NO327325B1 - Ekspresjonsvektor, vertcelle samt fremgangsmate for fremstilling av et peptidprodukt. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et peptidprodukt ved bruk av en vertcelle som er transformert eller transfektert med en nærmere definert ekspresjonsvektor. Nevnte peptidprodukt er vist å bli utskilt i dyrkningsmediet med høyt utbytte

Beskrivelse av teknikkens stand

Forskjellige teknikker foreligger for rekombinant fremstilling av peptidprodukter, d.v.s. enhever forbindelse hvis molekylstruktur omfatter flere aminosyrer sammenbundet med peptidbindinger. Et problem når det fremmede peptidprodukt er lite er at det ofte lett kan degraderes av endogene proteaser i cytoplasma eller periplasma hos vertscellen som benyttes for ekspresjon av peptidet. Andre problemer omfatter å oppnå tilstrekkelig utbytte og å gjenvinne peptidet i relativt ren tilstand uten å endre tertiærstrukturen (noe som på uønsket måte kan redusere dets evne til å utføre sin basalfunksjon). For å overvinne problemet vedrørende liten størrelse uttrykkes peptidproduktet av interesse ifølge teknikkens stand ofte som et fusjonsprotein med et annet (vanligvis større) peptid, og dette fusjonsprotein akkumuleres i cytoplasma. Det andre peptid kan fylle flere funksjoner, for eksempel å beskytte peptidet av interesse mot proteaser som foreligger i vertens cytoplasma. Et slik ekspresjonssystem er beskrevet i Ray et al., Bio/ Technology, bind 11, sidene 64-70, (1993).

Isolering av peptidproduktet ved benyttelse av en slik teknologi krever imidlertid kløyving av fusjonsproteinet og rensing fra alle de peptider som normalt foreligger i vertens cytoplasma. Dette kan nødvendiggjøre en rekke andre trinn som kan redusere prosessens totaleffektivitet. Dersom for eksempel et fusjonsprotein ifølge teknikkens stand akkumuleres i cytoplasma må cellene vanligvis høstes og lyseres, og cellerester fjernes i et klarningstrinn. Alt dette unngås i samsvar med foreliggende oppfinnelse, hvor peptidproduktet av interesse uttrykkes direkte i og gjenvinnes fra dyrkningsmediet.

Ifølge teknikkens stand er det ofte nødvendig å benytte et affinitetskromatografitrinn for å rense fusjonsproteinet, som fortsatt må kløyves for å skille peptidet av interesse fra fusjonspartneren. I den ovenfor nevnte Bio/ Technology- artikkél ble for eksempel kalsitoninforløper fra laks klyvet fra fusjonspartneren ved benyttelse av cyanogenbromid. Dette kløyvingstrinn nødvendiggjorde ytterligere trinn for å beskytte cysteinsulfhydryl-gruppene i posisjonene 1 og 7 i kalsitoninforløperen fra laks. Sulfonering ble benyttet for å tilveiebringe beskyttelsesgrupper for cysteinene. Dette endret i sin tur tertiærstrukturen til kalsitoninforløperen fra laks, noe som nøvendiggjorde påfølgende renaturering av forløperen (og naturligvis fjerning av beskyttelsesgruppene).

Peptidproduktet som fremstilles ifølge oppfinnelsen uttrykkes kun med en signalsekvens og uttrykkes ikke sammen med en stor fusjonspartner. Foreliggende oppfinnelse fører til "direkte ekspresjon". Produktet uttrykkes i utgangspunktet med et signalområde koblet til sin N-terminale ende. Dette signalområdet avkløyves imidlertid posttranslasjonelt under utskillelse av peptidproduktet til cellens periplasma. Deretter diffunderer eller utskilles på annet vis peptidproduktet fra periplasma til dyrkningsmediet utenfor cellen, hvor det kan gjenvinnes i korrekt tertiær form. Det er ikke koblet til noen fusjonspartner hvis fjerning først ville kreve cellelysis, denaturering eller modifisering, selv om sulfonering benyttes i noen utførelser av oppfinnelsen for å beskytte cysteinsulfhydrylgrupper under rensing av peptidproduktet.

Et annet problem ved akkumulering av peptidproduktet i cellen ifølge teknikkens stand er at det akkumulerende produkt kan være toksisk for cellen, noe som kan begrense mengden av fusjonsprotein som kan syntetiseres. Et annet problem med denne tilnærming er at den større fusjonspartneren vanligvis utgjør hovedmengden av utbyttet. For eksempel kan 90% av utbyttet være den større fusjonspartner, noe som fører til at kun 10% av utbyttet omfatter peptidet av interesse. Nok et annet problem med denne tilnærming er at fusjonsproteinet kan danne uløselige inklusjonslegemer i cellen, og solubilisering av inklusjonslegemene fulgt av kløyving gir ikke nødvendigvis biologisk aktive peptider.

Ifølge teknikkens stand forsøkes det å uttrykke peptidet sammen med et signalpeptid koplet til N-enden for å styre det ønskede peptidprodukt til utskillelse i periplasmaet (se EP 177.343, Genentech Inc.). Flere signalpeptider er identifisert (se Watson, M. Nucleic Acids Research, bind 12, nr. 13, side: 5145-5164). For eksempel benyttet Hsiung et al.

(Biotechnology, bind 4, november 1986, side: 991-995) signalpeptidet fra det ytre membranprotein A (OmpA) fra E. coli for å styre visse peptider til periplasmaet. Vanligvis har peptider som utskilles til periplasma en tendens til å forbli der, med minimal utskillelse til mediet. Ytterligere et uønsket trinn som omfatter ødeleggelse eller permiabilisering av den ytre membran kan være nødvendig for å frigi tilstrekkelige mengder av de periplasmiske bestanddeler. Noen forsøk ifølge teknikkens stand på å utskille peptider fra periplasma til dyrkningsmediet utenfor cellen har omfattet å

ødelegge integriteten til den ytre membranbarriere ved at verten samtidig uttrykker det ønskede peptidprodukt som omfatter et signalpeptid og et lyrisk peptidprotein som gjør at den ytre membran blir permeabel eller at den lekker (U.S. patentskrift nr. 4.595.658). Imidlertid må man være forsiktig når det gjelder mengden lyrisk peptidprotein som produseres, slik at man ikke ødelegger cellens integritet og dreper cellene. Rensing av peptidet av interesse kan også vanskeliggjøres ved denne teknikk.

Bortsett fra teknikkene beskrevet ovenfor for destabilisering av den ytre membran finnes det mindre stringente måter å permeabilisere den ytre membran hos gram-negative bakterier på. Disse metoder gir ikke nødvendigvis ødeleggelse av den ytre membran som kan føre til lavere celleviabilitet. Disse fremgangsmåter omfatter, men er ikke begrenset til, anvendelse av kationiske midler (Martti Vaara., Microbiological Reviews, bind. 56, s. 395-411 (1992)) og glysin (Kaderbhai et al., Biotech. Appl. Biochem, bind 25, s. 53-1 (1997)) kationiske midler permeabiliserer den ytre membran ved at de interagerer med og skader lipopolysakkaridryggraden i den ytre membran. Omfanget av skaden og disrupsjonen kan være ikke-letal eller letal, avhengig av den benyttede konsentrasjon. Glysin kan erstatte alaninrester i peptiddelen av peptidoglykan. Peptidoglykan er en av de strukturelle bestanddeler av den ytre cellevegg hos gram-negative bakterier. Dyrking av E. coli i høye glysinkonsentrasjoner øker hyppigheten av erstatning av alanin med glysin, noe som fører til en defekt cellevegg og således øker permeabiliteten.

En annen fremgangsmåte ifølge teknikkens stand for å oppnå ekskresjon av et ønsket peptidprodukt omfatter fusjon av produktet til et bærerprotein som normalt utskilles i mediet (hemolysin) eller et helt protein som uttrykkes på ytre membran (f.eks. ompF-protein). For eksempel kan humant P-endorfin utskilles som et fusjonsprotein av E. Coli-celler når det er bundet til et fragment av ompF-proteinet (EMBO J., bind 4, nr. 13 A, s. 3589-3592,1987). Isolering av det ønskede peptidprodukt er imidlertid vanskelig siden det må skilles fra bærerpeptidet, og dette omfatter noen (om enn ikke alle) av ulempene forbundet med ekspresjon av fusjonspeptider i cytoplasma.

Nok en annen tilnærming ifølge teknikkens stand omfatter genetisk endring av en vertscelle slik at det dannes nye stammer som har en permeabel ytre membran som er relativt ute av stand til å tilbakeholde periplasmatiske peptider eller proteiner. Disse nye stammer kan imidlertid være vanskelige å opprettholde, og de kan kreve stringente betingelser som på skadelig måte påvirker utbyttet av det ønskede peptidprodukt. Raymond Wong et al. (U.S. patentskrift nr. 5.223.407) utformet nok en annen tilnærming for utskillelse av peptidprodukter ved å fremstille en rekombinanent DNA-konstruksjon som omfattet DNA som koder for det heterologe protein, koblet med opprettholdelse av leserammen til DNA som koder for et ompA-signalpeptid og et kontrollområde som omfatter en tac-promoter. Med dette system rapporteres utbytter som er signifikant lavere enn hva som oppnås ved benyttelse av foreliggende oppfinnelse.

Videre er direkte ekspresjon av peptider inn i periplasma og kulturmedium kjent fra Abstracts of Papers - American chemical Society, vol.213, nummer 1-3, 1997. Det er i sistnevnte publikasjon dog ikke beskrevet anvendelse av vertceller som er transformert eller transfektert med en vektor som omfatter flere promotere for å fremme ekspresjon.

Agri. Biol. Vol 52(11), 2823-2830,1998 og US5332664 omtaler cytoplasmisk ekspresjon av peptider. Sistnevnte publikasjoner nevner dog ikke anvendelse av vertceller som er transformert eller transfektert med en vektor som omfatter flere promotere for å fremme ekspresjon.

Selv om teknikkens stand kan tillate eksport av proteiner fra periplasma til medium kan dette føre til "syke" celler som ikke lett kan dyrkes til den ønskede høye tetthet, noe som påvirker produksjonsutbyttet på uheldig måte.

Foreliggende oppfinnelse søker å fremstille peptid i høyt utbytte med en effektiv ekspresjonsvektor og å tilveiebringe dyrkningsteknikker som gir høyt utbytte samt andre forbedringer som tillater gjenvinning i høyt utbytte av det utskilte peptid av interesse fra dyrkningsmediet, uten omfattende forstyrrelse av cellemembranens integritet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å la et peptidprodukt akkumulere i godt utbytte i mediet i hvilket peptidproduserende vertsceller vokser. Dette er en fordel siden mediet er relativt fritt for mange cellulære peptidkontaminanter.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en forbedret fermenteringsprosess for å øke utbyttet av et peptidprodukt som uttrykkes av genetisk modifiserte vertsceller.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å tilveiebringe genetisk modifiserte vertsceller som er spesielt anvendbare for ekspresjon av de nye ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen.

Det er et annet formål med oppfinnelsen å tilveiebringe en vertscelle som er spesielt tilpasset produksjon av kalsitoninforløper fra laks, uavhengig av ekspresjonsvektoren som benyttes for ekspresjon av laksekalsitonin.

Det ver nok et formål med oppfinnelsen å tilveiebringe forbedrede fremgangsmåter for fremstilling: av amiderte peptider ved benyttelse av forløperpeptider med C-terminale glysiner, hvor forløperene amideres etter direkte ekspresjon i dyrkningsmediet i samsvar med oppfinnelsen.

Et første aspekt ved oppfinnelsen vedrører en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter: (a) et kodende område med nukleinsyrer som koder for et peptidprodukt, koblet med

opprettholdt leseramme 3' for nukleinsyrer som koder for et signalpeptid, og

(b) et kontrollområde operativt koblet til det kodende området, hvor kontrollområdet omfatter flere promotere og minst ett ribosombindingssete, hvori minst en av promoterene er tac.

Et andre aspekt ved oppfinnelsen vedrører en vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med vektoren ifølge det første aspekt av oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelsesform ifølge det andre aspekt ved oppfinnelsen

Et tredje aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et peptidprodukt, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge det andre aspekt ved oppfinnelsen i et dyrkningsmedium og deretter gjenvinning av peptidproduktet fra mediet i hvilket vertscellen er dyrket.

Kort beskrivelse av figurene

Figurene IA og IB viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pSCT-016B (IA) som benyttes for konstruksjon av vektoren pSCT-018D (IB), som igjen benyttes ved konstruksjon av vektoren pSCT-015.

Firugr2 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjons LAC-OMPASCTGLY-kassetten som benyttes ved konstruksjonen av pSCT-025 ble fremstilt ved polymerasekjedereaksjon (PCR)-amplifisering av en delavpSCT-019.

Figur 3 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pSCT-025

som ble benyttet for konstruksjon av vektorene pSCT-029A, pSCT-025A, pSCT-037ogpSCT-038.

Figur 4 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pSCT-029A

som ble benyttet for konstruksjon av vektorene pSCT-038 og pSCT-034.1 tillegg ble pSCT-029A benyttet for transformering av E. coli BLR og fremstilling av den nye, digeniske UGL 165-klon.

Figur 5 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pSEC-E som

ble benyttet for konstruksjon av vektoren pSEC-EY.

Figur 6 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pPRLA4

som ble benyttet for konstruksjon av vektoren pSEC-EY.

Figur 7 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektoren pSEC-EY

som ble benyttet for konstruksjon av vektorene pSCT-037 og pSCT-038.

Figur 8 viser en skjematisk fremstilling av konstruksjonen av vektorene pSCT-037

og pSCT-038. pSCT-037 ble benyttet for transformering av E. coli BLR og fremstilling av den monogeniske UGL 702-kIon. pSCT-038 ble benyttet for transformasjon av E. coli BLR og fremstilling av den digeniske UGL 703 klon. pSCT-038 inneholder to kopier av OmpA-sCTgly-operonet (som koder for OmpA-signalet sammen med kalsitoninforløper fra laks), noe som gjør det til en ny digenisk ekspresjonsvektor. Den inneholder også kopier av gener som koder for to sec-maskineirproteiner som fremmer translokering over den indre membran inn i periplasmarommet. Det påfølgende er en liste over forkortelser som benyttes for beskrivelse av denne vektor i figur 8: TAC - Hybrid promoter med tryptofan E- og lac-operatorsekvenser,

LAC P/O - Område som inneholder lac-promoter og lac-operator fra P-galaktosidasegen,

LAC-IQ - Gen som koder for lac-repressoren som bindes til operatorområdet i lac-promoteren og tac-promoteren. IPTG konkurrerer med lac-repressoren og inhiberer binding av lac-repressor til operatorområdet i bådet tac-promoteren og lac-promoteren, slik at disse promotere induseres.

TRP P/O - Promoter/operatorområde i tryptofan E-genet,

OMPA-SCTGLY - Genfusjon som omfatter en sekretorisk signalsekvens fra genet for det ytre membranprotein A og kodende sekvens for glysinforlenget laksekalsitonin (kalsitoninforløperen fra laks),

SEC-E (også betegnet "PrlG") - Gen som koder for sekresjonsfaktor E fra E. coli. Denne går sammen med prlA (også betegnet secY) eller prlA-4 og danner translokasjonsdomenet i den indre membran for sec-reaksjonsveien, ved hvilken signalsekvensholdige proteiner translokeres fra cytoplasma til periplasma.,

PRLA-4 - Mutant allel av prlA-genet,

RRNB T1-T2 - Tandem transkripsjonsterminatorer 1 og 2 fra gen for ribosomalt protein fra E. coli, og

KAN-R - Kanamysinresistensgen.

Figur 9 viser en skjematisk fremstilling av vektoren pSCT-034 som ble benyttet for transformasjon av E. coli BLR og fremstilling av den trigeniske UGL 168-klon. Figur 10 viser cellevekst og sCTgly-produksjon av UGL 165-klonen (plasmid pSCT-029A i E. coli BLR) over tid etter en typisk 1 liter fermentering i nærvær av induser. Celleveksten ble målt ved lysabsorbans ved en bølgelengde på 600 nm. sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Tid null angir tidspunktet på hvilket induser først tilsettes til dyrkningsmediet hvor vertscellene ifølge oppfinnelsen dyrkes. Figur 10 viser at det meste av sCTgly-produksjonen ved UGL 165 skjer mellom 20 og 25.5 timer etter at induser først tilsettes til dyrkningsmediet hvor vertscellene ifølge oppfinnelsen dyrkes. Figur 11 viser cellevekst og sCTgly-produksjon ved UGL 703-klonen (plasmid pSCT 038 i E. coli BLR) over tid etter en typisk 1 liter fermentering i nærvær av induser. Celleveksten ble målt ved lysabsorbans ved en bølgelengde på 600 nm. sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Tid null angir tidspunktet på hvilket induser først tilsettes til dyrkningsmediet hvor vertsceller ifølge oppfinnelsen dyrkes. Figur 11 viser at det meste av sCTgly-produksjonen ved Ugl 703 skjer mellom 20 og 26 timer etter dyrkning i nærvær av induser. Figur 12 viser en sammenligning mellom cellevekst av UGL 172-klonen (plasmid pSCT 025 i E. coli BLR), UGL 165-klonen og UGL 168-klonen (plasmid pSCT 034 i E. coli BLR) i en typisk 1 liter fermentering over tid etter inkubering i nærvær av induser, målt ved absorbans ved 1 bølgelengde på 600 nm. Figur 12 viser ingen signifikante forskjeller i celleveksthastighet mellom UGL 165 og UGL 172, mens UGL 168 viser en svak reduksjon i celleveksthastigheten i dette spesielle eksperiment. Figur 13 viser en sammenligning mellom sCTgly-produksjonen ved UGL 172-klonen, UGL 165-klonen og UGL 168-klonen over tid i en typisk 1 liter fermentering etter inkubering i nærvær av induser, angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Figur 13 viser at den digeniske UGL 165-klonen er best egnet for produksjon av sCTgly, mens den trigeniske klon er nest best og bedre enn den monogenisk UGL 173-klon. Figurene 14A og 14B viser en sammenligning mellom sCTgly-produksjonen (14A) og cellevekst (14B) over tid etter en typisk 1 liter fermentering i nærvær av induser av UGL 165-klonen, og enten i nærvær eller fravær av oksygentilsetning til luftforsyningen. Celleveksten ble målt som g våtvekt , celler pr liter inkubasjonsmedium. sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Figurene 14A og 14B viser at tilsatt oksygen i fermenteringsmediet ikke er kritisk for cellevekst av UGL 165, men svært viktig for å øke produksjonen av sCTgly. Figurene 15A og 15B viser en sammenligning mellom cellevekst (15A) og sCTgly-produksjonen (15B) over tid etter en typisk 1 liter fermentering i nærvær av induser ved E. cø//-stammene WA837 og BLR hvor hver stamme uttrykker vektoren pSCT-029A /UGL164 henholdsvis UGL165). Celleveksten ble målt ved lysabsorbans ved en bølgelengde på 600 nm. sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Figurene 15A og 15B viser at E. coli stamme BLR er mer egnet for sCTgly-produksjon enn E. coli stammen WA837. Figur 16 viser en sammenligning mellom sCTgly-produksjonen etter en typisk 1 liter fermentering i nærvær av induser ved E. co/i-stammene WA837, BLR, B121 og B834, hvor hver stamme uttrykker vektoren pSCT-1029A (UGL164, UGL165, UGL167 henholdsvis UGL166). sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Figur 16 viser at E. Coli stamme BLR er mer egnet for sCTgly-produksjon enn hver av E. coli-stammene WA837, BL21 og B834. Figur 17 viser en sammenligning mellom den beste sCTgly-produksjonen observert i forskjellige eksperimenter etter 1 liters fermenteringer i nærvær av induser ved klonene UGL 165 (pSCT-029A i BLR), UGL 168 (pSCT-034 i BLR), UGL 172 (pSCT-025 i BLRT), UGL 702 (pSCT-037 i BLR) og UGL 703 (pSCT-038 i BLR). sCTgly-produksjonen ble angitt som mg sCTgly utskilt pr liter inkubasjonsmedium. Figur 17 viser at de digeniske klonene UGL 703 og UGL 165 er mer egnet for sCTgly-produksjon enn de monogeniske klonene UGL 172 og UGL 702 og den trigeniske klon UGL 168. Figur 17 viser også at den digeniske UGL 703-klon som uttrykker sekresjonsfaktorer er mer egnet for sCTgly-produksjon enn den digeniske UGL 165-klon som ikke uttrykker sekresjonsfaktorer.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse tillater peptidproduktutbytter høyere enn 100 mg pr liter medium. Dette oppnås med nye ekspresjonsvektorer, nye verter (transformert, transfektert eller benyttet i samsvar med foreliggende oppfinnelse), nye fermenteringsprosesser eller en kombinasjon av to eller flere av disse.

Oversikt over en foretrukket ekspresjonsvektor

I en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ekspresjonsvektor som omfatter et kodende område og et kontrollområde. Det kodende området omfatter nukleinsyrer for et peptidprodukt av interesse, koblet med opprettholdt leseramme nedstrøms for nukleinsyrer som koder for et signalpeptid. Kontrollområdet er operativt koblet til det kodende området og omfatter flere promotere, hvor nevnte flere promotere fortrinnsvis er i tandem, og minst et ribosombindingssete, hvori minst en av promoterene er tac.

Vektoren omfatter fortrinnsvis flere transkripsjonskassetter plassert i tandem, hvor hver kassett har kontrollområdet og det kodende området ifølge foreliggende oppfinnelse. En slik digenisk vektor eller multigenisk vektor antas å gi bedre ekspresjon enn en disistronisk eller multisistronisk ekspresjonsvektor. Dette er en overraskende forbedring fremfor disistronisk eller multisistronisk ekspresjon som antas ikke å ligge innenfor teknikkens stand.

Vektoren kan om ønskelig ytterligere omfatte nukleinsyrer som koder for et repressorpeptid som undertrykker operatorer forbundet med en eller flere av promoterene i kontrollområdet, et transkripsjonstermineringsområde, et seleksjonsmarkørområde og/eller et område som koder for minst ett sekresjonsfremmende peptid. Alternativt kan i noen utførelser nukleinsyrer som koder for et repressorpeptid og et sekresjonsfremmende peptid foreligge på en separat vektor som uttrykkes i samme vertscelle som vektoren som uttrykker peptidproduktet.

Spesifikke eksempler på konstruerte ekspresjonsvektorer og fremgangsmåter for konstruksjon av slike ekspresjonsvektorer beskrives heri nedenfor. Mange kommersielt tilgjengelige vektorer kan benyttes som utgangsvektorer for de foretrukne vektorer ifølge oppfinnelsen. Noen av de foretrukne områder i vektorene ifølge oppfinnelsen kan allerede foreligge i utgangsvektoren, slik at antall modifikasjoner som er nødvendig for erholdelse av vektoren ifølge oppfinnelsen er relativt begrenset. Foretrukne utgangsvektorer omfatter, men er ikke begrenset til, pSP72 og pKK233-2.

Det antas at de nye vektorer ifølge oppfinnelsen gir fordeler som er iboende i vektorene, og at disse uventede fordeler vil foreligge selv om vektorene benyttes i vertsceller som er forskjellige fra de spesielle verter som angis som spesielt anvendbare heri, og uavhengig av hvorvidt den forbedrede fermenteringsprosess som beskrives heri benyttes.

Likeså identifiseres i visse utførelser gitte vertsceller som spesielt anvendbare for ekspresjon av peptider, for eksempel kalsitoninforløper fra laks og kalsitoningenbeslektet peptidforløper. Fordelene som oppnås ved spesifikt å benytte de spesielle vertsceller som identifiseres heri antas å foreligge uavhengig av hvorvidt ekspresjonsvektoren er en av de nye vektorer som beskrives heri, eller hvorvidt den nye fermenteringsprosess som beskrives heri benyttes. Med andre ord antas det at disse vertsceller vil gi signifikante uventede fordeler selv ved benyttelse av fermentering og vektorer ifølge teknikkens stand.

Den nye fermenteringsprosess antas å gi forhøyet utbytte grunnet iboende fordeler som gis av fermenteringsprosessen. Det antas at disse fordeler vil foreligge uavhengig av hvorvidt de foretrukne vertsceller og/eller nye vektorer som beskrives heri benyttes.

Trass i det som er angitt ovenfor benytter en foretrukket utførelse av oppfinnelsen samtidig de forbedrede ekspresjonsvektorer ifølge oppfinnelsen transformert inn i de spesielt angitte vertsceller ifølge oppfinnelsen og uttrykt ved benyttelse av den foretrukne fermenteringsoppfinnelse som beskrives heri.

Kontrollområdet

Kontrollområdet er operativt koblet til det kodende området og omfatter flere

promoterer og minst ett ribosombindingssete, hvori minst en av promoterene er lac. Det har overraskende blitt funnet at den ovenfor beskrevne kombinasjon av promoterer i ett enkelt kontrollområde gir signifikant høyere utbytte av peptidproduktet som produseres av det kodende området (som beskrevet i mer detalj nedenfor). Det var å forvente at to slike promoterer stort sett ville tilveiebringe overlappende funksjoner og ikke gi noen additiv eller synergistisk effekt. Eksperimenter utført av søkerene har overraskende nok vist en synergi ved benyttelse av en promoterkombinasjon ifølge kravene. Andre promotere er kjent innen faget og kan benyttes i kombinasjon med en tac- promoter ifølge oppfinnelsen. Slike promotere omfatter, men er ikke begrenset til, lpp, ara B, trpE, gal K.

Kontrollområdet omfatter fortrinnsvis nøyaktig to promoterer. Dersom den ene av promoterene er tac foretrekkes det at tac-promoteren ligger 5' for en annen promoter i kontrollområdet. Dersom en av promoterene er lac ligger lac-promoteren fortrinnsvis 3' for en annen promoter i kontrollområdet. I en utførelse omfatter kontrollområdet både en tac-promoter og en lac-promoter, fortrinnsvis med lac-promoteren liggende 3' for tac-promoteren.

Det kodende området

Det kodende området omfatter nukleinsyrer som koder for et peptidprodukt av interesse, koblet med opprettholdt leseramme nedstrøms for nukleinsyrer som koder for et signalpeptid, hvorved det kodende området koder for et peptid som omfatter, fra N-ende til C-ende, signalproduktet henholdsvis pepetidproduktet. Uten å ønske å være begrenset av teori antas det at signalet kan gi en viss beskyttelse til peptidproduktet mot proteolytisk degradering, i tillegg til å delta i utskilling av peptidproduktet til periplasma.

Mange peptidsignalsekvenser er kjent og kan benyttes i samsvar med oppfinnelsen. Disse omfatter signalsekvenser fra yttermembranproteiner fra velkarakteriserte vertsceller og enhver sekvens som kan translokere peptidproduktet til periplasma og avkløyves posttranslasjonelt av verten som en følge av translokasjon. Egnede signalpeptider omfatter, men er ikke begrenset til Omp A, pel B, Omp C, Omp F, Omp T, p-la, Pho A, Pho S og Staph A.

Peptidproduktet er fortrinnsvis tilstrekkelig lite til at det i fravær av foreliggende oppfinnelse vanligvis ville kreve en fusjonspartner ved benyttelse av teknologien ifølge teknikkens stand. Peptidproduktet har typisk en molekylvekt på mindre enn 10 Kda. Mer foretrukket har peptidproduktet en C-terminal glysin og benyttes som forløper for en enzymatisk amideringsreaksjon som overfører den C-terminale glysin til en aminogruppe, noe som fører til et amidert peptid. En slik overføring er beskrevet i mer detalj nedenfor. En rekke biologisk viktige peptidhormoner og neurotransmittorer er amiderte peptider av denne type. For eksempel kan peptidproduktet som kodes av det kodende område være kalsitoninforløper fra laks eller kalsitoningenrelatert peptidforløper, som begge har C-terminale glysiner og som begge kan amideres enzymatisk til moden laksekalsitonin eller modent kalsitoningenrelatert peptid. Andre amiderte peptider som kan fremstilles i samsvar med foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, veksthormon-frigivende faktor, vasoaktivt intestinalt peptid og galanin. Andre amiderte peptider er velkjente innen faget.

Analoger av parathormon kan også fremstilles i samsvar med oppfinnelsen. For eksempel kan et peptid som omfatter de første 34 aminosyrer i parathormon tilveiebringe en funksjon som ligner på funksjonen til parathormon selv, likeså en amidert versjon av 34-aminosyrersanalogen. Denne kan fremstilles ved ekspresjon, i samsvar med ett eller flere av ekspresjonssystemene og en eller flere av fremgangsmåtene som beskrives heri, av de første 34 aminosyrer i parathormon, fulgt av glysin-35. Enzymatisk amidering som beskrevet heri vil så overføres glysinet til en aminogruppe.

Selv om foretrukne utførelser av det direkte ekspresjonssystem som beskrives heri gir peptider med C-terminal glysin antas det at ethvert peptid vil oppnå godt utbytte og lett gjenvinning ved benyttelse av vektorene, vertene og/eller fermenteringsteknikkene som beskrives heri.

Andre valgfrie sider ved en foretrukket vektor ifølge oppfinnelsen eller ved andre vektorer som skal uttrykkes i samme vert som vektoren ifølge oppfinnelsen.

Repressor

Den foretrukne vektor ifølge foreliggende oppfinnelse kan om ønskelig omfatte nukleinsyrer som koder for et repressorpeptid som kan undertrykke ekspresjonen som kontrolleres av minst en av promoterene. Alternativt kan imidlertid nukleinsyrene som koder for et repressorpeptid foreligge en separat vektor i en vertscelle sammen med vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse. Egnede repressorer er kjent innen faget for et stort antall operatorer. Fortrinnsvis koder nukleinsyrene som koder for repressoren for en lac-repressor i foretrukne utførelser av oppfinnelsen, siden denne undertrykker lac-operatoren som inngår både i tac- og lac-promoteren, hvorav minst én alltid er tilstede i foretrukne vektorer ifølge oppfinnelsen.

Seleksjonsmarkører

Det foretrekkes at en av stort utvalg av seleksjonsmarkørgener (f.eks. et gen som koder for kanamycinresistens) foreligger i vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette vil tillate egnet og spesifikk seleksjon av vertsceller som effektivt er transformert eller transfektert med den nye vektor ifølge oppfinnelsen.

Sekresjonsfremmende peptid

Nukleinsyrer som koder for minst ett sekresjonsfremmende peptid kan om ønskelig foreligge i vektoren ifølge foreliggende oppfinnelse. Alternativt kan nukleinsyrene som koder for et sekresjonsfremmende peptid foreligge i en separat vektor som uttrykkes i samme vertscelle som vektoren som koder for peptidproduktet. Det sekresjonsfremmende peptid er fortrinnsvis utvalgt fra gruppen som består av SecY (prlA) og prlA-4. Det skal understrekes at SecY og prlA er identiske og at de to begreper benyttes som synonymer innen faget. PrlA-4 er en kjent modifikasjon av prlA og har lignende funksjon. Et annet foretrukket sekresjonsfremmende peptid er SecE, også betegnet "prlG", et begrepet som benyttes synonymt med "SecE". Mest foretrukket koder vektoren for flere seksjonsrfemmende peptider av hvilke minst ett er SecE og de andre er utvalgt fra gruppen som består av SecY (prlA) og prlA-4. Disse to antas å interagere slik at translokasjon av peptidproduktet fra cytoplasma til periplasma lettes. Uten å ønske å være begrenset av teori kan disse sekresjonsfremmende peptider tenkes å bidra til å beskytte peptidproduktet fra cytoplasmatiske proteaser, i tillegg til deres sekresjonsfremmende funksjoner.

Vertscelle

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en vertscelle som er transformert eller transfektert med en av vektorene ifølge foreliggende oppfinnelse. Vertscellen er fortrinnsvis en bakteriecelle. Mer foretrukket er vertscellen en gram-negativ bakteriecelle. Enda mer foretrekkes det at vertscellen er E. coli. Det foretrekkes ytterligere at E. co//-stammen er stamme BLR, BL21 og WA837. Mest foretrukket er E. co//-stammen stamme BLR. Videre er det mest foretrukket at vertscellen videre uttrykker minst ett sekresjonsfremmende peptid.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter et gen for ekspresjon av kalsitoninforløper fra laks eller kalsitoningenrelatert peptidforløper, hvor vertscellen er E. coli stamme BLR. Det antas at BLR-ekspresjon av disse to peptider vil være spesielt effektivt selv dersom vektorer ifølge teknikkens stand benyttes for ekspresjonen. Med andre ord antas det ikke at de nye ekspresjonsvektorer som rapporteres heri er nødvendige for god ekspresjon av disse to peptider i en BLR-vert.

Fremgangsmåte for fremstilling av et heterologt peptid

Nye fermenteringsbetingelser tilveiebringes for dyrking av vertsceller til svært høy celletetthet under dyrkningsbetingelser som tillater diffusjon eller utskillelse av peptidproduktet til dyrkningsmediet i høyt utbytte.

Vertsceller som er anvendbare i den nye fermentering omfatter, men er ikke begrenset til, vertscellene som er diskutert ovenfor og/eller vertsceller transformert eller transfektert med en eller flere av de nye ekspresjonsvektorene som er diskutert ovenfor. Andre vertsceller som er genetisk modifisert slik at de uttrykker peptidprodukt sammen med et signalområde kan benyttes. Cellene plasseres i en fermentor som fortrinnsvis omfatter egnede midler for tilførsel av luft eller andre gasser, en karbonkilde og andre mediebestanddeler og midler for induksjon av promoteren. Egnede midler for måling av oksygeninnholdet, celletettheten, pH og lignende foretrekkes også.

Søkerene har funnet at vesentlig forhøyet utbytte av peptidprodukt som uttrykkes direkte i dyrkningsmediet oppnås ved nøye kontroll av den gjennomsnittlige celleveksthastighet innenfor et kritisk område på mellom 0.05 og 0.20 doblinger pr time. Det foretrekkes at denne kontrollerte vekt begynner i tidlig loggfase i kulturen. Det foretrekkes videre å opprettholde en gjennomsnittlig celleveksthastighet under fermenteringsperioden (d.v.s. tidsrommet i hvilket veksten kontrolleres som beskrevet heri) på mellom 0.10 og 0.15 doblinger pr time, mest foretrukket 0.13 doblinger pr time. Veksthastigheten kan kontrolleres ved å justere enhver av parameterene beskrevet nedenfor i avsnittet betegnet "Fremstilling av sCTgly (fermentering)", nærmere bestemt formelen som relaterer foringshastigheten "Q" til flere andre parametere. Søkerene har funnet at det å variere hastigheten med hvilken karbonkilden tilføres de fermenterende celler er en fordelaktig fremgangsmåte for å opprettholde veksthastigheten innenfor det kritiske området. For å opprettholde en relativt konstant veksthastighet vil mengden av karbonkilden som tilføres i fermentoren øke tilnærmet proporsjonalt med økningen i celletallet.

Søkerene har også funnet at et signifikant forbedret utbytte kan oppnås ved å tilføre induser under fermenteringstidsrommet med kontrollert vekst. Som for karbonkilden

omfatter tilførsel av egnede mengder av induser å øke tilførselshastigheten proporsjonalt med veksten i celletallet. Siden tilførsel av både karbonkilden og induseren fortrinnsvis øker på en måte som er koblet til celleveksten har søkerene funnet at det er fordelaktig å blande for og induser og tilføre blandingen av disse med passende hastighet for kontroll

av celleveksten (med karbonkilden), slik at det samtidig oppnås en kontinuerlig tilførsel av induser som opprettholdes i et konstant mengdeforhold relativt til mengden av karbonkilden. Det er imidlertid naturligvis mulig å tilføre karbonkilde og induser hver for seg. Selv da er det imidlertid, dersom en kjemisk induser som kan være toksisk for cellene i store mengder benyttes, ønskelig at induseren og karbonkilden tilsettes time for time under dyrkningen i mengder som gjør at vektsforholdet mellom tilsatt induser i ethvert tidsrom relativt til karbonkilden tilsatt i det samme tidsrom ikke varierer med mer enn 50% fra mengdeforholdet mellom induser tilsatt i løpet av hele fermenteringsprosessen (den kontrollerte vekstperiode) relativt til mengden karbonkilde tilsatt under hele fermenteringsprosessen. Denne varians på 50% måles fra det laveste forhold dersom to forhold sammenlignes. Dersom for eksempel forholdet mellom karbonkilde og induser for den fullstendige fermentering er 2 til 1 er forholdet i et gitt tidsrom fortrinnsvis ikke høyere enn 3 til 1 og ikke lavere enn 1.333 til 1. Det er også mulig å indusre en eller flere av promoterene under veksten ved andre midler, for eksempel endret temperatur i kulturen eller endret konsentrasjon av en gitt forbindelse eller et gitt næringsstoff.

Dersom tilførsel av en ekstern karbonkilde benyttes som fremgangsmåte for å kontrollere celleveksten er det fordelaktig å vente til eventuelle karbonkilder som opprinnelig forelå i mediet (før tilførsel av eksternt karbon) har blitt forbrukt i en grad hvor celleveksten ikke lenger kan understøttes uten tilførsel av eksternt karbon. Dette sikrer at den eksterne tilførsel har mer direkte kontroll over celleveksten uten signifikant forstyrrelse fra opprinnelige (ikke-tilførte) karbonkilder. En oksygenkilde tilføres fortrinnsvis kontinuerlig i fermenteirngsmediet mens nivået av oppløst oksygen måles. En økning i oksygennivået tyder på en signifikant reduksjon i celleveksten, noe som igjen kan tyde på at den opprinnelige karbonkilde er forbrukt og at det er på tide å starte den eksterne tilførsel.

Det har uventet blitt funnet at peptidproduktutbyttet øker med økt oksygenmetning av dyrkningsmediet. Dette gjelder selv om lavere oksygenmetningsnivåer er tilstrekkelige for å opprettholde celleveksten. Således foretrekkes det under hele fermenteringsprosessen at en oksygenkilde eller en oksygenanriket kilde tilføres dyrkningsmediet og at minst 20% og fortrinnsvis minst 50% oksygenmetning oppnås. Som benyttet heri betyr "oksygenmetning" prosent oksygen i fermenteirngsmediet når mediet er fullstendig mettet med vanlig luft. Med andre ord har et fermenteirngsmedium som er mettet med luft en "oksygenmetning" på 100%. Selv om det er vanskelig å opprettholde oksygenmetningen i fermenteirngsmediet signifikant over 100%, d.v.s. over oksygeninnholdet i luft, er dette mulig og til og med ønskelig i lys av at et høyere oksygeninnhold gir høyere utbytter. Dette kan oppnås ved å gjennomboble mediet med gasser som har høyere oksygeninnhold enn luft har.

Signifikant forbedret utbytte kan oppnås ved å opprettholde oksygenmetningen i fermenteringsmediet på et nivå som ikke er lavere enn 70%, særlig ikke lavere enn 80%. Disse nivåer er relativt enkle å opprettholde.

Hurtigere oVerrøring kan bidra til å øke oksygenmetningen. Når først fermenteringsmediet begynner å tykne blir det vanskeligere å opprettholde oksygenmetningen, og det anbefales å tilføre gasser med høyere oksygeninnhold enn luft i det minste i dette stadium. Søkerene har funnet at vanlig luft kan være tilstrekkelig til å opprettholde god oksygenmetning inntil relativt sent i fermenteringsperioden. Søkerene har supplementert lufttilførselen med tilførsel av 50% oksygen eller 100% oksygen senere i fermenteringsperioden. Vertscellen dyrkes fortrinnsvis over et tidsrom på mellom 20 og 32 timer (etter innledning av den kontrollerte vekst), mer foretrukket mellom 22 og 29 timer, mest foretrukket i tilnærmet 24-27 timer.

Fortrinnsvis inkuberes vertscellene ved en temperatur på mellom 20 og 35°C, mer foretrukket mellom 28 og 32°C, mer foretrukket mellom 29.5 og 30.5°C. En temperatur på 30°C har vist seg å være optimal i flere fermenteringer utført av søkerene.

pH i dyrkningsmediet ligger fortrinnsvis mellom 6.0 og 7.5, mer foretrukket melom 6.6 og 7.0, med 6.78 - 6.83 (f.eks. 6.8) som spesielt foretrukket.

I foretrukne utførelser utføres fermenteringen ved benyttelse av verter som er transformert med en ekspresjonsvektor med et kontrollområde som omfatter både en tac-promoter og en lac-promoter og et kodende område som omfatter nukleotider som koder for et signalpeptid oppstrøms for nukleotider som koder for kalsitoninforløper fra laks. En slik ekspresjonsvektor omfatter fortrinnsvis flere, fortrinnsvis to, transkripsjons-kassetter i tandem. Som benyttet heri betyr begrepet "transkripsjons-kassetter i tandem" at et kontrollområde og et kodende område følges av minst ett kontrollområde og minst ett kodende område som koder for samme peptidprodukt som det første kodende området. Dette må skilles fra den disistroniske ekspresjon, hvor ett enkelt kontrollområde kontrollerer ekspresjonen av to kopier av det kodende området. Denne definisjonen vil tillate endringer i det kodende området som ikke gjelder peptidproduktet, for eksempel innsetting i den andre transkripsjonskassett av nukleotider som koder for et annet signalpeptid enn det som kodes av den første transkripsjonskassett.

En rekke karbonkilder er kjent innen faget. Glyserol har vist seg effektiv. Foretrukne fremgangsmåter for induksjon omfatter tilsetning av kjemiske indusere som IPTG og/eller laktose. Andre fremgangsmåter som temperaturforandring eller endret nivå av næringsstoffer kan benyttes. Andre induksjonsteknikker som er egnet for operatoren eller promoteren i kontrollområdet (eller en av promoterene som benyttes dersom mer enn én foreligger i kontrollområdet) kan også benyttes.

Det er typisk at peptidproduktproduksjonen reduseres signifikant omtrent samtidig med at veksten av cellene i fermenteringsmediet ikke lenger kan opprettholdes innenfor den foretrukne veksthastighet, diskutert ovenfor. På dette punkt stoppet fermenteringen og tilførsel av karbonkilde og induser samt oksygentilførsel opphører. Kulturen avkjøles fortrinnsvis hurtig for å undertrykke aktiviteten av proteaser og således redusere degradering av peptidproduktet. Det er også ønskelig å modifisere pH til et nivå som i vesentlig grad reduserer den proteolyttiske aktivitet. Dersom kalsitoninforløper fra laks fremstilles ved benyttelse av foretrukne vektorer og vertsceller ifølge oppfinnelsen reduseres den proteolyttiske aktivitet med redusert pH. Denne surgjøring skjer fortrinnsvis samtidig med avkjølingen av mediet.<1> De foretrukne pH-områder diskuteres i mer detalj nedenfor. Den samme analyse som benyttes for måling av fermenteringsprodukt kan benyttes for å måle degradering ved forskjellige pH-nivåer for således å etablere pH-optimum for et gitt peptid og dets urenheter.

1 eller den kan utføres etter fjerning av bakteriecellene.

Gjenvinning av det heterologe peptid

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for gjenvinning av peptidproduktet som omfatter å skille vertscellene fra dyrkningsmediet og deretter behandle dyrkningsmediet med minst én type kromatografi utvalgt fra gruppen som består av gelfiltrering, jonebytterkromatografi (fortrinnsvis kationbytterkromatografi dersom peptidet er kalsitonin), reversfasekromatografi, affinitetskromatografi og hydrofob interaksjonskromatografi. For et peptid som inneholder cysteinrester kan S-sulfonering utføres før eller under rensingstrinnene for å forhindre aggregering av peptidet og derved øke utbyttet av monomert peptid. Fortrinnsvis benyttes tre kromatografitrinn i følgende rekkefølge: jonebytterkromatografi, reversfasekromatografi og nok en jonebytterkromatografi.

Etter avsluttet fermentering justeres pH i dyrkningsmediet om ønskelig for å redusere den proteolyttiske aktivitet. Analysen som benyttes for å måle produktproduksjonen kan også benyttes for å måle produktdegradering og til å bestemme den beste pH for stabilitet. Dersom kalsitoninforløper fra laks fremstilles i samsvar med oppfinnelsen foretrekkes en pH-verdi mellom 2.5 og 4.0, mens en verdi mellom 3.0 og 3.5 er spesielt foretrukket. Disse pH-områder antas også å bidra til tilbakeholdelse av kalsitoninforløper fra laks på kationbytterkolonner og således bidra til bedre rensing under en foretrukket renseteknikk som beskrives heri.

Om ønskelig reduseres også temperaturen i mediet etter avsluttet fermentering til en temperatur under 10°C, fortrinnsvis mellom 3°C og 5°C, mest foretrukket 4°C. Dette antas også å redusere uønsket proteaseaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et amidert peptidprodukt som omfatter følgende trinn: dyrking i et dyrkningsmedium av enhver av vertscellene ifølge foreliggende oppfinnelse som uttrykker et peptidprodukt med en C-terminal glysin, gjenvinning av peptidproduktet fra dyrkningsmediet, amidering av peptidproduktet ved å sette peptidproduktet i forbindelse med oksygen og et reduksjonsmiddel i nærvær av peptidylglysin a-amiderende monooksygenase eller peptidylglysin a-hydroksylerende monooksygenase. Dersom peptidylglysin a-amiderende monooksygenase ikke benyttes ovenfor og dersom reaksjonsblandingen ikke allerede er basisk økes pH i reaksjonsblandingen inntil den er basisk. Amidert peptid kan deretter gjenvinnes fra reaksjonsblandingen, fortrinnsvis ved å benytte renseteknikken beskrevet nedenfor i eksempel 6.

Vertcellen dyrkes fortrinnsvis i et dyrkningsmedium i nærvær av en induser mens en gjennomsnittlig celleveksthastighet under dyrkningen på mellom 0.05 og 0.20 doblinger pr time opprettholdes.

Eksperimentelle detaljer

Kloningsstrategi for psCT-037 og pSCT-038

Konstruksjonen av pSCT-038 og pSCT-037 omfatter åtte deler som går sammen for dannelse av de intermediære vektorer som er nødvendige for konstruksjon av de endelige ønskede ekspresjonsplasmider. Alle gener og fragmenter som ble benyttet eller konstruert utenfor beskrivelsen i teksten av dette prosjekt er angitt i Tabell 1.

Del I: Konstruksjon av pSCT-018D

TAC-promoterkassetten (Tabell 1) ble subklonet i pGEMl 1ZF+ (Tabell 1) som et Hind III-Bam HI-fragment slik at pGEMl 1ZF+TAC ble dannet. PelB-sCTgly cas2 genet (Tabell 1) ble innligert nedstrøms for tac-promoteren (i pGEMl 1ZF+TAC) i Barn HI-setet slik at ekspresjonsvektoren pSCT-013B ble dannet. Tac-pelBsCTgly-operonet ble kuttet ut fra pSCT-013B ved benyttelse av Hind m og Eco RI. Dette fragment ble så ligert, sammen med en Hind ni-Pst I-adapter inn i pSP72 (Tabell 1) slik at pSCT-015B ble dannet. Kanamycinresistensgenet ble så ligert inn i Pst I-setet i pSCT-015B slik at pSCT-016B ble dannet. Det 5' kodende området og kontrollområdet fra P-laktamasegenet (ampicillinresistens) ble fjernet ved å kutte vektoren med Pvu II og Fsp I, fulgt av religering slik at pCT-017B ble dannet. Tl-T2-transkripsjonsterminatoren fra pSP72 T1-T2 (Tabell 1) ble utkuttet og ligert inn i pSCT-017B ved benyttelse av Sal I-og Bgl II-setene slik at pSCT-018B ble dannet. LAC-IQ-genet (Tabell 1) som inneholder Barn HI- og Eco RI-seter ble så ligert inn i Bgl II - Eco RJ-setene pSCT-018B slik at pSCT-018D ble dannet (se Figurene IA og 1 B).

Del II: Konstruksjon av pSCT-019

lac P/O (Tabell 1) med seter for Pst I og Hind III og et Hind III-Eco Rifragment fra pSCT-013B (inneholdende tac-pelBsCTgly) ble innsatt i en treveis ligering i Pst I- og Eco RI-setene i pSP72 slik at pSGT-015A ble dannet. Som beskrevet i konstruksjonen av pSCT-017A ble Kan-R-genet innsatt og p-laktamasegenet fjernet fra pSCT-015A slik at pSCT-016A og pSCT-017A ble dannet. Lpp-lac-ompAsCTgly (Tabell I) - Pst I - Acc I fragmentet (17 basepar av den 5' kodende sekvens fra sCTgly foreligger ogsål ble utkuttet fra pSP72-OMPA og ligert inn i de kompatible seter i pSCT-017A slik at pSCT-019 ble dannet (se Figur 2).

Del III: Konstruksjon av pSCT-025

Et Barn HI-fragment fra det PCR-amplifiserte operon lac-ompAsCTgly (Tbaell 1) ble ligert inn i Barn HI-setet i pSCT-018D slik at det erstattet pelBsCTgly-genet under dannelse av pSCT-023(-). (-) angir at inskuddet ble innsatt i revers orientering relativt til tac-promoteren. Lac-ompAsCTgly-operonet ble så utkuttet fra pSCT-023(-) ved benyttelse av Barn HI og Sal I og deretter ligert inn i de kompatible seter i psCT-017B slik at pSCT-017 DELTA ble dannet. Det største Bgl I-Bgl II-fragment som inneholder kanamycinresistensgenet, tac-lac-promoterene og ompAsCTgly ble utkuttet fra pSCT-017 dELTA og ligert inn i Bgl I-Bam HI-setene i pSCT-018D slik at pSCT-025 ble dannet (se Figur 3).

Del IV: Konstruksjon av pSCT-029A

Et PCR-produkt fra RRNB T1-T2-02 (Tabell 1) som omfattet Xho I- og Eco RI-setene ble ligert inn i Sal I - Eo RI-setene i pSCT-025 slik at pSCT-025A ble dannet. Et Hind III-Sac I-fragment utkuttet fra pSCT-025 som inneholdt tac-lac-ompAsCTgly-RRNB-T1-T2 terminatorer-genkassetten ble ligert inn i de kompatible seter i pSP72 slik at pCPM-01 ble dannet. pCPM-01 A-vektoren ble konstruert ved benyttelse av samme fremgnagmsåte som beskrevet for pSCT-025A. pSCT-025A og pCPM-01 A-plasmidene avviker fra pSCT-025 og pSCT-01-plasmidene når det gjelder hvilke typer restriksjonsseter som foreligger oppstrøms og nedstrøms for RRNB T1-T2-transkripsjonsterminatoren. Et Xho I-Eco RI-fragment som omfattet tac-lac-ompAsCTgly RRNB TI-T2-terminator-genkassetten ble utkuttet fra pCPM-01 A og ligert inn i Sal I-Eco RI-setene i pSCT-025A for dannelse av den digeniske ekspresjonsvektor pSCT-029A (Figur 4). Fremgangsmåtene som ble benyttet for dannelse av pSCT-029A kan gjentas for fremstilling av ytterligere polygeniske ekspresjonsvektorer, som vist nedenfor for konstruksjonen av pSCT-034.

Del V: Konstruksjon av pSEC-E

Vektoren pCPM-01 ble kuttet med Pst I og Xba I for utkutting av lac P/O som deretter ble ligert inn i de kompatible seter i pSP72. Det PCR-amplifiserte secE-gen (Tabell I) som omfattet Xba I og Barn HI-kloningssetene ble ligert inn i de kompatible seter i ompAsCTgly-Tl-T2-cistron-kloningsvektoren (Tabell 1) for dannelse av pCM-SECE. secE og Tl-T2-terminatorene ble utkuttet fra PCM-SECE som et Xba I-Eco RI-fragment og ligert, sammen med et Xba I-Sal I-fragment som omfattet lac P/O (utkuttet fra pSP72-lac) inn i Sal I-Eco RI-setene i pSP72 slik at pSEC-E ble dannet (se Figur 5). Del VI: Konstruksjon av pPRLA-4 (prlA-4 er et mutant allel av prlA- eller secY-genet.

Tl-T2-terminatorområdet i ompAsCTgly Tl-T2-cistron-vektoren ble utkuttet med Barn HI og Sma I, og deretter innligert i Pvu II- og Barn HI-setene i pSP72 slik at den intermediære kloningsvektor PRLA4-INT ble dannet, lac P/O ble utkuttet fra pSP72-LAC med Xba I og Sac I og ligert, sammen med prlA-4 PCR-fragmentet (Tabell I), som omfatter Xba I- og Barn HI-restriksjonsseter, inn i Sac I - Barn HI-setene i PRLA4-INT slik at pPRLA-4 ble dannet (se Figur 6).

Del VII: Konstruksjon av pSEC-EY

Et syntetisk oligonukleotidfragment som omfattet trpE P/O-sekvensen (Tabell I) ble

subklonet inn i Xho I-Xba I-setene i pCPM-01 A slik at pCPM-08 ble dannet. prlA-4- og Tl-T2-sekvensene ble utkuttet fra pPRLA-4 med Xba I og Xho I og ligert, sammen med et Sal I-Eco RI-fragment fra pSEC-E, som omfattet lac-secE-Tl-T2-operonet inn i Xba I- og Eco RI-setene i pCPM-08 slik at pSEC-EY ble dannet (se Figur 7).

Del VIII: Konstruksjon av pSCT-037 og pSCT-038

Det secE og prlA-4-kodende området ble utkuttet fra pSEC-EY med Xho I og Bgl II. Det resulterende fragment ble så ligert inn i Sal I-Bgl II-setene i pSCT-025A og pSCT-029A slik at pSCT-037 henholdsvis pSCT-038 ble dannet (se Figur 8).

Kosntruksjon av pSCT-034

pSCT-034 er et trigenisk ekspresjonsplasmid som omfatter tre kopier av Tac-Lac-ompAsCTgly RRNB Tl-T2-transkripsjonskassetten. Denne vektor (se Figur 9) ble konstruert ved å innsette den beskrevne kassett fra pCPM-01 A inn i Sal I- og Eco RI-setene i pSCT-029A slik at en tredje kopi av ekspresjonskassetten ble innført. Fremgangsmåten for konstruksjonen er identisk med fremgangsmåten for konstruksjon av pSCT-029A fra pCPM-01 A og pSCT-025A. De 3' Sal I- og Eco RI-setene gjendannes og tilveiebringer setene som er nødvendige for innføring av flere kopier av kassetten.

Transformering av E. coli BLR med pSCT-029A eller pSCT-038

Etter konstruksjon av plasmidene pSCT-029A eller pSCT-038, d.v.s. sammenligering av de forskjellige DNA-fragmenter, er det nødvendig å benytte den endelige ligeringsblanding for transformering av en E. cø/z-vertsstamme for videreføring av plasmidet og for fremtidig proteinekspresjonsarbeid. For å utføre denne transformasjon er det nødvendig å gjøre E. co/z-cellene kompetente for opptak av DNA. Fremstilling av kompetente celler kan gjøres ved en rekke fremgangsmåter, for eksempel CaCb-behandling og elektroporering. For den endelige fremstillling av de foretrukne cellelinjer, UGL 165 og UGL 703, benytter vi begge fremgangsmåter i serie ifølge følgende fremgangsmåter.

I. Primær transformering inn i E. coli K-12-verten BB4

Denne første transformasjon er ikke nødvendig, men foretrekeks siden verten E. coli BB4 K-12 har høy transformasjonseffektivitet, noe som fører til et stort antall transformater og en høy sannsynlighet for identifisering av en rekke ønskede kloner.

A. Fremstilling av kompetente BB4-celler ved CaCh-behandling

BB4 Genotype...LE392.32 [F' lac^ZAMISproAB Tn 10 (Tet<R>)]

1. Fremstill en mettet over natten-kultur av vertscellen.

2. Fremstill en frisk vertscellekultur ved å inokulere 100 ml medium til 0.5% (v/v), og dyrk den til A60o nm = 0.02-0.03.

3. Dyrk kulturen til en A6oo nm på 0.15-0.3, tilnærmet 3 doblinger.

4. Inkuber cellene på is i 10 minutter.

5. Fjern cellene fra dyrkningsmediet ved sentrifugering, 5.000 rpm i 10 min.

6. Resuspender de nedsentrifugerte celler i 0.5 volumer iskald 0.1 M CaCtø, oppbevar på is i 30 minutter og nedsentrifuger så cellene som tidligere beskrevet. 7. Resuspender de nedsentrifugerte celler i 0.1 X volum 0.1 M CaCfe og inkuber på is i 1 time før bruk.

B. T ransformasjonsfremgangsmåte

1. Til 100 ul kompetente celler, fremstilt som beskrevet, tilsettes 1-2 ul av en ligeringsblanding som ideelt bør inneholde 2-10 ng plasmidvektor-DNA.

2. Inkuber blandingen på is i 30 minutter.

3. Gi blandingen et varmesjokk ved å plassere den i en varmeblokk eller et vannbad ved 37°C. 4. Tilsett blandingen 1 ml forvarmet dyrkningsmedium og inkuber blandingen ved 37°C i 30-60 minutter. 5. Fordel en passende mengde av transformasjonsblandingen på et egnet fast medium som inneholder det nødvendige selektive antibiotikum, og inkuber platene 18-24 timer inntil kolonier opptrer.

II. Sekundær transformasjon

Transformantene identifiseres ved en rekke fremgangsmåter. Forskjellige kloner utvelges for overføring til sekundærverten, E. coli B vertsstamme BLR. BLR er den foretrukne vertsstamme for fermentering og proteinekspresjon.

Genotypen for BLR er F" ompT hsdSB(rB". mn") gal dem A(srl-recA) 306::TnlO(Tc<R>). E. co//-cellene vil akseptere DNA etter behandling med et elektrisk felt under kontrollerte og spesifiserte betingelser. E. coli B-vertsstammer transformeres enklest med et intakt plasmid snarere enn en ligeringsblanding, og de er mer mottakelige for fremmed DNA dersom de gjøres kompetente ved elektroporering enn dersom CaCfe-behandling benyttes.

A. Fremstilling av kompetente E. coli BLR-celler for påfølgende elektroporering

1. Fremstill en mettet overnattskultur av vertscellen.

2. Fremstill en fersk vertscellekultur ved å inokulere 100 ml medium med 1.0% (vol/vol), og dyrk til en A60o nm på 0.3-0.5. 3. Høst cellene ved sentrifugering etter avkjøling av kulturen på is i 15 minutter. 4. Avhell supernatanten og fjern så mye av mediet som mulig. Resuspender cellene i et totalvolum på 100 ml av iskald vandig 10% glyserol vekt/vol (glyserolen bør være av ekstra høy kvalitet). Sentrifuger de resuspenderte cellene umiddelbart. 5. Resuspender cellene i 50 ml iskald 10% glyserol (vekt/vol). Sentrifuger på ny. 6. Resuspender cellene i 25 ml iskald 10% glyserol (vekt/vol). Sentrifuger på ny.

7. Gjenta trinn 6.

8. Resuspender cellene i et sluttvolum på 2 ml iskald 10% glyserol (w/v). Den endelige cellekonsentrasjon bør være 1-3 x 10<10> celler/ml. Cellene kan oppbevares i inntil 1 år ved -80°C.

B. Transformasjon ved elektroporering

1. Inkuber sterile kuverter og den hvite kammerslede i 10 minutter på is.

Inkuber også flere polypropylenrør på is.

2. Bland 40 (il cellesuspensjon med 1-2 ul løsning inneholdende plasmid-DNA i Tris/EDTA ved en egnet konsentrasjon på 100 pg/ul. (DNA-blandingen må være så saltfri som mulig for å forhindre gnistdannelse i utstyret). Bland løsningen godt og inkuber på is i 0.5-1.0 minutter. 3. Innstill Gene-Pulser-apparatet på 25 uF. Sett pulskontrollermotstanden til 200 ohm. Innstill Gene-Pulser-apparatet på 2.5 Kv med 0.2 cm kuverter eller 1.5-1.8 Kv dersom 1.0 cm kuverter benyttes. Overfør blandingen av celler og DNA til en kald elektroporeringskuvette og rist suspensjonen ned til bunnen av kuverten slik at alle luftbobler fjernes. Plasser kuverten i den avkjølte sikkerhetskammerslede og dytt sleden inn i kammeret inntil kuverten er plassert mellom kontaktpunktene i bunnen av kammeret.

4. Gi kuverten en puls ved innstillingene ovenfor.

5. Tilsett umiddelbart 1 ml bufret SOC (20 g Trypton, 5 g gjærekstrakt, 0.5 g NaCl, IL H2O og 20 mM glukose)-medium til kuverten og resuspender cellene. 6. Overfør suspensjonen til et sterilt 17 x 100 mm polypropylenrør og inkuber ved 37°C i 1 time. 7. Utså elektroporeringsblandingen på skåler méd selektivt medium.

Fremstilling av sCTgly (fermentering)

Fermenteirngsmedium fremstilles ved benyttelse av bestanddelene opplisten i Tabell 2. Fermenteringsblandingen inokuleres med en kultur i sen loggfase dyrket i inokuleringsmediet (Tabell 29. Inokuleringsvolumet bestemmes ut fra mengden inokulum (antall celler) som er nødvendig for å nå en innledende A 600nm-verdi i fermentoren på mellom 0.015 og 0.24. pH, DO2 og temperaturparameterene for fermenteringskjøringen er angitt i Tabell 3. Fortilførsel i fermenteringsblandingen startes når glyserol i mediet er oppbrukt. (Glyserolfjerning kan observeres som en topp ved analyse åv oppløst oksygen og/eller glyserol). Tilføringshastigheten justeres slik at det oppnås en konstant celledelingshastighet basert på cellemasse (tørrcellevekt) ved det tidspunkt glyserolet er oppbrukt. Bestanddelene i foret er angitt i Tabell 2. Tilførselshastigheten er basert på følgende formel:

hvori:

Mu = veksthastighet (målt i doblinger pr time)

dcw = tørrcellevekt i gram pr liter medium på det tidspunkt fortilførselen starter,

bestemt empirisk for forskjellige E. co//-stammer

t = tid i timer

Y x/s = glyserolforbrukskonstant for verten (0.327 for E. coli W A 837,

tilsvarende for BLR)

v = fermenteringsvolum i liter

[for] = gram glyserol pr liter formedium (629 gram pr liter benyttet i alle

eksempler som rapporteres heri).

Q = glyserolforingshastighet, liter/time

Induksjonsprosessen oppnås ved å benytte en gradientinduksjon koblet til foringshastigheten, slik at konsentrasjonen av induser (IPTG) øker over tid, tilpasset den fastsatte veksthastighet.

Under fermenteringen måles absorbansen ved 600 nm og våtcellevekten i g/l, i tillegg til CEX-kromatografianalyse av mediumprøver for forekomst og konsentrasjon av sCTgly i mg/l.

Glysin kan tilsettes til fermenteringen for å øke den ytre membrans permeabilitet. Glysin kan tilsettes til fermenteirngsmediet eller til foringsmediet. Glysin tilsettes fortrinnsvis til foringsmediet slik at glysinkonsentrasjonen i fermenteringskulturen øker med økende cellevekst. Den optimale glysinkonsentrasjon bør være i områet 0.1-1 gram 100 ml ved fermenteringens avslutning. I praksis beregnes mengden glysin som tilsettes til foret slik at den ønskede glysinkonsentrasjon ved fermenteringens avslutning oppnås. Den faktiske glysinmengde som tilsettes avhenger av fermenteringens varighet etter induksjonen og den ønskede sluttkonsentrasjon av glysin. Vi har benyttet følgende fremgangsmåter: 24 g/l glysin ble tilsatt til fermenteirngsforet, noe som førte til en sluttkonsentrasjon av glysin på 5 g/l 26 timer etter induksjonen. Vi har funnet at tilsetning av glysin til foret er mer effektivt enn å tilsette glysin til dyrkningsmediet.

Isolering av sCTgly

Det kondisjonerte medium høstes ved å separere cellene fra mediet ved benyttelse av enten tangensiell strømfiltrering eller sentrifugering for oppsamling av mediet og

fjerning av cellene. Det utskilte sCTgly stabiliseres i mediet ved tilsetning av 2.0 N Hel til en slutt-pH på 3.0. Glysinforlenget laksekalsitonin er stabilt over lengere tidsrom ved pH 3.0. Etter fjerning av cellene og stabilisering av pH renses peptidet ved benyttelse av kationbytterkromatografi og reversfasekromatografi. Selv om reversfasekromatografi fulgt av kationbytterkromatografi kan gi god rensing foretrekkes det at et innledende

kationbyttertrinn også omfattes før reversfase-væskekromatografi. For rensing i stor skala reduserer dette volumet som skal behandles ved reversfasekromatogri og reduserer således miljømessige og sikkerhetsmessige hensyn som oppstår ut fra behovet for å benytte høye volumer av organiske løsemidler, for eksempel acetonitril.

En annen foretrukket modifisering er S-sulfonering av cysteinrestene i lakse-kalsitoninpeptidet før eller under rensingen for å forbedre utbyttet av det monomere peptid.

Beskrivelse av klonene

Den monogeniske klon UGL 172 er en E. coli BLR-vertsstamme som inneholder vektoren pSCT-025A, som omfatter en transkripsjonskassett (monogenisk) som koder for laksekalsitonin med en C-terminal glysin (sCTgly).<2> Den digeniske klon UGL 165 er en E. coli BLR-vertsstamme som inneholder vektoren pSCT-029A, som omfatter to kassetter i tandem (digenisk) som hver koder for laksekalsitonin med en C-terminal glysin (sCTgly). Den trigeniske klon UGL 168 er en E. coli BLR-stamme som inneholder vektoren pSCT-034, som omfatter tre kassetter i tandem (trigenisk) som hver koder for laksekalsitonin med en C-terminal glysin. (SCTgly). Den monogeniske klon UGL 702 er en E. coli BLR-stamme som inneholder vektoren pSCT-037, som omfatter en kassett og sekresjonsfaktorgener. Den digeniske klon UGL 703 er en E. coli BLR-stamme som inneholder vektoren pSCT-038, som omfatter 2 kassetter i tandem og sekresjonsfaktorgener. 2 En foretrukket transkripsjonskassett inneholder den dobbelte tac/lac-promoter, fulgt av et ribosombindingssete, fulgt av sekvenser for OmpA-signalpeptidet, fulgt av sekvenser for sCTgly, fulgt av transkripsjonsterminatorsekvensene rmB T1-T2.

Eksempel 1 - UGL 165-fermentering i 1 liters skala

Fermenteringen av klonen UGL 165 ble utført som beskrevet under eksperimentelle detaljer. Tabell 4 oppsummerer fermenteringsparameterene og resultatene. Kort beskrevet ble klonale UGL 165-celler dyrket i inokuleringsmedium og benyttet for utsåing i en fermentor som inneholdt 1 liter fermenteringsmedium, slik at en innledende A6oo nm på 0. 06 ble erholdt. Cellene ble dyrket i 6.25 timer inntil glyserol i mediet var oppbrukt. Deretter ble foringsstadiet av fermenteringen innledet, og kulturen ble kontinuerlig tilsatt formedium i 25.5 timer. Betingelsene ved tid null (innledende foring og induksjon) var som følger: oksygenmetning: 94%, temperatur: 30°C, og pH 6.8. Betingelsene ved avsluttet fermentering (ved tid 25.5 timer) var som følger: oksygenmetning: 40%, temperatur: 31°C og pH 6.8. Ved avslutningen av fermenteringen var videre absorbansen ved 600 nm lik 113.3, og våtcellevekten i g/liter var 168 g. Mengden av sCTgly ved avsluttet fermentering ble også målt til å være 222 mg/liter medium (se Figur 10 og Tabell 4).

Eksempel 2 - - Fermentering av UGL 703 i 1 liters skala

Rekombinant E. coli UGL 703 er deponert hos American Type Culture collection (ATCC) som ATCC 98395 i samsvar med kravene i Budapestkonvensjonen vedrørende deponering av mikroorganismer som et ledd i patenteringsprosessen. Fermentering av UGL 703-klonen ble utført som beskrevet under eksperimentelle detaljer. Tabell 5 oppsummerer betingelsene for denne fermentering. Kort beskrevet ble UGL 703-klonen dyrket i inokuleringsmedium og benyttet for utsåing i en fermentor som inneholdt 1 liter fermenteirngsmedium slik at en innledende A6oo nm på 0.06 ble oppnådd (det foretrukne er 0.06 til 0.12). Cellene ble dyrket i 6.25 timer (det foretrukne området er mellom 6.0 og 7.0 timer) inntil glyserol i i mediet var oppbrukt. Deretter ble foringsstadiet av fermenteringen innledet, og kulturen ble kontinuerlig tilsatt foringsmedium i 26 timer. Betingelsene ved tid null (innledning av foringsfasen og induksjon) var som følger: oksygenmetning: 95%, temperatur 30°C og pH 6.8. Betingelsene ved avsluttet fermentering (tid 26 timer) var som følger: oksygenmetning: 80%, temperatur 31 °C og pH 6.8. Ved avsluttet fermentering var videre absorbansen ved 600 nm lik 80.9, og våtcellevekten i gram pr liter var 129.1. Mengden av sCTgly ble også målt til å være 284 mg/liter medium (se Figur 11 og Tabell 5).

Konklusjoner

Andre eksperimenter ble utført under lignende totalbetingelser ved benyttelse av klonene UGL 172, UGL 168 og UGL 702. Figurene 12 og 13 tyder på at den digeniske klon Ugl 165 er best egnet for produksjon av sCTgly, mens den trigeniske klon Ugl 165 er nestbest og bedre enn den monogeniske klon Ugl 173. Imidlertid kan produksjonen av sCTgly ved UGL 165 fortsatt forbedres i nærvær av samtidig uttrykte sekresjonsfaktorer (UGL 703) (sammenlign Figurene 10 og 11 og 17).

Når det gjelder oksygenmetning under fermenteringen understøtter Figurene 14A og 14B konklusjonen om at tilsatt oksygen i fermenteirngsmediet ikke er kritisk for cellevekst av UGL 165, men svært viktig for å øke produksjonen av sCTgly.

Figurene 15 A, 15B og 16 viser tydelig at E. coli stamme BLR er best egnet for produksjon av sCTgly.

Produksjonen av sCTgly kan ytterligere økes ved tilsetning av glysin som en ekstra forbestanddel.

Eksempel 3 - Rensing av sCTgly fra UGL 165-dyrkningsmedium:

Kationbytterkromatografi nr. 1:

Tilnærmet 1000 L dyrkningsmedium som var festet ved tangensiell flytfiltrering elelr sentrifugering ble surgjort med et tilstrekkelig volum av 2N saltsyre til at pH ble redusert til 3.0. Mediet ble deretter fortynnet med et tilstrekkelig volum vann til at ledningsevnen ble redusert til <7.5 mS. Det fortynnede medium ble påsatt en kationbytterkolonne (Pharmacia SP-Sepharose Big Beads, 99.0 cm x 13.0 cm) som var ekvilibrert med 10 mM sitronsyre pH 3.0 ved en gjennomstrømmingshastighet på 25 L/minutt (3.25 cm/minutt). Etter påsetningen ble kolonnen vasket med 10 mM sitronsyre pH 3.0 ved 8 L/minutt (1.0 cm/minutt) i tilnærmet 40 minutter (3 kolonnevolumer), eller inntil en stabil UV-grunnlinje ble oppnådd. Produktet (sCTgly) ble eluert med 10 mM sitronsyre, 350 mM natriumklorid pH 3.0 ved gjennomstrømmingshastighet på 8 L/minutt (1.0 cm/minutt). Kolonnen ble vasket og sterilisert med 0.5 M natriumhydroksid, 1.0 M natriumklorid i 60.0 minutter (5.0 kolonnevolumer) ved 8 L/minutt (1.0 cm/minutt).

Til en omrørt beholder som inneholdt det resulterende CEX nr.l-eluat (tilnærmet 100 L) tilsettes 60.57 gram trometamin. Løsningen omrøres inntil alle faste stoffer er oppløst. pH i løsningen justeres til 8.25 [område: 8.0 til 8.5] med 2 M NaOH. 23.64 gram TRIS-HC1 (Tris[hydroksymetyl]aminometan-hydroklorid) og løsningen omrøres inntil alle faste stoffer er oppløst. En løsning av 1.0 kg natriumsulfitt løst i TRIS-HC1 og en løsning av 200 gram natriumtetrationat løst i TRIS-HCL tilsettes til beholderen under omrøring Reaksjonen omrøres i 15 minutter. Om nødvendig justeres pH til 8.25 [område: 8.0 til 8.5] med 2 M NaOH. Reaksjonsblandingen omrøres over natten ved romtemperatur. pH i reaksjonsblandingen justeres til 2.25 [område: 2.0 til 2.5] med 1 M HC1.

Reversfasekromatografi nr. 1 (RP nr. 1):

Den resulterende S-sulfoneringsreaksjonsblanding (tilnærmet 100 L) ble direkte påsatt en reversfasekolonne (Toso Haas Amberchrom CG300md, 25.0 cm x 18.0 cm) som var ekvilibrert med 0.1% trifluoreddiksyre ved 2.0 L/min. (4.0 cm/min.). Etter påsetningen ble kolonnen vasket med 0.1% trifluoreddiksyre ved 750 ml/min. (1.5 cm/min.) inntil en stabil UV-grunnlinje ble oppnådd. Kolonnen ble vasket med 0.1% trifluoreddiksyre, 20% acetonitril ved 750 ml/min. (1.5 cm/min.) inntil hovedforurensningstoppen var fullstendig eluert. Produktet (sCTgly) ble eluert med 0.1% trifluoreddiksyre, 40% acetonitril ved 750 ml/min. (1.5 cm/min.). Kolonnen ble vasket med 0.1% trifluoreddiksyre, 80% acetonitril i 30 minutter ved 750 ml/min. (1.5 cm/min.)

Kationbytterkromatografi nr. 2 (CEX nr.2):

Det resulterende RO nr. 1-Eluat (tilnærmet 8.0 L) ble direkte påsatt en

kationbytterkolonne (E. Merck Fractogel EMD S03 650M, 18.0 cm x 24.0 cm) som var ekvilibrert med 25 mM MES (2-[N-morfolino]-etansulfonsyre) pH 5.8 ved 500 ml(min.

(2.0 cm/min.). Etter påsetningen ble kolonnen vsket ved 750 ml/min. (3.0 cm/min.) med 25 mM MES (2-[N-morfolino]-etansulfonsyre) pH 5.8 inntil kolonnéeluatet igjen nådde ph 5.8 (område 5.6-5.9). Kolonnen ble vasket med 25 mM MES (2-[N-morfolino]-etansulfonsyre, pH 5.8 i ytterligere 30 minutter ved 750 ml/min. (3.0 m/min.) for å fjerne de viktigste peptidkontaminanter. Produktet (sCTgly) ble eluert med 25 mM MES, 100 mM natriumklorid pH 5.8 ve 750 ml(min. (3.0 cm/min.). Produktrfaksjonen justeres til pH 3.0 - 5.0 med 1.0 M HC1 med mindre amideringen følger umiddelbart. Kolonnen ble vasket og sterilisert med 0.1 M natriumhydroksid, 1.0 M natriumklorid i 60 minutter ved 750 ml/min. (3.0 m/min.).

Amideringsreaksjon

Det resulterende pH-justerte CEX nr. 2-Eluat inneholder renset sCTgly som er en egnet substratløsnihg for anvendelse ved in v/Yro-overføringen av sCTgly til autentisk laksekalsitonin, en reaksjon som katalyseres av peptidylglysin a-amiderende enzym (PAM), som vist nedenfor i Eksémpl 5.

Eksempel 4

Analytisk kationbytter-HPLC for kvantitering av sCTgly:

sCTgly i de sammenslåtte kromatograiffraksjoner ble identifisert og kvantitert ved analytisk CEX-HPLC. En uttak av hver fraksjon ble påsatt en kationbyggerkolonne (The Nest Group, Polysulfoetylaspartamid, 4.6 mm x 50 mm) som var ekvilibrert med 10 mM natriumfosfat pH 5.0 ved en gjennomstrømmingshastighet på 1.2 ml/min. Separasjonen ble oppnådd ved å benytte en lineær gradient fra 10 mM natriumfosfat pH 5.0 til 10 mM natriumfosfat, 250 mM natriumklorid pH 5.0 ved 1.2 ml/min. over 15 minutter. Kolonnealuatet ble fulgt ved måling av UV-absorbansen ved 220 nm. sCTgly ble identifisert ved sammenligning av retensjonstiden med retensjonstiden til en renset sCTgly-referansestandard. SCTgly ble kvantitert ut fra topparealet, sammenlignet med arealet til sCTgly-referansestandarden. Denne analytiske fremgangsmåte ble også benyttet for kvantitering av sCTgly fra fermenteringsmediet.

Eksempel 5 - Overføring av glysinforlenget laksekalsitonin til autentisk

laksekalsitonin ved benyttelse av a-amiderende enzym

For å oppnå de optimale utbytter av amidert laksekalsitonin ble følgende kritiske parametere nøye overholdt: 1) Amideringsreaksjonen utføres i et silanisert glasskår for å forhindre uspesifikk adsorpsjon av peptid til reaksjonskaret. 2) Et høyt nivå av oppløst oksygen opprettholdes i reaksjonsblandingen ved gjennombobling og/eller omrøring. Nivået av oppløst oksygen er fortrinnsvis >75%. 3) Inkuberingstemperaturen under amideringen opprettholdes mellom 35°C og 39°C.

4) pH i amideringsreaksjonen opprettholdes mellom 6.0 og 6.5.

5) Utgangskonsentrasjonen av glysinforlenget laksekalsitonin i amideringsreaksjonen bør ligge mellom 3.5 og 1.5 mg/ml (0.95 mM til 2.9 mM). 6) Dersom 12.000 - 24.000 enheter/ml av i det vesentlige proteasefritt a-amiderende enzym (peptidylglysin a-amiderende monooksygenase, heri betegnet "PA;") tilsettes til reaksjonsblandingen og konsentrasjonen av substrat er som angitt i 5) ovenfor, for reaksjonen forløper i 4.6 timer. Reaksjonstiden kan imidlertid forlenges videre opp til 24 timer uten uheldige virkninger på produktet. 7) For å forhindre at amideringsreaksjonen blir askrobatbegrenset tilsettes ytterligere en ekvivalent askorbat når reaksjonen er tilnærmet 50% fullstendig.

Bestanddelene i amideringsreaksjonsblandingen er følgende:

3.5 -10.5 mg/ml S-sulfonert glysinforlenget laksekalsitonin.

30 mM MES-buffer, pH 6.0 - 6.5

0.5 til 1.0 uM CuS04 (f.eks. 0.5)

4-15mMKI(f.eks. 5)

l-5%Etanol (f.eks. 1%)

10-100 ug/ml Catalase (f.eks. 35)

1.5-3.0 mM askorbat (f.eks. 1.5)

peptidylglysin a-amiderende monooksygenase (12.000-24.000 enheter pr ml reaksjonsbladning. En enhet tilsvarer en overføring av 1 pikomol pr minutt av DansylTyr-Val-Gly-substrat til produkt ved 37°C og pH 7). PAM-enzymet kan erholdes som beskrevet i Miller et al., aBB 298: 380-388 (1992) U.S. patentskrift 4.708.934, EP 0 308 067 og 0 382 403 og Biotechnology bind II (1993) s. 64-70, hvis beskrivelser inkorporeres heri ved referanse.

Det glysinforlengede laksekalsitonin kan fremstilles ved fermentering som beskrevet i Eksempel 1 eller Eksempel 2, og renses som beskrevet i Eksempel 3 før amideringen.

Dersom enzymet som benyttes for amideringen er peptidylglysin a-hydroksylerende monooksygenase PHM) benyttes samme reaksjonsblanding som beskrevet ovenfor bortsett fra at PHM benyttes i stedet for PAM. I tillegg økes pH i reaksjonsblandingen etter inkubasjonsperioden på 4 til 6 timer ved tilsetning av base til mellom 8 og 9. Reaksjonsblandingen omrøres i ytterligere 4 til 8 timer før reaksjonen stoppes. Peptidylglysin a-hydroksylerende monooksygenase kan erholdes ved å uttrykke kun den N-terminale del av PAM (tilnærmet de første 40 dKa). Se f.eks. Mizuno et al. BBRC bind 148, nr. 2, s. 546-52 (1987) hvis beskrivelse vedrørende Mizunos "AE 1" inkorporeres heri ved referanse. Froskehud benyttes for naturlig ekspresjon av PHM.

Etter at amideringsreaksjonen er avsluttet fortynnes reaksjonsblandingen med tilstrekkelig vann til at den endelige peptidkonsentrasjon er lavere enn 3.0 mg/ml. Det tilsettes tilstrekkelig 1 M TRIS pH 9.0 til blandingen til at sluttkonsentrasjonen av TRIS blir tilnærmet 100 mM. Om nødvendig justeres pH til [8.0 til 9.0] med 2 M NaOH. Et 3.0 gangers overskudd av L-cystein over sluttkonsentrasjonen (M) av SO3-SCT tilsettes langsomt under omrøring til reaksjonsblandingen. Om nødvendig justeres pH til [8.0 til 8.5] med 2 M NaOH. Renatureringsreaksjonen omrøres i 1 time ved romtemperatur. Reaksjonen avsluttes ved surgjøring med 10% fosforsyre til pH 2.0 [1.9 til 2.3].

Eksempel 6

Rensing etter amidering

Kationbytterkromatografi nr. 3 (CEX nr. 3):

Denne kolonne benyttes for rensing av sCT etter a-amidering og renaturering. Hovedkontaminanten etter a-amidering/renaturering er sCTG. CEX nr. 3-Kromatografi benytter en Amicon Vantage-A-kolonne (18.0 x 16.0 cm) pakket med Toyopearl SP650S-resin. Enhetsoperasjonen oppnås ved å benytte injeksjonsvann (WFI) og løsninger av 0.5 M, 50 mM og 175 mM natriumklorid sammen med 150 mM natriumfosfat pH 5.5. En kort beskrivelse av trinnene i prosessen følger.

1) Gjennomstrømmingshastigheten settes til 750 ml/min.

2) Følgende parametere som benyttes for å følge kromatografien innstilles ved benyttelse av LC-systemkontrollen:

UV-bølgelengde 230 nm

Område 0.64 AUFS

Ledningsevne X1000

3) Kolonnen vaskes først med WFI i minst 5 minutter ved en gjennomstrømmings-hastighet på 750 ml/min. 4) Fortynningspumpen (150 mM natriumfosfat pH 5.0) innstilles til 50 ml/min., og kolonnen ekvilibreres med 10 mM natriumfosfat ved en gjennomstrømmings-hastighet på 750 ml/min. inntil en stabil pH-grunnlinje observeres. 5) Kolonnen re-ekvilibreres med 10 mM natriumfosfat ved en gjennomstrømmings-hastighet på 750 ml/min. inntil en stabil pH-grunnlinje under 6.0 oppnås. (Bemerk: Dersom kolonnens pH ikke er under 6.0 er det påkrevet med en vask med 150 mM natriumfosfat). Dersom vask med 150 mM natriumfosfat pH 5.5 utføres må kolonnen re-ekvilibreres med 10 mM natriumfosfat pH 5.5 før man fortsetter til neste trinn. 6) Etter re-ekvilibreringen blankelueres kolonnen med 175 mM natriumklorid, 10 rnM natriumfosfat pH 5.5 i 4 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 750 ml/min. 7) Kolonnen re-ekvilibreres med 10 mM natriumfosfat pH 5.5 ved en gjennom-strømmingshastighet på 750 ml/min. inntil en stabil pH-grunnlinje observeres. 8) Etter oppnådd ekvilibrering justeres pH i det amiderte/renaturerte produkt som inneholder 10-25 gram sCT til 3.5 med 2 N natriumhydroksid, og løsningen påsettes CEX nr. 3-Kolonnen ved 400 ml/min. Etter påsetningen vaskes påsetningsbeholderen med 500 ml WFI. 9) Etter påsetningen vaskes kolonnen med 10 mM natriumfosfat pH 5.5 ved en gjennomstrømmingshastighet på 750 ml/min. i 30 minutter, eller inntil pH i kolonnen stabiliserer seg over 5.0. 10) Når først pH i kolonnen er stabilisert over 5.0 vaskes kolonnen ved 750 ml/min. Med 50 mm natriumklorid, 10 mm natriumfosfat pH 5.5 i 100 minutter eller inntil sCTgly-toppen kommer. 11) Etter at de 100 minuttene har forløpt kobles 175 mM natriumklorid til systemet. Kolonnen vaskes med 175 mM natriumklorid, 10 mm natriumfosfat pH 5.5 ved en gjennomstrømmingshastighet på 750 ml/min., og produktet elueres. Hele produkttoppen oppsamles i en beholder. Vekten av det erholdte CEX3-materialet bestemmes, og 1 N eddiksyre (10% av faksjonens vekt) tilsettes til fraksjonen. 12) Kolonnen vaskes med 0.5 M natriumklorid, 10 mm natriumfosfat pH 5.5 ved en gjennomstrømmingshastighet på 750 ml/min. i 15 minutter. 13) Etter at kolonnen er vasket med 1.0 M natriumklorid kobles 0.25 N natriumhydroksid til systemet. Fortynningspumpen justeres til 0.000 ml/min., og kolonnen vaskes med 1.0 M natriumklorid/0.25 N natriumhydroksid ved en gjennomstrømmingshastighet på 600 ml/min. i minst 30 minutter. 14) Kolonnen vaskes med WFI i 5 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 750 ml/min. 15) Kolonnen vaskes med 10 mM natriumhydroksid ved en gjennomstrømmings-hastighet på 500 ml/min. i 30 minutter. Kolonnen lagres under disse betingelser.

Reversefasekromatografi (RP nr. 2):

Dette trinn følger CEX nr. 3 og benyttes som et salt- og bufferutbyttingstrinn før frysetørking. Hovedformålet med trinnet er å utbytte saltet med acetat. RP nr. 2-kromatografien benytter en Amicon Vantage-A-kolonne (13.0 x 12.5 cm) pakket med Amberchrom CG300md-resin. Operasjonen utføres med injeksjonsvann, etylalkohol, 250 mM natriumacetat og 0.5% eddiksyre. En kort beskrivelse av trinnene i prosessen følger: 1) CEX nr. 3-Eluatet (tilnærmet 4 liter) surgjøres til pH 2.0 med fosforsyre og fortynnes så med 3 volumer 333 mM natriumacetat, og inkuberes i minst 1 time. 2) Gjennomstrømmingshastigheten justeres til 320 ml/min. samtidig som fortynningspumpen (0.5% eddiksyre) justeres til 80 ml/min. For en total operasjonell gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. 3) Følgende parametere som benyttes for å styre kromatografien justeres med LC-systemkontrollen:

UV-bølgelengde 230 nm

Område 2.54 AUFS

Ledningsevne X 1000

4) Kolonnen vaskes først med 0.1 % eddiksyre ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. inntil en stabil ledningsevnegrunnlinje observeres. 5) Kolonnen vaskes med 80% etylalkohol, 0.1 % eddiksyre ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. inntil en stabil pH-grunnlinje observeres. 6) Kolonnen vaskes med 0.1% eddiksyre inntil en stabil pH-grunnlinje observeres. 7) Etter vasken utføres en kolonneanalyse for å måle resinrensingen. Kolonnen utsettes for en blank-eluering med 40% etylalkohol, 0.1% eddiksyre i 6 minutter ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. Det samlede eluat fra kolonneanalysen analyseres ved QC. 8) Kolonnen vaskes med 0.1 % eddiksyre ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. Inntil en stabil ledningsevnegrunnlinje observeres. 9) Etter vasken frakobles WFI fra innløpet og 250 mM natriumacetat tilkobles. Fortynningspumpen justeres til 0.000 ml/min. Kolonnen ekvilibreres med 250 mM natriumacetat ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. inntil en stabil pH-grunnlinje observeres. 10) Etter oppnådd ekvilibrering påsettes CEX nr. 3-Eluatet på RP nr. 2-Kolonnen ved 400 ml/min. Prøven etterfølges av vask av påsetningsbeholderen med 1.0 liter 250 mM natriumacetat. 11) Kolonnen vaskes med 250 mM natriumacetat ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. i 60 minutter. 12) Etter vask med natriumacetat frakobles natriumacetatet fra innløpet og WFI tilkobles. Fortynningspumpen justeres igjen til en gjennomstrømmingshastighet på 80 ml/min., og kolonnen vaskes med 0.1% eddiksyre ved en gjennomstrømmings-hastighet på 400 ml/min. i 25 minutter. 13) Etter vask med 0.1% eddiksyre elueres produktet med 40% etylalkohol, 0.1 % eddiksyre ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. Hele produkttoppen oppsamles og frysetørkes for erholdelse av renset sCT-pulver. 14) Kolonnen vaskes med 80% etylalkohol, 0.1% eddiksyre ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. i minst 20 minutter. 15) Etter vasken justeres fortynningspumpen til 0.000 ml/min., og kolonnen vaskes med WFI ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. i minst 5 minutter. 16) Etter WFI-vasken frakobles WFI fra innløpet og 0.5 N natriumhydroksid tilkobles. Kolonnen vaskes med 0.5 N natriumhydroksid ved en gjennom-strømmingshastighet på 400 ml/min. i minst 20 minutter. 17) 0.5 N natriumhydroksid frakobles fra systemet og WFI tilkobles. Kolonnen vaskes med 50% etylalkohol ved en gjennomstrømmingshastighet på 400 ml/min. i minst 20 minutter. Kolonnen lagres under disse betingelser.

18) RP nr. 3-eluatet lagres ved 2 til 8°C.

Selv om foreliggende oppfinnelse er beskrevet ut fra spesielle utførelser av denne vil mange andre varianter og modifikasjoner og andre anvendelser være åpenbare for fagfolk. Foreliggende oppfinnelse er derfor ikke begrenset av den spesifikke beskrivelse heri, men kun av de vedlagte krav.

Claims (20)

1. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter: (a) et kodende område med nukleinsyrer som koder for et peptidprodukt, koblet med opprettholdt leseramme 3' for nukleinsyrer som koder for et signalpeptid, og (b) et kontrollområde operativt koblet til det kodende området, hvor kontrollområdet omfatter flere promotere og minst ett ribosombindingssete, hvori minst en av promoterene er tac.

2. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter flere transkripsjonskassetter hvor hver kassett omfatter kontrollområdet og det kodende området.

3. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at kontrollområdet har nøyaktig to promotere.

4. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at tac-promoteren ligger 5' for en annen promoter i kontrollområdet.

5. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den C-terminale aminosyre i peptidproduktet er glysin.

6. Vektor ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter nukleinsyrer som koder for minst ett sekresjonsfremmende peptid.

7. Vektor ifølge krav 6, karakterisert ved at det sekresjonsfremmende peptid er utvalgt fra gruppen som består av secY og prlA-4.

8. Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med vektoren ifølge krav 1.

9. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert ved at vektoren ytterligere omfatter nukelinsyrer som koder for minst ett sekresjonsfremmende peptid.

10. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert ved at vertcellen er en E. coli vertcelle, hvori ekspresjonsvektoren omfatter flere transkripsjonskassetter i tandem inneholdende (a) et kodende område med nukleinsyrer som koder for et peptidprodukt koblet med opprettholdt leseramme 3' for nukleinsyrer som koder for et signalpeptid; og (b) et kontrollområde operativt koblet til det kodende området, og hvori nevnte flere promotere i kontrollområdet er i tandem hvor minst en av promoterene er tac.

11. Vertscelle ifølge krav 8, transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter et gen for ekspresjon av kalsitoninforløper fra laks, karakterisert v e d at vertscellen er E. coli stamme BLR.

12. Vertscelle ifølge krav 8, transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter et gen for ekspresjon av kalsitoningenrelatert peptidforløper, karakterisert ved at verten er E. coli stamme BLR.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidprodukt, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 10 i et dyrkningsmedium og deretter gjenvinning av peptidproduktet fra mediet i hvilket vertscellen er dyrket.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptidprodukt, karakterisert ved at den omfatter dyrking av vertscellen ifølge krav 11, i et dyrkningsmedium og deretter gjenvinning av peptidproduktet fra mediet i hvilket vertscellen er dyrket.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at nevnte dyrkningsmedium omfatter en karbon kilde og hvori kultiveringstrinnet ytterligere omfatter å indusere ekspresjon av peptid produktet, samtidig som vertscellenes vekst kontrolleres ved en veksthastighet på mellom 0.05 og 0.20 doblinger pr time.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved aten membranpermeabiliserende glysinmengde foreligger i mediet under i det minste en del av den kontrollerte vekst.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at gjenvinning av peptidproduktet omfatter: (a) å skille vertsceller fra dyrkningsmediet, og (b) å behandle mediet med reversfase-væskekromatografi og gjenvinne fraksjoner som inneholder peptidprodukt, og (c) å behandle fraksjonene fra trinn (b) med kationbytterkromatografi, og (d) å deretter gjenvinne fraksjoner som inneholder peptidprodukt.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13, for fremstilling av et amidert peptid, karakterisert ved at den omfatter: (a) å dyrke vertsceller som uttrykker et peptidprodukt med en C-terminal glysin sammen med et N-terminalt signalpeptid i et dyrkningsmedium under betingelser hvor vekst av vertscellene kontrolleres til å ligge innenfor et område på 0.05 til 0.20 doblinger pr time, hvori kulturen induseres under noe av tiden med kontrollert vekst, (b) å gjenvinne peptidproduktet fra dyrkningsmediet, og (c) å omdanne peptidproduktet til et amidert peptid ved å omdanne den C-terminale glysin til en aminogruppe.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at omdanningen til amidert peptid oppnås ved: (a) å danne en reaksjonsblanding ved å sette peptidproduktet i forbindelse med oksygen og et reduksjonsmiddel i nærvær av peptidylglysin a-amiderende monooksygenase eller peptidylglysin a-hydroksylerende monooksygenase, (b) dersom peptidylglysin a-amiderende monooksygenase ikke benyttes i trinn (a) og dersom reaksjonsblandingen ikke allerede er basisk, å øke pH i reaksjonsblandingen inntil den er basisk, og (c) å gjenvinne det amiderte peptid fra reaksjonsblandingen.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 13, hvor peptidproduktet uttrykkes direkte i et dyrkningsmedium, karakterisert ved at den videre omfatter å dyrke vertsceller som uttrykker peptidproduktet sammen med et signalpeptid i mediet under betingelser hvor vekst av vertscellene er kontrollert til å ligge innenfor et område på 0.05 til 0.20 doblinger pr time, hvori en induser foreligger under en del av tidsrommet med kontrollert vekst.