNA sekvensen eksprimeres derved. Generelt kan en DNA sekvens eksprimerbar for et selektert geneprodukt ligert til et positivt retroregulatorisk element plasseres i ethvert plasmid som er istand til å eksprimere geneproduktet i en egnet transformert vert. Således inkluderer oppfinnelsen plasmider som bærer DNA sekvenser som er eksprimerbare for et selektert geneprodukt ligert til et positivt retroregulatorisk element så vel som vertscellen som transformeres dermed.

Plasmider som er istand til å transformere E. coli inkluderer f.eks. Col El typen plasmider generelt. Andre egnede plasmider for transformering av E. coli inkluderer :pSC101, psSF2124, pMB8, pMB9, pACYC184,PACYC177, pCKl, pCKl, R6K, pBR312, pBR313, pBR317,PBR318, pBR320, pBR321, pBR322, pBR333, pBR341, pBR345, pBR350, pBR351, pML2, pML21, ColElAP, RSF1010, pVH51, pVH51, pVH51, pVH151 og pVH153, se Recombinant Molecules Impact on Science and Society, Beers, R.F. og Bassett, E.G., eds. Raven Press, New York (1977). Plasmider av typen pBR inkluderer pBR325, pBR327 og pBR328, se Soberon et al., Gene, 9:287-305 (1980). Andre egnede plasmider er beskrevet i DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes, Bukhari et al. (eds) Cold Spring Harbor Laboratory (1976).

Plasmider som er istand til å transformere B. subtilis inkluderer pC194, pC221, pC223, pUB112, pT127, pE194, pUBHO, pSA0501, pSA2100, pTP4, pTP5 (se Gryczan, T. J., "Molecular Cloning in B. subtilis in Tne Molecular Biology of the Bacilli, Dubnau, D., Ed., Academic Press, Inc., New York, 1982, p. 310) og derivater derav.

Plasmider som er istand til å transformere både B. subtilis og E. coli og som kan benyttes ved gjennomføring av oppfinnelsen inkluderer:pDH5060, pLP1201 (Ostroff et al., infra p062165 (Gray, 0. og Chang, S., "Molecular cloning and expression of B. licheniformis p-lactamase gene in E. coli and B. subtilis", J. Bacteriol., 145:422-428 (1982), pHVll, pHV12, pHV14, pHV16 (Ehrlich, S. D., "DNA cloning in B. subtilis", Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:1433-1436 (1978), og pSYC310-2 (McLaughlin et al., infra. Se også Old, R. W. og Primrose, S. B., "Plasmid vectors for cloning in microbes other than E. coli", Principles of Gene Manipulation 2. utg., Carr., N.6, Ingraham, L.L., and Rittenberg, S. C, Eds, University of Ca. Press, Berkeley, 1981, p. 48).

Plasmider som er istand til å transformere S. cervisiae inkluderer: pMP78, YEpl3, pBTIl, pLC544, YEp2, YEp2, YRpl7, pRB8 (YIp30), pBT19, pBTHO, pACl, pSLel, pJDB219, pDB248 og YRp7.

DNA sekvensen som koder for et eksprimerbart geneprodukt som er ligert til det positive retroregulatoriske element kan være cistronisk, f.eks. kode for et enkelt polypeptid eller polycistronisk, dvs. kode for et antall polypeptider, mRNA for polycistronisk DNA er under transkripsjonen kontroll av en enkelt promotor. Slike polycystroniske DNA sekvenser er velkjente for fagmannen og inkluderer f.eks. genene for tryptofanbio-syntesen under kontroll av tryptofanoperonet i E. coli. Polycistroniske gener kan også dannes kunstig ved å ligere en serie ønskede gener sammen under kontroll av en enkelt promotor, se f.eks. Flock, J. et al., supra (1984).

Den selekterte DNA sekvens som er eksprimerbar for et ønsket geneprodukt ligatert til et positivt retroregulatorisk element kan være homologt med vertens DNA eller alternativt heterologt til vertens DNA. Således kan f.eks. den selekterte DNA sekvens være avledet fra en organisme som er av samme art som vertscellen som er blitt transformert for å ekprim-ere geneproduktet, i hvilket tilfelle den selekterte DNA sekvens som heri benyttet kalles homolog. Et eksempel på en homolog genesekvens som er eksprimerbar for et selektert geneprodukt ifølge oppfinnelsen er den fremmende ekprimering i en E. coli vert transformert av et plasmid som bærer et gen som er nativt til E. coli. Et eksempel er fremstilling av E. coli p-galaktosidase hvori den forbedrede ekprimering medieres ved ligering av et positivt retroregulatorisk element ved 3'-enden av e-galaktosidase.

Som nevnt ovenfor kan den selekterte DNA sekvens som er eksprimerbar for et ønsket polypeptid ligert til et positivt retroregulatorisk element alternativt være heterologt til verten. Tallrike eksempler på slik heterolog forbedret ekprimering er gitt i detalj nedenfor og omfatter: forbedret eksprimering, under mediering av et positivt retroregulatorisk element, av B. licheniformis penicillinase gene i B. subtilis; eukaryotiske gener slik som pattedyr interleukin-2 og mutert interleukin-2 i prokariotisk "mikroorganismer slik som B. subtilis og E. coli.

I et annet aspekt ved oppfinnelsen kan det positive retroregulatoriske element benyttes i en fremgangsmåte for å utvide halveringstiden for mRNA transkriptet kodet av en selektert DNA sekvens. Som vist i detalj i eksemplene blir, når det positive retroregulatoriske element er ligert til 3'-enden av en selektert DNA sekvens, halveringstiden for mRNA transkriptet kodet av den selekterte DNA sekvens, utvidet. Mekanismen med hvilken det positive retroregulatoriske element bevirker denne mRNA halveringstids utvidelse er ikke helt ut forstått. En mulig forklaring for den observerte mRNA halveringstidsutvidelse er at mRNA transkriptet for det positive retroregulatoriske element antar en sekundær struktur som forhindrer enzymatisk hydrolyse av mRNA transkriptet initiert ved 3'-enden av transkripet. Metoden for utvidelse av halveringstiden for mRNA transkriptene er vist ved å benytte det positive retroregulatoriske element i retning både 3' mot 5' og 5' mot 3'.

Det positive retroregulatoriske element kan benyttes for å utvide halveringstiden for mRNA transkritet kodet av en selektert DNA sekvens når DNA sekvensen er heterolog til vertsorganismen. Videre opptrer halveringstidsutvidelsen av mRNA transkriptet tilveiebragt ved bruk av det positive retroregulatoriske element også der promotoren, den valgte DNA sekvens og den positive retroregulator alle er heterologe til vertsorganismen. Ment innenfor rammen av oppfinnelsen er fremgangs-måter for mRNA halveringstidsutvidelser der promotoren, elektert DNA eller positivt retroregulatorisk element hver enten enkeltvis eller sammen ikke er heterologe til vertsmekanismen.

mRNA transkriptet kodet av en selektert DNA sekvens med positivt retroregulatorisk element i 3'-enden, er vist å ha utvidet halveringstid i mikrooganismer i hvilke de er blitt transkribert. Slike mikroorganismer tilveiebringer således et middel for transkribering av et selektert DNA til RNA. Andre midler for transkribering av et selektert DNA til RNA er ansett å være brukbar innenfor oppfinnelsens ramme. Således ansees eukaryotiske celler slik som saccharomyces eller xenopus oocytes som slike midler for trankribering av DNA. I tillegg er cellefrie systemer som

i seg har de komponenter som er nødvendig for RNA transkribering slik som buffere, DNA ^avhengig RNA polymerase, ioner og ribonukleotidtri-fosfater ansett å være brukbare for transkribering av en selektert DNA sekvens med et positivt retroregulatorisk element legert i 3'-enden derav og utgjøre en RNA med utvidet halveringstid.

Utvidelsen av halveringstiden for mRNA transkribert fra en selektert DNA sekvens i det positive retroregulatoriske element i 3'-enden, kan måles direkte ved hybridisering av radiomerkede DNA prober til mRNA i cellene som er behandlet med transkripsjonsinhibitorer slik som rifampi-sin. Det er vist at forbedret eksprimering av en selektert DNA sekvens oppnådd ved å benytte det positive retroregulatoriske element korrolerer vesentlig med utvidelsen av halveringstiden av mRNA kodet av den selekterte DNA sekvens.

Ut fra den foregående oppsummering av oppfinnelsen vil det være klart for fagmannen at oppfinnerne har tilveiebragt positive retroregulatoriske elementer, plasmider som bærer de positive retroregulatoriske elementer legert til en DNA sekvens som er ekprimerbar for et selektert geneprodukt forbedres, celler som transformeres med slike plasmider eksprimerer det selekterte geneprodukt i forbedrede nivåer, og de selekterte geneprodukter som eksprimeres på denne måte.

Det vil videre være klart for fagmannen at oppfinnerne har tilveiebragt en generell metode for å forbedre ekprimeringen av et valgt geneprodukt, en metode som omfatter å tilveiebringe en DNA sekvens som er ekprimerbar for et valgt geneprodukt og ligering av et positivt retroregulatorisk element til DNA sekvensen i et forhold til denne hvorved eksprimering av det selekterte geneprodukt forbedres. Den generelle metode som er beskrevet ovenfor og i større detlj nedenfor i eksemplene som følger, er effektiv med henblikk på å forbedre eksprimeringen av DNA sekvenser som koder for et ønsket geneprodukt i prokaryotisk og eukayotiske verter, og synes å være effektiv uansett om DNA sekvensen som skal eksprimeres er homolog eller heterolog til vertscellen som eksprimerer den. Oppfinnelsen inkluderer også geneprodukter fremstilt ved den generelle metode for forbedring av eksprimeringen av et valgt geneprodukt.

De følgende eksempler er ment kun å være illustrerende for oppfinnelsen og skal ikke være begrensende. Som nevnt ovenfor er oppfinnelsen som er beskrevet heri og krevet nedenfor generelt anvendbar på den forbedrede ekprimering av tallrike geneprodukter av tallrike celletyper, et faktum som vil være klart for fagmannen. Eksemplene nedenfor er kun ment å tilveiebringe en detaljert og praktisk beskrivelse av oppfinnelsen slik den anvendes på celler og plasmider som er eksemplifisert nedenfor.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere under henvisning til tegningene.

Figur 1 er en skjematisk presentasjon av restriksjonskartet for rekom-binantplasmidet pESl som bærer det klonede krygen fra B. thuringiensis. Transkripsjonen av krygenet begynner på setet ca. 350 bp oppstrøms det fjerde EcoRl setet og slutter ca. 360 bp nedstrøms det tredje PvuII setet vist i figur 1.

Nukleotidsekvensen for PvuII-Ndel restriksjonsfragmentete som bærer den transkripsjonene terminator av kry er også vist i figur 1. Det er en invertert gjentagelsessekvens lokalisert omtrent 40 bp oppstrøms Ndel sete. Et mRNA transkript fra dette område kan potensielt danne en stamme og løkkestruktur. Figur 2 viser den forventede stamme og løkkestruktur for RNA kodet av den inverterte gjentagelsessekvens indikert i figur 1. Stamme og løkkestrukturen er relativt rik på G/C, ca. 44% med en forutsagt aG° på ca. -30,4 kgkal. beregnet etter reglene til Tinoco, et al., supra.

Figur 3 er en skjematisk representering av plasmide pSYC667.

Figur 4 er en skjematisk presentering av plasmidene pHYC70 og pHCW70. Figur 5 er en skjematisk presentering av plasmidene pHCW300 og pHCW301 hvorfra de ble konstruert. Figur 6 er en skjematisk presentering av plasmide pFC54.t. Ingen av plasmidene som er vist i figuren er ment å være skalategninger. Relative posisjoner for endonukleaseposisjoner og relevante kodingsregioner for plasmidene er antydet.

Figur 7 er et diagram over sammenbruddet av penP mRNAer produsert av E. coli og B. subtilis som huser plasmisene pSYC667 og pHCW-A3.

Nedenfor følger en liste over restirksjonsendonukleaser som ble benyttet i eksemplene nedenfor. Den venstre kolonne av listen er det vanligvis benyttede navn for de spesielle endonukleaser og den høyre kolonne er organismen hvorfra den opprinnelig ble avledet. De anførte restriksjonsendonukleaser ble benyttet under buffer- og temperaturbetingelser anbefalt av leverandøren. Restriksjonsendonukleaser er tilgjengelige fra tallrike kommersielle kilder inkludert New Englsih BioLabs, Beverly, Massachusetts, USA og Bethesda Research Labaratories, Geithersberg, Maryland USA. Identiteten for nukleotidsekvensene ved hvilke spesielle restriksjonsendonukleaser kutter, kan finnes i produktkataloger fra leverandører av enzymene såvel som standard referansetekster.

Visse uttrykk og forkortelser benyttes nedenfor. Hvis ikke annet er sagt er meningen ment å være følgende: Som brukt heri er uttrykket "penP" ment å angi prepenicillinasegenet av B. licheniformisstamme 749/C, eller, der det går klart ut fra konteksten, en relevant del derav. Nucleotidsekvensen fra penP er publisert av Kroyer, J., og Chang, S., Gene, 15:343-347 (1981) og Neugebauer, K., Sprengd, R., og Schaller, H., Nucl. Acids Res., 9:2577-2589 (1981).

Som brukt heri betyr "kodon" av vekslene (i) en triplet av ribonukleotider i en mRNA som er translatert inn i en aminosyre i et polypeptid eller en kode for initiering av termineringen av translasjonen, eller (ii) en triplet av deoksyribonukleotider i et gen hvis komplementære triplet er transkribert til en triplet av ribonukleotider i et mRNA som, i sin tur, er translatert til en aminosyre i et polypeptid eller en kode for initiering eller terminering eller translasjon. Således er f.eks. 5'TCC-3' og 5'-UCC-3' begge "kodoner" for serin slik uttrykket "kodon" her benyttes.

Som benyttet heri betyr "nukleotid", "deoksynukleotid" og "deoksyribonukleotid" alle deoksyribonukleotid.

dNTP eller NTP betyr et hvilket som helst av deoksyribonuklotidtri-fosfatene, dvs. ATP, GTP, CTP og TTP.

"bp" betyr basepar og "kb" betyr kilobasepar.

"Polypeptid" betyr et hvilket som helst peptid med to eller flere aminosyrer inkludert proteiner.

"Kodende sekvens" eller "DNA kodende sekvens" betyr en DNA sekvens som koder et polypeptid.

"ATCC" betyr American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Brukt i forbindelse med et tall, f.eks. "ATCC 37017" henviser ATCC

til adgangsnummeret hos American Type Culture Collection for en organisme som er deponert med ATTC.

"Virksomt forbundet" brukt i forbindelse med DNA sekvenser henviser til den situasjon der sekvensene er anordnet på en slik måte at de tillates sin vanlige funksjonalitet. F.eks. henviser en promotor som er virksomt forbundet til en kodende sekvens til slike bindinger der promotoren er istand til å kontrollere eksprimeringen av sekvensen. Promotorene som virksomt er bundet til en ribosombindingkodende sekvens har samme betydning: Dvs. den tillater ribosombindingssete, RBS, og kunne posisjon-eres i transkriptet slik at den deltar initieringen av translasjonen av RNA transkriptet. En RBS virksomt bundet til en startkondon er posisjonert slik at det tillater start av translasjonen ved denne kodon.

Fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen gjør bruk av teknikker eller genetisk konstruksjon og molekylær kloning. Generelle teknikker for genetisk konstruksjon og molekylær kloning finnes i Maniatis, T.fFritsch, E. F., og Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, og Methods in Enzymology, Volume 68, Recombinant DNA, (Wu, R., forfatter), Akademic Press, New York, 1979.

Olingonukleotidsyntese kan gjennomføres ved hjelp av et antall metoder inkludert de som er beskrevet i US-PS 4.415.734 og i Matteuci et al., J. Am. Chem. Soc. 103 (11):3185-3191 (1981), Adams et al., J. Am. Chem. Soc, 105 (3):661 -663 (1983 samt Bemcage et al., Tetrahedron Letters, 22 (20): 1859-1867 (1981).

Eksempel I

Fremstilling av 3' eksprimeringsforbedringsfragmenter.

A. pESl

Plasmid pESl ble fremstilt som beskrevet i publisert europeisk søknad nr. 82302137.3, fra plasmid pBR322 (ATCC 37017) og en nedbrytning av det store plasmidfragment av B. thuringiensis var. Kurstaki HD-1. pESl er også beskrevet i H. Schnepf og H. Whiteley, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 78:2897 (1981) og US-PS 4.48.885. pESl i E. coli K-12/HB101 ér deponert av søkerne til den ovenfor angitte europeiske søknad i ATCC under Budapestavtalens betingelser. Under nummeret ATCC 31995. B. thuringiensis var. Kurstaki stamme HD-l-Dipel er tilgjengelig fra Nothern Regional Research Laboratory Culture Collection i Peoria, Illinois under

Som beskrevet av Schnepf og Whiteley, supra og i H. Wong et al., Jour. Biol. Chem. 258, 1960 (1983) har pESl tilskudd i BamHl sete på sitt pBR322 opphav, et Sau3Al fragment fra 30 megadaltonplasmidet, 47 megadalton plasmidet eller begge disse plasmider fra B. thuringiensis. Sau3Al fragmentet inkluderer et gen som koder for delta-endotok sin-krystallproteinet av B. thuringiensis (krygene). Dette gen er eksprimert til å danne et biologisk aktivt krystallprotein i E. coli transformert med plasmidet pESl.

B. M13mp8 EP1 - klonen av 3'-enden til krygenet.

Plasmidet pESl ble brutt ned med PvuII og EcoRI og det resulterende 2 kb fragment ble isolert ved agarosegelelektroforese, se Maniatis et al. supra 1982 s. 164 med det enkle unntak at 1/10 x TEA (4mM Tris. 0,1 mM Na EDTA 21^0, 0,5 mM NaHC var den buffert som ble benyttet. Dette fragment er fra.3'-enden av krystallprotein genet og inkluderer transkripsjonsterminasjonssignalet til krystallgenet. Kartlokaliseringen og en andel av sekvensen av dette fragment inkludert translasjonstermina-sjonskodonet til akkurat etter transkripsjonsterminasjonssignalet, er vist i fig. 1.

Ved bruk av konvensjonelle legeringsmetoder ble 2 kb fragmenter så klonet inn i replikativ form (RF) DNA av fagen M13mp8, tilgjengelig fra Bethesada Research Laboratories Inc., som på forhånd var brutt ned med Smal og EcoRI. Det resulterende plasmid er kalt M13mp8 EP1. E. Coli stammen JM103 ble transformert med M13mp8 EP1 plasmidet.

C. M13mp9 NP3 - subklonen av 3'-enden av krygenet.

M13mp9 NP3 ble fremstilt som følger: M13mp8 EP1 RF DNA ble nedbrutt med Ndell. Ndel endene ble gjort stumpe med E. coli DNA polymerase I Klenow fragment og dNTPs. De stumpendede DNA molekyler ble ytterligere brutt ned med BamHI. Et 382 bp-fragment kalt NP3 med transkrip- ' sjonsterminasjonssignalet til krygenen ble så isolert ved akrylamidgelelektroforese ved hjelp av den metode som er beskrevet av Maxim et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:560-564 (1979). NP3 ble subklonet inn i en BamHI-Smal nedbrutt M13mp9 RF DNA for å danne M13mp9 NP3.

E. coli JM103 ble transformert med M13mp9 NP3.

Fragmentet kalt NP3 klonet inn i M13mp9 NP3 er vist i figur 1. Som man ser av figuren mangler fragmentet klonet inn i M13mp9NP3 ca. 1,6 kb DNA tilstede mellom Ndel og EcoRI setene nedstrøms transk rips jons - terminalsignalet i M13mp8 EP1.

Eksempel II

Syntetiske gener omfattende positive retroregulatoriske elementer.

A. pSYC667

Plasmid pSYC667 er istand til replikering i E. coli og B. subtilis (se fig. 3). Det inneholder genet for prepenicillinase (penP) fra B. licheniformis 749/C som eksprimeres under påvirkning av en spesifikt mutert signalsekvens for penP i E. coli og B. subtilies som er transformert med plasmidet. Moden penicillianase skilles ut ekstracellulært til mediet til B. subtilis transformert med pSYC667. Modent penicillinase skilles ut til det peripalsmiske rom av E. coli transformert med pSYC667 og kan avgis fra det periplasmiske rom ved osmotisk sjokk i henhold til metoden ifølge Nosel og Heppel, J. Biol. Chem., 241:3055-3062 (1966) eller Lunn og Pigiet, J.Biol. Chem., 257:11424-11430 (1962).

pSYC667 ble konstruert som følger:

B. licheniformis penicillinasegenet ble sekventert, se Kroyer, J., og "hang, S.,

Gene, 15:343-347 (1981), og Neugebauer, K., et al., Nucl. Acids Res., 9:2577-2588 (1981). Den native signalsekvens inneholdt kodonet TGC som koder for et cystein ved aminosyreposisjon 27. Cysteinresten ved posi modifiseres som en del av en sekvens av begivenheter som fører til dannelsen av den membranbundne lipoproteinform av penicillinase, se bp Hindlll-BamHI fragmentet i pSYC660, har pSYC667 sekvensen 5'-GGATCGATCC-3'.

Plasmid pSYC667 beholder Ostl og BgHI erkjennelsessetene til plasmid pSYC660. På samme måte har Hinlll-BamHI framgentet av M13penPS27P28som inneholder penPS27P28genet et Pstal sete og BgHI sete på samme lokalisering som Pstl sete og BgHI sete i det Hindlll-BamHI-penPS27~holdige fragment i pSYC667.

pSYC667 er deponert hos ATCC under Budapestavtalens betingelser og gitt nummeret ATCC 39758.

B. pHCW3- A3

Plasmid pSYC667 ble brutt ned med Bell som kutter mellom translasjons-terminasjonskodonet og transkripsjonsterminasjonssignalet i B. licheniformis penicillinasegenet. BslI enden ble fylt ved bruk av DNA polymerase I Klenow fragment og de fire dNTP'er. Slike metoder er velkjente for fagmannen (se Maniatis, et al., surpa (1982)). Enzymene ble inaktiverte ved fenolekstraksjon og DNA ble gjenvunnet ved etanolutfelling.

DNA ble ytterligere nedbrutt med Nrul og ekstrahert to ganger med fenol og så to ganger med eter. Nrul kutter nedstrøms transkripsjonsterminasjonssignalet til B. licheniformis penicillinasegenet i pSYC667. Således inneholder det store Nrul-Bcll spaltede fragment av pSYC667 hele penicillinasegenet gjennom translasjonsterminasjonskodonen men inkluderer ikke transkripsjonsterminasjonssignalet (se fig. 3).

M13mp9 NP3 ble kuttet med EcoRI og BamHI og et 400 bp-fragment ble isol.ert ved standard metoder ved bruk av en 1% agarosegel og renset ved DE-52 kromatografi. Slike metoder er beskrevet av Maniatis, et al. supra, 104 (1982).

EcoRI-BamHI 400 bp fragmentet fra M13mp9 NP3 ble så ligert inn i det store Nrul-Bcll fragmentet til pSYC667 ved bruk av standardprosedyrer. De resulterende plasmider ble transformert inn i E. coli K-12/CS412 ved bruk av metodene ifølge Cohen et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 69:2110 (1973); se også Maniatis et al. supra, 1982, s. 250). Transfor manter ble valgt for resistans på LB mediumplater inneholdende 50 jjg/ml ampicillin, se Maniatis et al. supra, 440 (1982). Plasmid DNA ble fremstilt fra selekterte transformanter ved mini-prepmetoden ifølge Birnboim og Doly (Nucl. Acids Res., 7:1513 (1979)) og ble bedømt med henblikk på et plasmid det forventede 1,6 kb EcoRI fragment, omtrent 0,4 kb av fragmentet avledet fra M13mp9 NP3 og omtrent 1,2 kb fra pSYC667. En transformant huset et plasmid som ble kalt pHCW-A3.

B.l. Tranformasjon av B. subtilis med pHCW- A3

pHCW-A3 ble også transformert inn i B. sbutilis, PSL1, Bacillus Genetic Stock Center No. IA510 (Bacillus Genetic Stock Center, Department of Microbiology, Ohio State University, Columbus, Ohio, U.S.A.). B. subtilis PSL1 er Leu~, Arg-, Thr og recE4.

En kultur av B. subtilis PSL1-celler ble gjort kompetent for transformering ved bruk av en teknikk som er forbundet med den som er beskrevet av Anagnostopoulos og Spizizen, J. Bacteriol., 741-746 (1961).

j

10 X Spizizen I Minimal Solution ble fremstilt ved blanding i et totalt oppløsningsvolum på 1 liter fremstilt av destillert vann, 20 g (NH^SO^ 140 g K2HP04, 60 g KH2P04og 10 g Na citrat.

Spizizen I medium ble fremstilt ved å blande 2,05 ml 1 M MgSO^ 6 ml 50% vekt/vekt glukose; 5 ml 10% vekt/vekt gjærekstrakt; 5 ml 2% vekt/vekt kaseinhydrolysat; for hver aminosyre krevet av stammen som skulle transformeres, 2,5 ml 1% vekt/vekt oppløsning av aminosyre; 50 ml 10 x Spizizen I minimal oppløsning; og tilstrekkelig destillert vann til å bringe oppløsningen til et volum på 500 ml. For B. subtilis PSL1 var de nødvendige aminesyrer treonin, arginin og leucin.

Spizizen II medium ble fremstilt ved å tilsette 0,25 ml 1 M CaCl2og 1 ml 1 M MgCl2til 500 ml Spizizen I Medium. 30 ml Spizizen I medium ble inokulert med en koloni av sporer av B. subtilis stammen som skulle transsformeres og ble dyrket overnatt (16-20 timer) ved 37 °C. • 15 ml av denne kultur ble så inokulert inn i 135 ml Spizizen I medium i en 2800 ml kolbe og dyrket ved 37 'c. Den optiske densitet ved 600 nm (O.D.) for kulturen ble målt etter 1,5 til 2 timer og så hvert 15 minutt inntil kulturen ble funnet å være i den sene logfase på basis av en økning i O.D. på mindre enn 5% mellom 15 minutters O.D. avlesninger.

50 ml sen logfasekultur ble så inokulert inn i 450 ml Spizizen II medium

i en 2800 ml kolbe og dyrket ved 37 °C i 1,5 timer. Etter 1,5 timers dyrking ble cellene spunnet ned ved sentrifugering ved 5000 omdr. pr. minutt i 10 minutter ved 4°C.

Pelleten fra sentrigueringen ble så suspendert igjen i 45 ml supernatant hvortil det var satt 6 ml 80% (volum/volum) steril glyserol akkurat før frysing av kulturen i et tørris-etanolbad (-70°C). Cellene i den frosne kultur var kompetente celler, egnet for transformering av det ønskede plasmid, som følger: 0,5 ml - 0,6 ml av den frosne, kompetent-celle-holdige kultur ble tint på

is og 5 til 50 ul oppløsning inneholdende plasmidet som skulle transformeres inn i cellene ble kombinert med den tinte kultur. _Den resulterende blanding ble rystet ved 37 "C i 2 timer i løpet av hvilket tidsrom transformering av plasmidene og eksprimering av genene på dem skjedde.

For seleksjon ble tilslutt små mengder slik som ca. 5 ul til 200 ul av I kulturen av transformerte celler overført til plater inneholdende det eller de ønskede antibiotika for seleksjon.

En mini-prep av plasmid pHCW.-A3 ble fremstilt som beskrevet ovenfor

for E. coli K-12/C54-12 transformert med plasmidet. Til 1 ml kultur av kompetent B. subtilis PSL1 ble det tilsatt 5 ul mini-prep plasmid DNA

oppløsning. Blandingen ble inkubert ved 37"C i 2 timer. Like mengder av blandingen ble så bragt på plate og inkubert ved 37"C overnatt på rike mediumagarplater (1,5 g/l kjøttekstrakt; 3,0 g/l gjærekstrakt; 6,0 g/l

pepton; 15,0 g/l agar) hvortil det var tilsatt 5>jg/ml kloramfenikol. En i kloramfenikolresistent koloni ble plukket ut og inokulert i 5 ml 2 x LB

medium inneholdende 5 jjg/ml kloramfenikol; kulturen ble inkubert overnatt ved 37 °C under rysting.

Underkulturer av kulturer av B. subtilis PSL1 transformert med pHCW-A3 og fremstilt som angitt ovenfor, er deponert i CMCC under nummeret 2120.

C. pLWl.

Plasmid pLWWl er et pBR322 derivat istand til replikering i E.coli inneholdende som tetracyklinresistent genet E. coli trp promoteren, ribosombindingssete (RBS) fragmentet og et 706 bp Hindlll-Pstl DNA fragment som inkluderer genet for human interleukin-2 (IL-2) (Rosenberg, S. A. et al. Science, 223:1412-1415 (1984). pLWl er deponert i henhold til Budapestavtalen under nummeret ATCC 39405.

D. pLW45

Plasmid er et pBR322 derivat istand til replikering i E. coli inneholdende et tetracyklinresistansegen og E. coli trp. promoteren. Plasmidet inneholder på et 706 bp Hindlll-Pstl fragment et gen for et modifisert IL-2 protein.

pLW45 er deponert i henhold til Budapest-avtalen under nummeret ATCC 39629.

Det modifiserte IL-2 ble kodet med pLW45 og bruken av slikt IL-2 protein ved behandling av humansykdommer og også undertrykkelse av immunsystemet er beskrevet i BE-PS 898.016.

E. pHCW701 og pHCW702

400 bp EcoRI-BamHI restriksjonsfragmentet med transkripsjonsterminasjonssignalet til krygenet ble skåret ut fra M13mp90 NP ved nedbrytning med EcoRI og BamHI restriksjonsendonukleaser under bufferbertingelser foreslått av leverandøren. EcoRI-BamHI endene av fragmentet ble gjort stumpe med Klenow Poll fragment og dNTPer. De stumpendede fragmenter inneholdende transkripsjonsterminalsignalet til krygenet ble isolert ved akrylamidgelelektroforese. Det isolerte stumpendede fragment ble elektroeluert og ligert ved bruk av T4 legase og ATP inn i plasmid pLWl som på forhånd var brutt ned med Stul restriksjonsendonuklease.

Uansett den orientering i hvilke det stumpendede fragmentet som bærer transkripsjonsterminasjonssignalet rekombineres med Stul endene av pLWl, vil begge de opprinnelige EcoRI og BamHI seter regenereres. En orientering resulterer i at BamHI setet lokaliseres nærmere 3' enden av IL-2 genet og plasmidet karakteriseres således pHCW710. (Denne orientering tilsvarer det som er funnet i krygenet selv.) Den andre orientering resulterer i at EcoRI setet er nærmere 3' enden av IL-2 genet og dette rekombinante plasmidet kalles pHCW702 (fig. 3). På grunn av den symmetriske lokalisering av den inverterte gjentagelsessekvens i EcoRI-BamHI fragmentet som angitt i fig. 1, er stamme- sløyfestrukturen til det positive retroregulatoriske element lokalisert ca. 310 bp nedstrøms BamHI setet ved 3' enden av IL-2 genet i pHCW701. I pHCW702 er stamme-slø.yfestrukturen for det positive retroregulatoriske element ca. 30 bp nedstrøms EcoRI sete for 3' enden av IL-2 genet.

pHCW701 og pHCW702 kan lett skilles ved nedbrytning av plasmid DNAene med restriksjonsenzymet EcoRI og bestemme størrelsen av restriksjonsfragmentene ved bruk av akrylamid- eller agarosegelelektroforese. EcoRI nedbrutt pHCW701 frigir et 960-bp restriksjonsfragment som inneholder trp-promoter-RBS- kasetten (108 bp), i IL-2 genet (450 bp) og terminatoren (400 bp). Imidlertid frigir EcoRI nedbrutt pHCW702 et 560-bp restriksjonsfragment som akkurat inneholder kun trp promoter-RBS-kasetten (108 bp) og IL-2 genet (450 bp).

F. Konstruksjon av pHCW801.

pHCW801 ble konstruert for å bedømme virkningen av det positive retroregulatoriske element på fremstillingen av det modifiserte IL-2 ved plasmidet pLW45. Plasmidet pHCW701 ble brutt ned med BamHI og endene ble gjort stumpe med Klenow Poll fragment og dNTPer som vist tidligere. Det stumpendede BamHI fragment ble brutt ned med Aval. Det største resulterende fragment var 2,7 kb og hadde en stump BamHI -ende og en Aval-ende. Dette fragment ble renset ved 0,8% agarose gel elektroforese og inneholdt 3' ekspressjonsforbedringssekvensen.

Plasmid pLW45 ble brutt ned med Stul- og så Aval-restriksjonsendonukleaser. Et ca. 2,3 kb-fragment ble renset fra produktet ved agarose-elelektroforese, elektroeluert og ligert ved bruk av T4 legase og ATP, til fragmentet med en BamHI stump ende og en Aval ende, avledet fra plasmid pHCW701, som inneholdt det positive retroregulatoriske element. Tetracyklinresistente transformanter ble analysert ved mini-prep isolasjon av plasmidet DNA og bedømt for nærvær av EcoRI fragment inkludert både det modifiserte IL-2 gen og det retroregulatoriske gen, se Birnboim og Doly, supra (1979).

G. pHCW301

1. Promoter 156:

En promoter, er kjent av B. subtilis vegetative RNA polymerase, som er lokalisert på et 240 bp Hhal restriksjonsfragment av bakteriofagen SP82, ble først oppdaget ved DNA restriksjonsfragmentprobeanalyse og B. subtilis RNA polymerasebinding- og initieringsanalyse, se JOnes, B.B., Chan, H., Rothstein, S.; Wells, R. D. og Reznikoff, W. S., Proe. Nati. Acad. Sei- (USA), 74:4914-4918 (1979). 240 bp Hhal fragmentet ble isolert fra Hhal nedbrutt SP82 DNA /ved gel elektroforese og endene ble gjort stumpe ved å fjerne uparrede nukleotider med Sl nuklease (2200/ml i pH 4,6 buffer inneholdende 300 mM NaCl, 60 mM SO4og 50 mM Na acetat), se <maniatis et al. supra at p. 140. Det stumpendede fragment ble så klonet inn i HincII setet til M13mp7 RF DNA (oppnådd fra Bethesda Research Labs) som på forhånd var brutt ned med HincII restriksjonsendonuklease. DNA sekvensanalyse antydet at en RBS sekvens var lokalisert i 3' enden av Hhal restriksjonsfragmentet som bar promoter-sekvensen. For å eliminere RBS sekvensen ble 240 bp Hhal fragmentet brutt ned med Alul restriksjonsendonuklease. Et 150 Hhal-Alul restriksjonsfragment ble isolert ved akrylamidgelelektroforese. Promoteren var kjent lokalisert på dette 150 bp restriksjonsfragment ved DNA sekvensanalyse. 150 bp restriksjonsfragmentet ble så subklonet inn i HincII setet av M13mp7 RF DNA som på forhånd var brutt ned med HincII restriksjonsendonuklease for å danne en fag kalt M13mp7-pl56.

2. Ribosomsbindingssete:

Det ble fremstilt to syntetiske oligonukleotider med sekvensen : (1) 5'-CGATAAGAGGAGGTA-3' og (2) 5'-AGCTTACCTCCTCTTAT-3\

500 pikomol av hvert oligonukleotid ble blandet og forsforylert med polynukleotidkinase og ATP. De fosforylerte oligonukleotider ble så

temperert ved 68°C i 1 time og så ved 37°C i 3 timer. Den tempererte oligomer hadde sekvensen ,

5'AGCTTACCTCCTCTAAT -3'

3'ATGGAGGAGATTAGC-5'

som så ble klonet inn i Clal-Hindlll setet til pUC8-41 ved bruk av T4 legase under legeringsbetingelser og et molforhold mellom oligomer og vektor på ca. 10 til 1. pUC8 er kommersielt tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories og ble modifisert som følger for å oppnå pUC8-41: pUC8 ble brutt ned med BanHI og endene ble gjort stumpe med Klenow Poll fragment. Hvite kolonier av E. coli JM103 inneholdende det re-sirkulariserte BamHI reparerte pUC8 ble selektert. Plasmid DNA fra disse transformanter ble linearisert med Pstl og endene ble trimmet med Klenow Poll fragment. Denne prosedyre gjenopprettet den korrekte leserakke for lac Z og etter ligering ble blå transformanter av JM103 valgt. Fordi reparasjon av BamHI setet gir et Clal sete i DNA fremstilt fra en DNA metylasemanglende (Dam-) E. coli vert, ble pUC8-41 bekreftet ved Clal linearisering. Restriksjonsenzymanalyse og nukleotid-sekvensbestemmelse ble foretatt for å bestemme at det konstruerte rekombinante plasmid kalt pUC8-41-RBSl virkelig bar en enkel kopi av det syntetiske ribosombindingssete.

3. Konstruksjon av pLP201- pl56- RBSl

Det sysntetiske ribosombindingssete i pUC8-41-RBSl ble gjenvunnet ved EcoRI-Hindlll dobbelt nedbrytning av plasmidet og ble isolert ved akrylamikgelelektroforese. EcoRI-Hindlll fragment ble subklonet inn i plasmid pLP1201 som på forhånd var brutt ned med EcoRI- og Hindlll restriksjonsendonukleaser for å danne pLP1201-RBSl. Ostroff, G. R. og Pene, J. M. Mol. Gen. Genet., 193:306-311 (1984). E. coli stammen CS412 ble transformert med plasmid pLP1201-RBSl ved bruk av konvensjonelle metoder, se Cohen et al. supra (1973). E. coli transformanter med plasmid pLP1201-RBSl var ampicillinresistente og tetracyklinsensitive.

Promoteren pl56 ble så skåret ut fra M13mp7-pl56 RF DNA ved bruk av EcoRI restriksjonsendonuklease og subklonet inn i EcoRI setet i pLP1201-RBSl som på forhånd var nedbrutt med EcoRI restriksjonsendonuklease. Det ønskede rekombinante plasmid pLP1201-p56-RBSl gir ampicillin- og tetracyklinresistens til E. coli verten CS412 transformert med plasmidet.

4. Konstruksjon av plasmid pHCW300 (pLP1201-RBSl-pl56-il-2)

phCW300 ble konstruert fra pLW21 og pLP1201-RBSl-pl56. pLW21 avledes fra pBR322 og inneholder en 570 bp EcoRI-Banll sekvens inkludert en region som koder for IL-2. pLW21 ble konstruert ved ligering av 570 bp EcoRI-Banll sekvensen, oppnådd ved nedbrytning av pLWl med EcoRI- og Banll endonukleaser, inn i pBR322 som på forhånd var nedbrutt fullstendig med EcoRI og Banll. Dette EcoRI-Banll fragment erstatter 485 bp EcoRI-Banll fragmentet i pBR322 inneholdende en del av tetracyklinresistensgenet og man oppnår pLW21 som er tetracyklinsensitivt. pLW21 ble brutt ned med Hindlll restriksjonsendonuklease fulgt av nedbrytning med Nrul restriksjonsendonuklease. To fragmenter ble dannet og et Hindlll-Nrul fragment med en lengde på ca. 400 bp ble isolert ved akrylamidgelelektroforese. Plasmid pLP1201-RBSl-pl56 ble brutt ned med Hindlll- og Nrul restriksjonsendonuklease og dannet et linearisert plasmid med regionen inneholdende tetracyklinresistensgenet fjernet. Det lineariserte plasmid ble kombinert med 400 bp Hindlll-Nrul fragmentet fra pLW21 og ble ligert ved bruk av T4 ligase for å danne et plasmid kalt pHCW300 med pl56 promoter og RBS beskrevet ovenfor og en 400 bp sekvens med en DNA sekvens som kodet for IL-2. Tetracyklinsensitive transformanter av E. coli ble oppnådd ved replikaplatering av ampicillin-resistanstransformanter og ble bedømt på nærværet av ålasmid pHCW300 ved bruk av Hindlll og Aval restriksjonsendodukleaser for å danne to fragmenter på ca. 7 kb og 0,85 kb.

5. Konstruksjon av plasmid pHCW301 (pLP201-RBSl-pl56-IL-2-retroregulator)

Plasmid pHCW701 ble nedbrutt med EcoRI restriksjonsendonuklease og endene ble gjort stumpe med Klenow Pol I fragment og dNTPs. Ved å følge nedbrytingen med Hindlll restriksjonsendonuklease ble det omtrent 0,85 kb store fragment inneholdende IL-2 genet og det positive retroregulatoriske element isolert ved agarosegelelektroforese. Plasmid pLP1201-RBSl-pl56 ble nedbrutt med Hindlll og Nrul restriksjonsendonukleaser noe som resulterte i utskjæring av regionen inneholdende tetracyklinresistensgenet. Det 0,85 kb EcoRI stumpe Hindlll fragment inneholdende IL-2-genet og det positive retroregulatoriske element ble ligert til Hindlll-Nrul nedbrutt pLP1201-RBSl-pl56 vektoren ved bruk av T4 ligase under legeringsbetingelser. Tetracyklinsensitive transformanter av E. coli ble oppnådd ved replikaplatering av ampicillinresistente transformanter og ble bedømt med henblikk på plasmidet pHCW301 ved bruk av EcoRI restriksjonsendonuklease. Tre fragmenter på ca. 7 kb, 0,88 kb og 156 bp tilsvarende de forventede størrelser for pLP1201-RBSl fragmentet, IL-2 genpositive regulatoriske elementfragment henholdsvis promoter fragmentet ble dannet.

Eksempel III

Forbedret proteineksprimering av gener inn i hvilke et positivt retroregulatorisk element er innskutt.

A. Analyseprosedyre for B. livheniformis penicillinase eksprimering

1. I E. coli.

Fem ml YT buljong (8 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, p g/l NaCl) inneholdende 50 jjg/ml ampicillin ble inokulert med indiuviduelle kolonier av E. coli K-12/CS412 som bar enten pSYC667 eller pHCW-A3 og ble dyrket overnatt ved 37'C under rysting i en New Brunswick rotasjons - inkubator. Cellene ble så pelletisert ved 5.000 omdr. pr. min. i 10 minutter i JA-20 rotoren til en Beckman Model J-21C sentrifuge. Cellepelleten ble vasket med 5 ml iskold 50 mM fosfatbuffer med pH7,0.

Den vaskede cellepellet ble resuspendert til 0,5 ml 50 mMfosfatbuffer og'sonikert ved bruk av en Branson 350 Sonifer ved maksimal utgang i 3

minutter i 0,5 sekunders børster ved 0°C. Sonikatet ble spunnet i en Eppendorf mikrofuge i 2 minutter. Den resulterende supernatant ble benyttet for analysen av enzymaktiviteten.

i Produksjonen av B. licheniformis penicillinase ble analysert ved bruk av det kromogene3-laktamasesubstratet PADAC (tilgjengelig fra Cal Biochem) i henhold til Schindler og Huber, "Use og PADAC, A Novel Chromogenic,3-lactamase Substrate, for the Detection of3-Lactamase

Producing Organisms and Assay og3-Lactamase Inhibitors/Inactivators", i i Enzyme Inhibitors, Brodbeck, U., ed., Weinheim:VerlagChemice, 1980, p.

169-176. PADAC substratet (MW 562.7) ble fremstilt ved å lage en oppløsning med 00573=! (ca. 27,4 um) i fosfatbuffer ved pH 7,0. Reduk-

sjonen i absorbahs ved 573 nm i løpet av tiden, etter tilsetning av celleekstrakten, ble målt ved bruk av et Gary 219 spektrofotometer ved

•romtemperatur. REsultåtene er gitt i tabell I.

2. I B. subtilis

B. subtilis PSLI ble transformert med enten pSYC667 eller pHCW-A3, i henhold til metoden relatert til Anagnostopolus og Spizizen supra (1961), beskrevet ovenfor, platert på rikt medium agar som beskrevet ovenfor og dyrket overnatt ved 37 °C. Fem ml 2 x LB medium inneholdende 5 pg/ml kloramfenikol ble inokulert med individuelle transformanter og dyrket ved 37 °C under rysting og en New Brunswick rotas jonsinkubator overnatt. Cellene ble så pelletisert ved 5000 omdr./min. i 10 minutter i en JA-20 rotor som ovenfor. Supernatanten ble benyttet for penicil-linaseanalysen ved den samme metode som beskrevet ovenfor for E. coli. Resultatene er vist i tabell I.

B. Analyseprosedyre for IL-2 eksprimering.

1. I E. coli

En rystekolbekultur av E. coli K12/MM294 transformert med pHCW701, pHCW702 eller pLWl ble dyrket i 10 ml tryptofan (trp) inneholdende: N medium (0,7% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5% NaCl, 0,1% NH4G1, 0,2% glukose, 0,5% kasaminosyrer, 40 pg/ml trp., og 10 pg/ml tetracyklin) ved 37 °C overnatt ,under rysting i en New Brunswick rotasjonsinkubator. Celler fra en 5 ml overnattkultur ble pelletisert ved sentrifugering ved 5000 omdr. pr. min. i 10 minutter i en JA-20 rotor. Cellepellet ble resuspendert i 5 ml N medium uten trp inneholdende 2 jjg/ml tiamin. Optisk densitet ble bestemt ved absorbans ved 600 nanometer (OD^qq) i et spektrofotometer. 25 ml subkulturer med en OD0øq på 0,05 i N medium minus trp ble satt opp og dyrket ved 37"C under rysting til en slutt OD500På ca« 0,3. Kontroller ble satt opp og dyrket under de samme tingelser bortsett fra at N mediet manglet tryptofan. Cellene ble så pelletisert og resuspendert i IL-2 sinikeringsbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 50 mM EDTA, 15% sukrose, 1% SDS) til en slutt OD60o=10. Cellene ble sonikert som beskrevet ovenfor. Supernatantene ble analysert med henblikk på nærvær av IL-2 aktivitet ved metoden som er beskrevet av Gillis, S., et al. J. Immunol., 120, 2027-2032 (1978). Resultatene er i vist i tabell II.

2. Fermenteringskulturer

E. coli K-12/MM294-1, transoformert med enten pHCW801 eller pLW45 ble fermentert i en 10 liters fermenter ved 37°C og 350-1200 omdr./min med 0-2 liter pr. minutt luft og 0-5 l/min. oksygen (oppløst oksygen ved ca. 40%). Mediet bestod av 72 mM (NH4)2S04, 21,6mM KH2P04, 21.6 mM KH2P04,1.5mMNa3sitrat, 1.5mg/l TK-6g3pcføl'gendeteis;terile tilsetninger: 3 mM 0,5% MgS04, 20 mg/l 1% tiamin-HCl, 72 mM 0,2 M FeS04, 5 g/l 50% glukose, 70 mg/l 0,5% L-tryptofan, 5 mg/l 1% tetracyklin og 100 ml/l 20% kasaminosyrer (tilsatt ved OD0go=15-20). Dette inokulum var 20 mg/l og pH-verdien ble kontrollert ved 6,8 med 5N KOH. En glukosetilmatning ble også benyttet for å holde glukosekonsentrasjonen mellom 5-10 g/l.

Kulturprøver for SDS polyakrylamidgelelektroanalyse av det totale celleprotein ble trukket av hver time fra 13,7 til 19,7 timer. Densitometri av proteinbåndene i gelene antydet en maksimal produksjon av IL-2 som 17,2% av det totale celleprotein ved 17,7 timer. Den biologiske aktivitet for IL-2 fra disse prøver ble bestemt somkj beskrevet tidligere for IL-2 eksprimering i E. coli. Resultatene er vist i tabell II.

3. I B. subtilis

Kulturer av B. subtilis 1A510, transformert som beskrevet ovenfor med pHCW301 eller pHCW300 ble dyrket til en ODo0o=l,0 ved 37°C med rysting etter enkelkoloniinokulering i 5 ml 2 x LB mediuminneholdende 5 jjg/ml kloramfenikol. Cellene ble pelletisert, resuspendert i IL-2 sonikeringsbuffer, sonikert og analysert for IL-2 aktivitet som beskrevet for E. coli. Resultatene er vist i tabell II.

Eksempel IV Utelukkelseskartlegging av det positive retroregulatoriske element .,,

Utelukkelsesstudier ble innført for å definere mere presist sekvensen i kryterminatorregionen som var ansvarlig for det positive retroregulatoriske element. Oligodeoksyribonukleotidrettet setespesifikk mutagenese ifølge metoden til Zoller, M. og Smith, M., Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into Ml 3 vectors Methods in Enzymology, 100:468-500 (1983) ble benyttet for å innføre to BgHI restriksjonsseter separat på lokaliseringene 80- henholdsvis 20 bp oppstrøms den inverterte gjentagelsessekvens i kry terminatorfragmentet kalt henholdsvis Bl og B2 i figur 1. Disse forkortede terminatorholdige fragmenter kan kuttes ut fra de respektive modifiserte M13mp9 NP3 faggenomer ved Bglll-EcoRI nedbrytning. De ble klonet inn i pSYC667 på Bcll-Nrul sete ved prosedyrer tilsvarende det som ble benyttet for konstruksjonen av pHCW-A3 og dannet plasmider pHCW-A4 og pHCW-A5. Data for analysen av B. subtilis- henholdsvis E. coli stammer som huset disse plasmider med henblikk på deres evne til å eksprimere det klonede penP gen er angitt i tabell III. Det er klart at det forkortede fragment fremdeles inneholder det positive retroregulatoriske element som er observert i det opprinnelige fragment. Fordi de to nylig dannede BgHI seter er utenfor krykodingssekvensen viser disse data at det lokus som stemmer overens med forbedringsaktiviteten er lokalisert i den ikke-kodende region av krygenet og sannsynligvis overlapper terminatoren til krygenet.

B. subtilis stamme PSL1 og E. coli stamme CS412 ble transformert med plasmider pHCW-A3, pHCW-A4 eller pHCW-A5 som beskrevet ovenfor. Penicillinaseaktiviteten, analysert som beskrevet ovenfor er vist i tabell

III.

Eksempel V

Inskyting av det positive retroregulatoriske element øker nivået for fremstilling av et nytt rekombinant IL-2 mutein ved bruk av en bærbar temperaturregulert kontrollkasett i en temperaturregulert ColEl kopi-mutantplasmidvektor.

A. Konstruksjon av plasmid pFC54. t

Plasmid pFC54 koder des-Alanyl, sering interleukin-2 (IL-2) under kontroll av bakteriofagen X Pl promoteren og genet N ribosom bindings-sete (Pl Nrb5). ColEl plasmidvektoren inneholder to mutasjoner som gir en temperatursensitiv kopinummer fenotyp på plasmidet. E. coli celler som huser dette plasmid er termisk indusert til å akkumulere 20% av det totale protein som et nytt IL-2 mutein.

Plasmid pFC54 ble nedbrutt fullstendig med SphI og behandlet med DNA polymerase I (Klenow fragment) i nærvær av 25 jjM dGTP for å eliminere en 3' fremragende enekltstrenget hale. Det stumpendede DNA ble deretter nedbrutt med Xbal.

Plasmid pHCW801 ble nedbrutt selvstendig med EcoRI, behandlet med DNA polymerase I (Klenow fragment) i nærvær av dNTPs, og deretter nedbrutt med Xbal. 655 bp DNA fragmentet omfattende den C-terminale 225 bp av ser<125>IL-2, 36 bp av 3'utranslatert IL-2 cDNA og 394 bp av fragmentet som bærer det positive retroregulatoriske element, ble renset ved gelelektroforese. pFC54 vektor DNA fragmenter og renset pHCW801 fragment ble ligert (1:3 molforhold) ved en konsentrasjon av 30 ugDNA/ml DNA ved bruk av T4 DNA ligase under betingelser som favoriserer ligering av klebrige ender, fortynnet 2,5 ganger og så ligert ved bruk av T4 DNA ligase under betingelser for stumpendet ligering for å favorisere intramolekulær sirkeldannelse. Det ligerte DNA ble brutt ned med Banll for å inaktivisere uønskede ligeringsprodukter omfattet av de små og store Xbal-SphI fragmenter av pFC54.

E. coli K12 stammen DG95(\N7N53cl857susP80) ble transformert til Amp<R>med 60 ng av deet ligerte og nedbrutte DNA. Denne stamme inneholder en lambda profag som koder en temperatur-sensitiv v cl repressor, som er aktiv ved lav temperatur, 30-32° C. Ved høyere temperatur, 36-42°C, er imidlertid repressor en inaktiv og transkripsjon fra Pj^ promoteren kan skje. Det er et ytterligere karakteristikum ved denne stamme at ved forhøyede temperaturer kan profagen ikke inkudere. Transformanter ble selektert for Ampo<a>ar og Amp<R>kolonier ble bedømt på det ønskede 5,6 kb plasmid. Kandidatplasmider ble bedømt for frigjøring av et 1182 bp EcoRI fragment (ligering av reparert EcoRI sete i fragmentet som bærer det positive retroregulatoriske element til det reparerte SphI sete i

vektor fragmentet var forventet å regenerere et EcoRI sete), retensjon av i Xbal sete i IL-2 kodesekvensen, akvisering av et enkelt BamHI sete (i terminatorfragmentet), og tapet av det ene Banll sete i pFC54. Et ønsket rekombinant plasmid ble isolert og kalt pFC54.t.

Som vist ovenfor, når E. coli K12 stammen DG95(\N7N53cl857susP80) som i huset plasmid pFC54.t temperaturinduseres under egnede betingelser, er 34% av det totale celleprotein des-Alanyl, Ser^5 il_2.

Plasmid pFC54.t er deponert under Budapestavtalen under betegnelsen ATCC 39789.

Plasmid pFC54.t er vist i fig. 6. Ut fra EcoRII restriksjonsendonuklease- sete kalt 5.61/0 og; i ■ ■retning klokken omfatter plasmid pFC54.t de komponenter som er beskrevet umiddelbart nedenfor.

Koordinat 0-0.35 kb omfatter en EcoRI-Hindlll modul som koder den temperaturregulerte promoter/operator av bakteriofag X PL promoteren og det ved siden . av; liggende gen N ribosombindingssete. BgHI erkjennelsessete ved L koordonat 35715 (Sanger, F. et al., J. Mol. Biol., 162:729-773 (1982) er omdannet til et EcoRI erkjennelsessete og Hinfl erkjennelsessete ved L koordinat 35366 er omdannet til et Hindlll erkjennelsessete for innskyting i plasmid pFC54.t.

Koordinater 0,35-0,794 kb omfatter 44 bpHindlll-StuI fragmentet av plasmid pLW46 som koder moden human des Alanyl, Ser1^ IL-2 mutein, se Wang, A,, et al., Science, 224:1433 (1984).

5' Hindlll setet ligger umiddelbart foran ATG initieringskodonen for det endrede mutein Rosenberg, S. A. et al. Science, 223:1412-1416 (1984)) og Stul erkjennelsessete (36 bp distalt til opalstoppkodonet i human IL-2) var omdannet til et BamHI erkjennelsessete i pFC54.t.

Koordinatene 0,784-1,188 kb omfatter 394 bp BamHI-EcoRI DNA fragmentet fra plasmid pHCW801 og inkluderer det positive retroregulatoriske element fra B. thuriniensis delta enotoksingenet.

Koordinatene 1,188-2,05 kb omfatter 863 bp SphI (gjenopprettet)Aval (gjenopprettet) pBR322 DNA fragmentet (pBR322 koordinatene 567-1429, respektivt).

Koordinatene 2,05-3,48 kb omfatter 1,43 kb PuvII-BamHI DNA fragmentet fra plasmid pOP6 (Gelfand, D. H., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:5869-5873, 1978; Muesing, M., et al., Cell, 24:235-242, 1981) som koder3-laktamasegenet av bakterielt transposon Tn3, se Heffron, F., et al., Cell, 18:1153-1163 (1979).

Koordinatene 3,48-3,95 kb omfatter 0,47 kb Sstl-PvuII DNA fragmentet av pOP6 (Gelfand, supra 1978). Dette DNA fragment inneholder den venstre grense av bakteriell transposon Tn3 (koordinat 1-270, Heffron, F., et al. supra 1979) og en andel av det nærliggende ColEl Haell C fragment.

Koordinatene 3,95-5,61 kb omfatter 1,66 kb PvuII-EcoRI DNA fragmentet fra plasmid pEWW27 (Wong, e. M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 79:3570-3574 (1982). Dette fragment koder kolisin El immunit ets regionen av plasmidet ColEl så vel som primer promoter regionen, RNA 1 regionen, og replikeringsopprinnelsen. Den ville ColEl DNA sekvens av pBGP120 (Polisky, B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73:3900-3904

(1976) og Gelfand, D. H., et al., supra 1978) er endret i to posisjoner (G-»A transisjon i DNA strengen tilsvarende nukleotidene 125 og 135 i primer RNA transkriptet) som gir en temperatursensitiv cop-fenotype på plasmid pFC54.t.

B. IL- 2 mutienfremstilt ved transformerte stammer

E. coli K12 stamme DG95 (\N7N53cl857susP8O), transformert med enten pFC54 eller pFC54.t, ved bruk av metoder som beskrevet ovenfor, ble dyrket i en 10 liters fermentor under de samme betingelser som beskrevet ovenfor i 18,5 timer til en ODog0på 28,7 henholdsvis 28,1. Etter målinger ved 18,5 timer ble temperaturen i kulturmediet inneholdende transformert mikroorganisme hevet til 42"C for å indusere den tempera-turfølsomme nummerplasmid og promoter. Prøver ble tatt hver halve eller hele time etter induksjon i 4 timer. Hver prøve ble pelletisert ved sentrifugering og resuspendert til en konsentrasjon på 10 mg tørrvekt pr. ml i fosfatbufferet saltoppløsning (PBS). Hver prøve ble så fortynnet 10 ganger i 1% natrium dodesylsulfat/PBS, sonikert i en Heat Systems modell W-375 sosnikator i et tidsrom tilstrekkelig til helt å bryte opp cellene og så analysert. Enheter av IL-2 mutien/ml ble bestemt som angitt ovenfor. Mg protein/ml sonikat ble bestemt ved Lowrymetoden. Enheter IL-2 mutien/mg protein ble bestemt og er angitt i tabell IV nedenfor.

Produksjonen av IL-2 som en prosentandel av det totale fremstilte protein for hver prøve ble bestemt ved SDS akrylamidgelelektroforese. Omtrent like mengder protein, bestemt ved Lowry-analysen, ble belastet på hver gel. Båndene ble flekket med Coomasie Blue stamme og avlest ved bruk av en Zeineh skanderende densitometer forbundet med en Hewlett Packård 3390A integrator. Prosentandelen IL-2 ': mutien ble bestemt ved -; integreringsprogrammet. IL-2 mutienproduksjonen som en prosentandel av det totale cellulære protein er angitt i tabell V nedenfor. Prosentvis økning i IL-2 ble funnet ved å bestemme nettoøkning i IL-2 mutienprodusert av stammen med det positive retroregulatoriske element og uttrykker økningen som en prosentandel av IL-2 mutien fremstilt av stammen uten det positive retroregulatoriske element.

E. coli stamme K12 DG95 (\N7N53cl857susP8O) transformert med pFC54.t ble dyrket under de samme betingelser som beskrevet ovenfor bortsett fra at kulturene ble temperaturindusert ved en OD530på 14,0 i stedet for 28,1 som i det foregående eksempel. Prøver ble tatt og bestemmelsen foregikk som i det foregående eksempel. IL-2 mutienproduksjonen som et prosentandel av totalt celleprotein ble bestemt til 34% . Øket produksjon av IL-2 mutien av mikroorganismen som var transformert med plasmidet som bar det positive retroregulatoriske elemen gjennomføres best når temperaturinduksjonen gjennomføres ved lav celledensitet som målt ved OD-580 (14) enn høyere (28,1).

EKSEMPEL VI

Halveringstidsforlengelsen av mRNA transkripter på grunn av det positive retroregulatoriske element.

For å bestemme hvorvidt forbedringen av eksprimeringen av den selekterte DNA sekvens legert til det positive retroregulatoriske element er resultatet av øket stabilitet og utvidet halveringstid for mRNA transkriptet kodet av den selekterteDNA sekvens, ble ødeleggelseshastigheten for penP transkriptene fremstilt av plasmid pHCW-A3 og dennes opphav plasmid pSYC667 både i E. coli og B. subtilis, målt. E. coli stamme CS412 og B. subtilis stamme 1A510, hver med plasmid pHCW-A3 eller opphavet plasmid pSSYC667, ble dyrket i L-buljong ved 37 °C under rysting. Etter at kulturen nådde en midlere logfase for veksten (A 60Q=0J), ^e * mg/ml rifmapisin tilsatt for å blokkere ytterligere initiering av transkripsjon på grunn av RNA polymerase. Syv ml prøver ble trukket av fra kulturen i et minutts intervaller og rørende inneholdende prøvene ble hurtig avkjølt i isvann. Cellene ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 500 pl kaliumacetatbuffer med pH 5,5 inneholdende 1 mM EDTA og 10% vekt/volum SDS. Totalt cellulært RNA fra E. coli ble ekstrahert og renset som beskrevet iGabain et al.,Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 80:653-657 (1983).

RNA preparater fra B. subtilis ble ekstrahert ved følgende prosedyre: frosne cellepellets på 1 g ble suspendert i 4 ml 0,05 M kaliumacetat med pH 5,0, inneholdende 0,05 mg/ml bentonitt pr. ml, og 2 ml nydestillert fenol (mettet med den samme kaliumacetatbuffer) ble tilsatt. Suspen- sjonen ble sonikert i tre minutter ved hjelp av en Branson Sonifikator utstyr med en mikrospiss, ekstrahert ved 600 °C i 10 minutter og felt ut overnatt med etanol. Det utfelte materialet ble oppløst ved sentrifugering, vasket ved -20"C med etanol, oppløst i 4 ml 0,104 M Tris, pH 7,0, 0,01 M MgCl2- DNAse (30 ug/ml, Worthington, RNAse-fri) ble tilsatt. Preparatet ble dialysert i fire timer ved 37 °C mot 400 volumer 0,04 M Tris, pH 7,0, 0,01 M MgC^. RNA ble så ekstrahert to ganger med fenol ved romtemperatur i fem minutter, felt ut med etanol overnatt, vasket med etanol og oppløst i vann.

De rensede mRNAer ble immobilisert på 82 mm nitrocellulosefiltre (kvalitet BA 85, Schleicher and Schuell, Inc.) Prehybridisering av filtrene ble gjennomført ved fremgangsmåten ifølge Woo et al. som beskrevet i Methods in Enzymology, 68:389 (1979).

Behandlede filtre ble så hybridisert med penP-spesifikke prober (20 ug/filter) i lOml hybridiseringsbuffer (5 x Denhards oppløsning, 50 mM natriumfosfat, pH 7,0, 100 jjg/ml skjærbelastet enkelstrenget E. coli DNA, 1% SDS) ved 68°C overnatt.

Probene som ble benyttet ved hybridiseringen ble laget ved helt å bryte ned plasmid pSYC795 med Clal, og å reparere endene ved dNTPs og DNA polymerase storfragment for å oppnå et linearisert plasmid. Plasmid pSYC795 er et derivat av plasmid pSYC423 som er beskrevet i Hyashi et al., J. Biol. Chemistry, 259:10448-10454 (1984), som inneholder en G til C mutasjon på nukleotid 80 i kodingsregionen for penP-genet. Det lineariserte plasmid ble ytterligere brutt ned med EcoRI. Plasmidresten ble kjørt på en 5% polyakrylamidgel og et 727 bp EcoRI-Clal fragment inneholdende 5' delen av penP-genet ble gjenvunnet. Dette fragment ble subklonet inn i Smal-EcoRI sete av M13mpll. Enkeltstrengede DNA fra disse rekombinante fager ble isolert i henhold til Messing, Methods in Enzymology, Vol. 101:20-78 (1983), og det sirkulære DNA ble brutt ned med DNAse I (0,05 ug/ug DNA) i 20 minutter ved 37 °C. De enkeltstrengede DNA fragmenter ble fenoleterekstrahert, etanolutfelt, resuspendert i 50 mM trisbuffer pH 8, defosforylert med bakteriel alkalisk fosfatase og merket med [-y"^2P]-ATP og polynukleotidkinase til en spesifikk rtadioaktivitet på 3 x 10° cpm/jjg DNA. Etter hybridisering ble filtrene vasket sekvensielt med 2 x SSC og 1 gang SSC inneholdende 1,0% SDS ved 68"C i 15 minutter hver gang, tørket under en varmelampe og tellet i et flytende sintilasjonsfluid. For å sikre at et overskudd av DNA prober var tilstede i hybridiseringsoppløsningen ble flere filtere preparert inneholdende forskjellige mengder immobiliserte mRNA prøver. Resultatene av disse hybridiseringsforsøk er oppsummert i figurene 7A og 7B. Halveringstiden for penP mRNA fremstilt fra plasmid pSYC667 i enten E. coli eller B. subtilis ble bedømt til ca. to minutter, den fra pHCW-A3 var ca. 10 minutter. Analyser viste også at cellene med plasmid pHCW-A3 hadde et høyere stabilt tilstandsnivå for penP mRNA enn cellene som huset plasmidet pSYS667. Dette resultat er forventet hvis det positive restroregulatoriske element stabiliserer det kotranskriberte gen. Fordi økningen i nivåene av mRNA passer med størrelsesorden for økningen av penicillinaseenzym i begge disse bakterielle verter som vist i eksempel III ovenfor, øker det positive retroregulatoriske element geneeksprimeringen på grunn av sin innflytelse på mRNA stabiliteten.

Deponerte stammer

Deponering av stammer angitt i den følgende tabell VI er lagret i Master Culture Collection, foreliggende søkere, i Emeryville, California, USA, og er gitt et Cetus-nummer i tabellen. De oppsummerte stammer er også deponert av Citus Corporation i ATCC, Rockville, Maryland, USA, under de data som er antydet i tabellen og er gitt de ATCCnumre som er oppført der. ATCC deponeringen skjedde under Budapestavtalen og stammene vil være tilgjengelige for det offentlige i henhold til Budapest-avtalen.

Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen slik den er beskrevet og eksemplifisert vil være klare for fagmannen. Det er ment at slike modifikasjoner ligger innenfor oppfinnelsens område slik den er definert i de ledsagende krav.

Claims

1. Fremgangsmåte for å forbedre eksprimeringen av et valgt geneprodukt,karakterisert vedat den omfatter a) å tilveiebringe et positivt retroregulatorisk element, b) å tilveiebringe en DNA sekvens som er eksprimerbar for et valgt geneprodukt, c) å ligere det positive retroregulatoriske element til nevnte DNA sekvens i et forhold til denne hvorved eksprimeringen av det selekterte geneprodukt forbedres, og d) å eksprimere det selekterte gerneprodukt i en celle.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den selekterte DNA sekvens er et ikke-heterologt DNA

3- Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den selekterte DNA sekvens er et heterologt DNA.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat det heterologiske DNA koder for et prokaryotisk geneprodukt.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat det prokariotiske geneprodukt er penicillinase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat det heterologiske DNA koder for et eurkaryotisk geneprodukt.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat-det heterologe DNA koder for mammalt geneprodukt IL-2.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element er ligert nedstrøms DNA sekvensen som er eksprimerbar for et valgt geneprodukt.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat et translasjonsterminasjonssignal er lokalisert mellom nevnte positive retroregulatoriske element og nevnte DNA sekvens som koder for det selekterte geneprodukt.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element omfatter en andel av den 3' flankerende sekvens av B. thuringiensis krystallproteinet der den flankerende sekvens inkluderer en invertert gjentagelsessekvens.

U- Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element omfatter en andel av DNA sekvensenAGATATAAGTAATTTGTTGTAATGA AAAACGGACATCACCTCCATTGAAAC GGAGTGATGTCCGTTTTACTATGTTATTTTCTAGTAATACATATG-TATAGAGA.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat den inverterte gjentagelsessekvens har sekvensen 5'- AAAACGGACATCACCTCC ATTGAAAC GGAGTGATGTCCGT 111-3'.

13. Positivt retroregulatorisk element,karakterisert vedved at det når det er ligert nedstrøms DNA sekvensen som er eksprimerbar for et selektert geneprodukt forbedrer eksprimeringen av det selekterte geneprodukt.

14. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 13, karakteri-ser ved a t en sekvens når den er ligert i 3' enden av en DNA sekvens som er eksprimerbar for et selektert geneprodukt, forbedrer eksprimeringen av det selekterte geneprodukt.

15. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 13,karakterisert vedat den omfatter en del av den 3' flankerende sekvens av B. thuringiensis krystallproteingenet der den flankerende sekvens inkluderer en invertert repitisjonssekvens.

16. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 13, kara AGATCTAAG-TAATTTGTTGTAATGA AAAACGGACATCACCTCCATTGAAAC GGATGATGTC-GTTTT ACTATGTTATTTTCTAGTAATACATATGTATAGAGA.

17. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 15,karakterisert vedat nevnte inverterte gjentagelsessekvens omfatter sekvensen5'- AAAACGGACATCACCTCC ATTGAAA CGGAGTGATGTCCGTT-TT-3'.

18. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 15,karakterisert vedat RNA transkriptet av den inverterte gjentagelsessekvens kan danne en stamme/sløyfestruktur.

19. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 13,karakterisert vedat det tilsvarer et RNA transkript, en del av nevnte RNA transkript som danner en stamme- sløyfestruktur, idet stamme-sløyfestrukturen har en aG"på ca. -30,4 kkal/mol.

20. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 9, karakter i- sert ved at stamme- sløyf estrukturen omfatter 40 til 45% guanosinoog cytosin.

21. Positivt retroregulatorisk element ifølge krav 19,karakterisert vedat stamme- sløyfe omfatter ca. 43% guanosin og cytosin.

22. Plasmid,karakterisert vedat det omfatter en DNA sekvens eksprimerbar for et selektert geneprodukt og et positivt retroregulatorisk element ligert til DNA sekvensen i et forhold til denne hvorved eksprimering av det selekterte geneprodukt forbedres.

23. Plasmid ifølge krav 22,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element er ligert nedstrøms DNA sekvensen som er eksprimerbar for et selektert geneprodukt.

24. Plasmid ifølge krav 22,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element er ligert nedstrøms DNA sekvensen som er eksprimerbar for det selekterte geneprodukt og hvori et transla-sjonsterminatorsignal er lokalisert mellom det positive retroregulatoriske element og DNA sekvensen som er eksprimerbar for nevnte selekterte geneprodukt.

25. Plasmid ifølge krav 23,karakterisert vedat det positive retroregulatoriske element omfatter en andel av den 3'flankerende sekvens av B. thuringiensis krystallproteingenet hvori den flankerende sekvens inkluderer en invertert gjentagelsessekvens.

26. Plasmid ifølge krav 25,karakterisert vedat den inverterte gjentagelsessekvens har sekvensen 5'- AAAACGGACATCACCTCC ATTGAAAC GGAGTGATGTCCGT <III-3'.

27. Celle, transformert av et plasmid,karakterisert ved at plasmidet omfatter en DNA sekvens eksprimerbar for et selektert geneprodukt og et positivt retroregulatorisk element legert til DNA sekvensen i et forhold til denne hvorved eksprimering av det selekterte geneprodukt ved cellen forbedres.

28. Celle ifølge krav 27,karakterisert vedat den er en eukaryotisk celle.

29. Celle ifølge krav 27,karakterisert vedat den er en prokaryotisk celle.

30. Celle ifølge krav 29,karakterisert vedat den er E, coli.

31. Celle ifølge krav 29,karakterisert vedat den er B. subtilis.

32. Fremgangsmåte for å utvide halveringstiden for en RNA sekvens omfattende: a) å tilveiebringe en selektert DNA sekvens med et positivt retroregulatorisk element ligert i 3' enden; b) å tilveiebringe et middel for å transkribere den selekterte DNA sekvens inn i RNA som den koder; og c) å transkribere den selekterte del DNA sekvens med det positive retroregulatoriske element.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32,karakterisert vedat midlet for transkribering av den selekterte DNA sekvens er en vertscelle.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,karakterisert vedat den positive retroregulatoriske sekvens er heterolog med vertscellen.

35. RNA sekvens med en utvidet halveringstid oppnådd ved et kotranskribert positivt retroregulatorisk element.