LT4701B - Tiesioginė peptidų ekspresija į augimo terpė - Google Patents
Tiesioginė peptidų ekspresija į augimo terpė Download PDFInfo
- Publication number
- LT4701B LT4701B LT99-133A LT99133A LT4701B LT 4701 B LT4701 B LT 4701B LT 99133 A LT99133 A LT 99133A LT 4701 B LT4701 B LT 4701B
- Authority
- LT
- Lithuania
- Prior art keywords
- peptide
- peptide product
- vector
- medium
- psct
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 154
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 124
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 68
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 76
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 43
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 40
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 37
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 37
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 claims description 32
- 229960003773 calcitonin (salmon synthetic) Drugs 0.000 claims description 29
- 108010068072 salmon calcitonin Proteins 0.000 claims description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 24
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 23
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 22
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 21
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims description 16
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 15
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 102100039087 Peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase Human genes 0.000 claims description 10
- 108010007262 peptidylglycine monooxygenase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 108010075850 pro-calcitonin gene-related peptide Proteins 0.000 claims description 4
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims description 3
- 229920001192 peptidylglycine Polymers 0.000 claims description 3
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims 2
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 claims 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 85
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 85
- 239000000047 product Substances 0.000 description 78
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 23
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 23
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 18
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 16
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 16
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 16
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 16
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 13
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 241000549435 Pria Species 0.000 description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 8
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 7
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 5
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 5
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 4
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 4
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 101150114545 secE gene Proteins 0.000 description 3
- 101150059374 secY gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 108010000605 Ribosomal Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 108091003202 SecA Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 2
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000510930 Brachyspira pilosicoli Species 0.000 description 1
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 102400001370 Galanin Human genes 0.000 description 1
- 101800002068 Galanin Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101500024092 Homo sapiens Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 1
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102000055135 Vasoactive Intestinal Peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010003205 Vasoactive Intestinal Peptide Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000002862 amidating effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 101150117416 cas2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000007813 chromatographic assay Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 1
- 101150023479 hsdS gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000007154 intracellular accumulation Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N invicorp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 VBUWHHLIZKOSMS-RIWXPGAOSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N molport-023-220-247 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CN)[C@@H](C)O)C1=CNC=N1 SLZIZIJTGAYEKK-CIJSCKBQSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 231100000817 safety factor Toxicity 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/23—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/585—Calcitonins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/635—Parathyroid hormone (parathormone); Parathyroid hormone-related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/71—Expression systems using regulatory sequences derived from the trp-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Išradimo sritis
Šis išradimas yra susijęs su genų inžinerijos būdu sukurtų ląsteliųšeimininkų, ekspresuojančių peptidinj produktą, tiesiogine peptidinio produkto ekspresija į augimo terpę. Konkrečiau, šis išradimas yra susijęs su ekspresijos vektoriais, ląstelėmis-šeimininkais ir/arba fermentacijos metodais, skirtais didele išeiga produkuoti peptidinj produktą, kurį išskiria šeimininkas j augimo terpę. Kai kuriuose įgyvendinimo variantuose šis išradimas yra susijęs su tiesiogine peptidinio produkto, C-gale turinčio gliciną, ekspresija, kuris po to yra paverčiamas į amidinį peptidą, minėto glicino vietoje turintį aminogrupę.
Su išradimu susijusio technikos lygio aprašymas
Peptidinių produktų, t.y. bet kokio junginio, kurio molekulę sudaro daug aminorūgščių, sujungtų peptidinių ryšiu, rekombinantiniam produkavimui yra sukurta daug įvairių metodų. Jeigu svetimasis peptidas yra mažas, iškyla tokia problema: šj peptidą dažnai lengvai skaldo ląsteliųšeimininkų, kurios buvo naudojamos peptidui ekspresuoti, citoplazmoje arba periplazmoje esančios endogeninės proteazės. Kitos problemos yra: pakankamos išeigos pasiekimas ir palyginus grynos formos peptido išgavimas, nepakeičiant jo tretinės struktūros (kurios pakeitimas gali nepageidaujamai sumažinti jo gebą atlikti pagrindinę funkciją). Norint įveikti mažo baltymo dydžio problemą, anksčiau dažnai būdavo ekspresuojamas dominantis peptidinis produktas, kaip sulietas baltymas su kitu (paprastai didesniu) peptidu, ir šis sulietas baltymas sukaupiamas citoplazmoje. Šis kitas peptidas gali atlikti keletą funkcijų, pavyzdžiui, apsaugoti dominanti peptidą nuo šeimininko citoplazmoje esančių proteazių. Viena tokia ekspresijos sistema yra aprašyta Ray et ai., Bio/Technology, Vol. 11, p. 64-70 (1993).
Tačiau peptidinio produkto išskyrimas, naudojant tokią technologiją, reikalauja atskėlimo nuo sulieto baltymo ir atskyrimo nuo visų paprastai šeimininko citoplazmoje esančių peptidų. Tam tikslui gali reikėti keleto kitų stadijų, kurios gali sumažinti bendrą proceso produktyvumą. Pavyzdžiui, kai anksčiau aprašytas sulietas baltymas yra sukaupiamas citoplazmoje, paprastai ląstelės turi būti surenkamos ir lizuojamos, ir skaidrinim'o stadijoje pašalinamos ląstelių skeveldros. Viso to išvengiama šiame išradime siūlomame būde, kuriame dominantis peptidinis produktas yra ekspresuojamas tiesiogiai į augimo terpę ir išgaunamas iš jos.
Pagal . ankstesnį technikos lygį dažnai reikia naudoti afininės chromatografijos stadiją sulieto baltymo gryninimui, kuris turi būti dar suskaldomas, norint atskirti dominantį peptidą nuo jo sulieto partnerio. Pavyzdžiui, aukščiau nurodytame Bio/Technology straipsnyje lašišos kalcitonino pirmtakas buvo atskeliamas nuo jo sulieto partnerio naudojant bromcianą. Šiai skaldymo stadijai reikėjo dar papildomos stadijos, kad būtų apsaugotos cisteino sulfhidrilinės grupės, esančios lašišos kalcitonino pirmtako 1- ir 7-je padėtyje. Norint gauti apsaugančias grupes cisteinams, buvo naudojamas sulfoninimas. Tai savo ruožtu pakeitė lašišos kalcitonino pirmtako tretinę struktūrą ir po to šį pirmtaką reikėjo renatūruoti (ir, žinoma, pašalinti apsaugančias grupes).
Šio išradimo peptidinis produktas yra ekspresuojamas tik su signaline seka, ir neekspresuojamas su dideliu sulietu partneriu. Šis išradimas duoda “tiesioginę ekspresiją”. Iš pradžių ekspresuojama su signaline sritimi, prijungta prie jos N-galinės dalies. Tačiau ši signalinė sritis yra atskeliama po transliacijos, peptidinio produkto sekrecijos į ląstelės periplazmą metu. Po to šis peptidinis produktas difunduoja arba yra kitaip išskiriamas iš periplazmos. į augimo terpę už ląstelės, iš kur jį galima išskirti reikiamoje tretinėje formoje.
Jis nėra prijungtas prie kokio nors suliejimo partnerio, kurio pašalinimui pirmiausia reikėtų ląstelių ūžavimo, denatūracijos arba modifikacijos, nors kai kuriuose šio išradimo įgyvendinimo variantuose peptidinio produkto cisteino sulfhidrilinių grupių apsaugojimui yra naudojamas sulfoninimas.
Kita problema, susijusi su ankstesniuose darbuose naudojamu peptidinio produkto sukaupimu ląstelės viduje, yra tai, kad sukaupiamas peptidinis produktas gali būti toksiškas ląstelei, ir tai gali apriboti sulieto baltymo, kurį galima būtų sintezuoti, kiekį. Kita šios strategijos problema yra tai, kad didesnis suliejimo partneris sudaro didesniąją išeigos dalį. Pavyzdžiui, 90 % produkavimo išeigos gali būti didesnis suliejimo partneris, ir lieka tik 10 % išeigos, priklausančios dominančiam peptidui. Dar kita šios strategijos problema yra tai, kad sulietas baltymas gali sudaryti netirpius inkliuzinius kūnelius ląstelėje, ir šių inkliuzinių kūnelių soliubilizavimas, o po to suskaldymas gali nebeduoti biologiškai aktyvių peptidų.
Ankstesniuose darbuose bandyta ekspresuoti peptidą kartu su prijungtu prie N-galo signaliniu peptidu, kad būtų nukreipiama norimo peptidinio produkto sekrecija į periplazmą (žr. EP 177343, Genentech Ine.). Buvo identifikuota keletas signalinių peptidų (žr. VVatson, M. Nucleic Acids Research, Vol. 12, Nr.13, pp: 5145-5164). Pavyzdžiui, Hsiung et al. (Biotechnology, Vol. 4, November 1986, pp: 991-995) tam tikriems peptidams nukreipti į periplazmą naudojo E. coli išorinės membranos baltymo A (OmpA) signalinį peptidą. Labai dažnai į periplazmą sekretuojami peptidai linkę joje ir pasilikti, ir mažai išsiskiria į terpę. Norint išlaisvinti pakankamą kiekį periplazminių komponentų, reikalinga kita nepageidautina stadija - išorinės membranos suardymas arba padarymas laidžia membrana. Kai kuriuose ankstesniuose darbuose buvo bandomą .išskirti peptidus iš periplazmos į augimo terpę už ląstelės, statant į pavojų išorinės membranos barjero integralumą, imant šeimininką, ekspresuojantį norimą peptidini produktą, turintį signalinį peptidą kartu su liziniu peptidiniu baltymu, kuris padaro išorinę membraną laidžia arba nesandaria (U.S. Patent No. 4,595,658). Tačiau reikia būti atsargiam su lizinio peptidinio baltymo kiekio produkavimu, kad nebūtų pavojų ląstelių integralumui ir jos nežūtų. Pagal šią metodiką dominančio peptido išgryninimas dar labiau pasunkėja.
Apart aukščiau aprašytų išorinės membranos destabilizavimo metodikų, yra netokie griežti gram-neigiamų bakterijų laidumo padidinimo būdai. Šie būdai nebūtinai sukelia išorinės membranos destrukciją, kuri gali sumažinti ląstelės gyvybingumą. Tokie būdai apima, bet neapsiriboja, katijoninių agentų (Martti Vaara, Microbiological Revievvs, Vol. 56, p. 395-411 (1992) ir glicino (Kaderbhai et ai., Biotech. Appl. Biochem., Vol. 25, p. 53-61 (1997) panaudojimą. Katijoniniai agentai membraną padaro laidžia sąveikaudami su išorinės membranos liposacaridiniu karkasu ir sukeldami jo pažeidimus. Pažeidimų ir suardymo laipsnis gali būti neletalinis arba letalinis priklausomai nuo panaudotos koncentracijos. Glicinas gali pakeisti alanino liekanas peptidoglikano peptidiniame komponente. Peptidoglikanas yra vienas iš gram-neigiamų bakterijų ląstelių išorinės sienelės struktūrinių komponentų. Auginant E. coli esant didelėms glicino koncentracijoms, padidėja glicino-alanino mainų dažnis ir gaunama defektyvi ląstelės sienelė, dėl ko padidėja laidumas,
Kitas anksčiau aprašytas norimo peptidinio produkto išskyrimą sukeliantis metodas yra produkto suliejimas su baltymu-nešikliu, kuris paprastai yra išskiriamas j terpę (hemolizinas), arba viso baltymo ekspresavimas ant išorinės membranos (pvz. ompF baltymas). Pavyzdžiui, E. coli ląstelės gali išskirti žmogaus β-endorfiną kaip sulietą baltymą, jeigu jis yra surištas su ompF baltymo fragmentu (EMBO J., Vol. 4, No. 13A, pp: 3589-3592, 1987). Tačiau norimo peptidinio produkto išskyrimas yra sunkus, kadangi jį reikia atskirti nuo peptido-nešiklio, ir metodas turi kai kuriuos (nors nevisus) trūkumus, susijusius su sulietų peptidų ekspresija citoplazmoje.
Dar kita anksčiau aprašyta strategija yra genetinis ląstelės-šeimininko pakeitimas, sukuriant naujus kamienus, kurie turi laidžią išorinę membraną, kuri santykinai negali išlaikyti jokių periplazminių peptidų arba baltymų.
Tačiau tokius kamienus gali būti sunku išlaikyti ir gali reikėti griežtų sąlygų, kurios nepalankiai veikia norimo peptido išeigą.
Raymond Wong et ai. (U.S. Patent No. 5,223,407) pasiūlė dar vieną peptidinio produkto išskyrimo strategiją, pagaminant rekombinantinj DNR konstruktą, kurį sudaro DNR, koduojanti heterologinj baltymą, sujungta skaitymo rėmelyje su DNR, koduojančia ompA signalinį peptidą, ir kontrolinė sritis, turinti tac promotorių. Tokios sistemos duodamos išeigos, kaip aprašoma, yra daug mažesnės nei gaunamos naudojant šj išradimą.
Nors ankstesniuose darbuose yra nurodoma galimybė eksportuoti baltymus iš periplazmos į terpę, toks būdas gali duoti nesveikas ląsteles, kurias bus sunku išauginti iki norimų didelių tankių, ir tai nepalankiai veiks produkto išeigą.
Šiame išradime stengiamasi pagaminti peptidą didele išeiga, panaudojant produktyvų ekspresijos vektorių, pateikti didelę išeigą duodančias kultivavimo metodikas ir kitokius patobulinimus, kurie leidžia gauti didelę dominančio išskirto peptido išgavimo iš augimo terpės išeigą, nesuardant ląstelės membranos integralumo.
Išradimo santrauka
Taigi, šio išradimo tikslas yra turėti peptidinį produktą, gera išeiga sukauptą terpėje, kurioje auginamos peptidą produkuojančios ląstelėsšeimininkai. Tai yra naudinga, nes terpėje beveik nėra daugumos ląstelinių peptidų teršalų.
Kitas šio išradimo tikslas yra pateikti pagerintą fermentacijos būdą peptidinio produkto, kurį ekspresuoja genų inžinerijos būdu sukurtos ląstelės-šeimininkai, išeigos padidinimui.
Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti genų inžinerijos būdu sukurtas ląsteles-šeimininkus, kurios yra ypatingai tinkamos naujiems šio išradimo vektoriams ekspresuoti.
Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti ląsteles-šeimininkus, kurios yra ypatingai tinkamos' lašišos kalcitonino pirmtakui produkuoti, nepriklausomai nuo ekspresijos vektoriaus, naudojamo lašišos kalcitonino ekspresijai.
Dar kitas šio išradimo tikslas yra pateikti pagerintus amidintų peptidų produkavimo būdus, naudojant peptidus-pirmtakus, turinčius C-galinius glicinus: šie pirmtakai po tiesioginės jų ekspresijos j augimo terpę pagal šį išradimą, yra amidinami.
Viename šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas ekspresijos vektorius, kurį sudaro: (a) koduojanti sritis iš nukleorūgščių, koduojančių peptidinį produktą, sujungta nukleorūgščių skaitymo rėmelyje 3’, koduojančiame signalinį peptidą; ir (b) kontrolinė sritis, funkciškai sujungta su koduojančia sritimi; ši kontrolinė sritis turi daug promotorių ir bent vieną ribosomų prisirišimo vietą, o bent vienas iš minėtų promotorių yra tac. Pateikiamos šiuo vektoriumi transformuotos arba transfekuotos ląstelėsšeimininkai bei tiesioginės peptidinio produkto ekspresijos metodai, kultivuojant tokias ląsteles-šeimininkus.
Kitame šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamos ląstelėsšeimininkai, transformuoti ekspresijos vektoriumi, kuris turi lašišos kalcitonino pirmtako arba su kalcitoninu susijusio peptidinio pirmtako ekspresijos geną; šios ląstelės-šeimininkai yra E. coli BLR kamienas; ir jų kultivavimo būdai, gaunant minėtą pirmtaką terpėje.
Dar kitame šio išradimo jgyvendinimo variante pateikiamas amidinto peptidinio produkto produkavimo būdas, kuriame yra produkuojamas pirmtakas, turintis C-gale gliciną, naudojant bet kurj iš čia aprašytų vektorių, šeimininkų arba fermentacijos būdų; o po to minėtas glicinas paverčiamas aminogrupę, gaunant peptidinj amidą.
Dar kitame šio išradimo jgyvendinimo variante pateikiamas tiesioginis peptidinio produkto ekspresijos j augimo terpę būdas, kuris susideda iš tokių stadijų; (a) genų inžinerijos būdu gautų ląstelių-šeimininkų, kurios ekspresuoja minėtą peptidinj produktą kartu su signaliniu peptidu kultivavimo minėtoje terpėje sąlygomis, kuriomis minėtų ląstelės-šeiminkų augimas yra kontroliuojamas taip, kad jis būtų 0,05-0,20 padvigubėjimų per valandą; ir tam tikrą minėto kontroliuojamo augimo laikotarpį yra pridėta induktoriaus; ir (b) minėto peptidinio produkto išgavimo iš augimo terpės po viduląstelinio signalinio peptido atskėlimo.
Dar kitame šio išradimo jgyvendinimo variante tiesioginės ekspresijos. . fermentacijos eigoje j terpę yra pridedama glicino, norint padidinti išorinės membranos laidumą ir peptidinio produkto išskyrimą.
Trumpas figūrų aprašymas
Fig. 1A ir 1B parodyta pSCT-016B vektoriaus (1A), kuris yra naudojamas konstruojant pSCT-018D vektorių (1B), kuris savo ruožtu yra naudojamas konstruojant pSCT-025 vektorių, konstrukcijos scheminė diagrama.
Fig. 2 parodyta pSCT-019 vektoriaus konstrukcijos scheminė diagrama. LAC-OMPASCTGLY kasetė, panaudota konstruojant pSCT-025 vektorių, buvo gauta polimerazinės grandinės reakcijos (PGR) būdu, amplifikuojant dalį pSCT-019.
Fig. 3 parodyta pSCT-025 vektoriaus, kuris buvo panaudotas konstruojant pSCT-029A, pSCT-025A, pSCT-037 ir pSCT-038 vektorius, konstrukcijos scheminė diagrama.
Fig. 4 parodyta pSCT-029A vektoriaus, kuris buvo panaudotas konstruojant pSCT-038 ir pSCT-034 vektorius, konstrukcijos scheminė diagrama. Be to, pSCT-029A buvo panaudotas E. coli BLR transformuoti ir naujam digeniniam UGL 165 klonui produkuoti.
Fig. 5 parodyta pSCT-E vektoriaus, kuris buvo panaudotas konstruojant pSCT-EY vektorių, konstrukcijos scheminė diagrama.
Fig. 6 parodyta pRLA4 vektoriaus, kuris buvo panaudotas konstruojant pSEC-EY vektorių, konstrukcijos scheminė diagrama.
Fig. 7 parodyta pSEC-EY vektoriaus, kuris buvo panaudotas konstruojant pSCT-037 ir pSCT-038 vektorius, konstrukcijos scheminė diagrama.
Fig. 8 parodyta pSCT-037 ir pSCT-038 vektorių konstrukcijos scheminė diagrama. pSCT-037 buvo panaudotas E. coli BLR transformuoti ir monogeniniam UGL 702 klonui produkuoti. pSCT-038 buvo panaudotas E. coli BLR transformuoti ir naujam digeniniam UGL 703 klonui produkuoti. pSCT-038 turi dvi OmpA-sCTgly operono kopijas (koduojančias OmpA signalą kartu su lašišos kalcitonino pirmtaku), ir tai padaro jį nauju digeniniu ekspresijos vektoriumi. Jame taip pat yra kopijos genų, koduojančių du antrinius struktūrinius baltymus, kurie stiprina translokaciją per vidinę membraną j periplazminę sritį. Toliau duodamas sutrumpinimų, naudojamų šiam fig.8 vektoriui aprašyti, sąrašas:
TAC - triptofano E ir lac operatoriaus sekų hibridinis promotorius;
LAC P/O - sritis, turinti β-galaktozidazės geno lac promotorių ir lac operatorių;
LAC-IO - genas, koduojantis lac represorių, kuris susiriša su lac promotoriaus ir tac promotoriaus operatorine sritimi. iPTG konkuruoja su lac represoriumi ir inhibuoja lac represoriaus susirišimą su tac promotoriaus ir lac promotoriaus operatorine sritimi, ir taip indukuoja šiuos promotorius;
TRP P/O - triptofano E geno promotoriaus operatorine sritis;
OMPA-SCTGLY - geno suliejimas, turintis išorinės membranos baltymo A geno sekrecijos signalinę seką ir glicinu pailginto lašišos kalcitonino (lašišos kalcitonino pirmtako) kodavimo seką;
SEC-E (taip pat žinomas kaip “PrlG”) - genas, koduojantis E. coli sekrecijos faktorių E. Jis susijungia su prIA (taip pat žinomas kaip secY) arba prlA-4, susidarant sec kelio, kuriuo signalinę seką turintys baltymai yra translokuojami iš citoplazmos j periplazmą, vidinės membranos transiokacijos daliai;
PRLA-4 - prIA geno mutantinė alelė;
PRNB T1-T2 - tandeminiai transkripcijos terminatoriai 1 ir 2 iš E. coli ribosominio baltymo geno; ir
KAN-R - atsparumo kanamicinui genas.
Fig.9 parodyta pSCT-034 vektoriaus konstrukcijos, kuris buvo panaudotas E. coli BLR transformuoti ir -trigeniniam UGL 168 klonui produkuoti, scheminė diagrama.
Fig.10 parodytas ląstelių augimo ir UGL 165 klono (E. coli BLR plazmidė pSCT029A) sCTgly produkcijos priklausomybė nuo laiko po tipiškos 1 litro fermentacijos esant induktoriui. Ląstelių augimas buvo matuojamas pagal šviesos sugertį esant 600 nm bangos ilgiui. sCTgly produkcija išreikšta mg sCTgly, išskirto j litrą inkubavimo terpės. Nuliniu laiku pažymėtas laikas, kada j kultivavimo terpę, kurioje buvo inkubuojamos šio išradimo ląstelės-šeimininkai, pirmą kartą pridėta induktoriaus. Fig. 10 rodo, kad didžiausia UGL 165 duodama sCTgly produkcija yra tarp 20 ir 25,5 vai.
po to, kai j kultivavimo terpę, kurioje buvo inkubuojamos šio išradimo ląstelės-šeimininkai, pirmą kartą buvo pridėta induktoriaus.
Fig.11 parodytas ląstelių augimo ir UGL 703 klono (E coli BLR plazmidė pSCT 038) sCTgly produkcijos priklausomybė nuo laiko po tipiškos 1 litro fermentacijos esant induktoriui. Ląstelių augimas buvo matuojamas pagal šviesos sugertj esant 600 nm bangos ilgiui. sCTgly produkcija išreikšta mg sCTgly, išskirto j litrą inkubavimo terpės. Nuliniu laiku pažymėtas laikas, kada j kultivavimo terpę, kurioje buvo inkubuojamos šio išradimo ląstelėsšeimininkai, pirmą kartą pridėta induktoriaus. Fig. 10 rodo, kad didžiausia UGL 703 duodama sCTgly produkcija yra tarp 20 ir 26 vai. po to, kai j kultivavimo terpę pirmą kartą buvo pridėta induktoriaus.
Fig. 12 duotas UGL 172 klono (E coli BLR plazmidė pSCT 025), UGL 165 klono ir UGL 168 klono (E coli BLR plazmidė pSCT 034) ląstelių augimo, išmatuoto pagal šviesos sugertj esant 600 nm bangos ilgiui, tipiškoje 1 litro fermentacijoje esant induktoriui priklausomybės nuo laiko palyginimas. Fig.
nerodo žymaus skirtumo tarp UGL 165 ir UGL 172 ląstelių augimo greičių, o UGL 168 greitis šiame konkrečiame eksperimente yra šiek tiek mažesnis.
Fig.13 duotas UGL 172 klono, UGL 165 klono ir UGL 168 klono sCTgly produkcijos, išreištos mg sCTgly išskirto j litrą inkubavimo terpės tipiškoje 1 litro fermentacijoje po inkubavimo esant induktoriui, priklausomybės nuo laiko palyginimas. Fig. 13 rodo, kad digeninis UGL 165 klonas geriausiai tinka sCTgly produkavimui, o trigeninis klonas yra antras pagal gerumą, lyginant su monogeniniu UGL 172 klonu.
Fig.14A ir 14B duotas UGL 165 klono sCTgly produkcijos (14A) ir ląstelių augimo (14B) po tipiškos 1 litro fermentacijos esant induktoriui priklausomybės nuo laiko palyginimas, j paduodamą orą pridėjus arba nepridėjus deguonies. Ląstelių augimas buvo matuojamas gramais drėgnų ląstelių masės litre inkubacijos terpės. sCTgly produkcija išreišta mg sCTgly, išskirto j litrą inkubavimo terpės. Fig.14A ir 14B rodo, kad deguonies pridėjimas j fermentacijos terpę nėra kritiškas UGL 165 ląstelių augimui, bet yra labai svarbus didinant sCTgly produkciją.
Fig.15A ir 15B duotas E. coli WA837 ir BLR kamienų, kur kiekvienas kamienas ekspresuoja pSCT-029A vektorių (atitinkamai UGL164 ir UGL 165) ląstelių augimo (15A) ir sCTgly produkcijos (15B) po tipiškos 1 litro fermentacijos esant induktoriui priklausomybės nuo laiko palyginimas. Ląstelių augimas buvo matuojamas pagal šviesos sugert] esant 600 nm bangos ilgiui. sCTgly produkcija išreišta mg sCTgly, išskirto j litrą inkubavimo terpės. Fig.15A ir 15B rodo, kad E. coli BLR kamienas yra tinkamesnis sCTgly produkavimui nei WA835 E. coli kamienas.
Fig.16 duotas E. coli WA837, BLR, BL21 ir B834 kamienų, kur kiekvienas kamienas ekspresuoja pSCT-029A vektorių (atitinkamai UGL164, UGL 165, UGL167 ir UGL166) sCTgiy produkcijos po tipiškos 1 litro fermentacijos esant induktoriui palyginimas. sCTgly produkcija išreišta mg sCTgiy, išskirto į litrą inkubavimo terpės. Fig.16 rodo, kad E. coli BLR kamienas yra tinkamesnis sCTgly produkavimui nei bet kuris iš WA835, BL21 ir B834 E. coli kamienų.
Fig.17 duotas UGL 165 (pSCT-029A BLR), UGL 168 (pSCT-034 BLR), UGL 172 (pSCT-025 BLR), UGL 702 (pSCT-037 BLR) ir UGL 703 (pSCT-038 BLR) klonų geriausios sCTgly produkcijos, gautos iš skirtingų eksperimentų po 1 litro fermentacijos esant induktoriui palyginimas. sCTgly produkcija išreišta mg sCTgly, išskirto j litrą inkubavimo terpės. Fig.17 rodo, kad digeniniai UGL 703 ir UGL 165 klonai geriau tinka sCTgly produkavimui nei monogeniniai UGL 172 ir UGL 702 klonai ir trigeninis UGL 168 klonas. Fig. 17 taip pat rodo, kad digeninis UGL 703 klonas, kuris ekspresuoja sekrecijos faktorius, yra tinkamesnis sCTgly produkavimui nei digeninis UGL 165 klonas, kuris neekspresuoja sekrecijos faktorių.
Išsamus išradimo aprašymas
Šis išradimas leidžia gauti peptidinio produkto išeigas, viršijančias 100 mg litrui terpės. Tai pasiekiama naudojant naujus ekspresijos vektorius, naujus šeimininkus (kaip transformuotus, transfekuotus arba naudojamus pagal šį išradimą), naujus fermentacijos būdus arba derinant du arba daugiau aukščiau minėtų faktorių.
Tinkamiausiu ekspresijos vektorių apžvalga
Viename šio išradimo įgyvendinimo variante pateikiamas ekspresijos vektorius, kuriame yra koduojanti sritis ir kontrolinė sritis. Koduojančią sritį sudaro nukleorūgštys dominančiam peptidiniam produktui, sujungtos skaitymo rėmelyje pagal kryptį nuo nukleorūgščių, koduojančių signalinį peptidą. Kontrolinė sritis yra prijungta funkcionaliai prie koduojančios srities ir turi daugybę promotorių ir bent vieną ribosomų prisirišimo vietą, kur bent vienas iš promotorių yra pasirinktas iš grupės, kurią sudaro tac ir lac.
Pageidautina, kad vektorius turėtų daug transkripcijos kasečių, sudėliotų viena paskui kitą, ir kiekvienoje kasetėje būtų kontrolinė sritis ir koduojanti sritis pagal šį išradimą. Manoma, kad toks digeninis arba multigeninis vektorius turėtų duoti geresnę ekspresiją nei dicistroninis arba multicistroninis ekspresijos vektorius. Tai yra netikėtas pagerinimas, lyginant su dicistronine arba multicistronine ekspresija, kurios atrodo nebuvo pasiūlyta ankstesniuose darbuose.
Šiame vektoriuje taip pat gali būti nukleorūgštys, koduojančios represorinį peptidą, kuris nuslopina operatorius, susijusius su vienu arba daugiau promotorių kontrolinėje srityje., transkripcijos baigmės sritis, selektyvios žymės sritis ir/arba sritis, koduojant bent vieną sekreciją stiprinantį peptidą. Kitu atveju, kai kuriuose jgyvendinimo variantuose nukleorūgštys, koduojančios represorinį peptidą ir sekreciją stiprinantį peptidą, gali būti atskirame’ vektoriuje, kuris kartu ekspresuojamas toje pačioje ląstelėje-šeimininke, kaip ir peptidinį produktą ekspresuojantis vektorius.
Sukonstruotų ekspresijos vektorių konkretūs pavyzdžiai ir tokių ekspresijos vektorių konstravimo metodai yra duodami toliau. Pradiniais vektoriais tinkamiausiems šio išradimo vektoriams gauti gali būti naudojami daugelis prekybinių vektorių. Kai kurios iš šio išradimo vektorių pageidautinų sričių gali būti jau pradiniame vektoriuje, taigi modifikacijų, reikalingų šio išradimo vektoriui gauti, skaičius yra palyginus nedidelis. Tinkamais pradiniais vektoriais yra (bet jais neapsiribojama) pSP72 ir pKK233-2.
Tikimasi, kad naujieji šio išradimo vektoriai turi vektoriams būdingus pranašumus, ir kad šie nelaukti pranašumai išliks net ir tuo atveju, jei vektoriai bus naudojami ląstelėse-šeimininkuose, kurios yra ne tos pačios nei čia nurodytos, kaip ypatingai tinkamos ir nepriklausomai nuo to, ar naudojamas čia aprašytas pagerintas fermentacijos būdas.
Be to, kai kuriuose įgyvendinimo variantuose yra identifikuotos konkrečios ląstelės-šeimininkai kaip ypatingai tinkančios peptidų, kaip antai lašišos kalcitonino pirmtako ir su kalcitonino genu susijusio peptido pirmtako, ekspresijai. Tikimasi, kad čia identifikuotų konkrečių ląstelių specialaus panaudojimo duodami pranašumai išlieka nepriklausomai nuo to, ar vektorius yra vienas iš naujųjų čia aprašytų vektorių, ir nuo to, ar yra naudojamas čia aprašytas fermentacijos būdas. Kitaip tariant, manoma, kad šios ląstelės-šeimininkai duoda žymius nelauktus pranašumus net ir naudojant anksčiau aprašytą fermentaciją arba anksčiau aprašytus vektorius.
Tikimasi, kad naujieji fermentacijos būdai duos padidintą išeigą dėl būdingų privalumų, kuriuos duoda šis fermentacijos būdas. Manoma, kad šie privalumai išliks nepriklausomai nuo to, ar yra naudojamos čia aprašytos tinkamiausios ląstelės-šeimininkai ir/arba naujieji vektoriai.
Nepaisant to, kas pasakyta aukščiau, .viename iš tinkamiausių šio išradimo įgyvendinimo variantų vienu metu yra naudojami šio išradimo pagerinti ekspresijos vektoriai, transformuoti j konkrečias identifikuotas šio išradimo ląsteles-šeimininkus ir ekspresuojama, naudojant tinkamiausius šiame išradime aprašytus būdus; Kai yra naudojami šie visi trys išradimai.. derinyje, tikimasi, kad galima bus pasiekti žymų išeigos ir produkto išgavimo padidėjimą, lyginant su ankstesniu technikos lygiu.
Kontrolinė sritis
Kontrolinė sritis yra funkciškai sujungta su koduojančia sritimi ir apima daugybę promotorių ir bent vieną ribosomų surišimo vietą, kur bent vienas iš promotorių yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš lac ir tac. Netikėtai buvo rasta, kad aukščiau nurodytas promotorių derinys vienoje kontrolinėje srityje labai padidina koduojančios srities produkuojamo peptidinio produkto išeigą (smulkiau aprašyta toliau). Buvo tikėtasi, kad du tokie promotoriai atliks padidintą funkciją, bet nebus sumarinio arba sinergetinio efekto. Pareiškėjų atlikti eksperimentai netikėtai parodė, kad naudojant apibrėžtyje nurodytą promotorių derinį gaunamas sinergetinis efektas. Šioje srityje yra žinomi ir kiti promotoriai, ir pagal šį išradimą jie gali būti naudojami derinyje su tac arba lac promotoriais. Tokiais promotoriais yra (bet jais neapsiribojama) Ipp, ara B, trpE, gal K.
Geriausia, kai kontrolinėje srityje yra tiksliai du promotoriai. Jeigu vienas iš promotorių yra tac, geriausia, kad šis tac promotorius būtų į 5' pusę nuo kito kontrolinės srities promotoriaus. Jeigu vienas iš promotorių yra lac, geriausia, kad šis lac promotorius būtų į 3’ pusę nuo kito kontrolinės srities promotoriaus. Viename išradimo įgyvendinimo variante yra ir tac, ir lac promotriai; geriausia, kai lac promotorius yra į 3’ pusę nuo tac promotoriaus.
Koduojanti sritis
Koduojanti sritis apima nukleorūgštis, koduojančias dominantį peptidinį produktą, sujungtas skaitymo rėmelyje pagal kryptį nuo nukleorūgščių, koduojančių signalinį peptidą, ir koduojanti sritis koduoja peptidą, apimantį atitinkamai nuo signalo N-galo iki C-galo ir peptidinį produktą. Pagal teoriją nelaikant, kad jį reikia prijungti, tikimasi, kad signalinis peptidas gali šiek tiek apsaugoti peptidinį produktą nuo proteolitinio skaldymo bei dalyvauti jo sekrecijoje į periplazmą.
Daugelio peptidų signalinės sekos yra žinomos ir gali būti naudojamos šiame išradime. Tokiomis sekomis yra gerai žinomų ląstelių-šeimininkų išorinių membranų baltymų signalinės sekos ir bet kokios sekos, kurios gali perkelti peptidinį produktą į periplazmą ir kurias po transliacijos atskelia šeimininkas dėl translokacijos. Tinkami signaliniai peptidai yra (bet jais neapsiribojama) Omp A, pel B, Omp C, Omp F, Omp T, β-1 a, Pho A, Pho S ir Staph A.
Pageidaujama, kad peptidinis produktas būtų pakankamai mažas, todėl nesant šio išradimo, pagal ankstesnę technologiją būtų reikalingas suliejimo partneris. Paprastai peptidinis produktas turi molekulinę masę mažesnę nei 10 KDa. Dar geriau, kai peptidinis produktas C-gaie turi gliciną ir yra naudojamas kaip pirmtakas fermentinėje amidinimo reakcijoje, paverčiančioje C-galinj gliciną j aminogrupę, tokiu būdu gaunant amidintą peptidą. Smulkiau tokia konversija yra aprašyta toliau. Daug biologiškai svarbių peptidinių hormonų ir neuroperdaviklių yra šio tipo amidinti peptidai. Pavyzdžiui, koduojančios srities koduotas peptidinis produktas gali būti lašišos kalcitonino pirmtakas arba su kalcitonino genu susijęs peptidinis pirmtakas; abu šie peptidai C-gale turi gliciną ir abu gali būti fermentiškai amidinami iki subrendusio lašišos kalcitonino arba subrendusio su kalcitonino genu susijusio peptido. Kiti amidinti peptidai, kurie gali būti produkuojami pagal šj išradimą, yra (bet jais neapsiribojama) augimo hormoną išlaisvinantis faktorius, vazoaktyvus žarnyno peptidas ir galaninas.
Šioje srityje yra gerai žinomi ir kiti amidinti peptidai.
Pagal šj išradimą taip pat gali būti produkuojami paratiroidinio hormono analogai. Pavyzdžiui, peptidas, turintis paratiroidinio hormono pirmas 34 aminorūgštis, gali atlikti funkciją, panašią j paties paratiroidinio hormono funkciją, kaip ir 34 aminorūgščių analogo amidinta versija.
Pastarasis gali būti produkuojamas, ekspresuojant pagal vieną arba daugiau čia aprašytų ekspresijos sistemų ir būdų paratiroidinio hormono pirmąsias 34 aminorūgštis, po kurių yra prijungtas giicinas-35. Po to čia aprašyto fermentinio amidinimo būdu šis glicinas gali būti paverčiamas į aminogrupę.
Nepaisant to, kad čia aprašytų tiesioginių ekspresijos sistemų tinkamiausuose jgyvendinimo variantuose produkuojami peptidai C-gale turi., gliciną, manoma, kad naudojant čia aprašytus vektorius, šeimininkus ir/arba fermentacijos metodikas, bus gautos bet kokio peptido geros išeigos ir bus lengva ji išgauti.
Tinkamiausiu šio išradimo vektorių kiti galimi aspektai arba kiti vektoriai, kuriuos galima ekspresuoti tame pačiame šeimininke kaip išradimo vektorius
Represorius
Esant reikalui, tinkamiausias šio išradimo vektorius gali turėti nukleorūgštis, koduojančias represorinj peptidą, galintį slopinti ekspresiją, kurią kontroliuoja bent vienas iš promotorių. Tačiau kitu atveju nukleorūgštys, koduojančios represorinj peptidą, gali būti atskirame vektoriuje ląstelėješeimininke su šio išradimo vektoriumi. Šioje srityje daugeliui operatorių yra žinomi atitinkami represoriai. Geriau, kai koduojančios represorių nukleorūgštys koduoja lac represorių tinkamiausiuose šio išradimo įgyvendinimo variantuose, kadagi jis slopina lac operatorių, kuris yra ir tac, ir lac promotoriuose, o bent vienas iš jų visada yra tinkamiausiuose šio išradimo vektoriuose.
Selekcijos žymė
Pageidautina, kad šio išradimo vektoriuje būtų kuris nors iš didelio skaičiaus selekcinių žymių genų (pvz. genas, koduojantis atsparumą kanamicinui), Tai duotų galimybę atrinkti atitinkamas specifines ląstelesšeimininkus, kurios yra efektyviai transformuotos arba transfekuotos naujaisiais šio išradimo vektoriais.
Sekreciją stiprinantis peptidas
Šio išradimo vektoriuje gali būti nukleorūgštys, koduojančios bent vieną sekreciją stiprinantį peptidą. Kitu atveju, sekreciją stiprinantį peptidą koduojančios nukleorūgštys gali būti atskirame vektoriuje, kurios ekspresuojasi tose pačiose ląstelėse-šeimininkuose kaip ir peptidinj produktą koduojantis vektorius. Geriausia, kai sekreciją stiprinantis peptidas yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš SecY (prIA) arba prlA-4. Pažymima, kad SecY ir prIA yra vienodi, abu terminai šioje srityje yra naudojami kaip sinonimai. prlA-4 yra žinoma prIA modifikacija ir atlieka panašią funkciją. Kitas sekreciją stiprinantis peptidas yra SecA, taip pat žinomas kaip “prIG”; šis terminas yra naudojamas kaip “SecA” sinonimas. Geriausia, kai koduojama keletas sekreciją skatinančių peptidų, bent vienam iš jų esant SecE, o kitą pasirenkant iš grupės, susidedančios iš SecY (prIA) ir prlA-4. Manoma, kad abu šie peptidai sąveikauja padėdami perkelti peptidinį produktą iš citoplazmos j periplazmą. Pagal teoriją nelaikant, kad juos reikia prijungti, šie sekreciją stiprinantys peptidai, apart jų sekreciją skatinančių funkcijų, gali padėti apsaugoti peptidinį produktą nuo citoplazminių proteazių poveikio.
Lastelė-šeimininkas
Šiame išradime taip pat pateikiama ląstelė-šeimininkas, transformuota arba transfekuota bet kuriuo iš šio išradimo vektorių. Geriau, kai ląstelėšeimininkas yra bakterinė ląstelė. Dar geriau, kai ląstelė-šeimininkas yra gram-neigiama bakterinė ląstelė. Dar geriau, kai ląstelė-šeimininkas yra E. coli ląstelė. Dar geriau, kai E. coli yra BLR, BL21 arba WA837 kamienas. Geriausia, kai E. coli yra BLR kamienas. Visų geriausia, kai ląstelėšeimininkas ekspresuoja dar ir bent vieną sekreciją stiprinantį peptidą.
Šiame išradime taip pat pateikiama ląstelė-šeimininkas, transformuota ekspresijos vektoriumi, kuriame yra genas lašišos kalcitonino pirmtakui arba su kalcitonino genu susijusio peptido pirmtakui ekspresuoti; ši ląstelėšeimininkas yra E. coli BLR kamienas. Tikimasi, kad šių dviejų peptidų ekspresija BLR bus ypatingai efektyvi net ir tuo atveju, jeigu ekspresijai bus naudojami anksčiau žinomi vektoriai. Kitaip tariant, nemanoma, kad gerai šių peptidų ekspresijai BLR šeimininke gauti reikia naudoti čia aprašytus naujuosius vektorius.
Heterologinio peptido produkavimo būdas
Išradime pateikiamos naujos fermentavimo sąlygos ląstelėms^. šeimininkams išauginti iki labai didelių ląstelių tankių kultivavimo sąlygomis, kurios suteikia galimybę peptidiniam produktui difunduoti arba išsiskirti į augimo terpę didelėmis išeigomis.
Naujajai fermentacijai tinkamos ląstelės-šeimininkai yra (bet jomis neapsiribojama) aukščiau aptartos ląstelės-šeimininkai ir/arba ląstelėsšeimininkai, transformuotos arba transfekuotos vienu arba daugiau aukščiau aptartų naujųjų ekspresijos vektorių. Gali būti naudojamos ir kitos genų inžinerijos būdu gautos ląstelės-šeimininkai, kurios ekspresuoja peptidinj produktą su signaline sritimi. Ląstelės yra patalpinamos į fermentatorių, kuriame pageidautina, kad būtų atitinkamos priemonės orui arba kitoms dujoms, anglies šaltiniui ir kitiems terpės komponentams tiekti ir priemonės promotoriaus indukcijai. Taip pat pageidautinos deguonies kiekio, ląstelių tankio, pH ir pan. kontrolės priemonės.
Pareiškėjai rado, kad peptidinio produkto, tiesiogiai ekspresuojamo i augimo terpę, žymiai padidinta išeiga yra gaunama kruopščiai kontroliuojant vidutinį ląstelių augino greitį, kurio kritinės ribos yra tarp 0,05 ir 0,20 padvigubėjimų. Pageidautina, kad šis kontroliuojamas augimas prasidėtų ankstyvoje kultivavimo lag fazėje. Dar svarbiau išlaikyti vidutini ląstelių augimo greitį fermentacijos laikotarpiu (t.y. čia aprašyto kontroliuojamo ląstelių augimo laikotarpiu) tarp 0,10 ir 0,15 padvigubėjimų per valandą, geriausia 0,13 padvigubėjimų per valandą. Augimo greitis gali būti kontroliuojamas reguliuojant bet kurį iš toliau duodamame skyrelyje, pavadintame “sCTgiy produkavimas (fermentacija)” minėtų parametrų pagal formulę, rišančią tiekimo greitį “Q” su įvairiais kitais parametrais. Pareiškėjai nustatė, kad anglies šaltinio tiekimo fermentuojamos ląstelėms greičio keitimas yra geriausias būdas palaikyti augimo greitį kritinėse ribose. Norint palaikyti palyginti pastovų augimo greitį, anglies šaltinio kiekio tiekimas i fermentatorių turi būti didinamas proporcin-gai ląstelių skaičiaus didėjimui.
Pareiškėjai taip pat atrado, kad daug geresnę išeigą galima gauti pateikiant induktorių šiame kontroliuojamo augimo fermentacijos laikotarpyje. Kaip ir anglies šaltinio atveju, reikiamų induktoriaus kiekių padavimas reiškia tiekimo greičio didėjimą proporcingai ląstelių skaičiaus didėjimui. Kadangi pageidautina didinti ir anglies šaltinio, ir induktoriaus tiekimą su ląstelių augimu susijusiu būdu, pareiškėjai nustatė, kad geriausia yra sumaišyti maistą ir induktorių kartu, ir jų abiejų mišinį tiekti reikiamu greičiu ląstelių augimui kontroliuoti (anglies šaltiniu), tuo pačiu metu palaikant nepertraukiamą induktoriaus, kurio santykis išlieka pastovus anglies šaltinio atžvilgiu, tiekimą. Tačiau suprantama, kad anglies šaltinį ir induktorių galima tiekti atskirai. Tačiau net ir tokiu atveju, jeigu yra naudojamas cheminis induktorius, kurio dideli kiekiai gali būti toksiški ląstelėms, pageidautina, kad induktoriaus ir anglies šaltinis būtų pridedami kiekvieną kultivavimo valandą tokiais kiekiais, kad tam tikrą valandą pridedamo induktoriaus masės santykis su tą pačią valandą pridedamo anglies šaltinio mase nesikeistų daugiau nei 50 %, skaičiuojant nuo induktoriaus, pridėto per visą fermentacijos procesą (kontroliuojamo augimo laikotarpį) kiekio santykio su anglies šaltinio, pridėto per visą fermentacijos procesą, kiekiu. Šis 50 % kitimas yra matuojamas nuo mažiausio dviejų lyginamų santykių santykio. Pavyzdžiui, jei per visą fermentaciją anglies šaltinio santykis su induktoriumi yra 2:1, geriausia, kai šis santykis bet kurią duotą valandą bus ne didesnis nei 3:1 ir ne mažesnis nei 1,333:1. Augimo metu taip pat galima indukuoti vieną arba daugiau promotorių kitokiais būdais, kaip antai kultivavimo temperatūros pakeitimu arba tam tikro junginio, arba maistinės medžiagos koncentracijos pakeitimu.
Jeigu kaip ląstelių augimo kontroliavimo būdas yra naudojamas išorinis anglies šaltinio tiekimas, yra naudinga palaukti, kol pradžioje esantys terpėje (prieš išorinį anglies tiekimą) anglies šaltiniai išsieikvos iki tokio lygio, kada ląstelių augimo jau nebegalima ilgiau palaikyti be išorinio anglies padavimo. Tai užtikris išorinio tiekimo tiesioginę kontrolę ląstelių augimui, žymiai netrukdant pradiniam (netiekiamam) anglies šaltiniui, j fermentacijos terpę pageidautina nepertraukiamai tiekti deguonies šaltinį, matuojant ištirpusio deguonies kiekį. Aukštyn kylanti deguonies kiekio smailė rodo žymų ląstelių augimo sumažėjimą, kas savo ruožtu gali rodyti pradinio anglies šaltinio išsieikvojimą ir reikšti, kad jau laikas pradėti išorinį padavimą.
Netikėtai buvo rasta, kad peptidinio produkto išeiga didėja, didėjant fermentacijos terpės prisotinimui'deguonimi. Tai yra teisinga ir tuo atveju, kai. ląstelių augimui palaikyti pakanka mažesnių prisotinimo kiekių. Taigi, per visą fermentacijos procesą pageidautina, kad į fermentacijos terpę būtų tiekiamas deguonis arba deguonimi praturtintas šaltinis, ir būtų pasiekiamas bent 20 %, geriau bent 50 % prisotinimas deguonimi. Čia naudojamas terminas “prisotinimas deguonimi” reiškia deguonies procentus fermentacijos terpėje, kai terpė yra visiškai prisotinta paprastu oru. Kitaip tariant, fermentacijos terpė prisotinta oru turi 100 % “prisotinimą deguonimi. Nors ir sunku palaikyti daug didesnį nei 100 %, t.y. daugiau nei deguonies kiekis ore, fermentacijos terpės prisotinimą deguonimi, tai yra galima ir netgi pageidautina, nes didesni deguonies kiekiai duoda geresnes išeigas. Tai gali būti pasiekiama, paduodant į terpę dujas, turinčias didesnį nei oras deguonies kiekį.
Žymus išeigos padidėjimas gali būti pasiekiamas, palaikant ne mažesnį nei 70 %, ypatingai ne mažesnį nei 80 %, fermentacijos terpės prisotinimą deguonimi. Tokius lygius yra palyginti nesunku palaikyti.
Prisotinimo deguonimi padidinimui gali padėti greitesnis maišymas. Kai fermentacijos terpė pradeda tirštėti, pasidaro sunkiau palaikyti prisotinimą deguonimi, ir todėl bent jau šioje stadijoje rekomenduojama tiekti dujas, turinčias didesnį, nei oras, deguonies kiekį. Pareiškėjai nustatė, kad geram prisotinimui deguonimi palaikyti iki palyginti vėlyvo fermentacijos laikotarpio gali pakakti paprasto oro. Vėlesniame fermentacijos laikotarpyje pareiškėjai tiekiamą orą papildė 50 % deguonies arba tiekė 100 % deguonį. Pageidautina ląsteles-šeimininkus kultivuoti 20-32 vai. (prasidėjus kontroliuojamam augimui), geriau 22-29 vai., geriausia apie 24-27 vai.
Pageidautina ląsteles-šeimininkus ląsteles inkubuoti 20-35 °C temperatūroje, geriau 28-32 °C temperatūroje, geriausia 29,5-30,5 °C temperatūroje. Keliose pareiškėjų atliktose fermentacijose optimali temperatūra buvo 30 °C.
Pageidautina, kad kultivavimo terpės pH būtų 6,0-7,5 intervale, geriau 6,6-7,0 intervale, ypatingai gerai 6,78-6,83 (pvz. 6,8) intervale.
Tinkamiausiuose įgyvendinimo variantuose fermentacija vykdoma naudojant šeimininkus, transformuotus ekspresijos vektoriumi, turinčiu kontrolinę sritį, į kurią įeina ir tac, ir lac promotorius, ir koduojančią sritį, apimančią signalinį peptidą koduojančius nukleotidus, esančius prieš kryptį nuo lašišos kalcitonino pirmtaką koduojančių nukleotidų. Geriausia, kai tokiame ekspresijos vektoriuje yra keletas, ypatingai dvi transkripcijos kasetės, esančios viena už kitos. Čia naudojamas terminas “transkripcijos kasetės, esančios viena už kitos reiškia, kad po kontrolinės ir koduojančios srities yra bent viena papildoma kontrolinė sritis ir viena papildoma koduojanti sritis, koduojanti tą patį peptidą kaip ir pirmoji koduojanti sritis. Tai reikia skirti nuo dicistroninės ekspresijos, kurioje viena kontrolinė sritis kontroliuoja dviejų koduojančios srities kopijų ekspresiją. Toks apibūdinimas leidžia pakeitimus koduojančioje srityje, kurie neturi ryšio su peptidiniu produktu, pavyzdžiui, nukieotidų, koduojančių skirtingą signalinį peptidą, nei tas, kurį koduoja pirmoji transkripcijos kasetė, įterpimą antroje transkripcijos kasetėje.
Šiam tikslui yra žinomi įvairūs anglies šaltiniai. Buvo rasta, kad veiksmingas yra glicerolis. Tinkamiausiais indukcijos būdais yra cheminių induktorių, tokių kaip IPTG ir/arba laktozės pridėjimas. Gali būti naudojami ir kiti būdai, kaip antai temperatūros arba maitinimo medžiagų kiekių pakeitimas. Taip pat gali būti naudojamos kitos indukavimo metodikos, tinkančios kontrolinės srities operatoriui arba promotoriui (arba vienam iš keleto naudojamų promotorių, kai kontrolinėje srityje jų atsiranda daugiau nei vienas).
Būdinga, kad peptidinio produkto produkcija smarkiai sumažėja maždaug tuo pačiu metu, kai ląstelių augimas fermentacijos terpėje tampa nebeišlaikomas aukščiau aptarto pageidautino augimo greičio ribose. Tada fermentacija stabdoma, anglies šaltinio ir induktoriaus tiekimas ir deguonies srautas nutraukiamas. Pageidautina kultūrą greitai atšaldyti, kad būtų nuslopinamas proteazių aktyvumas ir sumažinama peptidinio produkto degradacija. Taip pat pageidautina pakeisti pH iki tokio lygio, kuris iš esmės sumažintų proteolitinį aktyvumą. Jeigu produkuojamas lašišos kalcitoninas naudojant tinkamiausius šio išradimo vektorius ir ląsteles-šeimininkus, proteolitinis aktyvumas sumažėja mažinant pH. Geriausia parūgštinimą. vykdyti kartu su terpės atšaldymu1. Tinkamiausios pH ribos smulkiau bus aptariamos toliau. Degradacijai esant skirtingiems pH išmatuoti gali būti naudojamas tas pats testas, kaip ir fermentacijos produktui matuoti, tokiu būdu nustatant duoto peptido optimalią pH reikšmę ir jo priemaišas.
Heterologinio peptido išgavimas
Toliau šiame išradime pateikiamas peptidinio produkto išgavimo būdas, kuris susideda iš šeimininko ląstelių atskyrimo nuo kultūrinės terpės ir po to kultūrinės terpės chromatografavimo pagal bent vieną chromatogafijos tipą, pasirinktą iš gel-filtracijos, jonų mainų (geriausia katijonų mainų, jei peptidas yra kalcitoninas), atvirkštinių fazių, afininės ir hidrofobinės sąveikos chromatografijos. Jeigu peptidas turi cisteino liekanas, norint apsaugoti nuo agregacijos ir taip padidinti monomerinio peptido išeigą, prieš gryninimo stadijas arba jų metu turi būti atliekamas S-sulfoninimas. Pageidautina naudoti tris chromatografijos stadijas tokia tvarka: jonų mainų chromatografija, atvirkštinių fazių chromatografija ir kita jonų mainų chromatografija.
1 arba galima parūgštinti pašalinus bakterines ląsteles.
Kai pasibaigia fermentacija, norint sumažinti proteolitini aktyvumą galima pakeisti kultūrinės terpės pH. Testas, naudojamas produkto produkcijai matuoti, taip pat gali būti naudojamas produkto degradacijai nustatyti ir geriausiam pH stabilumo atžvilgiu nustatyti. Jeigu yra produkuojamas šio išradimo lašišos kalcitonino pirmtakas, pageidautinas pH yra 2,5-4,0, ypatingai 3,0-3,5, intervale. Manoma, kad toks pH reikšmių intervalas padeda sulaikyti lašišos kalcitonino pirmtaką katijonų mainų kolonėlėse, ir tokiu būdu čia aprašytos tinkamiausios gryninimo metodikos metu gauti geresnį išgryninimą.
Taip pat, jeigu pageidaujama, po fermentacijos galima sumažinti terpės temperatūrą iki žemesnės už 10 °C temperatūros, geriau tarp 3 °C ir 5 °C, geriausia 4 °C. Manoma, kad tai sumažina nepageidaujamą proteazinį aktyvumą.
Šiame išradime taip pat pateikiamas amidinto peptidinio produkto produkavimo būdas, susidedantis iš tokių stadijų: bet kurio šio išradimo iąstelių-šeimininkų, kurios ekspresuoja peptidinj produktą, C-gale turintį gliciną, kultivavimas augimo terpėje; minėto peptidinio produkto išgavimas iš minėtos augimo terpės: minėto peptidinio produkto amidinimas, veikiant minėtą peptidinj produktą deguonimi ir redukcijos agentu, esant peptidilglicin-a-amidinančios monooksigenazės arba peptidilglicin-ahidroksilinančios monooksigenazės. Jeigu anksčiau nebuvo naudojama peptidilglicin-a-amidinanti monooksigenazė ir jeigu reakcijos mišinys dar nėra bazinis, tada didinamas reakcijos mišinio pH, kol jis tampa bazinis. Po to amidintas peptidas gali būti išgaunamas iš reakcijos mišinio, geriausia naudojant toliau duodamame 6 pavyzdyje aprašytą gryninimo metodiką.
Pageidautina ląsteles-šeimininkus kultivuoti augimo terpėje esant induktoriaus, palaikant vidutinį ląstelių augimo greitį kultivavimo metu tarp 0,05 ir 0,20 padvigubėjimų per valandą.
EKSPERIMENTŲ DETALĖS pSCT-037 ir pSCT-038 klonavimo strategija pSCT-038 ir pSCT-037 konstravimas yra sudarytas iš aštuonių dalių, sueinančių į tarpinių vektorių, reikalingų galutinei norimai ekspresijos plazmidei sukurti, sukonstravimą. Visi genai ir fragmentai, kurie buvo panaudoti arba sukonstruoti šiam projektui ir nepateko į aprašymą yra išvardinti 1 lentelėje.
I dalis. pSCT-018D konstravimas
TAC promotoriaus kasetė (1 lentelė) buvo įklonuota į pGEM11ZF+ (1 lentelė) kaip Hind lll-Bam Hl fragmentas, gaunant pGEM11ZF+TAC. pelBsCTgly cas2 genas (1 lentelė) įjungiamas pagal kryptį nuo tac promotoriaus (pGEM11ZF+TAC) Į Bam Hl vietą, gaunant ekspresijos vektorių pSCT-013B.
Iš pSCT-13B, naudojant Hind III ir Eco Rl, išpjaunamas tac-pelBsCTgly operonas. Po to šis fragmentas kartu su Hind lll-Pst I adapteriu įjungiamas j.. pSP72 (1 lentelė), gaunant pSCT-015B. Po to į pSCT-015B Pst I kirpimo vietą įjungiamas atsparumo kanamicinui genas, gaunant pSCT-016B. βLaktamazės geno (atsparumas ampicilinui) 5’ koduojanti sritis pašalinama perkerpant vektorių Pvu II ir Fsp I, o po to vėl sujungiama, gaunant pSCT017B. Po to iš pSP72 T1-T2 (1 lentelė) iškerpamas T1-T2 transkripcijos terminatorius ir įjungiamas j PCCT-017B naudojant Sal I ir Bgl II kirpimo vietas, gaunant pSCT-018B. Po to į PSCT-018B Bgl II - Eco RI kirpimo vietas įjungiamas LAC-IQ genas (1 lentelė), turintis Bam Hl ir Eco RI kirpimo vietas, gaunant pSCT-018D (žr. fig. 1A ir 1B).
II dalis. pSCT-019 konstravimas
Trigubu sujungimu j pSP72 Pst I ir Eco RI kirpimo vietas įterpiamas lac P/O fragmentas(1 lentelė) su Pst I ir Hind III kirpimo vietomis ir Hind lll-Eco RI fragmentas iš pSCT-013B (turintis tac-pelBsCTgly). Kaip aprašyta pSCT-017B konstravime, įterpiamas Kan-R genas, ir iš pSCT-015A pašalinamas βlaktamazės genas, gaunant pSCT-016A ir pSCT-017A. Iš pSP72-OMPA iškerpamas Ipp-lac-ompAsCTgly (1 lentelė) Pst I -Acc I fragmentas (taip pat yra sCTgly 5’ koduojančios srities 17 bazių porų) ir įjungiamas į pSCT-017A suderinamas kirpimo vietas, gaunant pSCT-019 (žr. fig. 2).
III dalis. pSCT-025 konstravimas
PGR amplifikuoto operono lac-ompAsCTgly (1 lentelė) Bam Hl fragmentas įjungiamas j pSCT-018D Bam Hl kirpimo vietą, pakeičiant pelBsCTgly geną, gaunant pSCT-023(-). Ženklas (-) rieškia, kad intarpas buvo įterptas atvirkščia kryptimi tac promotoriaus atžvilgiu. Po to, naudojant Bam Hl ir Sal I, iš pSCT-023(-) iškerpamas lac-ompAsCTgly operonas ir įjungiamas j pSCT-017B suderinamas kirpimo vietas, gaunant pSCT-017 DELTA. Iš pSCT-017 DELTA iškerpami, didesnis Bgl Ι-Bgl II fragmentas, turintis atsparumo kanamicinui geną, tac-lac promotorius ir ompAsCTgly ir įjungiamas į pSCT-018D Bgl l-Bam Hl kirpimo vietas, gaunant pSCT-025 (žr. fig. 3).
IV dalis. pSCT-029A konstravimas
RRNB T1-T2-20 PGR produktas (1 lentelė), turintis Xho I ir Eco RI kirpimo vietas, įjungiamas j pSCT-025 Sal I - Eco RI kirpimo vietas, gaunant pSCT-025A. Iš pSCT-025 iškirptas Hind lll-Sac I fragmentas, turintis tac-lacompAsCTgly RRNB T1-T2 terminatorių genų kasetę, įjungiamas j pSpSP72 suderinamas kirpimo vietas, gaunant pCPM-01. pCMP-01A vektorius buvo sukonstruotas, panaudojant tą patį metodą, kaip aprašyta pSCT-025A atveju. pSCT-025A ir pCPM-01 A plazmidės skiriasi nuo pSCT-025 ir pSCT-01 plazmidžių restrikcijos vietų, esančių prieš kryptį ir pagal kryptį nuo RRNB T1T2 transkripcijos terminatoriaus, tipais. Xho l-Eco Rl fragmentas, turintis taclac-ompAsCTgly RRNB T1-T2 terminatorių genų kasetę, iškerpamas iš pCPM-01 A ir įjungiamas į pSCT-025A Sal l-Eco Rl vietas, gaunant digeninį ekspresijos vektorių pSCT-029A (fig.4). pSCT-029A sukūrimui panaudoti metodai gali būti pakartojami, gaunant papildomus poligeninius ekspresijos vektorius, kaip parodyta toliau pSCT034 konstrukcijos atveju.
V dalis. pSEC-E konstravimas pCPM-01 vektorius karpomas Pst I ir Xba I, iškerpant iac P/O, kuris po to įjungiamas į pSP72 suderinamas kirpimo vietas. PGR būdu amplifikuotas secE genas (1 lentelė), turintis Xba I ir Bam Hl klonavimo vietas, įjungiamas i ompAsCTgly T1-T2 cistroninio klonavimo vektoriaus (1 lentelė) suderinamas vietas, gaunant pCM-SECE. Iš pCM-SECE iškerpami secE ir T1-T2 terminatoriai kaip Xba l-Eco Rl fragmentas ir kartu su Xba Ι-Sal I fragmentu, turinčiu Iac P/O (iškirptas iš pSP72-lac), įjungiami j pSP72 Sal l-Eco Rl kirpimo vietas, gaunant pSEC-E (žr. fig. 5).
VI dalis. pPRLA-4 (prlA-4 yra prIA mutantinė alelė arba secY genas) konstravimas
Naudojant Bam Hl ir Sma I, iškerpama ompAsCTgly T1-T2 cistroninio vektoriaus T1-T2 terminatoriaus sritis, kuri po to įjungiama j pSP72 Pvu II ir Bam Hl kirpimo vietas, gaunant PRLA4-INT tarpinį klonavimo vektorių. Iš pSP72-l_AC su Xba I ir Sac I iškerpamas Iac P/O ir kartu su prlA-4 fragmentu (1 lentelė), turinčiu Xba I ir Bam Hl kirpimo vietas, įjungiamas j PRL4-INT Sac I - Bam Hl kirpimo vietas, gaunant pPRLA-4 (žr. fig.6).
VII dalis. pSEC-EY konstravimas
Sintetinis oligonukleotidinis fragmentas, turintis trpE P/O seką (1 lentelė) jklonuojamas j pCPM-01A Xho l-Xba I kirpimo vietas, gaunant pCPM25
08. Iš pRLA-4 su Xba I ir Xho I iškerpamos prlA-4 ir T1-T2 sekos ir įjungiamos su Sal l-Eco Rl fragmentu iš pSEC-E, turinčiu lac-secE-T1-T2 operoną, j pCPM-08 Xba I ir Eco Rl kirpimo vietas, gaunant pSEC-EY (žr. fig.7).
VIII dalis. pSCT-037 ir pSCT-038 konstravimas
Iš pSEC-EY su Xho I ir Bgl II iškerpama secE ir prlA-4 koduojanti sritis. Po to gautas fragmentas įjungiamas j pSCT-025A ir pSCT-029A Sal Ι-Bgl II kirpimo vietas, gaunant atitinkamai pSCT-037 ir pSCT-038 (žr. fig.8).
pSCT-034 konstravimas pSCT-034 yra trigeninė ekspresijos plazmidė, turinti Tac-LacompAsCTgly RRNB T1-T2 transkripcijos kasetės tris kopijas. Šis vektorius (žr. fig.9) sukonstruojamas įterpiant j pSCT-029A Sal I ir Eco Rl kirpimo vietas aprašytą kasetę iš pSPM-01A, pridedant trečiąją ekspresijos kasetės kopiją. Konstravimo metodas yra identiškas pSCT-029A konstravimo iš pCPM-01A ir pSCT-025A metodui. Vėl sukuriamos 3’ Sal I ir Eco Rl kirpimo vietos gaunant vietas, kurių reikia, kad būtų galima pridėti daugiau kasečių kopijų.
lentelė
| Klonavimo fragmentas | Komponento tipas | Kilmė arba matrica |
| pGEM 11 ZF(+) | Plazmidė | Promega |
| pGEX1N | Plazmidė | Pharmacia Biosciences |
| pSP 72 | Plazmidė | Promega |
| Tac promotorius | tac promotoriusDNR blokas | Pharmacia Biosciences |
| pelB-sTCgly-cas2* | PGR amplifikuotas genas | pelB-sTCgly genas, surinktas iš sintetinių oligonukleotidų |
| atsparumo kanamicinui genas | genų blokas | Pharmacia Biosciences |
| RRNBT1-T2 | PGR fragmentas | ribosominio proteino geno T1 ir T2 transkripcijos terminatoriai iš pKK 233-2 |
| pSP72 T1-T2 | subklonas | jklonuotas iš aukščiau nurodyto PGR fragmento j pSP72 |
| lac represorius (LAC-IQ) | PGR amplifikuotas genas | pGEX 1-N plazmidė |
| lac promotorius/ | PGR amplifikuotas | PGEM11ZF+ |
| operatorius (P/O) | fragmentasas | |
| Ipp-lac-ompAsCTgly (nepilnas) | PGR amplifikuotas produktas (3' PGR pradmuo turintis 17 pirmųjų sCTgly nukleotidų | pIN IIIA |
| pSP 72-ompA | aukščiau nurodyto fragmento subklonas | jklonuotas iš aukščiau nurodyto PGR fragmento j pSP72 |
| lac-ompAsCTgly | PGR amplifikuotas operonas | pSCT-019 |
| RRNST1-T2-02 | PGR amplifikuotas produktas | pSCT-025 |
| OMPASCTGLY T1-T2 CISTRONAS | ompAsCTgly PGS amplifikuotas produktas jklonuotas j pSP72 T1-T2 | pSCT-025 matrica |
| SEC E | PGR amplifikuotas genas | E. coli WA 837 genominė DNR |
| PRLA-4 | PGR amplifikuotas genas | E. coli prIA 4 genas iš pRLA41 + + vektoriaus |
| TRP P/O | iš sintetinių oligonukleotidų surinktas genas | E. coli triptofano E promotoriaus/operatoriaus seka iš literatūros |
* pelB - pektatliazės B geno signalinė seka iš Erwinia carotovora.
+ + pRLA41 vektorių pateikė Tom Silhavy iš Princetono universiteto. prlA-4 mutantinė alelė gali turėti savybes, kurios suteikia galimybę lengviau translokuoti heterologinius peptidus ir baltymus. Tačiau gamtinis prl1A (secY) genas taip pat turėtų funkcionuoti.
E. coli BLR transformacija PSCT-029A arba pSCT-038
Sukonstravus pSCT-029A arba pSCT-038 plazmides, t.y. sujungus įvairius DNR fragmentus, būtina panaudoti galutinį sujungimo mišinį E. coli šeimininko kamienui, skirtam plazmides padauginimui ir būsimai baltymo ekspresijai, transformuoti. Norint atlikti šią transformaciją, reikia E. coli ląsteles padaryti imliomis DNR priėmimui. Imliosios ląstelės gali būti paruošiamos įvairiais būdais, tokiais kaip apdorojimas CaCI2 ir elektroporacija. Tinkamiausių ląstelių linijų (UGL 165 ir UGL 703) paruošimui mes panaudojome abu būdus iš eilės pagal toliau duodamas metodikas.
I. Pirminė transformacija į E. coli K-12 (BB4) šeimininką
Ši pirmoji transformacija yra neesminė, tačiau ji yra pageidautina, nes E. coli BB4 K-12 šeimininkas pasižymi dideliu efektyvumu transformacijos, kuri duoda daugybę transformantų ir didelę tikimybę identifikuoti įvairius pageidaujamus klonus.
A. Imliųjų BB4 ląstelių paruošimas, panaudojant apdorojimą CaCI?
BB4 genotipas... LE392.32 [F' lacQZAMI5proAB Tn 10 (TetR)]
1. Paruošiama per naktį prisotinta ląstelių kultūra.
2. Pagaminama šviežių ląstelių kultūra, inokuliuojant 100 ml terpės iki 0,5 % (t/t) ir auginama iki A6Oo nm = 0,02-0,03.
3. Kultūra auginama iki Α600 nm = 0,15-0,3, apytikriai 3 padvigubėjimai.
4. Ląstelės palaikomos 10 min. leduose.
5. Atskiriamos ląstelės nuo kultivavimo terpės centrifuguojant (5K aps/min x 10 min).
6. Nusodintos ląstelės vėl suspenduojamos 0,5 tūrio ledu atšaldyto 0,1 M CaCI2, palaikoma leduose 30 min., po to ląstelės nusodinamos aukščiau aprašytu būdu.
7. Nusodintos ląstelės vėl suspenduojamos 0,1 tūrio 0,1 M CaCI2; prieš naudojant palaikoma leduose 1 vai.
B. Transformavimo metodika.
1. j 100 μΙ imliųjų ląstelių, pagamintų kaip aprašyta aukščiau, pridedama 1-2 μΙ sujungimo mišinio, kuriame turi būti tiksliai 2-10 ng plazmidinio vektoriaus DNR.
2. Mišinys laikomas leduose 30 min.
3. Mišinys paveikiamas šiluminiu šoku, padedant jj Į 37 °C temperatūros šildymo bloką arba vandens vonią.
4. J mišinį pridedama 1 ml sušildytos kultivavimo terpės, ir mišinys inkubuojamas 37 °C temperatūroje 30-60 min.
5. Tam tikras kiekis transformavimo mišinio paskleidžiamas ant tinkamos kietos terpės, turinčios reikiamą selektyvų antibiotiką, ir lėkštelės inkubuojamos 18-24 vai., kol atsiranda kolonijos.
II. Antrinė transformacija
Transformantai identifikuojami įvairiais būdais. Pasirenkama keletas klonų perkėlimui j antrąjį šeimininką (E. coli B šeimininko kamienas, BLR). BLR yra šeimininko kamienas, pasirinktas fermentacijai ir baltymo ekspresijai.
BLR genotipas yra F' ompT hsdSB (rB'.mB') gal dcm A(srl-recA)· 306::Tn10(TcR). E. coli ląstelės priims DNR, palaikius jas elektriniame lauke kontroliuojamomis ir tiksliai apibrėžtomis sąlygomis. E. coli B šeimininko kamienai yra lengviau transformuojami sveika plazmidė, lyginant su sujungimo mišiniu, ir geriau priima svetimą DNR, kai padaromi imliais panaudojant elektroporaciją, o ne apdorojimą CaCI2.
A. E. coli BLR imliųjų ląstelių paruošimas tolimesnei elektroporaciiai
1. Paruošiama per naktį prisotinta ląstelių kultūra.
2. Paruošiama šviežių ląstelių kultūra, inokuliuojant 100 ml terpės iki 1,0 % (t/t) ir auginama iki Aeoo nm = 0,3-0,5.
3. Pašaldžius kultūrą leduose 15 min., ląstelės nucentrifuguojamos.
4. Nuopilas nupilamas, pašalinant kiek galima daugiau terpės. Ląstelės vėl suspenduojamos iš viso 100 ml ledu atšaldyto 10 % (m/t) vandeninio glicerolio (glicerolis turi būti labai geros kokybės). Suspenduotos ląstelės tuoj pat vėl nucentrifuguojamos.
5. Ląstelės vėl suspenduojamos 50 ml ledu atšaldyto 10 % (m/t) glicerolio. Vėl nucentrifuguojama.
6. Ląstelės vėl suspenduojamos 25 ml ledu atšaldyto 10 % (m/t) glicerolio. Vėl nucentrifuguojama.
7. Pakartojama 6 stadija.
8. Ląstelės vėl suspenduojamos galutiniame 2 ml tūryje ledu atšaldyto 10 % (m/t) glicerolio. Galutinė ląstelių koncentracija turi būti 1-3 x 101° ląstelių/ml. Ląsteles galima laikyti iki 1 metų -80 °C temperatūroje.
B. Transformavimas elektroforaciios metodu
1. Sterilios kiuvetės ir baltosios kameros rėmeliai palaikomi 10 min. leduose. Leduose taip pat palaikoma keletas polipropileninių mėgintuvėlių.
2. Sumaišoma 40 μΙ ląstelių suspensijos su 1-2 μΙ plazmidinę DNR turinčio tirpalo Tris/EDTA, kurio apytikrė koncentracija yra 100 pg/μΙ. (Šis DNR mišinys turi turėti kaip galima mažiau druskų, kad būtų galima išvengti įrangos kibirkščiavimo). Tirpalas gerai sumaišomas ir palaikomas leduose 0,5-1,0 min.
3. įjungiamas Gene-Pulser prietaisas, nustatant 25 pF. Nustatoma 200 omų pulsacijas kontroliuojančio įtaiso varža. Gene-Pulser prietaise nustatoma 2,5 Kv 0,2 cm kiuvetėms arba 1,5-1,8 Kv, jei naudojamos 1,0 cm kiuvetės. Ląstelių ir DNR mišinys perpilamas į šaltą elektroporacijos kiuvetę ir suspensija sukratoma j kiuvetės dugną, pašalinant visus oro burbuliukus. Kiuvetė patalpinama j šaldomos apsauginės kameros rėmelius ir stumiami rėmeliai į kamerą tol, kol kiuvetė atsiduria tarp kontaktų kameros apačioje.
4. Kiuvetė vieną kartą paveikiama srovės pulsacija, esant aukščiau nurodytiems prietaiso parametrams.
5. Tuoj pat j kiuvetę pridedama 1 ml SOC (20 g triptono, 5 g mielių ekstrakto, 0,5 g NaCI, 1 I H2O ir 20 mM gliukozės) buferinės terpės ir ląstelės vėl suspenduojamos.
6. Suspensija perpilama į sterilius 17x100 mm polipropileninius mėgintuvėlius ir 37 °C temperatūroje inkubuojama 1 vai.
7. Elektroporuotu mišiniu padengiamos selektyvios terpės lėkštelės.
sCTglv produkavimas (fermentacija)
Fermentacijos vonios terpė pagaminama naudojant 2 lentelėje išvardintus komponentus. Ši fermentacija inokuliuojama vėlyvosios log fazės kultūra, išauginta inokuliavimo terpėje (2 lentelė). Inokuliavimo tūris nustatomas pagal inokulo kiekį (ląstelių skaičių), kurio reikia, kad pradinio fermentacijos mišinio A6oo nm būtų tarp 0,015 ir 0,24. pH, DO2 ir temperatūros parametrai, reikalingi fermentacijos vykdymui, duoti 3 lentelėje. Fermentacijos palaikymo stadija pradedama tada, kai išsenka partijos terpėje esantis glicerolis (Glicerolio išsekimą galima nustatyti pagal ištirpusio deguonies kreivės smailę ir/arba pagal glicerolio testą). Padavimo greitis nustatomas toks, kad būtų palaikomas pastovus ląstelių dalijimosi greitis, nustatytas pagal ląstelių masę (sausų ląstelių masė) glicerolio išsekimo metu.
Papildymo komponentai yra duoti’2 lentelėje. Padavimo greitis remiasi tokia formule:
(V) x (Mu) x (dcw) x (e Mu+t) Q = (Yx/s x [Feed]) r
kurioje:
Mu = augimo greitis (padvigubėjimai per valandą), dwc = sausų ląstelių masė (gramais litre terpės) padavimo pradžioje, nustatomas empyriškai atskiriems E. coli kamienams, t = laikas (valandos),
Yx/s = šeimininko glicerolio sunaudojimo konstanta (E. coli V/Λ 837 yra 0,327; panaši ir BLR),
V = fermentacijos tūris (litrai), [feed] = gramai glicerolio litre paduodamos terpės (visuose čia duotuose pavyzdžiuose buvo 629 gramai),
Q = glicerolio padavimo greitis (litrai per valandą).
Indukcijos procesas vykdomas naudojant gradientinę indukciją, susietą su padavimo greičiu, laikui bėgant didinant induktoriaus (IPTG) kiekj, atitinkantį nustatytą augimo greitį.
Fermentacijos eiga kontroliuojama matuojant sugertį esant 600 nm bangos ilgiui, drėgnų ląstelių masę g/l, apart terpės mėginių CEX chromatografinės analizės sCTgly buvimui ir jo koncentracijai (mg/l) nustatyti.
Norint padidinti išorinės membranos laidumą, j fermentacijos terpę galima pridėti glicino. Glicino galima pridėti j vonios terpę arba j papildymo mišinį. Geriau pridėti glicino j papildymo mišinį taip, kad glicino koncentracija fermentacijos kultūroje didėtų priklausomai nuo ląstelių augimo greičio. ' Optimali glicino koncentracija turėtų būti 0,1-1 g 100-ui ml besibaigiant fermentacijai. Praktiškai pridedamo j papildymo mišinį glicino kiekis yra apskaičiuojamas taip, kad fermentacijos gale būtų pasiekiama norima glicino koncentracija. Konkretus pridedamo glicino kiekis priklauso nuo fermentacijos trukmės (po indukavimo) ir norimos galutinės glicino koncentracijos. Mūsų naudoti būdai: j fermentacijos papildymą pridedama 24 g/l glicino, kuris praėjus 26 vai po indukcijos, duoda 5 g/l glicino koncentraciją. Mes nustatėme, kad glicino pridėjimas j papildymo mišinį yra efektyvesnis už glicino pridėjimą j vonios terpę.
lentelė - Terpės komponentu sąrašas
Inokuliavimo terpė
| Komponentai | Kiekis g/i |
| (NH4)2SO4 | 7,00 |
| kh2po4 | 2,00 |
| MgSO4.7H2O | 1,00 |
| CaCI2 | 0,25 |
| FeSO4.7H2O | 0,05 |
| natrio citratas | 1,50 |
| N-Z Case+ | 5,00 |
| Hy Yeast 412 | 2,00 |
| L-metioninas | 4,50 |
| Kanamicinas | 0,05 |
| Glicerolis | 18,00 |
Vonios terpė
| Komponentai | Kiekis g/' |
| (NH4)2SO4 | 14.80 |
| kh2po4 | 4,40 |
| MgSO4.7H2O | 2,10 |
| CaCI2 | 0,53 |
| FeSO4.7H2O | 0,11 |
| natrio citratas | 2,20 |
| N-Z Case+ | 10,60 |
| Hy Yeast 412 | 3,10 |
| L-metioninas | 4,50 |
| Kanamicinas | 0,05 |
| Glicerolis | 2,50 |
3apildymo terpė
| Komponentai | Kiekis g/i |
| Glicerolis | 629 |
| IPTG | 2,80 |
lentelė - Fermentacijos parametrams nustatytos sąlygos
| Parametras | geriausias | geresnis | geras |
| pH Temp. °C DO (prisotinimas deguonimi) Mu reikšmė Fermentacijos laikas (vai. po indukcijos) | 6,78-6,85 29,5-30,5 >80 % 0,12-0,14 24-27 | 6,50-7,00 28,0-32,0 >70 % 0,10-0,16 22-29 | 6,00-7,5 20,0-35,0 >50 % 0,05-0,20 20-32 |
sCTgly išskyrimas
Kondicionuota terpė apdorojama atskiriant ląsteles nuo terpės, panaudojus arba tangentinio srauto filtravimą arba centrifugavimą; terpė surenkama, o ląstelės atmetamos. Išsiskyręs sCTgiy stabilizuojamas terpėje pridedant 2,0 N HCI iki galutinio pH 3,0. Glicinu pailgintas lašišos kalcitoninas yra stabilus ilgesnį laiką esant pH 3,0. Atskyrus ląsteles ir stabilizavus pH, peptidas gryninamas katijonų mainų ir atvirkštinių fazių chromatografijos metodais. Nors atvirkštinių fazių chromatografija ir po jos vykdoma katijonų mainų chromatografija gali duoti gerą išgryninimą, pageidautina, kad prieš atvirkštinių fazių skysčių chromatografiją būtų vykdoma pradinė katijonų mainų stadija. Gryninant didelius kiekius, tai sumažina į atvirkštinių fazių chromatografiją paduodamą tūrį, tokiu būdu sumažinant aplinkosaugos ir saugumo faktorius, iškylančius dėl būtinumo naudoti didelius kiekius organinių tirpiklių, tokių kaip acetonitrilas.
Kita pageidautina modifikacija yra lašišos kalcitonino peptidinio pirmtako cisteino liekanų S-sulfoninimas prieš gryninimą arba jo metu, norint pagerinti monomerinio peptido išeigas.
Klonu aprašymas
Monogeninis UGL 172 klonas yra E. coli BLR kamienas, turintis pSCT025A vektorių, kuriame yra viena transkripcijos kasetė (monogeninė), koduojanti lašišos kalcitoniną su glicinu C-gale (sCTgly)2. Digeninis UGL 165 klonas yra E. coli BLR kamienas, turintis pSCT-029A vektorių, kuriame yra dvi viena po kitos einančios kasetės (digeninis), ir kiekviena jų koduoja lašišos kalcitoniną su glicinu C-gale (sCTgly). Trigeninis UGL 168 klonas yra E. coli BLR kamienas, turintis pSCT-034 vektorių, kuriame yra trys viena po kitos einančios kasetės (trigeninis), ir kiekviena jų koduoja lašišos kalcitoniną su glicinu C-gale (sCTgly). Monogeninis UGL 702 klonas yra E. coli BLR kamienas, turintis pSCT-037 vektorių, kuriame yra 1 transkripcijos kasetė ir sekrecijos faktoriaus genai. Digeninis UGL 703 klonas yra E. coli BLR kamienas, turintis pSCT-038 vektorių, kuriame yra 2 viena po kitos einančios kasetės ir sekrecijos faktoriaus genai.
pavyzdys -1 I apimties UGL 165 fermentacija
UGL 165 klono fermentacija buvo vykdoma taip, kaip aprašyta skyrelyje “Eksperimentų detalės”. Fermentacijos parametrai ir rezultatai susumuoti 4 lentelėje. Trumpai tariant, UGL 165 klono ląstelės buvo auginamos inokuliavimo terpėje ir panaudotos užsėti fermentacijos talpai, turinčiai 1 I terpės, gaunant 2 Tinkamiausioje transkripcijos kasetėje yra dvigubas tac/lac promotorius, po kurio eina ribosomų surišimo vieta, o po jos sekos OmpA signaliniam peptidui ir po jų sekos sCTgly, po kurių eina transkripcijos terminacijos sekos rrnBT1-T2.
pradinį Αθοο nm = 0,06. Ląstelės buvo auginamos 6,25 vai., kol terpėje išseko glicerolis. Po to buvo pradėta fermentacijos vonios papildymo stadija ir be pertraukos buvo tiekiama papildoma terpė 25,5 vai. Sąlygos nuliniame laiko taške (papildymo ir indukcijos pradžia) buvo tokios: prisotinimas deguonimi 94 %, temperatūra 30 °C ir pH 6,8. Sąlygos fermentacijos gale (25,5 vai) buvo tokios: prisotinimas deguonimi 40 %, temperatūra 31 °C ir pH 6,8. Be to, fermentacijos pabaigoje sugertis esant 600 nm bangos ilgiui buvo 113,3, o drėgnų ląstelių masė g/l buvo 168 g. Fermentacijos pabaigoje taip pat buvo išmatuota sCTgly produkcija, ir ji yra 222 mg/litre terpės (žr. fig.10 ir 4 lentelę).
lentelė - UGL 165 fermentacijos santrauka
| Laikas PO papildymo, vai. | Aeoo nm | Drėgnų ląstelių masė, g/l | sCTgly, mg/l** | Papildymo tūris, pridėta ml | [IPTG] μΜ | Maišy- mas, aps./min. |
| -6,25 | 0,06 | - | - | - | - | 500 |
| 0*** | 11,1 | - | - | - | - | 1300 |
| 15 | 51,7 | 83,3 | netirta | 44,1 | 528 | 1000 |
| 17 | 48,7 | 92,3 | netirta | 51,3 | 614 | 1200 |
| 19 | 53,6 | 100,5 | 38 | 78,2 | 948 | 1300 |
| 21 | 67,6 | 117,3 | 77 | 104,8 | 1256 | 1300 |
| 22 | 86,7 | 130,9 | 111 | 120,4 | 1442 | 1350 |
| 23 | 92,6 | 140,0 | 104 | 138,2 | 1654 | 1350 |
| 24 | 106,5 | 153,7 | 156 | 158,4 | 1896 | 1350 |
| 25 | 108,5 | 162,8 | 183 | 181,2 | 2174 | 1400 |
| 25,5 | 113,3 | 168 | 222 | 194,1 | 2324 | 1400 |
** sCTgly nustatytas naudojant CEX-HPLC testą, kaip aprašyta 4 pavyzdyje. .*** per naktį ir 2 vai nuo papildymo pradžios maišyta esant 1450 aps/min.
pavyzdys - 1 I apimties UGL 703 fermentacija
Rekombinantinis E. coli UGL 703 buvo deponuotas Amerikos tipinių kultūrų kolekcijoje (ATCC) su žyme ATCC 98395 pagal Budapešto sutarti dėl mikroorganizmų patentiniams tikslams deponavimo. UGL 703 klono fermentacija buvo vykdoma taip, kaip aprašyta skyrelyje “Eksperimentų detalės. Fermentacijos parametrai ir rezultatai susumuoti 5 lentelėje. Trumpai tariant, UGL 703 klonas buvo auginamas inokuliavimo terpėje ir panaudotas užsėti fermentacijos talpai, turinčiai 1 I terpės, gaunant pradini
A6oo nm = 0,06 (geriausia 0,06-0,12). Ląstelės buvo auginamos 6,25 vai.(geriausias intervalas yra 6,0-7,0 vai), kol terpėje išseko glicerolis. Po to buvo pradėta fermentacijos vonios papildymo stadija ir be pertraukos buvo tiekiama papildoma terpė 26 vai. Sąlygos nuliniame laiko taške (papildymo ir indukcijos pradžia) buvo tokios; prisotinimas deguonimi 95 %, temperatūra 30 °C ir pH 6,8. Sąlygos fermentacijos gale (26 vai) buvo tokios: prisotinimas deguonimi 80 %, temperatūra 31 °C ir pH 6,8. Be to, fermentacijos pabaigoje sugertis esant 600 nm bangos ilgiui buvo 80,9, o drėgnų ląstelių masė g/l buvo 129,1 g. Fermentacijos pabaigoje taip pat buvo išmatuota sCTgly produkcija, ir ji yra 284 mg/litre terpės (žr. fig.11 ir 5 lentelę).
lentelė - UGL 703 fermentacijos santrauka
| Laikas PO papildymo, vai. | Αβοο | Drėgnų ląstelių masė, g/l | sCTgly, mg/l** | Papildymo tūris, pridėta ml | [IPTG] μΜ | Maišy- mas, aps./min. |
| -6,25 | 0,06 | - | - | - | - | 500 |
| 0*** | 8,1 | - | - | - | - | 1300 |
| 15,5 | 22,6 | 7,3 | ~18 | 47,5 | 570 | 1150 |
| 19 | 36,5 | 83,1 | 25 | 72,9 | 948 | 1250 |
| 21 | 53,5 | 94,2 | 53 | 104,8 | 1256 | 1350 |
| 22 | 61,3 | 100,8 | 58 | 120,4 | 1442 | 1450 |
| 23 | 59,7 | 106,0 | 69 | 138,2 | 1654 | 1550 |
| 24 | 73,3 | 119,0 | 83 | 158,4 | 1898 | 1580 |
| 25 | 74,1 | 119,1 | 203 | 181,1 | 2174 | 1620 |
| 26 | 80,9 | 129,1 | 284 | 207,6 | 2487 | 1620 |
** sCTgly nustatytas naudojant CEX-HPLC:testą, kaip aprašyta 4 pavyzdyje.
Išvados
Kiti eksperimentai buvo atlikti panašiomis bendromis sąlygomis, naudojant UGL 172, UGL 168 ir UGL 702 klonus. Fig. 12 ir 13 rodo, kad digeninis UGL 165 klonas geriausiai tinka sCTgly produkavimui, o trigeninis UGL 165 klonas yra antroje vietoje lyginant su monogeniniu UGL 173 klonu. Tačiau UGL 165 sCTgly produkavimą galima dar labiau pagerinti esant koekspresuojamiems sekrecijos faktoriams (UGL 703) (plg. fig. 10 ir 11, ir 17)·
Kai dėl prisotinimo deguonimi fermentacijos metu, fig.14A ir 14B paremia išvadą, kad į fermentacijos terpę pridėtas deguonis neturi kritiško poveikio UGL 165 ląstelių augimui, bet yra labai svarbus sCTgly produkcijos padidinimui,
Fig. 15A, 15B ir 16 aiškiai rodo, kad E. coli BLR kamienas geriausiai tinka sCTgly produkuoti.
sCTgly produkavimą galima dar labiau padidinti pridėjus glicino, kaip pridedamo papildomo komponento.
pavyzdys - sCTgly išskyrimas iš UGL 165 kutivavimo terpės: katijonų mainų chromatografija #1
Apie 1000 I kultivavimo terpės, kuri buvo atskirta nuo ląstelių arba tangentinio srauto filtracija, arba centrifugavimu, parūgštinama pakankamu tūriu 2N vandenilio chlorido rūgšties, kad pH sumažėtų iki 3,0. Po to terpė praskiedžiama pakankamu kiekiu vandens, kad laidumas būtų sumažintas iki < 7,5 mS. Praskiesta terpė įkraunama į katijonų mainų kolonėlę (Pharmacia SP-Sepharose Big Beads, 99,0 cm x 13,0 cm), kuri buvo išlyginta su 10 mM citrinos rūgštimi pH 3,0, esant 25 l/min (3,25 cm/min.) srauto greičiui. Kai įkrovimas buvo baigtas, kolonėlė plaunama 10 mM citrinos rūgštimi pH 3,0, esant 8 l/min (1,0 cm/min.) srauto greičiui maždaug 40 min. (3 įkrovos tūriai) arba tol, kol pasiekiama stabili UV bazinė linija. Produktas (sCTgly) eliuuojamas 10 mM citrinos rūgštimi, 350 mM natrio chloridu, pH 3,0, esant 8 l/min (1,0 cm/min.) srauto greičiui. Kolonėlė išvaloma ir regeneruojama 0,5 M natrio hidroksidu, 1,0 M natrio chloridu per 60,0 min (5 įkrovos tūriai), esant 8 l/min (1,0 cm/min.) srauto greičiui.
į maišomą baką, kuriame yra gautas eliuatas CEX#1 (apytikriai 100 I), pridedama 60,57 g trometamino. Tirpalas maišomas tol, kol ištirpsta visa kieta medžiaga. Naudojant 2 M NaOH, tirpalas pašarminamas iki pH 8,25 (intervalas; 8,0-8,5). Pridedama 23,64 g TRIS-HCI (tris[hidroksimetiljaminometano hidrochlorido), ir tirpalas maišomas tol, kol ištirpsta visa kieta medžiaga. Į baką maišant supilama 1,0 kg natrio sulfito, ištirpinto TRIS-HCI, ir 200 g natrio tetrationato, ištirpinto TRIS-HCI. Reakcijos mišinys maišomas 15 min. Jeigu reikia, pakoreguojamas pH iki 8,25 (intervalas: 8,0-8,5)su 2 M
NaOH. Reakcijos mišinys maišomas per naktį kambario temperatūroje. Reakcijos mišinio pH sumažinamas iki 2,25 (intervalas: 2,0-2,5) su 2M HCI.
Atvirkštiniu fazių chromatoorafi ja #1 (RP #1)
Gautas S-sulfoninimo reakcijos mišinys (apytikriai 100 I) įkraunamas tiesiai į atvirkštinių fazių kolonėlę (Toso Haas Amberchrom CG300md, 25,0 cm x 18,0 cm), kuri buvo išlyginta 0,1 % trifluoracto rūgštimi, esant 2,0 l/min (4,0 cm/min) srauto greičiui. Kai įkrovimas buvo baigtas, kolonėlė plaunama 0,1 % trifluoracto rūgštimi, esant 750 ml/min (1,5 cm/min.) srauto greičiui, kol pasiekiama'stabili UV bazinė linija. Kolonėlė plaunama 0,1 % trifluoracto rūgštimi 20 % acetonitrilu, esant 750 ml/min (1,5 cm/min.) srauto greičiui, kol buvo visiškai išplauta pagrindinė priemaišų smailė. Produktas (sCTgly) eliuuojamas 0,1 % trifluoracto rūgštimi, 40 % acetonitrilu, esant 750 ml/min (1,5 cm/min.) srauto greičiui. Kolonėlė valoma 0,1 % trifluoracto rūgštimi, 80 % acetonitrilu 30 min., esant 750 ml/min (1,5 cm/min.) srauto greičiui.
Katijonu mainu chromatografi ja #2 (CEX #2)
Gautas RP #1 eliuatas (apytikriai 8,0 I) įkraunamas tiesiai į katijonų mainų kolonėlę (E. Merck Fractogel EMD SO3 650M, 18,0 cm x 24,0 cm), kuri buvo išlyginta su 25 mM MES (2-[N-morfolino]etansulfonrūgštis), pH 5,8, esant 500 ml/min. (2,0 cm/min) srauto greičiui. Kai įkrovimas buvo baigtas, kolonėlė plaunama, esant 750 ml/min. (3,0 cm/min) srauto greičiui, 25 mM MES (2-[N-morfolino]etansulfonrūgštis), pH 5,8 tol, kol ištekėjusio iš kolonėlės skysčio pH grįžta iki 5,8 (intervalas:5,6-5,9). Pagrindinėms peptidinėms priemaišoms pašalinti kolonėlė plaunama 25 mM MES (2-[Nmorfolinojetansulfonrūgštis), pH 5,8, dar 30 min. esant 750 ml/min. (3,0 cm/min) srauto greičiui. Produktas (sCTgly) eliuuojamas 25 mM MES, 100 mM natrio chloridu, pH 5,8, esant 750 ml/min. (3,0 cm/min) srauto greičiui. Jeigu tuoj pat nevykdomas amidinimas, produkto frakcija parūgšinama iki pH 3,0-5,0 su 1,0 M HCI. Kolonėlė išvaloma ir regeneruojama 0,1 M natrio hidroksidu, 1,0 M natrio chloridu per 60 min., esant 750 ml/min (3,0 cm/min.) srauto greičiui.
Amidinimo reakcija
Gautas CEX #2 eliuatas su sureguliuotu pH turi išgrynintą sCTgiy ir yra tinkamas substrato tirpalas, kurį galima naudoti sCTgiy in vitro konversijai Į tikrą lašišos kalcitoniną; šią reakciją katalizuoja peptidilgliciną a-amidinantis fermentas (PAM), kaip parodyta tolimesniame 5 pavyzdyje.
pavyzdys - Analitinė katijonų mainų HPLC sCTgiy kiekiui nustatyti sCTgiy surinktose chromatografinėse frakcijose identifikuojamas ir jo kiekis nustatomas analitinės CEX-HPLC metodu. Kiekvienos frakcijos alikvota supilama j katijonų mainų kolonėlę (The Nešt Group, polisulfoetilaspartamidas, 4,6 mm x 50 mm), kuri buvo išlyginta su 10 mM natrio fosfatu pH 5,0, esant 1,2 ml/min srauto greičiui. Atskiriama panaudojant tiesinį gradientą nuo 10 mM natrio fosfato pH 5,0 iki 10 mM natrio fosfato, 250 mM natrio chlorido pH 5,0, esant 1,2 ml/min srauto greičiui per 15 min. Ištekantis iš kolonėlės skystis kontroliuojamas pagal UV sugerti esant 220 nm bangos ilgiui. sCTgiy identifikuojamas palyginant jo sulaikymo trukmę su išgryninto etaloninio sCTgiy sulaikymo trukme. sCTgiy kiekis nustatomas pagal smailės plotą, lyginant su etaloninio sCTgiy plotu. Šis analizės metodas taip pat buvo naudojamas sCTgiy kiekiui nustatyti fermentacijos terpėje.
pavyzdys - Glicinu pailginto lašišos kalcitonino pavertimas tikru kalcitoninu naudojant α-amidinanti fermentą
Norint gauti optimalias amidinto lašišos kalcitonino išeigas, reikaligi tokie kritiniai parametrai:
1) Siekiant išvengti nespecifinės peptido adsorbcijos ant reakcijos indo sienelių, amidinimo reakcija vykdoma silanizuotame stikliniame inde.
2) Reakcijos mišinyje palaikomi dideli ištirpusio deguonies kiekiai purškiant ir/arba maišant. Pageidautina, kad ištirpusio deguonies kiekis būtų > 75 %.
3)lnkubacijos temperatūra amidinimo metu palaikoma 35 °C - 39 °C ribose.
1) Amidinimo reakcijos pH palaikomas 6,0 - 6,5 ribose.
2) Glicinu pailginto lašišos kalcitonino pradinė koncentracija amidinimo reakcijos mišinyje turėtų būti 3,5-10,5 mg/ml (0,95-2,9 mM) ribose.
3) Jeigu į reakcijos mišinį pridedama 12000-24000 vienetų/ml iš esmės neturinčio proteazių α-amidinančio fermento (peptidilgliciną a-amidinančios monooksigenazės, čia žymimos “PAM”) ir substrato koncentracija yra tokia kaip nurodyta 5) abzace, reakcijai leidžiama vykti 4-6 valandas. Tačiau reakcijos laikas gali būti pailgintas iki 24 valandų be kenksmingo poveikio produktui.
4) Siekiant išvengti, kad amidinimo reakciją pradėtų limituoti askorbatas, maždaug reakcijos viduryje pridedamas papildomas ekvivalentas askorbato.
Amidinimo reakcijos komponentai yra tokie:
3.5- 10,5 mg/ml S-sulfoninto glicinu pailginto lašišos kalcitonino, mM MES buferio, pH 6,0-6,5,
0,5-1,0 μΜ CuSO4 (pvz. 0,5)
4-15 mM Kl (pvz. 5)
1-5 % etanolio (pvz. 1 %)
10-100 ųg/ml katalazės (pvz. 35)
1.5- 3,0 mM askorbato (pvz. 1,5) peptidilgliciną α-amidinančios monooksigenazės (12000-24000 vienetų mililitrui reakcijos mišinio. 1 vienetas yra DansilTyr-Val-Gly substrato 1 pikomolio per minutę konversija j produktą 37 °C temperatūroje, pH 7). PAM fermentas gali būti gaunamas pagal Miller et al., ABB 298: 380-388 (1992), U.S. Patent 4,708,934, European Publication 0 308 067 ir 0 382 403 bei Biotechnology, Vol. II (1993) pp. 64-70, kurie čia duodami kaip literatūros šaltiniai.
Prieš amidinimą glicinu pailgintas lašišos kalcitoninas gali būti produkuojamas 1 arba 2 pavyzdyje aprašytos fermentacijos būdu ir išgryninamas taip, kaip aprašyta 3 pavyzdyje.
Tais atvejais, kai amidinimui naudojamas fermentas yra peptidilgliciną α-hidroksilinanti monooksigenazė (PHM), naudojamas toks pats reakcijos mišinys, kaip aprašytas aukščiau, PAM’ę pakeičiant PHM’e. Be to, 4-6 valandų inkubacijos laikotarpio pabaigoje reakcijos mišinio pH padidinamas iki 8-9, pridedant bazės. Prieš nutraukiant reakciją, šis reakcijos mišinys pamaišomas dar 4-8 vai. Peptidilgliciną α-hidroksilinanti monooksigenazė gali būti gaunama ekspresuojant tik N-galinę PAM dalį (maždaug 40 pirmųjų kDa). Žr. pvz. Mizuno et ai. BBRC Voi. 148, No., pp.546-52 (1987) kurio aprašymas (kiek jis susijęs su Mizuno “AE1) duodamas kaip literatūros šaltinis. Yra žinoma, kad gamtoje PHM ekspresuoja varlės oda.
Pabaigus amidinimo reakciją, reakcijos mišinys praskiedžiamas tokiu kiekiu vandens, kad galutinė peptido koncentracija būtų mažesnė už 3,0 mg/ml. j mišinj pridedama tiek 1M TRIS pH 9,0, kad galutinė TRIS koncentracija būtų apytikriai 100 mM. Jeigu reikia, pakoreguojamas pH (8,09,0) 2M NaOH. Maišant į reakcijos mišinj lėtai pridedama 3,0 kartus didesnis, skaičiuojant pagal galutinę SO3-sCT koncentraciją (mM), kiekis L-cisteino.
Jeigu reikia, pakoreguojamas pH (8,0-9,0) 2M NaOH. Renatūracijos reakcijos mišinys maišomas 1 valandą kambario temperatūroje. Reakcija nutraukiama parūgštinant 10 % fosfato rūgštimi iki pH 2,0 (1,9-2,3).
pavyzdys - Gryninimas po amidinimo
Katijonu mainu chromatografija #3 (CEX #3)
Ši kolonėlė naudojama sCT gryninimui po a-amidinimo ir renatūracijos. Pagrindinė priemaiša po α-amidinimo/renatūracijos yra sCTG.
CEX =3 chromatografijoje naudojama Amicon Vantage-A kolonėlė (18,0 x 16,0 cm) pripildyta Toyopearl SP650S dervos. Vienkartinė operacija atliekama naudojant injekcijoms skirtą vandenį (WFI) ir 0,5 M, 50 mM ir 175 mM natrio chlorido tirpalus kartu su natrio fosfatu pH 5,5. Toliau duodamas trumpas šio proceso stadijų aprašymas:
1) Nustatomas 750 ml/min operatyvinis srauto greitis.
2) Naudojant LC sistemos kontroliavimo įtaisą, nustatomi tokie chromatografijos kontroliavimo parametrai:
UV bangos ilgis 230 nm, intervalas 0,64 AUFS, laidumas Χ1000.
3) Iš pradžių kolonėlė plaunama WFI mažiausiai 5 min., esant 750 ml/min srauto greičiui.
4) Skiedimo siurblys (150 mM natrio fosfatas, pH 5,0) pastatomas ant 50 ml/min reikšmės ir kolonėlė lyginama 10 mM natrio fosfatu, esant 750 ml/min. srauto greičiui tol, kol gaunama stabili pH bazinė linija.
5) Kolonėlė vėl lyginama 10 mM natrio fosfatu, esant 750 ml/min. srauto greičiui tol, kol gaunama stabili pH bazinė linija žemiau 6.0. (Atkreipkite dėmesį; jeigu kolonėlės pH nėra žemiau 6,0, tada reikia plauti 150 mM natrio fosfatu). Jeigu atliekamas plovimas 150 mM natrio fosfatu pH 5,5, prieš pereinant prie tolimesnės stadijos, kolonėlė vėl turi būti išlyginama naudojant 10 mM natrio fosfatą.
6) Po papildomo išlyginimo kolonėlė eliuuojama 175 mM natrio chloridu, 10 mM natrio fosfatu pH 5,5 4 min., esant 750 ml/min. srauto greičiui (tuščiasis eliuavimas).
7) Kolonėlė vėl lyginama 10 mM natrio fosfatu pH 5,5, esant 750 ml/min. srauto greičiui tol, kol gaunama stabili pH bazinė linija.
8) Kai pasiekiamas išlyginimas, amidinto/renatūruoto produkto, turinčio 10-25 g sCT, pH sukoreguojamas iki 3,5 naudojant 2N natrio hidroksidą ir produktas įkraunamas j CEX #3 kolonėlę 400 ml/min greičiu. Po mėginio įkrovimo įkrovimo konteineris perplaunamas 500 ml WFI,
9) Po jkrovimo kolonėlė plaunama 10 mM natrio fosfatu pH 5,5 esant 750 ml/min srauto greičiui 30 min, kol kolonėlės pH stabilizuojasi ties daugiau nei 5,0.
10) Kai kolonėlės pH stabilizavosi ties daugiau nei 5,0, kolonėlė plaunama 750 ml/min greičiu 50 mM natrio chloridu, 10 mM natrio fosfatu-pH 5,5 100 minučių, kol pasirodo sCTgly smailė.
11) Kai praeina 100 min., prie sistemos prijungiamas 175 mM natrio chloridas. Kolonėlė plaunama 175 mM natrio chloridu, 10 mM natrio fosfatu pH 5,5, esant 75 ml/min srauto greičiui ir eliuuojamas produktas. Visa produkto smailė surenkama j vieną talpą. Nustatoma gauto po CEX3 produkto masė ir j frakciją pridedama 1N acto rūgšties (10 % frakcijos masės).
12) Kolonėlė valoma 0,5 M natrio chloridu, 10 mM natrio fosfatu pH 5,5, esant 750 ml/min srauto greičiui, 15 min.
13) Išvalius kolonėlę, prie sistemos prijungiamas 1,0 M natrio chloridas/0,25 M natrio hidroksidas. Skiedimo siurblys pastatomas j 0,000 ml/min., ir kolonėlė plaunama 1,0 M natrio chloridu/0,25 M natrio hidroksidu, esant 600 ml/min. srauto greičiui, mažiausiai 30 min.
14) Kolonėlė plaunama WFI 5 minutes, esant 750 ml/min srauto greičiui.
15) Kolonėlė plaunama 10 mM natrio hidroksidu 30 minučių, esant 500 ml/min srauto greičiui. Kolonėlė laikoma tokiomis sąlygomis.
Atvirkštiniu fazių chromatografi ja (RP #2)
Ši stadija eina po CEX#3 ir yra naudojama kaip druskos ir buferio pakeitimo stadija prieš liofilizaciją. Pagrindinis šios stadijos tikslas yra pakeisti druską acetatu. RP #2 chromatografijoje naudojama Amicon Vantage-A kolonėlė (13,0 x 1.2,5 cm), pripildyta Amberchrom CG300md dervos. Vienkartinė operacija atliekama naudojant injekcijoms skirtą vandenį, etilo alkoholį, 250 mM natrio acetatą ir 0,5 % acto rūgštį. Toliau duodamas trumpas šio proceso stadijų aprašymas:
1) CEX#3 eliuatas (apytikriai 4 litrai) parūgštinamas iki pH 2,0 fosfato rūgštimi, po to praskiedžiamas 3 lygiais tūriais 333 mM natrio acetato tirpalo ir paliekamas stovėti mažiausiai 1 valandą.
2) Nustatomas 320 ml/min srauto greitis, o skiedimo siurblys (0,5 % acto rūgštis) nustatomas 80 ml/m’in., gaunant 400 mi/min bendrą operatyvinį· srauto greitį.
3) Naudojant LC sistemos kontroliavimo įtaisą, nustatomi tokie chromatografijos kontroliavimo parametrai:
UV bangos ilgis 230 nm, intervalas 2,54 AUFS, laidumas Χ1000.
4) Iš pradžių kolonėlė plaunama 0,1 % acto rūgštimi, esant 400 ml/min srauto greičiui, kol gaunama stabili laidumo bazinė linija.
5) Kolonėlė valoma 80 % etilo alkoholiu, 0,1 % acto rūgštimi, esant 400 ml/min srauto greičiui, kol gaunama stabili pH bazinė linija.
6) Kolonėlė plaunama 0,1 % acto rūgštimi, kol gaunama stabili pH bazinė linija.
7) Po plovimo atliekamas kolonėlės testas dervos išvalymui patikrinti. Kolonėlė eliuuojama 40 % etilo alkoholiu, 0,1 % acto rūgštimi 6 min, esant 400 ml/min srauto greičiui (tuščiasis eliuavimas). Surinktas kolonėlės tikrinimo eliuatas analizuojamas QC metodu.
8) Kolonėlė plaunama 0,1 % acto rūgštimi, esant 400 ml/min srauto greičiui, kol gaunama stabili laidumo bazinė linija.
9) Pabaigus plauti, nuo įleidimo atjungiamas WFI ir prijungiamas 250 mM natrio acetatas. Skiedimo siurblys pastatomas į 0,000 ml/min. padėtį. Kolonėlė lyginama 250 mM natrio acetatu, esant 400 ml/min srauto greičiui, kol gaunama stabili pH bazinė linija.
10) Pasiekus išlyginimą, į RP #2 kolonėlę 400 ml/min greičiu įkraunamas CEX #3 eliuatas. Po mėginio įkrovimo įkrovimo konteineris perplaunamas 1,0 I 250 mM natrio acetato.
11) Kolonėlė plaunama 250 mM natrio acetatu, esant 400 ml/min srauto greičiui, 60 minučių.
12) Po plovimo natrio acetatu natrio acetatas atjungiamas nuo padavimo ir prijungiamas WFI. Skiedimo siurblys grąžinamas į 80 ml/min. srauto greičio padėtį, ir kolonėlė plaunama 0,1 % acto rūgštimi, esant 400 ml/min srauto greičiui, 25 minutes.
13) Po plovimo 0,1 % acto rūgštimi produktas eliuuojamas naudojant 40 % etilo alkoholį, 0,1 % acto rūgštį, esant 400 ml/min srauto greičiui. Surenkama visa produkto smailė, ir tirpalas liofilizuojamas gaunant išgryninto sCT miltelius.
14) Kolonėlė valoma 80 % etilo alkoholiu, 0,1 % acto rūgštimi, esant 400 ml/min srauto greičiui, mažiausiai 20 minučių.
15) Išvalius kolonėlę, skiedimo siurblys pastatomas j 0,000 ml/min.padėtį, ir kolonėlė plaunama WFI, esant 400 ml/min. srauto greičiui, mažiausiai 5 minutes.
16) Po plovimo WFI WFI atjungiamas nuo padavimo ir prijungiamas 0,5 N natrio hidroksidas. Kolonėlė plaunama 0,5 N natrio hidroksidu mažiausiai 20 minučių, esant 400 ml/min srauto greičiui.
17) Nuo sistemos atjungiamas 0,5 N natrio hidroksidas ir prijungiamas WFI. Kolonėlė plaunama 50 % etilo alkoholiu, esant 400 ml/min srauto greičiui, mažiausiai 30 min. Kolonėlė laikoma tokiomis sąlygomis.
18) RP #3 eliuatas laikomas 2-8 °C temperatūroje.
Nors šis išradimas buvo aprašytas remiantis konkrečiais jo įgyvendinimo variantais, specialistams bus aiškios įvairios kitos jo variacijos ir modifikacijos ir kitokie panaudojimo variantai. Todėl šis išradimas neapsiriboja čia duotais konkrečiais atvejais; jį apriboja toliau duodama apibrėžtis.
Claims (20)
- IŠRADIMO APIBRĖŽTIS1. Ekspresijos vektorius, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš:a) koduojančios srities, kurioje yra peptidinį produktą koduojančios nukleorūgštys, sujungtos skaitymo rėmelyje 3' kryptimi nuo signalinį peptidą koduojančių nukleorūgščių, irb) kontrolinė sritis, funkciškai sujungta su koduojančia sritimi; šioje kontrolinėje srityje yra daug promotorių ir bent viena ribosomų prisirišimo vieta, o bent vienas iš minėtų promotorių yra tac.
- 2. Vektorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame yra daug transkripcijos kasečių, ir kiekvienoje kasetėje yra minėta kontrolinė sritis ir minėta koduojanti sritis.
- 3. Vektorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtoje kontrolinėje srityje yra tiksliai du promotoriai.
- 4. Vektorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame minėtoje kontrolinėje srityje minėtas tac promotorius yra 5' kryptimi nuo kito promotoriaus.
- 5. Vektorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto peptidinio produkto C-galinė aminorūgštis yra glicinas.
- 6. Vektorius pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame yra dar ir nukleorūgštys, koduojančios bent vieną sekreciją skatinantį peptidą.
- 7. Vektorius pagal 6 punktą, besiskiriantis tuo, kad ši sekreciją skatinantį peptidą pasirenka iš grupės, susidedančios iš secY ir prlA-4.
- 8. Ląstelė-šeimininkas, transformuota arba transfekuota vektoriumi pagal 1 punktą.
- 9. Ląstelė-šeimininkas, transformuota arba transfekuota vektoriumi pagal 6 punktą.
- 10. E. coli šeimininkas, turintis ir ekspresuojantis ekspresijos vektorių, kuriame yra daug sujungtų viena paskui kitą transkripcijos kasečių, kur kiekvienoje kasetėje yra:a) koduojanti sritis, turinti peptidinį produktą koduojančias nukleorūgštis, sujungtas skaitymo rėmelyje 3’ kryptimi nuo signalinį peptidą koduojančių nukleorūgščių, irb) kontrolinė sritis, funkciškai sujungta su koduojančia sritimi, ir šioje kontrolinėje srityje yra daug vienas paskui kitą einančių promotorių ir bent viena ribosomų prisirišimo vieta, kur bent vienas iš minėtų promotorių yra pasirinktas iš grupės, susidedančios iš tac ir lac.
- 11. Ląstelė-šeimininkas, transformuota ekspresijos vektoriumi, kuriame yra lašišos kalcitonino pirmtaką ekspresuojantis genas, ir ši ląstelėšeimininkas yra E. coli BLR kamienas.
- 12. Ląstelė-šeimininkas, transformuota ekspresijos vektoriumi, kuriame yra su kalcitonino genu susijusį peptidinį pirmtaką ekspresuojantis genas, ir ši ląstelė-šeimininkas yra E. coli BLR kamienas.
- 13. Peptidinio produkto produkavimo būdas, besiskirianti tuo, kad jis susideda iš ląstelių-šeimininkų pagal 8 punktą kultivavimo augimo terpėje ir po to šio peptidinio produkto išgavimo iš terpės, kurioje buvo kultivuotos ląstelės-šeimininkai.
- 14. Peptidinio produkto produkavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš ląstelių-šeimininkų pagal 9 punktą kultivavimo augimo terpėje ir po to šio peptidinio produkto išgavimo iš terpės, kurioje buvo kultivuotos ląstelės-šeimininkai.
- 15. Peptidinio produkto produkavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš tokių stadijų:(a) ląstelių-šeimininkų pagal 8 punktą kultivavimo, augimo terpėje esant anglies šaltiniui ir indukuojant peptidinio produkto ekspresiją, kontroliuojant minėtų ląstelių augimo greitį tarp 0,05 ir 0,20 padvigubėjimų per valandą; ir po to (b) minėto peptidinio produkto išgavimo iš terpės.
- 16. Būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad bent jau minėto kontroliuojamo augimo metu terpėje yra membraną padarantis laidžia glicino kiekis.
- 17. Būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto peptidinio produkto išgavimas susideda iš:(a) ląstelių-šeimininkų atskyrimo nuo kultivavimo terpės;(b) terpės chromatografavimo atvirkštinių fazių chromatografijos metodu, ir peptidinj produktą turinčių frakcijų išskyrimo;(c) minėtų (b) stadijos frakcijų chromatografavimo katijonų mainų chromatografijos metodu; ir po to (d) peptidinj produktą turinčių frakcijų išskyrimo.
- 18. Amidinto peptido produkavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš:(a) ląstelių-šeimininkų, kurios ekspresuoja peptidinj produktą, turinti Cgalinį gliciną kartu su N-galiniu signaliniu peptidu, kultivavimo kontroliuojamomis sąlygomis, kad minėtų ląstelių augimo greitis būtų 0,050,20 padvigubėjimų per valandą ribose, kuriose kultivavimas yra indukuojamas tam tikrą minėto kontroliuojamo augimo laikotarpį;(b) minėto peptidinio produkto išgavimo iš augimo terpės; ir (c) minėto peptidinio produkto pavertimo j amidintą peptidą, paverčiant minėtą C-galini gliciną amino grupe,
- 19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad pavertimą amidintu peptidu vykdo:(a) pagamindami reakcijos mišinį, kuriame minėtą peptidinj produktą veikia deguonimi ir redukcijos agentu esant peptidilgliciną a-amidinančios monooksigenazės arba peptidilgliciną α-hidroksilinančios monooksigenazės;(b) jeigu (a) stadijoje nenaudojama peptidilgliciną a-amidinanti monooksigenazė ir jeigu reakcijos mišinys dar nėra pakankamai bazinis, padidina reakcijos mišinio pH kol jis tampa bazinis; ir (c) išgauna minėtą amidintą peptidą iš minėto reakcijos mišinio.
- 20. Tiesioginės peptidinio produkto ekspresijos j augimo terpę būdas, besiskiriantis tuo, kad jis susideda iš tokių stadijų:(a) ląstelių-šeimininkų, kurios ekspresuoja peptidinj produktą kartu su signaliniu peptidu, kultivavimo kontroliuojamomis sąlygomis, kuriose minėtų ląstelių augimo greitis būtų 0,05-0,20 padvigubėjimų per valandą ribose ir kuriose kultivavimas yra indukuojamas tam tikrą minėto kontroliuojamo augimo laikotarpį: ir (b) minėto peptidinio produkto išgavimo iš kultivavimo terpės.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US4370097P | 1997-04-16 | 1997-04-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| LT99133A LT99133A (lt) | 2000-04-25 |
| LT4701B true LT4701B (lt) | 2000-09-25 |
Family
ID=21928441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| LT99-133A LT4701B (lt) | 1997-04-16 | 1999-11-10 | Tiesioginė peptidų ekspresija į augimo terpė |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6103495A (lt) |
| EP (2) | EP1005526B1 (lt) |
| JP (2) | JP4907751B2 (lt) |
| AT (2) | ATE522598T1 (lt) |
| AU (1) | AU742270B2 (lt) |
| CA (1) | CA2285658C (lt) |
| DE (1) | DE69841939D1 (lt) |
| DK (2) | DK2088188T3 (lt) |
| ES (1) | ES2375330T3 (lt) |
| HU (1) | HUP0001272A3 (lt) |
| LT (1) | LT4701B (lt) |
| NO (1) | NO327325B1 (lt) |
| RU (1) | RU2218407C2 (lt) |
| WO (1) | WO1998046722A1 (lt) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE522598T1 (de) * | 1997-04-16 | 2011-09-15 | Unigene Lab Inc | Direkte expression von peptiden in nährmedien |
| KR100385298B1 (ko) * | 2000-09-05 | 2003-05-23 | 한국생명공학연구원 | 단백질 생산방법 |
| US7166575B2 (en) * | 2002-12-17 | 2007-01-23 | Nastech Pharmaceutical Company Inc. | Compositions and methods for enhanced mucosal delivery of peptide YY and methods for treating and preventing obesity |
| TW200411053A (en) | 2002-12-30 | 2004-07-01 | Ind Tech Res Inst | Nucleic acid encoding recombinant salmon calcitionin, expression vector thereof, and method for producing recombinant salmon calcitonin therewith |
| US8088734B2 (en) | 2003-01-21 | 2012-01-03 | Unigene Laboratories Inc. | Oral delivery of peptides |
| US20050215476A1 (en) * | 2004-01-21 | 2005-09-29 | Unigene Laboratories Inc. | Amidated parathyroid hormone fragments and uses thereof |
| US8227241B2 (en) | 2004-03-12 | 2012-07-24 | Unigene Laboratories, Inc. | Bacterial host cell for the direct expression of peptides |
| US7648965B2 (en) * | 2004-05-14 | 2010-01-19 | Unigene Laboratories Inc. | Method for fostering bone formation and preservation |
| US7531518B2 (en) * | 2004-05-14 | 2009-05-12 | Unigene Laboratories Inc. | Method for fostering bone formation and preservation |
| US20060089723A1 (en) * | 2004-10-25 | 2006-04-27 | Murphy Kieran P | Method for bone augmentation |
| US7445911B2 (en) * | 2004-11-24 | 2008-11-04 | Unigene Laboratories Inc. | Enzymatic reactions in the presence of keto acids |
| PA8660701A1 (es) | 2005-02-04 | 2006-09-22 | Pfizer Prod Inc | Agonistas de pyy y sus usos |
| US20060293667A1 (en) * | 2005-05-19 | 2006-12-28 | Agnes Vignery | Bone implant device and methods of using same |
| US7825231B2 (en) | 2005-06-01 | 2010-11-02 | Darren P. Wolfe | Method of amidated peptide biosynthesis and delivery in vivo: endomorphin-2 for pain therapy |
| US20060275812A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-07 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Assay for agonists and antagonists of ion channels and for regulators of genetic expression |
| JP4856177B2 (ja) | 2005-06-24 | 2012-01-18 | ユニジーン・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | アミド化生成物の調製に有用な酵素を発現させるための細胞株 |
| EP2046826B1 (en) | 2006-07-24 | 2011-09-14 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Exendin fusion proteins |
| US8377863B2 (en) | 2007-05-29 | 2013-02-19 | Unigene Laboratories Inc. | Peptide pharmaceutical for oral delivery |
| RU2370280C2 (ru) * | 2007-10-08 | 2009-10-20 | Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского | СПОСОБ СУПЕРПРОДУКЦИИ В РАСТЕНИИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ОНКОГЕНА HER2/neu |
| US9399773B2 (en) | 2012-08-10 | 2016-07-26 | Shi-Lung Lin | Production and extraction of MicroRNA precursor as drug for cancer therapy |
| US9422559B2 (en) | 2010-06-02 | 2016-08-23 | Shi-Lung Lin | Production and utilization of a novel anti-cancer drug in therapy |
| CA2750035C (en) | 2009-01-22 | 2018-02-27 | Unigene Laboratories Inc. | Treatment for obesity |
| EP2720707B1 (en) | 2011-06-15 | 2018-12-19 | ResoTher Pharma ApS | Anti-inflammatory pharmaceutical products |
| JP6185468B2 (ja) | 2011-08-12 | 2017-08-23 | メロ バイオテクノロジー インコーポレイテッドＭｅｌｌｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． | 原核細胞内においてヘアピン様ｒｎａを発現させる方法及び組成物 |
| PT3095484T (pt) | 2011-11-02 | 2018-06-20 | Keybioscience Ag | Miméticas de calcitonina para tratar doenças e distúrbios |
| CA2854175A1 (en) | 2011-11-02 | 2013-05-10 | Keybioscience Ag | Peptide analogs for treating diseases and disorders |
| US10414808B2 (en) | 2012-05-18 | 2019-09-17 | Janssen Biotech, Inc. | Huwentoxin-IV variants and methods of use |
| US9102751B2 (en) * | 2012-05-18 | 2015-08-11 | Janssen Biotech, Inc. | Huwentoxin-IV variants and methods of use |
| US10196662B2 (en) | 2012-08-10 | 2019-02-05 | Mello Biotechnology, Inc. | Composition for producing microRNA precursors as drugs for enhancing wound healing and production method of the microRNA precursors |
| EP2964193B1 (en) | 2013-03-05 | 2019-12-11 | Enteris BioPharma, Inc. | Pharmaceuticals for oral delivery |
| CN105793277B (zh) | 2013-10-03 | 2020-09-15 | 詹森生物科技公司 | 原毒素-ii变体及其使用方法 |
| PL3321278T3 (pl) | 2013-11-14 | 2019-06-28 | Keybioscience Ag | Mimetyki kalcytoniny do leczenia chorób i zaburzeń |
| CN103709236B (zh) * | 2013-12-23 | 2015-04-15 | 江南大学 | 一种可提高分泌效率的信号肽及其应用 |
| KR102294577B1 (ko) | 2015-01-12 | 2021-08-26 | 엔터리스 바이오파마, 인크. | 고체 경구 제형 |
| MA41642A (fr) | 2015-03-03 | 2018-01-09 | Janssen Biotech Inc | Variants de protoxine ii et méthodes d'utilisation |
| JP6985151B2 (ja) | 2015-04-02 | 2021-12-22 | ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド | プロトキシン−ｉｉ変異体及びその使用方法 |
| WO2017095458A1 (en) | 2015-12-02 | 2017-06-08 | Chih-Li Lin | A COMPOSITION AND METHOD OF USING miR-302 PRECURSORS AS DRUGS FOR TREATING ALZHEIMER'S DISEASES |
| CN108431227A (zh) | 2015-12-02 | 2018-08-21 | 林希龙 | 使用微核醣核酸前驱物作为诱导cd34阳性成体干细胞增殖的药物 |
| GB201704429D0 (en) | 2017-03-21 | 2017-05-03 | Keybioscience Ag | Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders |
| GB201707955D0 (en) | 2017-05-18 | 2017-07-05 | Keybioscience Ag | Dual amylin and calcitonin receptor agonists for treating diseases and disorders |
| GB201813677D0 (en) | 2018-08-22 | 2018-10-03 | Keybioscience Ag | Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders |
| GB201813678D0 (en) | 2018-08-22 | 2018-10-03 | Keybioscience Ag | Acylated calcitonin mimetics |
| GB202001024D0 (en) | 2020-01-24 | 2020-03-11 | Key Bioscience Ag | Oxyntomodulin mimetics |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0177343A1 (en) | 1984-10-05 | 1986-04-09 | Genentech, Inc. | DNA, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery |
| US4595658A (en) | 1982-09-13 | 1986-06-17 | The Rockefeller University | Method for facilitating externalization of proteins synthesized in bacteria |
| US4708934A (en) | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| EP0308067A2 (en) | 1987-08-14 | 1989-03-22 | Unigene Laboratories Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| EP0382403A2 (en) | 1989-02-06 | 1990-08-16 | Unigene Laboratories Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
| US5223407A (en) | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5332664A (en) * | 1981-07-15 | 1994-07-26 | Celltech Limited | Human calcitonin precursor polyprotein structural gene |
| US4620948A (en) * | 1982-12-22 | 1986-11-04 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4962055A (en) * | 1983-03-08 | 1990-10-09 | Rikagaku Kenkyusho | Plasmid, method for construction of the same, microorganisms carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism |
| US4757013A (en) * | 1983-07-25 | 1988-07-12 | The Research Foundation Of State University Of New York | Cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts |
| US5747281A (en) * | 1984-09-28 | 1998-05-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | System useful for the production of proteins from recombinant DNA in single celled organisms |
| DE3632037A1 (de) | 1986-09-20 | 1988-04-07 | Hoechst Ag | Gentechnisches verfahren zur herstellung von salm-calcitonin sowie mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| US5089406A (en) * | 1987-01-07 | 1992-02-18 | Allied-Signal Inc. | Method of producing a gene cassette coding for polypeptides with repeating amino acid sequences |
| US4946790A (en) * | 1987-02-06 | 1990-08-07 | Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. | Recombinant plasmid for the expression of L-phenylalanine ammonia-lyase and transformed strain carrying same |
| JP2551399B2 (ja) * | 1989-08-15 | 1996-11-06 | 株式会社資生堂 | Ｃ末端アミド化に関与する酵素並びにその製造方法及びその使用 |
| US5240831A (en) * | 1991-01-10 | 1993-08-31 | Board Of Regents, The University Of Texas | Methods and compositions for the expression of biologically active eukaryotic cytochrome p45os in bacteria |
| US5547862A (en) * | 1993-07-29 | 1996-08-20 | Ambion Inc. | Vectors containing multiple promoters in the same orientation |
| US5589364A (en) * | 1994-07-29 | 1996-12-31 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Recombinant production of biologically active peptides and proteins |
| ATE522598T1 (de) * | 1997-04-16 | 2011-09-15 | Unigene Lab Inc | Direkte expression von peptiden in nährmedien |
-
1998
- 1998-04-15 AT AT09006784T patent/ATE522598T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-15 EP EP98918334A patent/EP1005526B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-15 AU AU71279/98A patent/AU742270B2/en not_active Ceased
- 1998-04-15 ES ES09006784T patent/ES2375330T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-15 DK DK09006784.4T patent/DK2088188T3/da active
- 1998-04-15 CA CA2285658A patent/CA2285658C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-15 WO PCT/US1998/007723 patent/WO1998046722A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-15 HU HU0001272A patent/HUP0001272A3/hu unknown
- 1998-04-15 AT AT98918334T patent/ATE484572T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-15 DE DE69841939T patent/DE69841939D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-15 RU RU99124196/13A patent/RU2218407C2/ru active
- 1998-04-15 DK DK98918334.8T patent/DK1005526T3/da active
- 1998-04-15 EP EP09006784A patent/EP2088188B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-15 JP JP54430898A patent/JP4907751B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-15 US US09/060,765 patent/US6103495A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-10-14 NO NO19995014A patent/NO327325B1/no not_active IP Right Cessation
- 1999-11-10 LT LT99-133A patent/LT4701B/lt not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-02-08 US US09/500,009 patent/US6210925B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-09 US US09/780,643 patent/US6737250B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 US US09/780,878 patent/US6627438B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-04-05 US US10/818,966 patent/US7968311B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-11-09 JP JP2011245398A patent/JP5634971B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4595658A (en) | 1982-09-13 | 1986-06-17 | The Rockefeller University | Method for facilitating externalization of proteins synthesized in bacteria |
| US4708934A (en) | 1984-09-27 | 1987-11-24 | Unigene Laboratories, Inc. | α-amidation enzyme |
| EP0177343A1 (en) | 1984-10-05 | 1986-04-09 | Genentech, Inc. | DNA, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery |
| EP0308067A2 (en) | 1987-08-14 | 1989-03-22 | Unigene Laboratories Inc. | Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use |
| US5223407A (en) | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| EP0382403A2 (en) | 1989-02-06 | 1990-08-16 | Unigene Laboratories Inc. | Expression systems for amidating enzyme |
Non-Patent Citations (6)
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| LT4701B (lt) | Tiesioginė peptidų ekspresija į augimo terpė | |
| EP0177343B1 (en) | Dna, cell cultures and methods for the secretion of heterologous proteins and periplasmic protein recovery | |
| JP2608870B2 (ja) | 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造 | |
| US6471500B1 (en) | Process for producing erythropoietin containing no animal proteins | |
| EP1733039B1 (en) | Improved bacterial host cell for the direct expression of peptides | |
| EP2173768B1 (en) | Novel orthogonal process for purification of recombinant human parathyroid hormone (rhpth) (1-34) | |
| LT4077B (en) | Expression systems for amidating enzyme | |
| NO175870B (lt) | ||
| CA1340091C (en) | Enhanced protein production in bacteria by employing novel ribosome binding site | |
| IE904294A1 (en) | Novel process for the production of unfused protein in E. coli | |
| Ohsuye et al. | Expression of chemically synthesized α-neo-endorphin gene fused to E. coli alkaline phosphatase | |
| EP0225860A2 (en) | A method to export gene products to the growth medium of Gram negative bacteria | |
| AU781978B2 (en) | Direct expression of peptides into culture media | |
| AU2005201901B2 (en) | Direct expression of peptides into culture media | |
| GB2214508A (en) | Plasmid vector for the efficient expression of foreign genes fused with newly conceived transcriptional and translational signal sequences. | |
| KR970009082B1 (ko) | 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법 | |
| JPH01160488A (ja) | ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM9A | Lapsed patents |
Effective date: 20130415 |