JPH01160488A - ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 - Google Patents
ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、１）ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）の生物活性
誘導体をコードしている遺伝子の解読フレーム内にある
転写および翻訳活性化ヌクレオチド配列、および ２）誘導条件下で、コピー数の制御能を喪失するレプリ
コン を含有する、選択可能な、自律的に複製する新規な組換
えＤＮＡ発現ベクターに関する。本発明は、さらに、こ
のベクターの新規な形質転換体、ウシ成長ホルモン誘導
体およびこれらの使用方法に関する。
誘導体をコードしている遺伝子の解読フレーム内にある
転写および翻訳活性化ヌクレオチド配列、および ２）誘導条件下で、コピー数の制御能を喪失するレプリ
コン を含有する、選択可能な、自律的に複製する新規な組換
えＤＮＡ発現ベクターに関する。本発明は、さらに、こ
のベクターの新規な形質転換体、ウシ成長ホルモン誘導
体およびこれらの使用方法に関する。
ｂＧＨを生産するための組換えＤＮＡ技術は、遺伝子の
発現性に問題があり、それ故にその開発および利用は妨
げられていた。これらの問題のうち、欧州特許出願公開
第００７５４４４号に記載されている幾つかの問題は、
機能的に最善でない（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｕ
ｂｏｐｔｉｍａｌ）ｍ ＲＮ Ａの転写に関するもので
ある。
発現性に問題があり、それ故にその開発および利用は妨
げられていた。これらの問題のうち、欧州特許出願公開
第００７５４４４号に記載されている幾つかの問題は、
機能的に最善でない（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｕ
ｂｏｐｔｉｍａｌ）ｍ ＲＮ Ａの転写に関するもので
ある。
組換えＤＮＡ技術の開発および利用は、遺伝子発現が高
レベルで得られるベクターが一般に不足していることか
ら、制限を受けている。ｌａｃ ［ロバート（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス、ニー・ニス・ニー（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７
６：５５９６゜１９７．９）およびガウシテ（Ｇｕａｒ
ａｎｔｅ）ら、セル（Ｃｅｌｌ ２０：５４３．１９８
０）］ 、ｔｒｐ ［ホールウェル（Ｈａｌｌｅｗｅｌ
１）およびエムテージ（Ｅｍｔａｇｅ）のジーン（Ｇ
ｅｎｅ ９：２７．１９８０）］ 、バクテリオファー
ジλＰＬ［レマウト（Ｒｅｍａｕｔ）ら、Ｇｅｎｅ １
５（１）：８１．１９８１．パーナート（Ｂｅｒｎａｒ
ｄ）ら、Ｇｅｎｅ ５：５９．１９７９およびブロム（
Ｄｅｒｏｍ）ら、Ｇｅｎｅ １７：４５．１９８２コお
よびｌｐｐ ［ジーベル（Ｚｉｅｂｅｌ）ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １４５：６５４．１９８１）、シー（Ｌｅｅ）
ら、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４６：８６１．１
９８１およびナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびイノ
ウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）のＣｅ１ｌ １８：１１０９，１
９７９］プロモーターシステムが、それらに適合する組
換えＤＮＡベクター類に組み込まれているが、他の使用
し得る発現システムは殆どなく、たとえあるとしてもわ
ずかである。実際、これらの既知の発現ベクターを用い
ても、多（の異種遺伝子は発現されないが、または、せ
いぜい若干量しか発現されない。このような発現の不良
は、ｍＲＮＡの転写、即ちリボゾームに対する最善でな
い結合または結合不能に関係していることが多い。これ
は、リボゾームと結合する部位を封鎖する不適当なステ
ム（ｓｔｅｍ）およびループ（ｌｏｏｐ）構造の形成、
ｍＲＮＡ転写物の一般的な不安定性、またはりボゾーム
の結合性もしくは翻訳の開始を阻害する配列の存在に由
来するのかもしれない。これらの問題の幾つかは、欧州
特許出願公開第００７５４４４号に記載されている。
レベルで得られるベクターが一般に不足していることか
ら、制限を受けている。ｌａｃ ［ロバート（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ）ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス、ニー・ニス・ニー（Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７
６：５５９６゜１９７．９）およびガウシテ（Ｇｕａｒ
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１）およびエムテージ（Ｅｍｔａｇｅ）のジーン（Ｇ
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ｄ）ら、Ｇｅｎｅ ５：５９．１９７９およびブロム（
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よびｌｐｐ ［ジーベル（Ｚｉｅｂｅｌ）ら、ジャーナ
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ｌ、 １４５：６５４．１９８１）、シー（Ｌｅｅ）
ら、Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １４６：８６１．１
９８１およびナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびイノ
ウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）のＣｅ１ｌ １８：１１０９，１
９７９］プロモーターシステムが、それらに適合する組
換えＤＮＡベクター類に組み込まれているが、他の使用
し得る発現システムは殆どなく、たとえあるとしてもわ
ずかである。実際、これらの既知の発現ベクターを用い
ても、多（の異種遺伝子は発現されないが、または、せ
いぜい若干量しか発現されない。このような発現の不良
は、ｍＲＮＡの転写、即ちリボゾームに対する最善でな
い結合または結合不能に関係していることが多い。これ
は、リボゾームと結合する部位を封鎖する不適当なステ
ム（ｓｔｅｍ）およびループ（ｌｏｏｐ）構造の形成、
ｍＲＮＡ転写物の一般的な不安定性、またはりボゾーム
の結合性もしくは翻訳の開始を阻害する配列の存在に由
来するのかもしれない。これらの問題の幾つかは、欧州
特許出願公開第００７５４４４号に記載されている。
本発明は、遺伝子の合成による修飾を要することなく、
発現に関する問題を解決するものである。
発現に関する問題を解決するものである。
この合成による修飾は、時間および費用がかかるばかり
でな（、偶発的にせよ、ＤＮＡ配列に誤りを生じさせか
ねない危険性が実質的に増大する。
でな（、偶発的にせよ、ＤＮＡ配列に誤りを生じさせか
ねない危険性が実質的に増大する。
本発明は、注目の遺伝子独自の配列を修飾または変化さ
せることなく、ｍＲＮＡ転写物の５°末端部を改変する
ことによって、この問題を回避するものである。
せることなく、ｍＲＮＡ転写物の５°末端部を改変する
ことによって、この問題を回避するものである。
本明細書中に記載の用語を以下に定義する。
組換えＤＮＡクローニングベクター：１つまたはそれ以
上の付加的なりＮＡ上セグメント追加することができる
が、またはこのようなセグメントが既に追加されたＤＮ
Ａ分子を含有している自律的に複製する物質であり、こ
れにはプラスミドがあるが、これに限定されるものでは
ない。
上の付加的なりＮＡ上セグメント追加することができる
が、またはこのようなセグメントが既に追加されたＤＮ
Ａ分子を含有している自律的に複製する物質であり、こ
れにはプラスミドがあるが、これに限定されるものでは
ない。
組換えＤＮＡ発現ベクター：１つまたはそれ以上の転写
および翻訳活性化配列（群）が組み込まれた組換えＤＮ
Ａクローニングベクター。
および翻訳活性化配列（群）が組み込まれた組換えＤＮ
Ａクローニングベクター。
転写活性化配列： ＤＮＡの、ＲＮＡ転写物への転写を
指令するＤＮＡ配列であるが、またはその転写のための
ＤＮＡ配列。
指令するＤＮＡ配列であるが、またはその転写のための
ＤＮＡ配列。
翻訳活性化配列：ｍＲＮＡ転写物の、ペプチド、ポリペ
プチドまたはタンパク質への翻訳を指令するＤＮＡ配列
であるが、またはその翻訳のためのＤＮＡ配列。
プチドまたはタンパク質への翻訳を指令するＤＮＡ配列
であるが、またはその翻訳のためのＤＮＡ配列。
翻訳開始シグナル：翻訳開始コドンをコードしているＤ
ＮＡ ｌ−リプレット。
ＮＡ ｌ−リプレット。
翻訳終止シグナル：翻訳終止コドンをコードしているＤ
ＮＡトリプレット。
ＮＡトリプレット。
形質転換： ＤＮＡを受容宿主細胞に導入すること。
形質転換体：形質転換を既に受けている受容宿主細胞。
制限フラグメント：１つまたはそれ以上の制限酵素の作
用によって生成された線状ＤＮＡ配列。
用によって生成された線状ＤＮＡ配列。
生物活性ポリペプチド：回収可能な生物学的に活性な同
種（ホモローガス）または異種（ヘテロローガス）ポリ
ペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチドおよび一部
もしくは全部の同種ポリペプチドを含有する回収可能な
ポリペプチド、または、異種ポリペプチドおよび特異的
に開裂することができる生物活性を不活化するポリペプ
チドを含有する回収可能な生物不活性な融合ポリペプチ
ド。
種（ホモローガス）または異種（ヘテロローガス）ポリ
ペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチドおよび一部
もしくは全部の同種ポリペプチドを含有する回収可能な
ポリペプチド、または、異種ポリペプチドおよび特異的
に開裂することができる生物活性を不活化するポリペプ
チドを含有する回収可能な生物不活性な融合ポリペプチ
ド。
融合憤伝子産物：同種ポリペプチドの一部または全部を
含有する回収可能な異種ポリペプチド。
含有する回収可能な異種ポリペプチド。
レプリコン：組換えＤＮＡクローニングおよび発現ベク
ターの復製を制御するＤＮＡ配列。
ターの復製を制御するＤＮＡ配列。
ウシナウェー・レプリコン°コピー数の制御能が欠如し
ているが、または喪失するよう誘導され得るレプリコン
である。このような喪失の結果、複製が非制御下に置か
れ、このようなレプリコンが組み込まれたＤＮＡはコピ
ー数が大幅に増大する。
ているが、または喪失するよう誘導され得るレプリコン
である。このような喪失の結果、複製が非制御下に置か
れ、このようなレプリコンが組み込まれたＤＮＡはコピ
ー数が大幅に増大する。
本発明は、ａ）転写活性化配列、
ｂ）以下の配列群の中から選ばれるいずれかのＤＴｆｆ
ｒＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＡ″ＩＴＡＴ−’）’および ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルである］
、および Ｃ）生物活性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 を連続的に含有している新規な組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーを提供するものである（ただし、配列ａおよび配列す
は配列Ｃか微生物学的に発現される様位置している）。
ｒＴＴＣＣＴＣＣＴＴＡＴＡ″ＩＴＡＴ−’）’および ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルである］
、および Ｃ）生物活性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 を連続的に含有している新規な組換えＤＮＡ発現ベクタ
ーを提供するものである（ただし、配列ａおよび配列す
は配列Ｃか微生物学的に発現される様位置している）。
本発明は、さらに、このベクターを構築するのに使用さ
れるＤＮＡ配列、ならびにこのような配列およびベクタ
ーを含有する形質転換された宿主細胞を提供するもので
ある。
れるＤＮＡ配列、ならびにこのような配列およびベクタ
ーを含有する形質転換された宿主細胞を提供するもので
ある。
本発明のベクターは、Ｘｂａｌ−Ｎｄｅｌ ＤＮＡリン
カ−配列ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６、ａ７ま
たはａ８のいずれかをｐＣＺ １４５の〜９２ｋｂ Ｘ
ｂａｌ−Ｎｄｅｌフラグメントにライゲートすることに
よって溝築される。得られるプラスミドはそれぞれｐＣ
Ｚ１４９、ｐＣＺ１８３、ｐＣＺ１８４、ｐＣＺ１４９
川、ｐＣＺ１４９．２、ｐＣＺ１４９．３、ｐＣＺ １
８３．ｌおよびｐＣＺ １８３．２と命名され、これら
は、 １・）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リポプロテイン遺伝子転
写活性化配列（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびイ
ノウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）、 １９７９）、 ２）合成翻訳活性化配列、 ３）メチオニル−ウシ成長ホルモン（ｎｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈ）をコードしているヌクレオチド配列の解読フレー
ム内に存在する翻訳開始シグナル、および４）ｍｅｔ−
ｂＧＨコード配列の解読フレーム内に於いて適切に配置
された翻訳終止シグナルを連続的に含有している。
カ−配列ａ１、ａ２、ａ３、ａ４、ａ５、ａ６、ａ７ま
たはａ８のいずれかをｐＣＺ １４５の〜９２ｋｂ Ｘ
ｂａｌ−Ｎｄｅｌフラグメントにライゲートすることに
よって溝築される。得られるプラスミドはそれぞれｐＣ
Ｚ１４９、ｐＣＺ１８３、ｐＣＺ１８４、ｐＣＺ１４９
川、ｐＣＺ１４９．２、ｐＣＺ１４９．３、ｐＣＺ １
８３．ｌおよびｐＣＺ １８３．２と命名され、これら
は、 １・）大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）リポプロテイン遺伝子転
写活性化配列（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）およびイ
ノウニ（Ｉｎｏｕｙｅ）、 １９７９）、 ２）合成翻訳活性化配列、 ３）メチオニル−ウシ成長ホルモン（ｎｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈ）をコードしているヌクレオチド配列の解読フレー
ム内に存在する翻訳開始シグナル、および４）ｍｅｔ−
ｂＧＨコード配列の解読フレーム内に於いて適切に配置
された翻訳終止シグナルを連続的に含有している。
プラスミドｐＣＺ１４５出発物質は〜９．２ｋｂであり
、Ｘｂａｌ−ＨｇｉＡＩ ＤＮＡリンカ−配列：を、プ
ラスミドｐｃ２１１８の０．６ｋｂ ＢａｍＨ１−Ｈｇ
ｉＡｌおよび８．６ｋｂ ＢａｍＨＩ −Ｘｂａｌフラ
グメントとライゲートすることによって構築される。
、Ｘｂａｌ−ＨｇｉＡＩ ＤＮＡリンカ−配列：を、プ
ラスミドｐｃ２１１８の０．６ｋｂ ＢａｍＨ１−Ｈｇ
ｉＡｌおよび８．６ｋｂ ＢａｍＨＩ −Ｘｂａｌフラ
グメントとライゲートすることによって構築される。
このプラスミドｐＣＺ１１８は〜９゜２ｋｂであり、〜
１．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌフラグメントをプラ
スミドｐＣＺｌｏｌから削除することによって構築され
る。このプラスミドｐＣＺ１０１は〜１０．８ｋｂであ
り、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの０、６ ｋｂ Ｘｂａ
ｌ −Ｂ ａｍＨＩフラグメントを、同様に消化したプ
ラスミドｐＴＭ−１°−Ａ３にライゲートすることによ
って構築される。
１．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌフラグメントをプラ
スミドｐＣＺｌｏｌから削除することによって構築され
る。このプラスミドｐＣＺ１０１は〜１０．８ｋｂであ
り、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂの０、６ ｋｂ Ｘｂａ
ｌ −Ｂ ａｍＨＩフラグメントを、同様に消化したプ
ラスミドｐＴＭ−１°−Ａ３にライゲートすることによ
って構築される。
Ｅ．Ｃｏｌｉリポプロテイン遺伝子の転写および翻訳活
性化配列ならびに温度誘発性ウシナウェイ・レプリコン
を含有するこの後者のプラスミドは、ノーザン・シージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、ペオリア、イリノイ）に寄託され、そのパーマ
ネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部を
構成している菌株であるＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ Ｒ
Ｖ３０８／ｐ１Ｍ ｌｏ−Ａ３から得ることができる
。この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源および
ストック保有宿主として受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５
７３３の下で入手可能である。上記プラスミドｐＮ、Ｍ
７８９Ｂ出発物質は、以下の第１図から第８図および実
施例１に於いて開示し、説明している工程に従い、プラ
スミドｐＫＥＮ１１１から得られる。プラスミドｐＫＥ
Ｎ１１１は、ノーザン・シージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ベオリア、イリ
ノイ）に寄託され、そのパーマネント・ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している菌株である
Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＣＣ６２０／ｐＫＥＮｌ １
１から得ることができる。
性化配列ならびに温度誘発性ウシナウェイ・レプリコン
を含有するこの後者のプラスミドは、ノーザン・シージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ
Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、ペオリア、イリノイ）に寄託され、そのパーマ
ネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部を
構成している菌株であるＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ Ｒ
Ｖ３０８／ｐ１Ｍ ｌｏ−Ａ３から得ることができる
。この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源および
ストック保有宿主として受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５
７３３の下で入手可能である。上記プラスミドｐＮ、Ｍ
７８９Ｂ出発物質は、以下の第１図から第８図および実
施例１に於いて開示し、説明している工程に従い、プラ
スミドｐＫＥＮ１１１から得られる。プラスミドｐＫＥ
Ｎ１１１は、ノーザン・シージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ベオリア、イリ
ノイ）に寄託され、そのパーマネント・ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している菌株である
Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＣＣ６２０／ｐＫＥＮｌ １
１から得ることができる。
この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源およびス
トック保有宿主として受託番号ＮＲＲＬＢ−１５０１１
の下で入手可能である。プラスミドｐＮＭ７８９Ｂも、
Ｅ．Ｃｏｌｉ リポプロティン遺伝子の転写および翻
訳活性化配列を含有しており、さらに、ｂＧＨおよびこ
のｂＧＨのＮ−末端に位置する９員ポリペプチドからな
る融合タンパク質のコード配列を、適切に配置されてい
る翻訳終止シグナルと共に含有している。Ｘｂａｌ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメント内に含有されている前述の転写活
性化配列および融合タンパク質コード配列を、適切に開
裂したプラスミドｐＩＭ−１°−Ａ３にライゲートする
ことにより、上記のプラスミドｐＣＺ１０１出発物質が
得られる。
トック保有宿主として受託番号ＮＲＲＬＢ−１５０１１
の下で入手可能である。プラスミドｐＮＭ７８９Ｂも、
Ｅ．Ｃｏｌｉ リポプロティン遺伝子の転写および翻
訳活性化配列を含有しており、さらに、ｂＧＨおよびこ
のｂＧＨのＮ−末端に位置する９員ポリペプチドからな
る融合タンパク質のコード配列を、適切に配置されてい
る翻訳終止シグナルと共に含有している。Ｘｂａｌ−Ｂ
ａｍＨＩフラグメント内に含有されている前述の転写活
性化配列および融合タンパク質コード配列を、適切に開
裂したプラスミドｐＩＭ−１°−Ａ３にライゲートする
ことにより、上記のプラスミドｐＣＺ１０１出発物質が
得られる。
関連する多くのその他のｂＧＨ発現プラスミドを構築す
ることもでき、これらも本発明を例示する。例えば、個
々のＤＮＡリンカ−配列は、ｍＲＮＡ転写物をポリペプ
チドに発現させるものでなければならないが、このよう
な構築に使用できるリンカ−Ｄ Ｎ Ａ配列の数は、実
際上無限である。
ることもでき、これらも本発明を例示する。例えば、個
々のＤＮＡリンカ−配列は、ｍＲＮＡ転写物をポリペプ
チドに発現させるものでなければならないが、このよう
な構築に使用できるリンカ−Ｄ Ｎ Ａ配列の数は、実
際上無限である。
これらの配列は、完全保護ジデオキシリボヌクレオチド
・ビルディングブロックを使用した改良ホスホトリエス
テル法によって、常法により合成することができる。こ
のような合成法は当業界では周知であり、イタクラら［
Ｉｔａｋｕｒａ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９
８：１０５６．１９７７］およびフレアらＥＰｒｏｃＮ
ａｋ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ７５：５７
６５．１９７８］の操作法に実質的に従うことで行うこ
とができる。
・ビルディングブロックを使用した改良ホスホトリエス
テル法によって、常法により合成することができる。こ
のような合成法は当業界では周知であり、イタクラら［
Ｉｔａｋｕｒａ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９
８：１０５６．１９７７］およびフレアらＥＰｒｏｃＮ
ａｋ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ ７５：５７
６５．１９７８］の操作法に実質的に従うことで行うこ
とができる。
本発明を実施する場合、特定の転写活性化配列を選択す
ることは重要でないので、本発明は、特定の転写活性化
配列を使用することに限定されない。既に例示したリポ
プロテインの転写活性化配列と置換することのできる転
写活性化配列としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ トリプトファ
ン（ｔｒｐ）、Ｅ 、 ｃｏｌ ｉラクトース（ｌａｃ
）、バタテリオファージλＰＬＯＬ。
ることは重要でないので、本発明は、特定の転写活性化
配列を使用することに限定されない。既に例示したリポ
プロテインの転写活性化配列と置換することのできる転
写活性化配列としては、Ｅ．Ｃｏｌｉ トリプトファ
ン（ｔｒｐ）、Ｅ 、 ｃｏｌ ｉラクトース（ｌａｃ
）、バタテリオファージλＰＬＯＬ。
バクテリオファージλＰＲＯＲ，バシラス・サブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ、枯草菌）増殖
（ｖｅｇ）およびストレプトマイセス・アズレウス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ）チオストレ
プトン耐性（ｔｓｒ）遺伝子転写活性化配列などが挙げ
られるが（これらに限定されるものではない。さらに、
１つまたはそれ以上の転写活性化配列、例えばｔｒｐお
よびＩａｃ転写活性化配列を直列して使用することがで
きる。
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂＬｉｌｉｓ、枯草菌）増殖
（ｖｅｇ）およびストレプトマイセス・アズレウス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｚｕｒｅｕｓ）チオストレ
プトン耐性（ｔｓｒ）遺伝子転写活性化配列などが挙げ
られるが（これらに限定されるものではない。さらに、
１つまたはそれ以上の転写活性化配列、例えばｔｒｐお
よびＩａｃ転写活性化配列を直列して使用することがで
きる。
既述した遺伝子の配列はすべて、既に特性化されており
、これらは合成によって、または既知のプラスミドから
構築することができる。
、これらは合成によって、または既知のプラスミドから
構築することができる。
本発明は、非常に応用性が広く、既述のｍｅｔ −ｂＧ
Ｈコード配列を、生物活性ポリペプチドをコードしてい
る、実際上ありとあらゆるヌクレオチド配列で置き換え
ることができる。このようなコート配列としては、ヒト
成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト・プレ成長ホルモン（ｐ
ｒｅ −ｈ Ｇ Ｈ） 、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン放出因子、ウシまたはブタ成長ホルモン放出因
子、ヒト・インシュリンＡ鎖、ヒト・インシュリンＢｍ
、ヒト・プロインシュリン、ヒトおよび非−ヒト・イン
ターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活
性化因子、インターロイキンＩおよびインターロイキン
１１．あらゆるポリペプチドホルモン、研究または商業
的に価値のあるあらゆる酵素およびあらゆる生物活性ポ
リペプチドをコードしている配列が挙げられるが、これ
らに限定されない。
Ｈコード配列を、生物活性ポリペプチドをコードしてい
る、実際上ありとあらゆるヌクレオチド配列で置き換え
ることができる。このようなコート配列としては、ヒト
成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト・プレ成長ホルモン（ｐ
ｒｅ −ｈ Ｇ Ｈ） 、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）
、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン放出因子、ウシまたはブタ成長ホルモン放出因
子、ヒト・インシュリンＡ鎖、ヒト・インシュリンＢｍ
、ヒト・プロインシュリン、ヒトおよび非−ヒト・イン
ターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活
性化因子、インターロイキンＩおよびインターロイキン
１１．あらゆるポリペプチドホルモン、研究または商業
的に価値のあるあらゆる酵素およびあらゆる生物活性ポ
リペプチドをコードしている配列が挙げられるが、これ
らに限定されない。
より具体的には、例えば生物活性ポリペプチドがｈＧＨ
の場合のベクターは、例えば、プラスミドｐＣＺ１０１
の〜ｌ ０．２ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌフラグメン
トおよびプラスミドｐ ＮＭ５７５の〜０５ｋｂ Ｂａ
ｍＨ［−ＦｎｕＤ ｆｆフラグメントの両者を、既述の
リンカ−配列１．２．３．４．５．６．７または８のい
ずれかにライゲートすることによって構築することがで
きる。
の場合のベクターは、例えば、プラスミドｐＣＺ１０１
の〜ｌ ０．２ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌフラグメン
トおよびプラスミドｐ ＮＭ５７５の〜０５ｋｂ Ｂａ
ｍＨ［−ＦｎｕＤ ｆｆフラグメントの両者を、既述の
リンカ−配列１．２．３．４．５．６．７または８のい
ずれかにライゲートすることによって構築することがで
きる。
本明細書に開示した具体例では、プラスミドの複製は、
英国（ＧＢ）特許公開番号第１，５５７，７７４号およ
びウーリン（Ｕｈｌｉｎ）らのＧｅｎｅ ６：９１．１
９７９の両者に開示されている温度誘発性ウシチウェイ
・レプリコンによって決定される。３０°Ｃ以下の温度
、特に２５℃では、このレプリコンは１個の細胞当たり
約１０−１５コピーと比較的少ないコピー数を維持して
いる。温度を３７°Ｃにした場合には、コピーの制御能
が喪失し、このレプリコンを含有するプラスミドＤＮＡ
が１細胞当たり１０００−２０００のコピー数にまで増
幅する。本明細書に於いて例示している特定のウシナウ
ェイ・レプリコンは、既述のプラスミドｐ１Ｍｉ’−Ａ
３出発物質に含有されている。
英国（ＧＢ）特許公開番号第１，５５７，７７４号およ
びウーリン（Ｕｈｌｉｎ）らのＧｅｎｅ ６：９１．１
９７９の両者に開示されている温度誘発性ウシチウェイ
・レプリコンによって決定される。３０°Ｃ以下の温度
、特に２５℃では、このレプリコンは１個の細胞当たり
約１０−１５コピーと比較的少ないコピー数を維持して
いる。温度を３７°Ｃにした場合には、コピーの制御能
が喪失し、このレプリコンを含有するプラスミドＤＮＡ
が１細胞当たり１０００−２０００のコピー数にまで増
幅する。本明細書に於いて例示している特定のウシナウ
ェイ・レプリコンは、既述のプラスミドｐ１Ｍｉ’−Ａ
３出発物質に含有されている。
本発明が特定のウシナウェイ・レプリコン、即ちコピー
数突然変異物を使用することに限定されるものでないこ
とは、理解されるであろう。他の誘発性ウシナウェイ、
即ち高いコピー数のレプリコンは、適当な選択によって
得ることができ、また、国際公開番号ＷＯ３２１０２９
０１およびピットナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）およびヴアブ
ネック（ｖａｐｎｅｋ）のＧｅｎｅ １５：３１９．１
９８１に記載されている操作法に従えば構築することが
できる。さらに、非−ウシナウェイ・レプリコンも、そ
れがＥ．Ｃｏｌｉ、 ＢａｃｉｌｌｕｓＳＳ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓまたは他の適当な細菌宿主細胞に於いて
機能的である限り、使用することができる。このような
レプリコンには、限定されるものではないが、例えばＥ
、 ｃｏｌ ｉ内で複製するバクテリオファージなど
の、ｐＭＢ ｌ、Ｃｏ１Ｅ１、ＮＲ１、ＲＫ２、ＲＫ６
、ｐｓｃ ｌ Ｏｌ、ＲＰＩ、ＲＰ４、Ｆなど由来のレ
プリコン、またストレプ］・マイセス内で復）ソするバ
クテリオファージなどの、ｐＥＬ７、ｐＥＬ１０３．５
ｃｐ２．５ＣＰ２＊など由来のレプリコン、さらにバシ
ラス内で復製するバクテリオファージなどの、ｐｃＩ９
４、ｐＢｓｌ、ｐＥＩ９４、ｐ［ＪＢ ｌ １０． ｐ
Ｔ Ｉ ２７など由来のレプリコンが挙げられる。当業
者であれば、これらのレプリコン、さらにはウシナウェ
イ・レプリコンの変異物も置換可能であり、これらを使
用して構築される発現ベクターも本発明の範囲内に属す
ることは理解できるであろう。
数突然変異物を使用することに限定されるものでないこ
とは、理解されるであろう。他の誘発性ウシナウェイ、
即ち高いコピー数のレプリコンは、適当な選択によって
得ることができ、また、国際公開番号ＷＯ３２１０２９
０１およびピットナー（Ｂｉｔｔｎｅｒ）およびヴアブ
ネック（ｖａｐｎｅｋ）のＧｅｎｅ １５：３１９．１
９８１に記載されている操作法に従えば構築することが
できる。さらに、非−ウシナウェイ・レプリコンも、そ
れがＥ．Ｃｏｌｉ、 ＢａｃｉｌｌｕｓＳＳ ｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓまたは他の適当な細菌宿主細胞に於いて
機能的である限り、使用することができる。このような
レプリコンには、限定されるものではないが、例えばＥ
、 ｃｏｌ ｉ内で複製するバクテリオファージなど
の、ｐＭＢ ｌ、Ｃｏ１Ｅ１、ＮＲ１、ＲＫ２、ＲＫ６
、ｐｓｃ ｌ Ｏｌ、ＲＰＩ、ＲＰ４、Ｆなど由来のレ
プリコン、またストレプ］・マイセス内で復）ソするバ
クテリオファージなどの、ｐＥＬ７、ｐＥＬ１０３．５
ｃｐ２．５ＣＰ２＊など由来のレプリコン、さらにバシ
ラス内で復製するバクテリオファージなどの、ｐｃＩ９
４、ｐＢｓｌ、ｐＥＩ９４、ｐ［ＪＢ ｌ １０． ｐ
Ｔ Ｉ ２７など由来のレプリコンが挙げられる。当業
者であれば、これらのレプリコン、さらにはウシナウェ
イ・レプリコンの変異物も置換可能であり、これらを使
用して構築される発現ベクターも本発明の範囲内に属す
ることは理解できるであろう。
本発明の発現ベクターおよび本発明の方法は、広い範囲
の宿主生物に使用することができ、これらには、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
の宿主生物に使用することができ、これらには、エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ。
大腸菌）、例えばＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １’
２ ＨＢ Ｉ Ｏ１、Ｅ。
ｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １’
２ ＨＢ Ｉ Ｏ１、Ｅ。
ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｃ６００、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２
Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−１Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＲ
１およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＭＭ２９４など、セ
ラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐ ｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのダラム陰性原核生物、パシ
ラス、例えばＢ、サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、スリンギエンシス（Ｂ。
Ｃ６００ＲＫ−ＭＫ−１Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＲ
１およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＭＭ２９４など、セ
ラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シュードモナス（Ｐ ｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などのダラム陰性原核生物、パシ
ラス、例えばＢ、サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ、スリンギエンシス（Ｂ。
ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）およびＢ、スリンギエンシ
スｖａｒ。
スｖａｒ。
イスラエレンシス（Ｂ、 ｔｈｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、ならびにストレ
プトマイセス、例えばＳ。
ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）、ならびにストレ
プトマイセス、例えばＳ。
フラジアエ（Ｓ、 ｆｒａｄｉａｅ）、Ｓ、アンボア
７ ’、ｉ Ｚ ７ス（Ｓ、 ａｉｂｏｆａｃｉｅｎｓ
）、Ｓ、リヴイダンス（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ）およ
びＳ、グリセオファスカス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ）などのグラム陽性原核生物などがある。本発明
のすべての態様は有用であるが、ウシ成長ホルモンをコ
ードしているＤＮＡを含有するベクターおよび形質転換
体が好ましい。
７ ’、ｉ Ｚ ７ス（Ｓ、 ａｉｂｏｆａｃｉｅｎｓ
）、Ｓ、リヴイダンス（Ｓ、 １ｉｖｉｄａｎｓ）およ
びＳ、グリセオファスカス（Ｓ、 ｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ）などのグラム陽性原核生物などがある。本発明
のすべての態様は有用であるが、ウシ成長ホルモンをコ
ードしているＤＮＡを含有するベクターおよび形質転換
体が好ましい。
好ましいベクターには、ｐＣＺ１４９、ｐＣＺ１８３、
ｐＣＺ１８４、ｐＣＺ１４９．１、ｐＣＺ１４９，２、
ｐＣＺ１４９．３、ｐＣＺ１８３゜１およびｐＣＺ１８
３．２があり、好ましい形質転換体には、Ｅ、ｃｏｌ、
ｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ Ｒ，Ｖ３０８／ｐＣＺ１８４、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ １４９．１、
Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ １４
９．２、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ
１４９．３、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／
ｐＣＺ １８３．１およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ
３０８／ｐＣＺ１８３．２がある。
ｐＣＺ１８４、ｐＣＺ１４９．１、ｐＣＺ１４９，２、
ｐＣＺ１４９．３、ｐＣＺ１８３゜１およびｐＣＺ１８
３．２があり、好ましい形質転換体には、Ｅ、ｃｏｌ、
ｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３、Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ Ｒ，Ｖ３０８／ｐＣＺ１８４、Ｅ．Ｃｏ
ｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ １４９．１、
Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ １４
９．２、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ
１４９．３、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／
ｐＣＺ １８３．１およびＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ
３０８／ｐＣＺ１８３．２がある。
当業者であれば、理解されるであろうが、本発明の発現
ベクターおよび方法を使用して適当な宿主生物を形質転
換すれば、標準的な発酵条件下で外来性タンパク生産物
が発現される。次いで、得られた発酵ブロスから常法に
よって外来性タンパク生産物を単離する。以下の実施例
によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらには
、本発明のベクターの構築の説明およびその実際の操作
法の両方を適宜記載している。
ベクターおよび方法を使用して適当な宿主生物を形質転
換すれば、標準的な発酵条件下で外来性タンパク生産物
が発現される。次いで、得られた発酵ブロスから常法に
よって外来性タンパク生産物を単離する。以下の実施例
によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらには
、本発明のベクターの構築の説明およびその実際の操作
法の両方を適宜記載している。
実施例１
プラスミドｐＫＥＮＯ２１（第３図、１０６）のＸｂａ
ｌ−Ｂａｎ＋Ｈｒ開裂によって調製した〜５、ｌｋｂフ
ラグメントを出発物質として使用した。プラスミドｐＫ
ＥＮＯ２１はｐＫＥＮｌｌｌ（第１図、１０１、これは
さらにり−（Ｌｅｅ）らのジャーナル・オブ・バクテリ
オロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔ、） １４６４６１−８６６゜
１９８１およびライ−ベル（’Ｚｗｉｅｂｅｌ）らのＪ
、 Ｂａｃｔ、 １４５：６５４−６５６．１９８１に
記載されている）の誘導体であり、このｐＫＥＮｌ １
１はＥ．Ｃｏｌｉ ＣＣ６２０（ＮＲＲＬ受託番号１５
０１１）として寄託されており、またＥ．Ｃｏｌｉのリ
ポプロティン遺伝子を含有している〜２．８ｋｂフラグ
メントを有している。
ｌ−Ｂａｎ＋Ｈｒ開裂によって調製した〜５、ｌｋｂフ
ラグメントを出発物質として使用した。プラスミドｐＫ
ＥＮＯ２１はｐＫＥＮｌｌｌ（第１図、１０１、これは
さらにり−（Ｌｅｅ）らのジャーナル・オブ・バクテリ
オロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔ、） １４６４６１−８６６゜
１９８１およびライ−ベル（’Ｚｗｉｅｂｅｌ）らのＪ
、 Ｂａｃｔ、 １４５：６５４−６５６．１９８１に
記載されている）の誘導体であり、このｐＫＥＮｌ １
１はＥ．Ｃｏｌｉ ＣＣ６２０（ＮＲＲＬ受託番号１５
０１１）として寄託されており、またＥ．Ｃｏｌｉのリ
ポプロティン遺伝子を含有している〜２．８ｋｂフラグ
メントを有している。
このフラグメントに関する記述は、ナカムラおよびイノ
ウニのＣｅｌｌ １８：１１０９−１１１７．１９７９
にある。
ウニのＣｅｌｌ １８：１１０９−１１１７．１９７９
にある。
ｐＫＥＮＯ２１中、ｐＢＲ３２２の唯一のＢａｍＨ■お
よび５ａｉｌ制限部位間に於ける６ ５０ ｂｐ（塩基
対）配列を、Ｅ 、 ｃｏｔ ｉのリポプロティン遺伝
子から取った配列と置換した。このリポプロティン遺伝
子配列（ナカムラおよびイノウニ、１９７９）は、リポ
プロティン遺伝子の最初のトリプレット（メチオニン）
の上流にある、プロモーター、５′−非翻訳領域および
リボゾーム結合部位を含有する４６２ｂｐのＡｌｕｌフ
ラグメントを含んでいる。
よび５ａｉｌ制限部位間に於ける６ ５０ ｂｐ（塩基
対）配列を、Ｅ 、 ｃｏｔ ｉのリポプロティン遺伝
子から取った配列と置換した。このリポプロティン遺伝
子配列（ナカムラおよびイノウニ、１９７９）は、リポ
プロティン遺伝子の最初のトリプレット（メチオニン）
の上流にある、プロモーター、５′−非翻訳領域および
リボゾーム結合部位を含有する４６２ｂｐのＡｌｕｌフ
ラグメントを含んでいる。
唯一のＸｂａＩ制限部位が、翻訳開始メチオニンシグナ
ルから１６ｂｐ前のりボゾーム結合部位内に位置してい
る。構造遺伝子の翻訳終止コドンから１０５ｂｐ上流に
位置しているＰｖｕｎ制限部位を、合成りＮＡリンカ−
（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３′、コラボレイティブ・
リサーチ（Ｃｏｌ １ａｂｏｒａｔ ｉｖｅ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）から入手）を付加することによりＢａｍＨＩ
制限部位に変換した。リポプロティンの最後の３５アミ
ノ酸に対応するコード配列、翻訳終止シグナルおよびメ
ツセンジャーＲＮＡの３”−非翻訳領域に対応する配列
がこのＢａｍＨＩ部位の後ろに続いている。プラスミド
ｐＫＥＮＯ２１はまた、リポプロティン遺伝子と関連の
ない、Ｅ、ｃｏ１ｉ染色体内に於けるその下流に位置す
る約８５０ｂｐの外来性配列をも含有している。これら
の配列は、リポプロティン遺伝子を最初に単離する時に
使用した方法および制限酵素部位の結果、含まれたもの
である。
ルから１６ｂｐ前のりボゾーム結合部位内に位置してい
る。構造遺伝子の翻訳終止コドンから１０５ｂｐ上流に
位置しているＰｖｕｎ制限部位を、合成りＮＡリンカ−
（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３′、コラボレイティブ・
リサーチ（Ｃｏｌ １ａｂｏｒａｔ ｉｖｅ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）から入手）を付加することによりＢａｍＨＩ
制限部位に変換した。リポプロティンの最後の３５アミ
ノ酸に対応するコード配列、翻訳終止シグナルおよびメ
ツセンジャーＲＮＡの３”−非翻訳領域に対応する配列
がこのＢａｍＨＩ部位の後ろに続いている。プラスミド
ｐＫＥＮＯ２１はまた、リポプロティン遺伝子と関連の
ない、Ｅ、ｃｏ１ｉ染色体内に於けるその下流に位置す
る約８５０ｂｐの外来性配列をも含有している。これら
の配列は、リポプロティン遺伝子を最初に単離する時に
使用した方法および制限酵素部位の結果、含まれたもの
である。
プラスミドｐＫＥＮＯ２１は、以下の方法によってｐＫ
ＥＮｌ １１から誘導される（第１図、第２図および第
３図を参照）：ｐＫＥＮｌｌｌ （第１図、１０１）の
約５０ｕｇを、２０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ＝７．４
） 、１０ｍＭ ＭｇＣ（！−おヨヒ６ｎ＋Ｍ β−メ
ルカプトエタノールを含有する緩衝ｉ＆３００μρ中に
於いて、３７°Ｃで２時間、制限酵素Ｈｐａ１１２５単
位を用いて消化した。得られた混合物を、フェノールお
よびクロロホルム５０：５０の混液３００μｇで２回抽
出し、次いでエタ／−ル２．５容量および３Ｍ酢酸ナト
リウムＯ１■容量を用い、回収した水層を沈澱させた。
ＥＮｌ １１から誘導される（第１図、第２図および第
３図を参照）：ｐＫＥＮｌｌｌ （第１図、１０１）の
約５０ｕｇを、２０ｍＭトリス・ＨＣＱ（ｐＨ＝７．４
） 、１０ｍＭ ＭｇＣ（！−おヨヒ６ｎ＋Ｍ β−メ
ルカプトエタノールを含有する緩衝ｉ＆３００μρ中に
於いて、３７°Ｃで２時間、制限酵素Ｈｐａ１１２５単
位を用いて消化した。得られた混合物を、フェノールお
よびクロロホルム５０：５０の混液３００μｇで２回抽
出し、次いでエタ／−ル２．５容量および３Ｍ酢酸ナト
リウムＯ１■容量を用い、回収した水層を沈澱させた。
得られたＤＮＡペレットを電気泳動用緩衝液１００μｅ
に溶解し、５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミ
ド：ビス（Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）の
比率２９；１である。以下、特に明記しない限りすべて
のゲルもこれと同様である。）上で分画した。このゲル
を０．５μｇ／ｘσ臭化エチジウムを含有する溶液中で
染色し、バンドを長波長紫外光下で観察した。９５０ｂ
ｐバンドを単離し、透析バッグへの電気溶出（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によってゲルから回収した。フ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタ／−ル沈澱した後
、回収したＤＮＡ （約２．５ ｕ ｇ）をＴＥＮ （
１０ｍＭ ＮａＣＱ、１０ｍＭ ）リス−ＨＣｆ２（
ｐＨ＝７．４）および″ １ｍＭエチレンジニトリロ
テトラ酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ） 、ｐＨ＝８．０）
２５μＱに溶解した。
に溶解し、５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミ
ド：ビス（Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）の
比率２９；１である。以下、特に明記しない限りすべて
のゲルもこれと同様である。）上で分画した。このゲル
を０．５μｇ／ｘσ臭化エチジウムを含有する溶液中で
染色し、バンドを長波長紫外光下で観察した。９５０ｂ
ｐバンドを単離し、透析バッグへの電気溶出（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によってゲルから回収した。フ
ェノール／クロロホルム抽出し、エタ／−ル沈澱した後
、回収したＤＮＡ （約２．５ ｕ ｇ）をＴＥＮ （
１０ｍＭ ＮａＣＱ、１０ｍＭ ）リス−ＨＣｆ２（
ｐＨ＝７．４）および″ １ｍＭエチレンジニトリロ
テトラ酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ） 、ｐＨ＝８．０）
２５μＱに溶解した。
得られた９ ５０ｂｐ Ｈｐａｎルミｎフラグメントｇ
を、５０ｍＭ ＮａＣＱ、６ｎ＋Ｍ トリス−ＨＣＱ（
ｐＨ−７，６） 、６ｍＭ ＭｇＣ１２，および６ｍＭ
β−メルカブトエタノールを含有する緩衝液２００″μ
σ中に於いて、３７°Ｃで２時間、制限酵素Ａｌｕ■で
消化した。得られたＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、生成した４６２ｂｐＡ１ｕ■フラグメン
トを既述の方法によって回収し、精製した。この４６２
ｂｐＡ１ｕｌフラグメント（約１μｇ）を、リン酸化し
たＥｃｏＲＩリンカ−（５”ＧＧＡＡＴＴＣＣ３°、Ｃ
ｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手
）１５０ピコモルおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位
を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ３
リス・ＨＣｆｆ（ｐＨ＝７．６）、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ｑｔ−，１０ｍＭ ジチオトレイトール、０．４ｍＭ
ＡＴＰ）ＬＯｌｔＱに溶解した。４°Ｃで１６時間イン
キュベートした後、得られた混合物を６５°Ｃで１０分
間暖め、ＥｃｏＲＩ緩衝液（１００ｍＭ）リス・ＨＣＱ
（ｐＨ＝７．２） 、５０ｍＭＮａＣＱ、１０ｍＭ
ＭｇＣＱ、、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）およ
びＥｃｏＲＩ酵素４０単位を加えて希釈した。３７°Ｃ
で２時間経過した後、得られた試料を常法によりフェノ
ール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。次い
で、得られたＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ０．１
単位、および前もってＥ、ｃｏＲＩで線状化した後、ア
ルカリホスファターセで処理しておいたｐＢＲ３２２０
゜１μｇ（第１図、１０２）を含有するＴ４ ＤＮＡ
ｌ）ガーゼ緩衝液２０μσに溶解した。４°Ｃで１６
時間ライゲートした後、得られたＤＮＡを使用して常法
により、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株に１２ ＨＢＩＯＩを形質転
換した。１２μｇ／ｒｔｔＱテトラサイクリンを含有す
る寒天平板上で形質転換体を選別し、バーンポイム（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリ−（Ｄｏｌｙ）のヌクレ
イツク・アンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、 ７：１５１３−１５２３
．１９７９に記載されている迅速アルカリ性抽出法（ｒ
ａｐｉｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔ １ｏｎ
）によって耐性コロニーからプラスミドを単離した。４
６６ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントを含有するプラスミ
ド（第１図、１０３）を選別し、これを、以下に記載の
次工程に於ける出発物質として使用した。
を、５０ｍＭ ＮａＣＱ、６ｎ＋Ｍ トリス−ＨＣＱ（
ｐＨ−７，６） 、６ｍＭ ＭｇＣ１２，および６ｍＭ
β−メルカブトエタノールを含有する緩衝液２００″μ
σ中に於いて、３７°Ｃで２時間、制限酵素Ａｌｕ■で
消化した。得られたＤＮＡを６％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、生成した４６２ｂｐＡ１ｕ■フラグメン
トを既述の方法によって回収し、精製した。この４６２
ｂｐＡ１ｕｌフラグメント（約１μｇ）を、リン酸化し
たＥｃｏＲＩリンカ−（５”ＧＧＡＡＴＴＣＣ３°、Ｃ
ｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手
）１５０ピコモルおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位
を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（６６ｍＭ３
リス・ＨＣｆｆ（ｐＨ＝７．６）、 １０ｍＭ ＭｇＣ
Ｑｔ−，１０ｍＭ ジチオトレイトール、０．４ｍＭ
ＡＴＰ）ＬＯｌｔＱに溶解した。４°Ｃで１６時間イン
キュベートした後、得られた混合物を６５°Ｃで１０分
間暖め、ＥｃｏＲＩ緩衝液（１００ｍＭ）リス・ＨＣＱ
（ｐＨ＝７．２） 、５０ｍＭＮａＣＱ、１０ｍＭ
ＭｇＣＱ、、６ｍＭ β−メルカプトエタノール）およ
びＥｃｏＲＩ酵素４０単位を加えて希釈した。３７°Ｃ
で２時間経過した後、得られた試料を常法によりフェノ
ール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。次い
で、得られたＤＮＡを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ０．１
単位、および前もってＥ、ｃｏＲＩで線状化した後、ア
ルカリホスファターセで処理しておいたｐＢＲ３２２０
゜１μｇ（第１図、１０２）を含有するＴ４ ＤＮＡ
ｌ）ガーゼ緩衝液２０μσに溶解した。４°Ｃで１６
時間ライゲートした後、得られたＤＮＡを使用して常法
により、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株に１２ ＨＢＩＯＩを形質転
換した。１２μｇ／ｒｔｔＱテトラサイクリンを含有す
る寒天平板上で形質転換体を選別し、バーンポイム（Ｂ
ｉｒｎｂｏｉｍ）およびドーリ−（Ｄｏｌｙ）のヌクレ
イツク・アンノズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、 ７：１５１３−１５２３
．１９７９に記載されている迅速アルカリ性抽出法（ｒ
ａｐｉｄ ａｌｋａｌｉｎｅ ｅｘｔｒａｃｔ １ｏｎ
）によって耐性コロニーからプラスミドを単離した。４
６６ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメントを含有するプラスミ
ド（第１図、１０３）を選別し、これを、以下に記載の
次工程に於ける出発物質として使用した。
この得られたプラスミド（第２図、１０３）の約２ｕｇ
を、Ｈｉｎｄｕ緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣＱ、１０ｍＭ
）リス・ＨＣＱ （ｐＨ＝７．４） 、］ ００ｍＭＭ
ｇ ＣＱ ２および６ｍＭ β−メルカプトエタノール
）５０μσ中に於いて、３７°Ｃで１時間、酵素）（ｉ
ｎｄＩ［［２１位で消化した。フェノール／クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱させた後、得られたＤＮｊＡ
を、３００ｍＭ −ＮａＣ（！、 ３０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ＝４．２５）、１ ｍＭ Ｚ ｎＣＱ２およ
びＳｌヌクレアーゼ（マイルス（Ｍｉｌｅｓ）・ラボラ
トリ−）２００単位を含有する緩衝液２００μＱに溶解
した。１５℃で１時間経過した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱によって反応を停止さ
せた。得られたＤＮＡを、リン酸化ＢａｍＨＩリンカ−
（５″ＣＣＧ Ｇ Ａ Ｔ ＣＣＧＧ３’、Ｃｏ１１ａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピ
コモルおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｅに溶解した。４
°Ｃで１６時間経過した後、得られた反応混合物を６５
°Ｃに１０分間暖め、リガーゼを不活性にし、次いでＢ
ａｍＨ１酵素２０単位を含有するＢａＩＩＩＨｒ緩衝液
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ２．２０ｍＭ トリス−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ＝８．０）、１０ｍＭＭｇｃＬ、６ｍＭ β−
メルカプトエタノール）１００μＣを加えて希釈した。
を、Ｈｉｎｄｕ緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣＱ、１０ｍＭ
）リス・ＨＣＱ （ｐＨ＝７．４） 、］ ００ｍＭＭ
ｇ ＣＱ ２および６ｍＭ β−メルカプトエタノール
）５０μσ中に於いて、３７°Ｃで１時間、酵素）（ｉ
ｎｄＩ［［２１位で消化した。フェノール／クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱させた後、得られたＤＮｊＡ
を、３００ｍＭ −ＮａＣ（！、 ３０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ＝４．２５）、１ ｍＭ Ｚ ｎＣＱ２およ
びＳｌヌクレアーゼ（マイルス（Ｍｉｌｅｓ）・ラボラ
トリ−）２００単位を含有する緩衝液２００μＱに溶解
した。１５℃で１時間経過した後、フェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱によって反応を停止さ
せた。得られたＤＮＡを、リン酸化ＢａｍＨＩリンカ−
（５″ＣＣＧ Ｇ Ａ Ｔ ＣＣＧＧ３’、Ｃｏ１１ａ
ｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピ
コモルおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液１０μｅに溶解した。４
°Ｃで１６時間経過した後、得られた反応混合物を６５
°Ｃに１０分間暖め、リガーゼを不活性にし、次いでＢ
ａｍＨ１酵素２０単位を含有するＢａＩＩＩＨｒ緩衝液
（１５０ｍＭ ＮａＣｌ２．２０ｍＭ トリス−ＨＣ
Ｑ（ｐＨ＝８．０）、１０ｍＭＭｇｃＬ、６ｍＭ β−
メルカプトエタノール）１００μＣを加えて希釈した。
３７°Ｃで２時間経過した後、得られた混合物を１％ア
ガロースゲル上で精製した。このゲルを染色し、凍結後
に、溶出によって比較的大きいフラグメント（〜４ 、
５ ｋｂ）を回収し、次いでフェノール／クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱して精製した。ＢａｍＨＩ粘着
末端を有する回収したフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ０．１単位を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ
緩衝液２０μＱに溶解した。４°Ｃで１６時間経過した
後、得られたＤＮＡを使用してＥ．ＣｏｌｉＨＢｌｏｌ
を形質転換した。１００μｇ／村のアンピシリンの耐性
能（Ａｐつによって形質転換体を選別し、１０ｕｇ／ｘ
Ｑテトラサイクリンに対する感受性（Ｔｃ’）について
スクリーニングした。既述したバーンボイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）の操作によって、Ａｐ’Ｔｃ”であるコロニ
ーから幾つかのプラスミドを調製し、これらをＨｉｎｄ
ｌ１１部位の不存在および単一のＢａｍＨ１部位の存在
について検査した。ＥｃｏＲＩ、５ａｉｌで連続的に消
化し、４６６ｂｐおよび３０５ｂｐフラグメントを得た
。
ガロースゲル上で精製した。このゲルを染色し、凍結後
に、溶出によって比較的大きいフラグメント（〜４ 、
５ ｋｂ）を回収し、次いでフェノール／クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱して精製した。ＢａｍＨＩ粘着
末端を有する回収したフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡ
リガーゼ０．１単位を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ
緩衝液２０μＱに溶解した。４°Ｃで１６時間経過した
後、得られたＤＮＡを使用してＥ．ＣｏｌｉＨＢｌｏｌ
を形質転換した。１００μｇ／村のアンピシリンの耐性
能（Ａｐつによって形質転換体を選別し、１０ｕｇ／ｘ
Ｑテトラサイクリンに対する感受性（Ｔｃ’）について
スクリーニングした。既述したバーンボイム（Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍ）の操作によって、Ａｐ’Ｔｃ”であるコロニ
ーから幾つかのプラスミドを調製し、これらをＨｉｎｄ
ｌ１１部位の不存在および単一のＢａｍＨ１部位の存在
について検査した。ＥｃｏＲＩ、５ａｉｌで連続的に消
化し、４６６ｂｐおよび３０５ｂｐフラグメントを得た
。
これらの特徴を有するプラスミド（第２図、１０４）を
選別し、次いでｌｐｐプロモーターの上流に位置するＥ
ｃｏＲ１部位をＨｉｎｄＩ［ｒ制限部位に変換するよう
修飾した。
選別し、次いでｌｐｐプロモーターの上流に位置するＥ
ｃｏＲ１部位をＨｉｎｄＩ［ｒ制限部位に変換するよう
修飾した。
プラスミド（第２図、１０４）２μｇを、Ｅｃ。
ＲＩｏ、２単位を含有するＥｃｏＲＩ緩衝液１００μＱ
中に於いて、３７°Ｃで１０分間消化した。６５℃に１
０分間暖めることで、反応を停止させ、次いでフェノー
ル／クロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈澱
させ、１０００単位／ｍＱのＳｌヌクレアーゼを含有す
るｓ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μＱに溶解し、１２°
Ｃで１時間反応させた。この反応をフェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱することで停止させた
。
中に於いて、３７°Ｃで１０分間消化した。６５℃に１
０分間暖めることで、反応を停止させ、次いでフェノー
ル／クロロホルム抽出した後、ＤＮＡをエタノール沈澱
させ、１０００単位／ｍＱのＳｌヌクレアーゼを含有す
るｓ１ヌクレアーゼ緩衝液２００μＱに溶解し、１２°
Ｃで１時間反応させた。この反応をフェノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱することで停止させた
。
得られたＤＮＡを、リン酸化ＨｉｎｄＩ［［リンカ−（
５″ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ３’、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピコモルおよ
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液１０μＱに再懸濁した。４°Ｃで１
６時間経過した後、得られた混合物を６５°Ｃに１０分
間暖め、ＨｉｎｄＩ［Ｉ酵素１０単位を含有するＨｉｎ
ｄＩ［［緩衝液１５０μＱに希釈し、３７°Ｃで２時間
インキュベートした後、１％アガロースゲル上で分画し
た。
５″ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧ３’、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピコモルおよ
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼ緩衝液１０μＱに再懸濁した。４°Ｃで１
６時間経過した後、得られた混合物を６５°Ｃに１０分
間暖め、ＨｉｎｄＩ［Ｉ酵素１０単位を含有するＨｉｎ
ｄＩ［［緩衝液１５０μＱに希釈し、３７°Ｃで２時間
インキュベートした後、１％アガロースゲル上で分画し
た。
最も大きなバンド（１回切断のプラスミドに相当）を常
法により回収して精製し、Ｔ４ リガーゼ０゜２単位を
含有するＴ４ リガーゼ緩衝液２０ａＱに溶解し、４℃
で１６時間インキュベートした。
法により回収して精製し、Ｔ４ リガーゼ０゜２単位を
含有するＴ４ リガーゼ緩衝液２０ａＱに溶解し、４℃
で１６時間インキュベートした。
次いで、得られたＤＮＡを使用してＥ．Ｃｏｌｉ ＨＢ
１０］を形質転換した。アンピシリン耐性によって形質
転換体を選別し、常法によりプラスミドを単離し、制限
酵素分析により分析した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメント５００ｂｐを有するプラスミド（第２図、
１０５）を選別し、これをＩｐｐ遺伝子の３゛領域を付
加するためのクローニングベクターとして使用した。
１０］を形質転換した。アンピシリン耐性によって形質
転換体を選別し、常法によりプラスミドを単離し、制限
酵素分析により分析した。ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメント５００ｂｐを有するプラスミド（第２図、
１０５）を選別し、これをＩｐｐ遺伝子の３゛領域を付
加するためのクローニングベクターとして使用した。
プラスミド（第３図、１０５）約２μｇを、５ａｉｌ２
単位を含有する５ａｌＴ制限緩衝液（１５０ｍＭＮａｃ
ｆ２．６ｍＭトリス−ＨＣｆｆｌ （ｐＨ＝７．９）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２２および６ｍＭβ−メルカプトエタ
ノール）中に於いて、３７℃で１時間消化し、次いで２
単位のＢａｍＨＩを含有するＢａｍＨＩ緩衝液１５ｃ）
Ｉ＆で希釈した。３７°Ｃで１時間経過した後、アルカ
リホスファターゼ２．５単位を加え、次いで６５°Ｃで
１時間インキュベートした。得られた物質をフェノール
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してＴＥＮに溶
解し、これをｌｐｐ ３′フラグメントのためのクロー
ニングベクターとして使用した。
単位を含有する５ａｌＴ制限緩衝液（１５０ｍＭＮａｃ
ｆ２．６ｍＭトリス−ＨＣｆｆｌ （ｐＨ＝７．９）、
６ｍＭ ＭｇＣｌ２２および６ｍＭβ−メルカプトエタ
ノール）中に於いて、３７℃で１時間消化し、次いで２
単位のＢａｍＨＩを含有するＢａｍＨＩ緩衝液１５ｃ）
Ｉ＆で希釈した。３７°Ｃで１時間経過した後、アルカ
リホスファターゼ２．５単位を加え、次いで６５°Ｃで
１時間インキュベートした。得られた物質をフェノール
／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してＴＥＮに溶
解し、これをｌｐｐ ３′フラグメントのためのクロー
ニングベクターとして使用した。
１ｐｐ３“領域を含有するフラグメントを得るために、
ｐＫＥＮｌｌｌ（第３図、＋０１）１０μｇを、Ｈｐａ
ｒｌＯ単位を含有するＨｐａｒ緩衝液（２０ｍＭ ＫＣ
Ｑ、１０ｍＭ トリス・ＨＣｌ２（ｐＨ−７４） 、１
０ｍＭ ＭｇＣＱｖ および６ｍＭ β−メルカプトエ
タ／−ル）中に於いて、３７℃で２時間消化した。フェ
ノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した後、
得られたＤＮＡを、リン酸化５ａｌｌリンカ−（５’Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ３°、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピコモルおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４Ｄ Ｎ Ａ ｌｌ
ガーゼ緩衝液１０μＱに溶解し、次いで４°Ｃで１６時
間インキュベートした。このリガーゼを、６５°Ｃに１
０分間暖めて不活性化した。得られた物質を、５ａｌｌ
酵素１０単位含有する５ａｌＩ緩衝液１００μＱに加え
て希釈し、３７°Ｃで１０Ｍインキュベートし、次いで
ＰｖｕＩＩ制限酵素１０単位を含有するＰｖｕｌＩ緩衝
液（６０ｍＭ ＮａＣＱ、６ｍＭ）リス・ＨＣＱ （ｐ
Ｈ＝７．５） 、６ｍＭ ＭｇＣＱ、および６ｍＭβ−
メルカプトエタノール）３００μＱで希釈した。３７°
Ｃで１時間経過した後、得られたＤＮＡを５％ポリアク
リルアミドゲル上で分画した。９５０ｂｐフラグメント
約０．５μｇを回収し、精製し、ＴＥＮに溶解した。こ
のフラグメント０．２μｇを、リン酸化ＢａｍＨＩリン
カ−（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３’、Ｃｏ１１ａｂ。
ｐＫＥＮｌｌｌ（第３図、＋０１）１０μｇを、Ｈｐａ
ｒｌＯ単位を含有するＨｐａｒ緩衝液（２０ｍＭ ＫＣ
Ｑ、１０ｍＭ トリス・ＨＣｌ２（ｐＨ−７４） 、１
０ｍＭ ＭｇＣＱｖ および６ｍＭ β−メルカプトエ
タ／−ル）中に於いて、３７℃で２時間消化した。フェ
ノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した後、
得られたＤＮＡを、リン酸化５ａｌｌリンカ−（５’Ｇ
ＧＴＣＧＡＣＣ３°、Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピコモルおよびＴ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４Ｄ Ｎ Ａ ｌｌ
ガーゼ緩衝液１０μＱに溶解し、次いで４°Ｃで１６時
間インキュベートした。このリガーゼを、６５°Ｃに１
０分間暖めて不活性化した。得られた物質を、５ａｌｌ
酵素１０単位含有する５ａｌＩ緩衝液１００μＱに加え
て希釈し、３７°Ｃで１０Ｍインキュベートし、次いで
ＰｖｕＩＩ制限酵素１０単位を含有するＰｖｕｌＩ緩衝
液（６０ｍＭ ＮａＣＱ、６ｍＭ）リス・ＨＣＱ （ｐ
Ｈ＝７．５） 、６ｍＭ ＭｇＣＱ、および６ｍＭβ−
メルカプトエタノール）３００μＱで希釈した。３７°
Ｃで１時間経過した後、得られたＤＮＡを５％ポリアク
リルアミドゲル上で分画した。９５０ｂｐフラグメント
約０．５μｇを回収し、精製し、ＴＥＮに溶解した。こ
のフラグメント０．２μｇを、リン酸化ＢａｍＨＩリン
カ−（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧ３’、Ｃｏ１１ａｂ。
ｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈから入手）２０ピコモ
ルおよびＴ４．ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μａに希釈し、次いで４°
Ｃで１６時間インキュベートした。次いで、得られたＤ
ＮＡを６５°Ｃに１０分間暖め、ＢａｍＨＩ２Ｑ単位を
含有するＢａｍＨＩ緩衝液１００μｇに希釈し、３７°
Ｃで２時間インキュベートした後、５％ポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカ−分子を除去した。
ルおよびＴ４．ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するＴ４
ＤＮＡリガーゼ緩衝液２０μａに希釈し、次いで４°
Ｃで１６時間インキュベートした。次いで、得られたＤ
ＮＡを６５°Ｃに１０分間暖め、ＢａｍＨＩ２Ｑ単位を
含有するＢａｍＨＩ緩衝液１００μｇに希釈し、３７°
Ｃで２時間インキュベートした後、５％ポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカ−分子を除去した。
得られたＢａｍＨＩおよび５ａｌｌ粘着末端を有する９
５０ｂｌ）フラグメントを常法により精製し、既述した
クローニングベクター〇、２μｇおよびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ０．２単位をともに含有するＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液２０μａに溶解した。４℃で１６時間イン
キュベートした後、得られたＤ Ｎ Ａを使用してＥ．
ＣｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩを形質転換した。アンピシ
リン耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、常法に
よりＳａｌ Ｉ −ＢａｍＨＩフラグメントに関して分
析した。所望のプラスミド（〜５．２ ｋｂ）をｐＫＥ
ＮＯ２１と命名したく第３図、１０６）。
５０ｂｌ）フラグメントを常法により精製し、既述した
クローニングベクター〇、２μｇおよびＴ４ ＤＮＡ
リガーゼ０．２単位をともに含有するＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液２０μａに溶解した。４℃で１６時間イン
キュベートした後、得られたＤ Ｎ Ａを使用してＥ．
ＣｏｌｉＫ１２ ＨＢＩＯＩを形質転換した。アンピシ
リン耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、常法に
よりＳａｌ Ｉ −ＢａｍＨＩフラグメントに関して分
析した。所望のプラスミド（〜５．２ ｋｂ）をｐＫＥ
ＮＯ２１と命名したく第３図、１０６）。
ｐＫＥＮＯ２１の１０μｇを、Ｘ ｂａ Ｉ ／ Ｂ
ａｍＨＩ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣＱ、ｌ ＯｍＭ
ト’） ス−ＨＣＱ、（１）Ｈ＝８）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＣＱｌおよび６ｍＭβ−メルカプトエタノール＞２００
μρ中に於いて、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７°
Ｃで１時間、次いでＸｂａＩＩＱ単位を用いてさらに１
時間消化した。次いで、アルカリホスファターゼ２゜５
単位で１５時間６５°Ｃに於いて処理し、フェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱によって所望のＸ
ｂａｌ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを捕集し、これをＴＥＮ
５０μＱに溶解して以後の使用に備えた（第３図、１０
７）。
ａｍＨＩ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣＱ、ｌ ＯｍＭ
ト’） ス−ＨＣＱ、（１）Ｈ＝８）、１０ｍＭ Ｍｇ
ＣＱｌおよび６ｍＭβ−メルカプトエタノール＞２００
μρ中に於いて、１０単位のＢａｍＨＩを用いて３７°
Ｃで１時間、次いでＸｂａＩＩＱ単位を用いてさらに１
時間消化した。次いで、アルカリホスファターゼ２゜５
単位で１５時間６５°Ｃに於いて処理し、フェノール／
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱によって所望のＸ
ｂａｌ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを捕集し、これをＴＥＮ
５０μＱに溶解して以後の使用に備えた（第３図、１０
７）。
Ｂ、プラスミドｐＮＭ５７５の構築
マーンヤル（Ｍａｒｔｉａｌ）らサイエンス２０５：６
０２−６０７゜１９７９に記載されているプラスミドｐ
ｔｒｐＥ Ｄ ５０ ｃｈＧＨ８００（第４図、１０８
）を、ヒト成長ホルモン遺伝子の一部をフードしている
コード配列を含有するＤＮＡフラグメントの供給源とし
て使用した。このフラグメントは、合成によっても構築
することができ「イタクラら（１９７７）およびフレア
（Ｃｒｅａ）ら（１９７８）］ 、あるいはヒトの下垂
体からヒト成長ホルモンをコードしているｍＲＮＡを単
離することによって、グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら
のメソッズ・イン・エンザイモロギー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、 ６８ニア５−９０
．１９７９に記載された容認されている方法により得る
ことができる。プラスミドｐｔｒｐＥ Ｄ ５０ ｃｈ
Ｇ、Ｈ８００のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、その遺
伝子の翻訳終止コドンから６ｂｐ下流に１つのＳｍａｌ
制限部位を有している。
０２−６０７゜１９７９に記載されているプラスミドｐ
ｔｒｐＥ Ｄ ５０ ｃｈＧＨ８００（第４図、１０８
）を、ヒト成長ホルモン遺伝子の一部をフードしている
コード配列を含有するＤＮＡフラグメントの供給源とし
て使用した。このフラグメントは、合成によっても構築
することができ「イタクラら（１９７７）およびフレア
（Ｃｒｅａ）ら（１９７８）］ 、あるいはヒトの下垂
体からヒト成長ホルモンをコードしているｍＲＮＡを単
離することによって、グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら
のメソッズ・イン・エンザイモロギー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、 ６８ニア５−９０
．１９７９に記載された容認されている方法により得る
ことができる。プラスミドｐｔｒｐＥ Ｄ ５０ ｃｈ
Ｇ、Ｈ８００のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、その遺
伝子の翻訳終止コドンから６ｂｐ下流に１つのＳｍａｌ
制限部位を有している。
この部位を以下の操作によってＢａｍＨＩ部位に変換し
た。このプラスミド６μｇを、Ｓ ｍａ Ｉ制限緩衝液
（１５ｍＭトリス−ＨＣ（！ （ｐＨ＝８．０）、６ｍ
Ｍ Ｍ ｇ ＣＱ ２．１５ｍＭＫＣｇおよび６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）２００μσ中に於いて、３
７°Ｃで１．５時間、Ｓｍａ１６単位で消化した。消化
が完全に終了した後、フェノール／クロロホルム抽出を
行い、エタノール沈澱によって、得られたＤＮＡを回収
し、次いでＴＥＮ２４μρに溶解した。リン酸化Ｂａｍ
ＨＩアダプターフラグメント（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） ４０ピコモルを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する上記の消化プラスミド
０．５１１ ｇ （０，２ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｅｎｄ
ｓ）のりガーゼ緩衝液１６μρに加えた。得られた混合
物を２２℃で２時間、４°Ｃで１６時間、次いで６５°
Ｃで１０分間インキュベートした。ＢａｍＨＩ制限酵素
で通常の消化を行いＢａｍＨＩ粘着末端を生成させた。
た。このプラスミド６μｇを、Ｓ ｍａ Ｉ制限緩衝液
（１５ｍＭトリス−ＨＣ（！ （ｐＨ＝８．０）、６ｍ
Ｍ Ｍ ｇ ＣＱ ２．１５ｍＭＫＣｇおよび６ｍＭ
β−メルカプトエタノール）２００μσ中に於いて、３
７°Ｃで１．５時間、Ｓｍａ１６単位で消化した。消化
が完全に終了した後、フェノール／クロロホルム抽出を
行い、エタノール沈澱によって、得られたＤＮＡを回収
し、次いでＴＥＮ２４μρに溶解した。リン酸化Ｂａｍ
ＨＩアダプターフラグメント（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） ４０ピコモルを、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼ２単位を含有する上記の消化プラスミド
０．５１１ ｇ （０，２ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｅｎｄ
ｓ）のりガーゼ緩衝液１６μρに加えた。得られた混合
物を２２℃で２時間、４°Ｃで１６時間、次いで６５°
Ｃで１０分間インキュベートした。ＢａｍＨＩ制限酵素
で通常の消化を行いＢａｍＨＩ粘着末端を生成させた。
この酵素は、得られたリンカ−配列を開裂させ、またク
ローンされたヒト成長ホルモンｃＤＮＡ配列の始めに位
置するＢａｍＨ１部分をも開裂させた。６％ポリアクリ
ルアミドゲルで分離し、次いで常法により回収すること
で、粘着ＢａｍＨＩ末端を有する６９１ｂｐのフラグメ
ントを得た。回収したＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ
Ｉ消化し、かつアルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ
３２２（第４図、１０２）とライゲートした［これには
、既述の条件下で２０μｅ緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ０．２単位を使用した］。４°Ｃで１６時間経過
した後、得られた物質を使用してＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＪＡ
２２１ （ＮＲＲＬ番号Ｂ−１５０１４）を形質転換し
た［ウェンシカ（Ｗｅｎｓｉｎｋ）らのＣｅｌｌ、 ３
：３１５−３２５．１９７４の形質転換法に実質的に従
った］。形質転換体を１００μｇ／ｚσアンピシリンを
含有した寒天平板上で選別し、次いでプラスミドを常法
により単離し、制限酵素分析および電気泳動分析によっ
て同定した。所望のプラスミド［ｐＮＭ５７５と命名（
第４図、１０９）］は、大きさが約７００ｂｐのＢａｍ
ＨＩフラグメントを含有しており、これを以後の使用の
ために増幅させた。
ローンされたヒト成長ホルモンｃＤＮＡ配列の始めに位
置するＢａｍＨ１部分をも開裂させた。６％ポリアクリ
ルアミドゲルで分離し、次いで常法により回収すること
で、粘着ＢａｍＨＩ末端を有する６９１ｂｐのフラグメ
ントを得た。回収したＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ
Ｉ消化し、かつアルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ
３２２（第４図、１０２）とライゲートした［これには
、既述の条件下で２０μｅ緩衝液中、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼ０．２単位を使用した］。４°Ｃで１６時間経過
した後、得られた物質を使用してＥ．Ｃｏｌｉ菌株ＪＡ
２２１ （ＮＲＲＬ番号Ｂ−１５０１４）を形質転換し
た［ウェンシカ（Ｗｅｎｓｉｎｋ）らのＣｅｌｌ、 ３
：３１５−３２５．１９７４の形質転換法に実質的に従
った］。形質転換体を１００μｇ／ｚσアンピシリンを
含有した寒天平板上で選別し、次いでプラスミドを常法
により単離し、制限酵素分析および電気泳動分析によっ
て同定した。所望のプラスミド［ｐＮＭ５７５と命名（
第４図、１０９）］は、大きさが約７００ｂｐのＢａｍ
ＨＩフラグメントを含有しており、これを以後の使用の
ために増幅させた。
Ｃ，プラスミドｐ ＮＭ６４５の構築
成熟ヒト成長ホルモンのＤＮＡ配列は、最初のヌクレオ
チドから４７ｂｐにある１つのＦｎｕＤＩ［部位を含有
している。２５μｇのｐＮＭ５７５を、２５単位のＢａ
ｍＨＩを含有するＢａｍＨＩ緩衝液２５０μσ中に於い
て３７°Ｃて１時間消化した。ＢａｍＨＩ粘着末端を有
する６９１ｂｐフラグメントを常法により６％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、精製した。このフラグメン
トを精製した後、そのｌ／３（プラスミド８μｇに相当
）を、２５単位Ｆ ｎｕＤ １１を含有したＦｎｕＤＩ
Ｔ緩衝液（６ｍＭＮａＣ１２，６ｍＭ）リス−ＨＣ（１
（ｐＨ＝７．４）、６ｍＭ ＭｇＣＱ＊、および６ｍＭ
β−メルカブトエ９／−ル） １００ｔｔ（ｌ テ、
３７°Ｃに於イテ１．５時間消化した。６％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行い、標準的な方法で回収し
、その遺伝子の後部１７５アミノ酸およびその後の翻訳
終止シグナルをコードしているコード配列を含有する５
３８ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。
チドから４７ｂｐにある１つのＦｎｕＤＩ［部位を含有
している。２５μｇのｐＮＭ５７５を、２５単位のＢａ
ｍＨＩを含有するＢａｍＨＩ緩衝液２５０μσ中に於い
て３７°Ｃて１時間消化した。ＢａｍＨＩ粘着末端を有
する６９１ｂｐフラグメントを常法により６％ポリアク
リルアミドゲルから単離し、精製した。このフラグメン
トを精製した後、そのｌ／３（プラスミド８μｇに相当
）を、２５単位Ｆ ｎｕＤ １１を含有したＦｎｕＤＩ
Ｔ緩衝液（６ｍＭＮａＣ１２，６ｍＭ）リス−ＨＣ（１
（ｐＨ＝７．４）、６ｍＭ ＭｇＣＱ＊、および６ｍＭ
β−メルカブトエ９／−ル） １００ｔｔ（ｌ テ、
３７°Ｃに於イテ１．５時間消化した。６％ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行い、標準的な方法で回収し
、その遺伝子の後部１７５アミノ酸およびその後の翻訳
終止シグナルをコードしているコード配列を含有する５
３８ｂｐＤＮＡフラグメントを単離した。
このヒト成長ホルモンコード領域にｌｐｐプロモーター
領域を結合させるために、二重鎖のＤＮＡフラグメント
（第５図、１ｌＯ）をホスホトリエステル法によって合
成した。この二重鎖のＤＮＡフラグメントは、下記の配
列を有している：祖阻工 このフラグメントは、以下のセグメントを調製すること
によって、容認されているホスホトリエステル方法論に
基づいて調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ５）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ８）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ９）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ｔｏ）ＡＴＧＧＧＡＡ １１）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）Ｃ，ＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 調製した上記セグメントを使用し、Ｔ４リガーセにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った： ａ）５°−非リン酸化セグメント１を、５゛−リン酸化
セグメント９の存在下にＴ４リガーゼを使用して５゛−
リン酸化セグメント２に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子ｌを
調製した［ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９−１５１
．１９７９］。
領域を結合させるために、二重鎖のＤＮＡフラグメント
（第５図、１ｌＯ）をホスホトリエステル法によって合
成した。この二重鎖のＤＮＡフラグメントは、下記の配
列を有している：祖阻工 このフラグメントは、以下のセグメントを調製すること
によって、容認されているホスホトリエステル方法論に
基づいて調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＡＣＣＡＴＴＣＣＣ ５）ＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣ ７）ＴＴＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧ ８）ＣＴＡＴＧＣＴＣＣＧ ９）ＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＣＴ ｔｏ）ＡＴＧＧＧＡＡ １１）ＣＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ １２）ＧＧＴＴＧＧＧＡＡ １３）Ｃ，ＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴ １４）ＧＴＣＡＡＡＡＡＧＣＣＴ １５）ＣＧＧＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＴ 調製した上記セグメントを使用し、Ｔ４リガーセにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った： ａ）５°−非リン酸化セグメント１を、５゛−リン酸化
セグメント９の存在下にＴ４リガーゼを使用して５゛−
リン酸化セグメント２に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子ｌを
調製した［ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９−１５１
．１９７９］。
この二本鎖分子を１５％ポリアクリルアミドの調製用ゲ
ル電気泳動によって単離した。
ル電気泳動によって単離した。
ｂ）５′−リン酸化セグメント３を、５′−リン酸化セ
グメント１１の存在下にＴ４リガーゼを使用して５”−
リン酸化セグメント４に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子２を
調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。
グメント１１の存在下にＴ４リガーゼを使用して５”−
リン酸化セグメント４に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子２を
調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。
Ｃ）５″−リン酸化セグメント５を、５゛−リン酸化セ
グメント１２および１３の存在下にＴ４１／ガーゼを使
用して５′−リン酸化セグメント６に結合し、二本鎖Ｄ
ＮＡ分子３を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
グメント１２および１３の存在下にＴ４１／ガーゼを使
用して５′−リン酸化セグメント６に結合し、二本鎖Ｄ
ＮＡ分子３を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
ｄ）５゛−リン酸化セグメント７を、５°−リン酸化セ
グメント１４および５゛−非リン酸セグメント１５の存
在下にＴ４リガーゼを使用して５“−リン酸化セグメン
ト８に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子４を調製し、次いでこ
の二本鎖分子を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。
グメント１４および５゛−非リン酸セグメント１５の存
在下にＴ４リガーゼを使用して５“−リン酸化セグメン
ト８に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子４を調製し、次いでこ
の二本鎖分子を１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。
ｅ）次いで、得られた二本鎖ＤＮＡ分子２．３および４
を、Ｔ４リガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖ＤＮ
Ａ分子５を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
を、Ｔ４リガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖ＤＮ
Ａ分子５を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
ｆ）５°−リン酸化セグメント１０および二本ｌＤＮＡ
分子５を、Ｔ４リガーゼの存在下に二本鎖ＤＮＡ分子ｌ
に加えた。得られた二本鎖ＤＮＡ分子（第５図、１１０
）を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精
製した。次いで、この二本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび［γ−Ｐ”］ ＡＴＰを使用
して酵素学的にリン酸化し、次いで確立された操作に付
した。
分子５を、Ｔ４リガーゼの存在下に二本鎖ＤＮＡ分子ｌ
に加えた。得られた二本鎖ＤＮＡ分子（第５図、１１０
）を１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精
製した。次いで、この二本鎖ＤＮＡ分子を、Ｔ４ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび［γ−Ｐ”］ ＡＴＰを使用
して酵素学的にリン酸化し、次いで確立された操作に付
した。
プラスミドｐＫＥＮＯ２１のＸｂａｌ −ＢａｍＨＴフ
ラグメント（第５図、１０７）０．’１ピコモル（０，
４μｇＬ合成りＮＡフラグメント（第５図、１１０）０
．０２５ピコモルおよび５３８ｂｐフラグメント（第５
図に於ける１０９由来）０゜３ピコモル（０，０８μｇ
）を、Ｔ４ ＤＮＡリガーセ１．５単位を使用したラ
イゲート緩衝液２４μσ中で酵素学的に結合させ、発現
プラスミドｐＮＭ６４５を構築した。４°Ｃで１６時間
インキュベートした後、得られた混合物を使用して、既
述のようにＥ．Ｃｏｌｉ Ｊ Ａ２２１を形質転換した
。ｌＯＯμｇ／ｘ（ｌアンピシリンを含有した寒天平板
を用いて形質転換体を選別し、これを、所望の発現プラ
スミドの好ましい供給源として常法、により培養した。
ラグメント（第５図、１０７）０．’１ピコモル（０，
４μｇＬ合成りＮＡフラグメント（第５図、１１０）０
．０２５ピコモルおよび５３８ｂｐフラグメント（第５
図に於ける１０９由来）０゜３ピコモル（０，０８μｇ
）を、Ｔ４ ＤＮＡリガーセ１．５単位を使用したラ
イゲート緩衝液２４μσ中で酵素学的に結合させ、発現
プラスミドｐＮＭ６４５を構築した。４°Ｃで１６時間
インキュベートした後、得られた混合物を使用して、既
述のようにＥ．Ｃｏｌｉ Ｊ Ａ２２１を形質転換した
。ｌＯＯμｇ／ｘ（ｌアンピシリンを含有した寒天平板
を用いて形質転換体を選別し、これを、所望の発現プラ
スミドの好ましい供給源として常法、により培養した。
ヒト成長ホルモンの発現を、標準的な放射免疫検定法（
ラジオイムノア、ライ）［ツォーメイ（Ｔｗｏｍｅｙ）
ら、クリニカル・ケミストリー（ＣＩ ｉｎ、 Ｃｈｅ
ｍ、 ）２０：３８９−３９１． ｆ９７４］によって
検出し、細胞１個当たりに少なくとも２００万個の分子
があることを確認した。
ラジオイムノア、ライ）［ツォーメイ（Ｔｗｏｍｅｙ）
ら、クリニカル・ケミストリー（ＣＩ ｉｎ、 Ｃｈｅ
ｍ、 ）２０：３８９−３９１． ｆ９７４］によって
検出し、細胞１個当たりに少なくとも２００万個の分子
があることを確認した。
Ｄ、プラスミドｐＮＭ７８９の構築
プラスミドｐＮＭ６４５（第６図、１１１）、ヒト成長
ホルモンの発現プラスミドを、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ −Ｐ
ｒｏ −Ｌ ｅｕ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓ
ｐ −Ａ ｓｐ −Ｌ ｙｓ−ｂＧＨを発現するプラス
ミドを構築するための出発物質として使用した。
ホルモンの発現プラスミドを、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ −Ｐ
ｒｏ −Ｌ ｅｕ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓ
ｐ −Ａ ｓｐ −Ｌ ｙｓ−ｂＧＨを発現するプラス
ミドを構築するための出発物質として使用した。
ウシ成長ホルモン遺伝子の一部をコードしているコード
配列を含有する２つのＤＮＡフラグメントの供給源とし
て、ミラー（ｌｉｌｌｅｒ）らのジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉ。
配列を含有する２つのＤＮＡフラグメントの供給源とし
て、ミラー（ｌｉｌｌｅｒ）らのジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、 Ｂｉ。
１、 Ｃｈｅｍ、２５５ニア５２１−７５２４．１９８
０）に開示されたプラスミドｐＢＰ３４８ （第６図、
１１２）を使用した。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２
のＰｓｔｌ制限部位にクローンされている８３１ｂｐウ
シ成長ホルモンコ一ド配列を含有している。ミラーら［
１９８０］に開示されている方法の替わりとして、ウシ
成長ホルモンのこの配列は合成により構築することがで
き［イタクラら、１９７７およびフレアら、１９７８］
、あるいはグツドマンら（１９７９）に開示された今
では常套手段である手法によってウシ下垂体から単離し
たメツセンジャーＲＮＡから得ることもできる。
０）に開示されたプラスミドｐＢＰ３４８ （第６図、
１１２）を使用した。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２
のＰｓｔｌ制限部位にクローンされている８３１ｂｐウ
シ成長ホルモンコ一ド配列を含有している。ミラーら［
１９８０］に開示されている方法の替わりとして、ウシ
成長ホルモンのこの配列は合成により構築することがで
き［イタクラら、１９７７およびフレアら、１９７８］
、あるいはグツドマンら（１９７９）に開示された今
では常套手段である手法によってウシ下垂体から単離し
たメツセンジャーＲＮＡから得ることもできる。
ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのコード配列
は非常に似ており、これらは高い相同性（ｈｏｍｏ Ｉ
ｏｇｙ）を示す。ウシ成長ホルモンの発現プラスミドを
構築する上で特に有用なものは、制限酵素ＰｖｕＩＩの
消化によって生成されるフラグメントである。この生成
フラグメントの大きさは、ヒト成長ホルモンでは４９７
ｂｐであり、ウシ成長ホルモンでは４９４ ｂｐであり
、両配列ともに、対応する制限部位が同じ解読フレーム
内に生じる。
は非常に似ており、これらは高い相同性（ｈｏｍｏ Ｉ
ｏｇｙ）を示す。ウシ成長ホルモンの発現プラスミドを
構築する上で特に有用なものは、制限酵素ＰｖｕＩＩの
消化によって生成されるフラグメントである。この生成
フラグメントの大きさは、ヒト成長ホルモンでは４９７
ｂｐであり、ウシ成長ホルモンでは４９４ ｂｐであり
、両配列ともに、対応する制限部位が同じ解読フレーム
内に生じる。
１）ＮＭ６４５（第６図、１１１）１０μｇを、Ｐｖｕ
ＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｆ２，６ｍＭ ）
リス・ＨＣｆ！ （ｐＨ＝７．５） 、６ｎ＋Ｍ Ｍｇ
Ｃ１２ｔ、 ６ｍＭβ−メルカプトエタノール’）２０
０μｅ中に於いて３７°Ｃで１０分間、ＰｖｕＩＩｌ単
位を用いて部分消化した。６５°Ｃに１０分間暖めて反
応を停止させた後、得られたＤＮＡをアルカリホスファ
ターゼで処理し、１％アガロースゲルによって、得られ
たフラグメントを分離した。４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラ
グメントか欠けたＤＮＡ （１カ所切断プラスミドより
も若干速く行う）に対応する大きさの、得られた線状Ｄ
ＮＡフラグメント（第６図、１１３）を常法により取り
出し、精製し、次いで中間プラスミド（第６図、１１４
）の構築に使用した。
ＩＩ制限緩衝液（６０ｍＭ ＮａＣｆ２，６ｍＭ ）
リス・ＨＣｆ！ （ｐＨ＝７．５） 、６ｎ＋Ｍ Ｍｇ
Ｃ１２ｔ、 ６ｍＭβ−メルカプトエタノール’）２０
０μｅ中に於いて３７°Ｃで１０分間、ＰｖｕＩＩｌ単
位を用いて部分消化した。６５°Ｃに１０分間暖めて反
応を停止させた後、得られたＤＮＡをアルカリホスファ
ターゼで処理し、１％アガロースゲルによって、得られ
たフラグメントを分離した。４９４ｂｐＰｖｕＩＩフラ
グメントか欠けたＤＮＡ （１カ所切断プラスミドより
も若干速く行う）に対応する大きさの、得られた線状Ｄ
ＮＡフラグメント（第６図、１１３）を常法により取り
出し、精製し、次いで中間プラスミド（第６図、１１４
）の構築に使用した。
プラスミドｐＢＰ３４８の１０１１ｇを、Ｐｖｕｌ１１
０単位を含有するＰｖｕＩＩ緩衝液２００μρ中に於い
て３７°Ｃで１時間消化し、プラスミドｐＢＰ３４８の
４９４ ｂｐ Ｐｖｕ［Ｉフラグメントを調製した。こ
のフラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル上で分難
し、所望の４９４ ｂｐフラグメント（第６図、１１２
由来）を常法によって明視化し、精製した。
０単位を含有するＰｖｕＩＩ緩衝液２００μρ中に於い
て３７°Ｃで１時間消化し、プラスミドｐＢＰ３４８の
４９４ ｂｐ Ｐｖｕ［Ｉフラグメントを調製した。こ
のフラグメントを６％ポリアクリルアミドゲル上で分難
し、所望の４９４ ｂｐフラグメント（第６図、１１２
由来）を常法によって明視化し、精製した。
中間プラスミド（第６図、１１４）は、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ２単位を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
０μｇ中、プラスミドｐＮＭ７０２のＰｖｕｌＩフラグ
メント０．２ ｔｔ ｇを４９４ｂｐフラグメント０．
０５μｇと４°Ｃで１６時間反応させることによって構
築した。形質転換し、アンピシリン耐性による選択を行
った後、プラスミドを常法により、４９４ｂｐ Ｐｖｕ
ＩＩフラグメントの存在および適正な方向に関して検定
した。４９４ ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４４
０ｂｐ Ｘｂａｌ −３ｍａｌフラグメントを有するプ
ラスミドを選択し、その後の構築に使用した。
ーゼ２単位を含有するＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液２
０μｇ中、プラスミドｐＮＭ７０２のＰｖｕｌＩフラグ
メント０．２ ｔｔ ｇを４９４ｂｐフラグメント０．
０５μｇと４°Ｃで１６時間反応させることによって構
築した。形質転換し、アンピシリン耐性による選択を行
った後、プラスミドを常法により、４９４ｂｐ Ｐｖｕ
ＩＩフラグメントの存在および適正な方向に関して検定
した。４９４ ｂｐＰｖｕＩＩフラグメントおよび４４
０ｂｐ Ｘｂａｌ −３ｍａｌフラグメントを有するプ
ラスミドを選択し、その後の構築に使用した。
中間プラスミド（第７図、１１４）１０μｇを、Ｐｖｕ
ＩＩ緩衝液２０ ＯｔｔＱ中、３７℃で５分間Ｐｖｕ■
１単位で消化した。６５°Ｃで１０分間暖めた後、得ら
れた混合物を１％アガロースゲル上に展開し、１分子当
たり唯一のＰｖｕＩＩ切断しかされていない線状ＤＮＡ
を回収し、精製した。この回収した物質（約３μｇ）を
Ｘｂａｌ ５単位で完全に消化し、アルカリホスファ
ターゼで処理した。得られたフラグメントを１％アガロ
ースゲル上に展開し、最も大きなフラグメント（ヒトお
よびウシ成長ホルモンに於けるＸｂａｌおよび初めのＰ
ｖｕ１１部位間の１０９ｂｐフラグメントを欠いている
）を常法により回収した（第７図、１１５）。
ＩＩ緩衝液２０ ＯｔｔＱ中、３７℃で５分間Ｐｖｕ■
１単位で消化した。６５°Ｃで１０分間暖めた後、得ら
れた混合物を１％アガロースゲル上に展開し、１分子当
たり唯一のＰｖｕＩＩ切断しかされていない線状ＤＮＡ
を回収し、精製した。この回収した物質（約３μｇ）を
Ｘｂａｌ ５単位で完全に消化し、アルカリホスファ
ターゼで処理した。得られたフラグメントを１％アガロ
ースゲル上に展開し、最も大きなフラグメント（ヒトお
よびウシ成長ホルモンに於けるＸｂａｌおよび初めのＰ
ｖｕ１１部位間の１０９ｂｐフラグメントを欠いている
）を常法により回収した（第７図、１１５）。
つ／成長ホルモンに於ける、初めのＰＶＬＩ１１部位マ
でノ最）／Ｌ７）２３７ミ／酸（６９ｂｐ） のＤＮＡ
配列は、２つ（１） Ｈｐａ ｌ］制限部位を含有して
おり、この最初の部分はコード配列の最明のヌクレオチ
ドから２３ｂｐにある。６３ｂｐフラグメント（第７図
、＋１６）をホスホトリエステルｌ去によって合成した
。このフラグメントは、ｌｐｐリポゾーム結合部位内の
Ｘｈａ［部位からＡＴＧ翻訳開始／グナルまでの１９ｂ
ｐ配列、その陵のＰ ｂｅ −Ｐ ｒｏ −Ｌ ｃｕ
−Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −
Ｌ ｙｓのコード配列（２４ｂｐ）およびウシ成長ホル
モンのコード配列の２０ヌクレオチド（Ｐｈｅから初め
のＩ−１ｐａ １１部位まで）に対応している。このフ
ラグメントは以下の配列を有する 砧徂工 この６３ｂｐフラグメントの調・シソに際して、以下の
９個のセグメントを調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ６）ＡＴＧＧＧ
ＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＴ ７）ＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ８）ＡＴＧＧＣ
ＴＧＧＧＡＡＣ ９）ＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ 調製した上記セグメントを使用し、Ｔ４リガーゼにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った： ａ）５゛−非リン酸化セグメント１を、５゛−リン酸化
セグメント６の存在下にＴ４リガーゼを使用して５゛−
リン酸化セグメント２に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子ｌを
調製し、これを１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動によって精製した。
でノ最）／Ｌ７）２３７ミ／酸（６９ｂｐ） のＤＮＡ
配列は、２つ（１） Ｈｐａ ｌ］制限部位を含有して
おり、この最初の部分はコード配列の最明のヌクレオチ
ドから２３ｂｐにある。６３ｂｐフラグメント（第７図
、＋１６）をホスホトリエステルｌ去によって合成した
。このフラグメントは、ｌｐｐリポゾーム結合部位内の
Ｘｈａ［部位からＡＴＧ翻訳開始／グナルまでの１９ｂ
ｐ配列、その陵のＰ ｂｅ −Ｐ ｒｏ −Ｌ ｃｕ
−Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −Ａ ｓｐ −
Ｌ ｙｓのコード配列（２４ｂｐ）およびウシ成長ホル
モンのコード配列の２０ヌクレオチド（Ｐｈｅから初め
のＩ−１ｐａ １１部位まで）に対応している。このフ
ラグメントは以下の配列を有する 砧徂工 この６３ｂｐフラグメントの調・シソに際して、以下の
９個のセグメントを調製した： １）ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴ ２）ＴＡＡＴＡＡＴＧＴＴＣＣ ３）ＣＡＴＴＧＧＡＴＧＡＴ ４）ＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＣ ５）ＣＡＧＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＣ６）ＡＴＧＧＧ
ＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＴＡＣＣＴ ７）ＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＣＡ８）ＡＴＧＧＣ
ＴＧＧＧＡＡＣ ９）ＣＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣ 調製した上記セグメントを使用し、Ｔ４リガーゼにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った： ａ）５゛−非リン酸化セグメント１を、５゛−リン酸化
セグメント６の存在下にＴ４リガーゼを使用して５゛−
リン酸化セグメント２に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子ｌを
調製し、これを１５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動によって精製した。
ｂ）５”−リン酸化セグメント３．４および５を、５°
−リン酸化セグメント７および８の存在下に、Ｔ４リガ
ーセを使用して５″−非リン酸化セグメント９に結合し
、二本鎖Ｄ Ｎ Ａ分子２を調製し、次いでこれを１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
−リン酸化セグメント７および８の存在下に、Ｔ４リガ
ーセを使用して５″−非リン酸化セグメント９に結合し
、二本鎖Ｄ Ｎ Ａ分子２を調製し、次いでこれを１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
Ｃ）次に、得られた二本鎖分子１および２を、Ｔ４１Ｊ
ガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子（第
７図、１１６）を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
ガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖ＤＮＡ分子（第
７図、１１６）を調製し、次いでこの二本鎖分子を１５
％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
次いで、この二本鎖ＤＮＡ分子を、確立された方法に従
って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−Ｐ”
］ＡＴＰを使用して酵素学的にリン酸化した。
って、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［γ−Ｐ”
］ＡＴＰを使用して酵素学的にリン酸化した。
前述のＨｐａＩ［部位からＰｖｕＩＩ部位までの４６ｂ
ｐＤＮＡフラグメントは、合成によって構築することが
でき、またあるいは原型のｐＢＰ３４８プラスミドから
得ることができる。従って、プラスミドｐＢＰ３４８の
１００μｇを、Ｐｖｕ［５０単位を含有するＰｖｕＵ緩
衝液４００μρ中に於いて、３７°Ｃで２時間消化した
。フェノール抽出し、エタノール沈澱させた後、得られ
たＤＮＡを、５０単位のＰｓｔｌを含有するＰｓｔＩ緩
衝ｉ＆（５０ｍＭＮａＣＱ、６ｍＭ）リス−ＨＣ＆ （
ｐＨ＝７．４）、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＱ ｔおよび
６ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に、３７°Ｃで
２時間溶解した。得られたＤＮＡフラグメントを６％ポ
リアクリルアミドゲル上で展開し、所望の４６ｂｐ配列
を含有する１３５ｂｐフラグメントを回収し、標準的な
方法で精製した。回収したＤＮＡの１／３量（３３μｇ
に相当）を、ＨｐａＩＩ緩衝液（２０ＬＩＩＭトリス・
ＨＣＱ （ｐＨ＝７．４） 、７ｍＭ ＭｇＣ＋ｂ、（
３ｍＭβ−メルカプトエタノール）ｌｏ’ｏμｇ中に於
けるＨｐａＩ［制限酵素１単位の限定消化反応（３７°
Ｃ１４０分間）に付した。６５°Ｃに１０分間暖めた後
、ＤＮＡフラグメントを、適当なサイズマーカーと共に
５％アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比率−
１９１）で展開した。１３５ｈｐフラグメント（第７図
、１１２由来）のＨｐａ１１部分消化によって得られた
所望の４６ｂｐフラグメントを標準的な方法によって精
製した。
ｐＤＮＡフラグメントは、合成によって構築することが
でき、またあるいは原型のｐＢＰ３４８プラスミドから
得ることができる。従って、プラスミドｐＢＰ３４８の
１００μｇを、Ｐｖｕ［５０単位を含有するＰｖｕＵ緩
衝液４００μρ中に於いて、３７°Ｃで２時間消化した
。フェノール抽出し、エタノール沈澱させた後、得られ
たＤＮＡを、５０単位のＰｓｔｌを含有するＰｓｔＩ緩
衝ｉ＆（５０ｍＭＮａＣＱ、６ｍＭ）リス−ＨＣ＆ （
ｐＨ＝７．４）、６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ ＣＱ ｔおよび
６ｍＭ β−メルカプトエタノール）中に、３７°Ｃで
２時間溶解した。得られたＤＮＡフラグメントを６％ポ
リアクリルアミドゲル上で展開し、所望の４６ｂｐ配列
を含有する１３５ｂｐフラグメントを回収し、標準的な
方法で精製した。回収したＤＮＡの１／３量（３３μｇ
に相当）を、ＨｐａＩＩ緩衝液（２０ＬＩＩＭトリス・
ＨＣＱ （ｐＨ＝７．４） 、７ｍＭ ＭｇＣ＋ｂ、（
３ｍＭβ−メルカプトエタノール）ｌｏ’ｏμｇ中に於
けるＨｐａＩ［制限酵素１単位の限定消化反応（３７°
Ｃ１４０分間）に付した。６５°Ｃに１０分間暖めた後
、ＤＮＡフラグメントを、適当なサイズマーカーと共に
５％アクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス比率−
１９１）で展開した。１３５ｈｐフラグメント（第７図
、１１２由来）のＨｐａ１１部分消化によって得られた
所望の４６ｂｐフラグメントを標準的な方法によって精
製した。
プラスミドベクター（第７図、１１５）のＸｂａＩ−Ｐ
ｖｕ［ｌフラグメント２／１０μｇ、６３ｂｐ合成フラ
グメント（第７図、１１６由来）３．２ピコモルおよび
４６ｂｐフラグメント（第７図、１１２由来）０．５ピ
コモルを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するラ
イゲート緩衝液ｌＯμρ中で４°Ｃで１６時間インキユ
ヘートした。このライゲート混合物を使用してＥ．Ｃｏ
ｌｉ Ｊ Ａ２２１を形質転換し、アンピシリン（Ａ
ｐ ’）の耐性能によって形質転換体（従って、これは
所望のプラスミドｐ ＮＭ７８９を含有している）を選
別した。
ｖｕ［ｌフラグメント２／１０μｇ、６３ｂｐ合成フラ
グメント（第７図、１１６由来）３．２ピコモルおよび
４６ｂｐフラグメント（第７図、１１２由来）０．５ピ
コモルを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２単位を含有するラ
イゲート緩衝液ｌＯμρ中で４°Ｃで１６時間インキユ
ヘートした。このライゲート混合物を使用してＥ．Ｃｏ
ｌｉ Ｊ Ａ２２１を形質転換し、アンピシリン（Ａ
ｐ ’）の耐性能によって形質転換体（従って、これは
所望のプラスミドｐ ＮＭ７８９を含有している）を選
別した。
プラスミドｐＮＭ７８９ （第７図、１１７）について
、常法により、Ｐｖｕｌｌ ４９４ｂｐフラグメントお
よびＸｂａＩ −ＰｖｕｌＩ １０９ｂｐフラグメント
の両者の存在に関してスクリーニングすることによって
その同定を行った。
、常法により、Ｐｖｕｌｌ ４９４ｂｐフラグメントお
よびＸｂａＩ −ＰｖｕｌＩ １０９ｂｐフラグメント
の両者の存在に関してスクリーニングすることによって
その同定を行った。
Ｅ、プラスミドｐ Ｎ Ｍ ７８９ Ｂの最終的構築ウ
シ成長ホルモンの完全な転換を図るには、プラスミドｐ
ＮＭ７８９ （第８図、１１７）に１つのアミノ酸コド
ンを変換する必要である。これは、ｐ ＮＭ７８９のＰ
ｖｕＩ［からＢａｍＨＩまでの２８ｂｐフラグメントを
除去し、以下の配列を有する合成二重鎖フラグメントで
置換すれば行える（第８図、１１８）： ３”−ＧＡＣＡＣＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＴＡＧ−５
“ｐ ＮＭ７８９の１０μｇをＰｖｕＩＩ緩衝液２００
μρ中、Ｐｖｕ１１１単位を用いて消化した。６５°Ｃ
に１０分間暖めた後、得られた混合物にＢａｍＨＩ緩衝
液を加えて３００μｅに希釈し、１０単位のＢａｍＨＩ
を用いて３７°Ｃで１時間完全に消化し、アルカリホス
ファターゼ５単位で処理し、６５°Ｃで１時間インキュ
ベートした。得られたＤＮＡフラグメントを１％アガロ
ースゲルで分離し、１カ所切断された大きさのプラスミ
ドｐ ＮＭ７８９のＤＮＡフラグメント（第８図、１１
９）を常法により精製した。このフラグメント２／１０
μｇを、リガーゼ緩衝液２０μρ中、Ｔ４リガーゼ２単
位を使用して合成フラグメント５ピコモルにライゲート
した。このライゲート反応は４°Ｃで一晩行った。形質
転換した後、幾つかのプラスミドを単離し、適当なＰｖ
ｕＩｌフラグメント（４９４ｂｐ）およびＸｂａｌ −
ＢａｍＨＩフラグメント（６２８ｂｐ）に関してスクリ
ーニングした。上記のフラグメントを含有するプラスミ
ドは、所望のプラスミドｐＮＭ７８９（第８図、１２０
）を構成していた。
シ成長ホルモンの完全な転換を図るには、プラスミドｐ
ＮＭ７８９ （第８図、１１７）に１つのアミノ酸コド
ンを変換する必要である。これは、ｐ ＮＭ７８９のＰ
ｖｕＩ［からＢａｍＨＩまでの２８ｂｐフラグメントを
除去し、以下の配列を有する合成二重鎖フラグメントで
置換すれば行える（第８図、１１８）： ３”−ＧＡＣＡＣＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＣＣＴＡＧ−５
“ｐ ＮＭ７８９の１０μｇをＰｖｕＩＩ緩衝液２００
μρ中、Ｐｖｕ１１１単位を用いて消化した。６５°Ｃ
に１０分間暖めた後、得られた混合物にＢａｍＨＩ緩衝
液を加えて３００μｅに希釈し、１０単位のＢａｍＨＩ
を用いて３７°Ｃで１時間完全に消化し、アルカリホス
ファターゼ５単位で処理し、６５°Ｃで１時間インキュ
ベートした。得られたＤＮＡフラグメントを１％アガロ
ースゲルで分離し、１カ所切断された大きさのプラスミ
ドｐ ＮＭ７８９のＤＮＡフラグメント（第８図、１１
９）を常法により精製した。このフラグメント２／１０
μｇを、リガーゼ緩衝液２０μρ中、Ｔ４リガーゼ２単
位を使用して合成フラグメント５ピコモルにライゲート
した。このライゲート反応は４°Ｃで一晩行った。形質
転換した後、幾つかのプラスミドを単離し、適当なＰｖ
ｕＩｌフラグメント（４９４ｂｐ）およびＸｂａｌ −
ＢａｍＨＩフラグメント（６２８ｂｐ）に関してスクリ
ーニングした。上記のフラグメントを含有するプラスミ
ドは、所望のプラスミドｐＮＭ７８９（第８図、１２０
）を構成していた。
実施例２
通常の微生物学的操作法に従い、細菌Ｅ 、 ｃｏｌ
１Ｋ１２／ｐ１Ｍ−１−Ａ３ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５７
３３）を、５０μｇ／ｍ（ｌカナマイシンを含有するＴ
Ｙブロス［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．４］中、２５°Ｃで培
養した。得られた培養物を新鮮なブロスでｌ：１０に希
釈し、３７°Ｃで３時間インキュベートした後、培養物
約０．５ｘ＆を１．５次σ容量エッペンドルフ試験管に
移し、約１５秒間遠心分離した。特に明記しない限り、
すべての手法は、環境温度で行った。得られた上清を、
微小先端のアスピレータ−を用いて注意深く除去し、得
られた細胞ペレットを、２μｇ／ｍＱ リゾチーム、５
０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ （ジアミン
テトラアセテート）および２５ｍ１ＶＩトリス・ＨＣＱ
（ｐＨ＝８）を含有する調製したばかりのりＶチーム
溶液（２ｔｔ ｇ／ｘｃ ）約１００ ｔｔＱに再懸濁
した。アルカリ性ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液約２００μＱ（０，２Ｎ ＮａＯＨ１１％５ＤＳ）
を加え、試験管を穏やかに逆さにし、次いで細胞溶解が
完了するまで（〜５分間）、０°Ｃを維持した。次ぎに
、３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０μｇを加え、数秒間穏や
かに逆さにするごて試験管の内容物を混合した。
１Ｋ１２／ｐ１Ｍ−１−Ａ３ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５７
３３）を、５０μｇ／ｍ（ｌカナマイシンを含有するＴ
Ｙブロス［１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．
５％塩化ナトリウム、ｐＨ＝７．４］中、２５°Ｃで培
養した。得られた培養物を新鮮なブロスでｌ：１０に希
釈し、３７°Ｃで３時間インキュベートした後、培養物
約０．５ｘ＆を１．５次σ容量エッペンドルフ試験管に
移し、約１５秒間遠心分離した。特に明記しない限り、
すべての手法は、環境温度で行った。得られた上清を、
微小先端のアスピレータ−を用いて注意深く除去し、得
られた細胞ペレットを、２μｇ／ｍＱ リゾチーム、５
０ｍＭ グルコース、１０ｍＭ ＥＤＴＡ （ジアミン
テトラアセテート）および２５ｍ１ＶＩトリス・ＨＣＱ
（ｐＨ＝８）を含有する調製したばかりのりＶチーム
溶液（２ｔｔ ｇ／ｘｃ ）約１００ ｔｔＱに再懸濁
した。アルカリ性ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液約２００μＱ（０，２Ｎ ＮａＯＨ１１％５ＤＳ）
を加え、試験管を穏やかに逆さにし、次いで細胞溶解が
完了するまで（〜５分間）、０°Ｃを維持した。次ぎに
、３Ｍ酢酸ナトリウム約１５０μｇを加え、数秒間穏や
かに逆さにするごて試験管の内容物を混合した。
この試験管を少なくとも６０分間Ｏ℃に維持し、次いで
１５分間遠心分離にかけ、殆ど清澄な上清を得た。この
上清を別の遠心管に移し、これに１００％冷エタノール
３容量を加えた。この遠心管をドライアイス−エタノー
ル上に５分間放置した後、得られた沈澱物を遠心分離（
５分間）によって集め、アスピレータ−法によって上清
を除去した。捕集したベレットをＴＥ（１０ｍＭ ト
リス・ＨＣ（（ｐＨ＝８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１
００μｅに溶解し、これを所望のｐＩＭ−１’−Ａ３プ
ラスミドＤＮ、Ａと選定した。
１５分間遠心分離にかけ、殆ど清澄な上清を得た。この
上清を別の遠心管に移し、これに１００％冷エタノール
３容量を加えた。この遠心管をドライアイス−エタノー
ル上に５分間放置した後、得られた沈澱物を遠心分離（
５分間）によって集め、アスピレータ−法によって上清
を除去した。捕集したベレットをＴＥ（１０ｍＭ ト
リス・ＨＣ（（ｐＨ＝８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１
００μｅに溶解し、これを所望のｐＩＭ−１’−Ａ３プ
ラスミドＤＮ、Ａと選定した。
グメントの生成
以下の組成を有するＨｉ塩緩衝液５ｏｌｌｅ中、プラス
ミドｐＮＭ７８９Ｂ ＤＮＡ約５μｇを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ各々１０単位とともに３７℃で約
１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
＝７．０）５μσを加えた後、１００％エタノール３容
量を用いてＤＮＡを沈澱させた。所望のＤＮＡ消化物を
ＴＥ緩衝液１００μｇに溶解し、今後の使用に備えてｏ
′ｃで保存した。
ミドｐＮＭ７８９Ｂ ＤＮＡ約５μｇを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩおよびＸｂａＩ各々１０単位とともに３７℃で約
１時間インキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
＝７．０）５μσを加えた後、１００％エタノール３容
量を用いてＤＮＡを沈澱させた。所望のＤＮＡ消化物を
ＴＥ緩衝液１００μｇに溶解し、今後の使用に備えてｏ
′ｃで保存した。
＊Ｈｉ塩緩衝液は以下の成分を用いて常法により調製し
た。
た。
１００ｍＭ ＮａＣＱ
２０ｍＭ トリス−ＨＣＱ（ｐＨ＝８．０）１０ｍＭ
ＭｇＣｂ ５ｍＭ β−メルカプトエタノール。
ＭｇＣｂ ５ｍＭ β−メルカプトエタノール。
Ｃ，プラスミドｐ１Ｍ−ビーＡ３のＸｂａｌ −Ｂａｍ
ＨＩ消化 プラスミドｐＮＭ７８９Ｂではなくプラスミドｐ１Ｍ−
ビーＡ３を用い、実施例２Ｂの操作法に実質的に従い、
所望の消化反応を行った。得られた所望のＤＮＡをＴＥ
緩衝液約１００μＱに溶解し、以後の使用に備えてＯ′
Ｃで保存した。
ＨＩ消化 プラスミドｐＮＭ７８９Ｂではなくプラスミドｐ１Ｍ−
ビーＡ３を用い、実施例２Ｂの操作法に実質的に従い、
所望の消化反応を行った。得られた所望のＤＮＡをＴＥ
緩衝液約１００μＱに溶解し、以後の使用に備えてＯ′
Ｃで保存した。
Ｄ ライゲートおよび形質転換
プラスミドｐ ＩＭ−１’−Ａ３消化物約１μｇ、プラ
スミドｐＮＭ７８９ Ｂ Ｘｂａｌ −ＢａｍＨＩ消
化物Ｊμｇ、水４０μｇ、（５ｍＭ） ＡＴ Ｐ ５
μｅ、ライゲート用ミックス２）５μｇおよびＴ４ＤＮ
Ａ リガーゼ５単位を、２０’Ｃで２時間インキュベ
ートした。６５°Ｃで２分間インキュベートした後、水
上で冷却し、次いて得られたライゲート混合物を使用し
、ウェンシンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）、 Ｃｅｌｌ ３：
３１５．１９７４に開示されている形質転換法に実質的
に従って、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８を、
５０μｇ／ｒＲＱのカナマイシンを含有するＴＹ平板（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム、１．５％寒天、ｐＨ＝７．４）上で形質転換
した。菌株Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８は、ノ
ーイン・レギオナル・リサーチ・ラボラトリ−（ペオリ
ア、イリノイ）のパーマネント・ストック・カルチャー
・コレクションの一部ヲ構成し、そこに寄託され、受託
番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４のもとて一般に入手可能
である。
スミドｐＮＭ７８９ Ｂ Ｘｂａｌ −ＢａｍＨＩ消
化物Ｊμｇ、水４０μｇ、（５ｍＭ） ＡＴ Ｐ ５
μｅ、ライゲート用ミックス２）５μｇおよびＴ４ＤＮ
Ａ リガーゼ５単位を、２０’Ｃで２時間インキュベ
ートした。６５°Ｃで２分間インキュベートした後、水
上で冷却し、次いて得られたライゲート混合物を使用し
、ウェンシンク（Ｗｅｎｓｉｎｋ）、 Ｃｅｌｌ ３：
３１５．１９７４に開示されている形質転換法に実質的
に従って、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８を、
５０μｇ／ｒＲＱのカナマイシンを含有するＴＹ平板（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナ
トリウム、１．５％寒天、ｐＨ＝７．４）上で形質転換
した。菌株Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８は、ノ
ーイン・レギオナル・リサーチ・ラボラトリ−（ペオリ
ア、イリノイ）のパーマネント・ストック・カルチャー
・コレクションの一部ヲ構成し、そこに寄託され、受託
番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４のもとて一般に入手可能
である。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電気泳
動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜１０
．８ｋｂプラスミド（第９図）のみを含有していた。本
明細書に於いてはＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２ ＲＶ３０
８／ｐＣＺ １０１と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。実
施例ＩＡの操作法に実質的に従い、得られた細胞を使用
してプラスミドｐＣＺＩＯＩを単離した。
動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜１０
．８ｋｂプラスミド（第９図）のみを含有していた。本
明細書に於いてはＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ ｌ ２ ＲＶ３０
８／ｐＣＺ １０１と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。実
施例ＩＡの操作法に実質的に従い、得られた細胞を使用
してプラスミドｐＣＺＩＯＩを単離した。
ａ）ライゲート用ミックス（緩衝液）は、以下の成分か
ら調製できる： ５００ｍＭ トリス−ＨＣ４（ｐＨ＝７．８）２０Ｃ
）ｍＭ ジチオトレイトール ｌ ＱＱｍＭ ＭｇＣＬ 実施例３ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ［） ＩＭ −１’−Ａ３
の代わりにＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐ
ＣＺ １０１を使用し、実施例２Ａて説明した操作法に
実質的に従い、プラスミドｐＣＺ１０１ ＤＮＡを得
た。所望のフラグメントは、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂ
ｉよび制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａｌの代わりにそ
れぞれプラスミドｐＣＺ１０１および制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＮｄｅｌを使用し、実施例２Ｂで説明した操作
法に実質的に従って溝築した。所望の８．６ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｎｄｅｌ制限フラグメントを常法により分離し
、アガロースゲル電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（マニ
アチス）ら、１９８２）で単離し、次いでＴＥ緩衝液約
１００μσに溶解し、以後の使用に備えてＯ′Ｃに保存
１７た。
ら調製できる： ５００ｍＭ トリス−ＨＣ４（ｐＨ＝７．８）２０Ｃ
）ｍＭ ジチオトレイトール ｌ ＱＱｍＭ ＭｇＣＬ 実施例３ Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ［） ＩＭ −１’−Ａ３
の代わりにＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐ
ＣＺ １０１を使用し、実施例２Ａて説明した操作法に
実質的に従い、プラスミドｐＣＺ１０１ ＤＮＡを得
た。所望のフラグメントは、プラスミドｐＮＭ７８９Ｂ
ｉよび制限酵素ＢａｍＨＩおよびＸｂａｌの代わりにそ
れぞれプラスミドｐＣＺ１０１および制限酵素ＥｃｏＲ
ＩおよびＮｄｅｌを使用し、実施例２Ｂで説明した操作
法に実質的に従って溝築した。所望の８．６ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩ−Ｎｄｅｌ制限フラグメントを常法により分離し
、アガロースゲル電気泳動法（Ｍａｎｉａｔｉｓ（マニ
アチス）ら、１９８２）で単離し、次いでＴＥ緩衝液約
１００μσに溶解し、以後の使用に備えてＯ′Ｃに保存
１７た。
Ａ、ライゲートおよび形′転換
プラスミドｐＣＺ１０１の〜８．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−
Ｎｄｅｌフラグメント約１μｇをクレノー・ポリメラー
ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｉおよび
４つのデオキシリボヌクレオチドとともにインキュベー
トし、−本鎖部分を充填した。クレノー・ポリメラーゼ
［［ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）、７９４１カストロウニー・ドライブ、
Ｐ、○ボックス５０８１６、インデイアナポリス、ＩＮ
４．６２５０から市販されているコは、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■のタンパク質加水分解の開裂によって得られるフ
ラグメントである。それは、粗酵素［コーンベルブ（Ｋ
ｏｒｎｂｅｒｇ）、 １９７４． Ｗ、 Ｈ、Ｆ ｒ
ｅｅｍｅｎ ａｎｄＣｏ、 、 ＳＦｏ、 ９８］の５
′→３′ポリマー化活性、３”→５°エキソヌクレアー
ゼ活性を有しているが、５”→３°エキソヌクレアーゼ
活性を存していない。
Ｎｄｅｌフラグメント約１μｇをクレノー・ポリメラー
ゼ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） Ｉおよび
４つのデオキシリボヌクレオチドとともにインキュベー
トし、−本鎖部分を充填した。クレノー・ポリメラーゼ
［［ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ）、７９４１カストロウニー・ドライブ、
Ｐ、○ボックス５０８１６、インデイアナポリス、ＩＮ
４．６２５０から市販されているコは、ＤＮＡポリメラ
ーゼ■のタンパク質加水分解の開裂によって得られるフ
ラグメントである。それは、粗酵素［コーンベルブ（Ｋ
ｏｒｎｂｅｒｇ）、 １９７４． Ｗ、 Ｈ、Ｆ ｒ
ｅｅｍｅｎ ａｎｄＣｏ、 、 ＳＦｏ、 ９８］の５
′→３′ポリマー化活性、３”→５°エキソヌクレアー
ゼ活性を有しているが、５”→３°エキソヌクレアーゼ
活性を存していない。
反応混合物を５０°Ｃに暖め、１０’Ｃまでゆっくりと
冷却させ、次いでクレノー酵素４μｇを加えた。室温で
１５分間インキュベートし、次いで３７°Ｃで３０分間
インキュベートした後、０．２５ＭＥＤＴＡ５μσを加
え、反応を停止させた。
冷却させ、次いでクレノー酵素４μｇを加えた。室温で
１５分間インキュベートし、次いで３７°Ｃで３０分間
インキュベートした後、０．２５ＭＥＤＴＡ５μσを加
え、反応を停止させた。
得られた反応混合物をフェノールで抽出し、クロロホル
ムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。得られた
ＤＮＡをライゲートｌ衝液に再懸濁してライゲートし、
次いで実施例２Ｄの操作法に実質的に従って、得られた
プラスミドを使用してＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０
８を形質転換した。
ムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。得られた
ＤＮＡをライゲートｌ衝液に再懸濁してライゲートし、
次いで実施例２Ｄの操作法に実質的に従って、得られた
プラスミドを使用してＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０
８を形質転換した。
得られた耐性形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電
気泳動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８
２］および他の検定法から通常分かるように、所望の〜
９．２ｋｂプラスミド（第１Ｏ図）のみを含有していた
。本明細書に於いてはＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ＲＶ３０
８／ｐＣＺ １１８と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。
気泳動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８
２］および他の検定法から通常分かるように、所望の〜
９．２ｋｂプラスミド（第１Ｏ図）のみを含有していた
。本明細書に於いてはＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ＲＶ３０
８／ｐＣＺ １１８と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。
実施例４
プラスミドｐＮＭ７−８９Ｂの代わりにプラスミドｐｃ
２１１８を用い、実施例２Ｂの操作法に実質的に従って
、所望のフラグメントを構築した。
２１１８を用い、実施例２Ｂの操作法に実質的に従って
、所望のフラグメントを構築した。
所望の〜８．６ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｘｂａｌ制限フラグ
メントを常法により分離し、アガロースゲル電気泳動法
「マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］によ
って単離し、次いでＴＥ緩衝液約１００μｇに溶解し、
以後の使用に備えてＯ′Ｃで保存した。
メントを常法により分離し、アガロースゲル電気泳動法
「マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］によ
って単離し、次いでＴＥ緩衝液約１００μｇに溶解し、
以後の使用に備えてＯ′Ｃで保存した。
プラスミドｐＮＭ７８９Ｂおよび制限酵素ＸｂａＩを使
用する代わりにそれぞれプラスミドｐＣＺ１０１および
制限酵素Ｈｇ１Ａ Ｉを用い、実施例２Ｂの操作法に実
質的に従って、所望のフラグメントを構築した。所望の
〜０．６ｋｂ ＢａｍＨＩ −ＨｇｉＡＴ制限フラグメ
ントを常法により分離し、アガロースケル電気泳動法［
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） ラ、１９８２］によ
って単離し、次いでＴＥ緩ｉＩｉ液約１００μｇに溶解
し、以後の使用に備えてｏ′ｃで保存した。
用する代わりにそれぞれプラスミドｐＣＺ１０１および
制限酵素Ｈｇ１Ａ Ｉを用い、実施例２Ｂの操作法に実
質的に従って、所望のフラグメントを構築した。所望の
〜０．６ｋｂ ＢａｍＨＩ −ＨｇｉＡＴ制限フラグメ
ントを常法により分離し、アガロースケル電気泳動法［
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） ラ、１９８２］によ
って単離し、次いでＴＥ緩ｉＩｉ液約１００μｇに溶解
し、以後の使用に備えてｏ′ｃで保存した。
所望のリンカ−配列を、イタクラら、１９７７およびフ
レアら、１９７８に開示された方法に実質的に従い、改
良ホスホトリエステル法によって常法とおりに合成した
。この合成法は、実施例１にら詳細に説明されている。
レアら、１９７８に開示された方法に実質的に従い、改
良ホスホトリエステル法によって常法とおりに合成した
。この合成法は、実施例１にら詳細に説明されている。
Ｄ ライケートおよび形質転換
実施例／ＩＣのＤＮＡリンカ−約２０ピコモル、プラス
ミドｐＣＺｌ］８の〜ｌ ０．２ｋｂ Ｂａｍ）−１１
Ｘｂａｌフラグメント１μｇおよびプラスミドｐＣＺ１
０１の〜０．６ｋｂ ＢａｍＨｒ −ＨｇｉＡ Ｉ ７
ラグメント０５μｇをライゲートし、得られたプラスミ
ドを使用し、実施例２Ｄの操作法に実質的に従い、Ｅ．
Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８を形質転換した。
ミドｐＣＺｌ］８の〜ｌ ０．２ｋｂ Ｂａｍ）−１１
Ｘｂａｌフラグメント１μｇおよびプラスミドｐＣＺ１
０１の〜０．６ｋｂ ＢａｍＨｒ −ＨｇｉＡ Ｉ ７
ラグメント０５μｇをライゲートし、得られたプラスミ
ドを使用し、実施例２Ｄの操作法に実質的に従い、Ｅ．
Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８を形質転換した。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電気泳
動法［マニアチス（Ｍａｎ ｉａ ｔ ｉ ｓ）ら、１
９８２］および他の検定法から通常分かるように、所望
の〜９．２ｋｂプラスミド（第１１図）のみを含有して
いた。このような形質転換体を選択しく本明細書に於い
てＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４５
と命名する）、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上に
プレートし、次いて通常の微生物学的手法に従って培養
した。ＳＤＳゲル電気泳動法、ｔＡおよび他の検定法に
より、得られた細胞では、ｍｅｔ−ｂＧＨが高いレベル
で発現されていることが証明された。プラスミドｐＣＺ
１４５は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ −ｂ
Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
動法［マニアチス（Ｍａｎ ｉａ ｔ ｉ ｓ）ら、１
９８２］および他の検定法から通常分かるように、所望
の〜９．２ｋｂプラスミド（第１１図）のみを含有して
いた。このような形質転換体を選択しく本明細書に於い
てＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４５
と命名する）、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上に
プレートし、次いて通常の微生物学的手法に従って培養
した。ＳＤＳゲル電気泳動法、ｔＡおよび他の検定法に
より、得られた細胞では、ｍｅｔ−ｂＧＨが高いレベル
で発現されていることが証明された。プラスミドｐＣＺ
１４５は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ −ｂ
Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
実施例５
プラスミドｐｃ］４５ＤＮＡ約５ ｔｔ ｇを、１−１
１塩ｋ ｌｒ液５０μ（！中でＸｂａｌおよびＮｄｅｌ
制限酵素各々１０単位とともに、３７°Ｃで約１時間イ
ンキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｒ−ｒ＝７
．０）５μ（を加えた後、１００％エタ／−ル３容量を
用いてｌ） Ｎ Ａを沈澱させた。このＤＮＡを゛ｒＥ
緩函液１００μａに溶解し、以後の使用に６ｆｉｆえて
Ｏ′Ｃで保存した。
１塩ｋ ｌｒ液５０μ（！中でＸｂａｌおよびＮｄｅｌ
制限酵素各々１０単位とともに、３７°Ｃで約１時間イ
ンキュベートした。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐｒ−ｒ＝７
．０）５μ（を加えた後、１００％エタ／−ル３容量を
用いてｌ） Ｎ Ａを沈澱させた。このＤＮＡを゛ｒＥ
緩函液１００μａに溶解し、以後の使用に６ｆｉｆえて
Ｏ′Ｃで保存した。
所望のリンカ−配列を、イタクラら（１９７７）および
フレアら（１９７ｇ）に開示された方法に実質的に従い
、改良ホスホトリエステル法によって、常法どおり合成
した。この合成法は、実施例１にも詳細に説明されてい
る。
フレアら（１９７ｇ）に開示された方法に実質的に従い
、改良ホスホトリエステル法によって、常法どおり合成
した。この合成法は、実施例１にも詳細に説明されてい
る。
Ｃ，ライゲートおよび形質転換
実施例５Ｂのリンカ−約２０ピコモルおよび実施例５Ａ
のｐＣＺ１４５消化物１１１ｇをライゲートし、実施例
２Ｄの操作法に実質的に従い、得られたプラスミドを使
用してＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８を形質転
換した。
のｐＣＺ１４５消化物１１１ｇをライゲートし、実施例
２Ｄの操作法に実質的に従い、得られたプラスミドを使
用してＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ １２ ＲＶ３０８を形質転
換した。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースケル電気泳
動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜９．
２ｋｂプラスミドのみを含有していた。
動法［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜９．
２ｋｂプラスミドのみを含有していた。
このような形質転換体を選択しく本明細書に於いてＥ．
Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９と命名す
る）、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法に従って培養した。Ｓ
ＤＳゲル電気泳動法、ＲＩ 、Ａおよび他の検定法によ
り、得られた細胞はｍｅｔ −ｂ Ｇ Ｈが高いレベル
で発現されていることが分かつた。プラスミドｐＣＺＩ
４９は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。
Ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９と命名す
る）、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法に従って培養した。Ｓ
ＤＳゲル電気泳動法、ＲＩ 、Ａおよび他の検定法によ
り、得られた細胞はｍｅｔ −ｂ Ｇ Ｈが高いレベル
で発現されていることが分かつた。プラスミドｐＣＺＩ
４９は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。
実施例６
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施ＩＺ１５のリンカ−配列の代わりにｆψ用する
以外は、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構
築物を構築した。イタクラら（１９７７）およびフレア
ら（１９７８）に開示された常法に実質的にウェイ、上
記のリンカ−配列を溝築した。この合成法は、実施例１
にも詳細に説明されている。
以外は、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構
築物を構築した。イタクラら（１９７７）およびフレア
ら（１９７８）に開示された常法に実質的にウェイ、上
記のリンカ−配列を溝築した。この合成法は、実施例１
にも詳細に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ．ＣｏｌｉＫ１
２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３と命名する）を、適当
な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートし、次いで
常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８３の生産および
単離のために培養した。ＳＤＳケル電気泳動法、ＲＩ
Ａおよび池の検定法により、得られた形質転換体はｍｃ
Ｌ −ｂ Ｇ Ｉ−Ｉが高いレベルで発現することが分
かった。プラスミドｐＣＺ Ｉ ８３はｊ！＋！＋ Ｉ
Ｕ ＋ｊｉ％発性ウシナウェイ・レプリコンを含イｆし
ているので、培地ｌ晶度約３７°Ｃの時に５ｅｔ−ｂ
Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３と命名する）を、適当
な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートし、次いで
常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８３の生産および
単離のために培養した。ＳＤＳケル電気泳動法、ＲＩ
Ａおよび池の検定法により、得られた形質転換体はｍｃ
Ｌ −ｂ Ｇ Ｉ−Ｉが高いレベルで発現することが分
かった。プラスミドｐＣＺ Ｉ ８３はｊ！＋！＋ Ｉ
Ｕ ＋ｊｉ％発性ウシナウェイ・レプリコンを含イｆし
ているので、培地ｌ晶度約３７°Ｃの時に５ｅｔ−ｂ
Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
実施例７
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施例５のリンカ−配列の代わりに１史用する以外
は、実施例５の操作法に実質的に１ノでって、所望の構
築物を構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレア
ら（１９７８）に開示された常法に実ｆｌ的に従い、上
記のリンカ−配列を１１４築した。この合成法は、実施
例Ｉにも詳細に説明されている。
は、実施例５の操作法に実質的に１ノでって、所望の構
築物を構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレア
ら（１９７８）に開示された常法に実ｆｌ的に従い、上
記のリンカ−配列を１１４築した。この合成法は、実施
例Ｉにも詳細に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ．ＣｏｌｉＫＩ
２ １ンＶ３０８／ｐＣＺ１８４と命名する）を、適当
な抗生物質を含有する′ＦＹ寒天上にプレートし、次い
で常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８４の生産およ
び単離のために培養した。ＳＤＳゲル電気泳動法、ＲＩ
Ａおよび他の検定法により、得られた形質転換体はｍｅ
ｔ −ｂ Ｇ ｔｌが高いレベルで発現することが分か
った。プラスミドｐＣＺＩ８／ｌは温度誘発性ウシナウ
ーイ・レプリコンを含有しているので、培地温度約３７
°Ｃの時にｍｅＬ−ｂ Ｇ Ｈの最高発現が認められた
。
２ １ンＶ３０８／ｐＣＺ１８４と命名する）を、適当
な抗生物質を含有する′ＦＹ寒天上にプレートし、次い
で常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８４の生産およ
び単離のために培養した。ＳＤＳゲル電気泳動法、ＲＩ
Ａおよび他の検定法により、得られた形質転換体はｍｅ
ｔ −ｂ Ｇ ｔｌが高いレベルで発現することが分か
った。プラスミドｐＣＺＩ８／ｌは温度誘発性ウシナウ
ーイ・レプリコンを含有しているので、培地温度約３７
°Ｃの時にｍｅＬ−ｂ Ｇ Ｈの最高発現が認められた
。
実施例８
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ．ＣｏｌｉＫ１
２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９．１と命名する）を、
適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートし、次
いで常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，１の生
産および単離のために培養した。
２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９．１と命名する）を、
適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートし、次
いで常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，１の生
産および単離のために培養した。
ＳＤＳゲル電気泳動法、ＲＩＡおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はｍｅｔ−ｂＧＨが高いレベルで
発現することが分かった。プラスミドｐｃ２１４９．１
は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有している
のて、培地を晶度約３７°Ｃの時にｎｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。
、得られた形質転換体はｍｅｔ−ｂＧＨが高いレベルで
発現することが分かった。プラスミドｐｃ２１４９．１
は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有している
のて、培地を晶度約３７°Ｃの時にｎｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。
実施例９
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実１ｒ＝例１にも
詳細に説明されている。
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実１ｒ＝例１にも
詳細に説明されている。
所望の形質転換体く本明細書に於いてｌ’：．Ｃｏｌｉ
！（１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ］４９．２と命名する）を
、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートシ、
次いて常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，２の
生産および単離のために培養した。
！（１２ＲＶ３０８／ｐＣＺ］４９．２と命名する）を
、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレートシ、
次いて常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，２の
生産および単離のために培養した。
ＳＤＳケル電気泳動法、ＲＩ Ａおよび池の検定法によ
り、１すられた形質転換体はｍａｔ −ｂ Ｇ Ｈか高
いレベルで発現することか分かった。プラスミドｐＣＺ
ｌ ４９．２はｔ温度誘発性ウシナウェイ・レプリコ
ンを含有しているので、培地温度約３７°Ｃの時にｎｅ
ｔ −ｂ Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
り、１すられた形質転換体はｍａｔ −ｂ Ｇ Ｈか高
いレベルで発現することか分かった。プラスミドｐＣＺ
ｌ ４９．２はｔ温度誘発性ウシナウェイ・レプリコ
ンを含有しているので、培地温度約３７°Ｃの時にｎｅ
ｔ −ｂ Ｇ Ｈの最高発現が認められた。
実施例１０
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ 、 ｃｏｔ
１ＫＩ２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９．３と命名する
）を、適当な抗生物質を含をするＴＹ寒天上にプレート
シ、次いて常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，
３の生産および単離のために培養した。
１ＫＩ２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１４９．３と命名する
）を、適当な抗生物質を含をするＴＹ寒天上にプレート
シ、次いて常法により以後のプラスミドｐＣＺ１４９，
３の生産および単離のために培養した。
ＳＤＳゲル電気泳動法、ＲＩＡおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はｍｃＬ−、ｂＧＨが高いレベル
で発現することが分かった。プラスミドｐＣＺ１４９，
３は温度誘発性ウシチウェイ・レプリコンを含有してい
るので、培地１品度約３７℃の時にｍｅＬ−ｂＧＨの最
高発現が認められた。
、得られた形質転換体はｍｃＬ−、ｂＧＨが高いレベル
で発現することが分かった。プラスミドｐＣＺ１４９，
３は温度誘発性ウシチウェイ・レプリコンを含有してい
るので、培地１品度約３７℃の時にｍｅＬ−ｂＧＨの最
高発現が認められた。
ＤＮＡリンカ−配列：
を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、ｌ記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（＋９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、ｌ記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ．ＣｏｌｉＫ１
２ ＲＶ３０８／、ｐＣＺ１８３川と命名する）を、
適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にブレートし、次
いで常法により以後のプラスミドｐＣ７１８３川の生産
および単離のために培養した。
２ ＲＶ３０８／、ｐＣＺ１８３川と命名する）を、
適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にブレートし、次
いで常法により以後のプラスミドｐＣ７１８３川の生産
および単離のために培養した。
ＳＤＳゲル電気泳動法、尺ｒＡおよび曲の検定法により
、得られた形質転換体はｍａｔ ｂＧ）Ｉが高いレベ
ルで発現することが分かった。プラスミドｐＣＺ１８３
．ｌは温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約３７°Ｃの時にｓｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。 ′実施例１２ ＤＮＡリンカ−配列： を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
、得られた形質転換体はｍａｔ ｂＧ）Ｉが高いレベ
ルで発現することが分かった。プラスミドｐＣＺ１８３
．ｌは温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約３７°Ｃの時にｓｅｔ −ｂ Ｇ
Ｈの最高発現が認められた。 ′実施例１２ ＤＮＡリンカ−配列： を、実施例５のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例５の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら（１９７７）およびフレアら（１
９７８）に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例１にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体（本明細書に於いてＥ 、 ｃｏｌ
１Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３．２と命名する
）を、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレート
シ、次いで常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８３，
１の生産および単離のために培養した。
１Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＣＺ１８３．２と命名する
）を、適当な抗生物質を含有するＴＹ寒天上にプレート
シ、次いで常法により以後のプラスミドｐＣＺ１８３，
１の生産および単離のために培養した。
ＳＤＳゲル電気泳動法、ＲＩＡおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はｍｅｔ −ｂ Ｇ Ｈが高いレ
ベルで発現することが分かった。プラスミドｐｃ２１８
３．２は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ−ｂＧＨ
の最高発現が認められた。
、得られた形質転換体はｍｅｔ −ｂ Ｇ Ｈが高いレ
ベルで発現することが分かった。プラスミドｐｃ２１８
３．２は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約３７°Ｃの時にｍｅｔ−ｂＧＨ
の最高発現が認められた。
第１図から第４図は、プラスミドｐＮＭ５７５の構築の
プロトコールを表した模式図、第５図から第８図は、プ
ラスミドｐＮＭ７８９Ｂの構築のプロトコールを表した
模式図、ならひに第９図はプラスミドｐＣＺ ｔｏ ｌ
の制限部位地図、第１０図はプラスミドｐＣＺ１１８の
制限部位地図および第１１図はプラスミドｐＣＺ１４５
の制限部位地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リシー・アンド・カンパ代 理
人 弁理士 前出 葆 （外１名）第１図 ｐＫＥＮｌｌｌ ｐＢＲ３２２第
２図 デ２ｐ白０３（第１の ／Ｓ１ λ２し１−にり 第３図 ｔ５．ｔｊＦ’１０５ ＠ ２ ｎ第４図 第５図 第６図 ａｌ ｌ 第７図 第８図 ピＶＬＩ ＩＩ 掘取Ｐｖ’ ＩＩ Ｂａｍ ＋ｔ１
ＢａｍＨＩ
４功保フンクヌンヒ第９図 第１０図
プロトコールを表した模式図、第５図から第８図は、プ
ラスミドｐＮＭ７８９Ｂの構築のプロトコールを表した
模式図、ならひに第９図はプラスミドｐＣＺ ｔｏ ｌ
の制限部位地図、第１０図はプラスミドｐＣＺ１１８の
制限部位地図および第１１図はプラスミドｐＣＺ１４５
の制限部位地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リシー・アンド・カンパ代 理
人 弁理士 前出 葆 （外１名）第１図 ｐＫＥＮｌｌｌ ｐＢＲ３２２第
２図 デ２ｐ白０３（第１の ／Ｓ１ λ２し１−にり 第３図 ｔ５．ｔｊＦ’１０５ ＠ ２ ｎ第４図 第５図 第６図 ａｌ ｌ 第７図 第８図 ピＶＬＩ ＩＩ 掘取Ｐｖ’ ＩＩ Ｂａｍ ＋ｔ１
ＢａｍＨＩ
４功保フンクヌンヒ第９図 第１０図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ａ）転写活性化配列、 ｂ）以下の配列群の中から選ばれるいずれかのＤＮＡ配
列：１）【遺伝子配列があります。】２）【遺伝子配列
があります。】 ３）【遺伝子配列があります。】 ４）【遺伝子配列があります。】 ５）【遺伝子配列があります。】 ６）【遺伝子配列があります。】 ７）【遺伝子配列があります。】 および ８）【遺伝子配列があります。】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルである］
、および ｃ）生物活性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 を連続的に含有している組換えＤＮＡ発現ベクター。 ２、プラスミドである請求項１に記載の組換えＤＮＡ発
現ベクター。 ３、転写活性化配列が、Ｅ．Ｃｏｌｉトリプトファン、
Ｅ．ｃｏｌｉリポプロテイン、Ｅ．ｃｏｌｉラクトース
、バクテリオファージλＰ＿ＬＯ＿Ｌ、バクテリオファ
ージλＰ＿ＲＯ＿Ｒ、バシラス・サブチリス増殖または
ストレプトマイセス・アズレウスチオストレプトン耐性
転写活性化配列である請求項１または請求項２に記載の
組換えＤＮＡ発現ベクター。 ４、プラスミドｐＣＺ１４９、ｐＣＺ１８３、ｐＣＺ１
８４、ｐＣＺ１４９．１、ｐＣＺ１４９．２、ｐＣＺ１
４８．３、ｐＣＺ１８３．１またはｐＣＺ１８３．２で
ある請求項１から請求項３までのいずれかに記載のベク
ター。 ５、請求項１から請求項３までのいずれかに記載の組換
えＤＮＡ発現ベクターを含有する宿主細胞。 ６、Ｅ．ｃｏｌｉである請求項５に記載の宿主細胞。 ７、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２ＲＶ３０８である請求項６に記
載の宿主細胞。 ８、機能的なポリペプチドを生産するための方法であっ
て、 １）ａ）転写活性化配列、 ｂ）以下の配列群の中から選ばれるいずれかのＤＮＡ配
列； １）【遺伝子配列があります。】 ２）【遺伝子配列があります。】 ３）【遺伝子配列があります。】 ４）【遺伝子配列があります。】 ５）【遺伝子配列があります。】 ６）【遺伝子配列があります。】 ７）【遺伝子配列があります。】 および ８）【遺伝子配列があります。】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルである］
、および ｃ）生物活性ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列 を連続的に含有している組換えＤＮＡ発現ベクターで原
核生物細胞を形質転換し、 ２）適当な遺伝子発現の条件下に、この形質転換した細
胞を培養すること を特徴とする生産方法。 ９、転写活性化配列が、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン、
Ｅ．ｃｏｌｉリポプロテイン、Ｅ．ｃｏｌｉラクトース
、バクテリオファージλＰ＿ＬＯ＿Ｌ、バクテリオファ
ージλＰ＿ＲＯ＿Ｒ、バシラス・サブチリス増殖または
ストレプトマイセス・アズレウスチオストレプトン耐性
転写活性化配列である請求項８に記載の方法。 １０、転写活性化配列が、直列に１つまたはそれ以上の
Ｅ．ｃｏｌｉ転写活性化配列を含有している請求項８に
記載の方法。 １１、転写活性化配列がＥ．ｃｏｌｉトリプトファンま
たはＥ．ｃｏｌｉラクトース転写活性化配列である請求
項９に記載の方法。 １２、組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミドである請
求項８から請求項１０までのいずれかに記載の方法。 １３、生物活性ポリペプチドのコード配列が、ウシ成長
ホルモン、ヒト成長ホルモン、ヒト・プレ成長ホルモン
、ブタ成長ホルモン、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホ
ルモン、ヒト成長ホルモン放出因子、ウシ成長ホルモン
放出因子、ブタ成長ホルモン放出因子、ヒト・インシュ
リンＡ鎖、ヒト・インシュリンＢ鎖、ヒト・プロインシ
ュリン、ヒトおよび非−ヒト・インターフェロン、ウロ
キナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インター
ロイキン I またはインターロイキンIIをコードしてい
る配列である請求項８から請求項１１のいずれかに記載
の方法。 １４、プラスミドが、ｐＣＺ１８３、ｐＣＺ１８４、ｐ
ＣＺ１４９．１、ｐＣＺ１４９．２、ｐＣＺ１４９．３
、ｐＣＺ１８３．１またはｐＣＺ１８３．２である請求
項１２に記載の方法。 １５、形質転換される細胞が原核生物細胞である請求項
８から請求項１３までのいずれかに記載の方法。 １６、形質転換される原核生物細胞がＥ．ｃｏｌｉであ
る請求項１５に記載の方法。 １７、形質転換される原核生物細胞がＥ．ｃｏｌｉＫ１
２ＲＶ３０８である請求項１６に記載の方法。 １８、配列が、 １）【遺伝子配列があります。】 ２）【遺伝子配列があります。】 ３）【遺伝子配列があります。】 ４）【遺伝子配列があります。】 ５）【遺伝子配列があります。】 ６）【遺伝子配列があります。】 ７）【遺伝子配列があります。】 および ８）【遺伝子配列があります。】 ［式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニル
、Ｃはデオキシシチジル、およびＴはチミジルを示す］ であるＤＮＡリンカー配列を含有する組換えＤＮＡ発現
ベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11867887A | 1987-11-09 | 1987-11-09 | |
| US118678 | 1987-11-09 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160488A true JPH01160488A (ja) | 1989-06-23 |
Family
ID=22380086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63283528A Pending JPH01160488A (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0316115A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01160488A (ja) |
| CA (1) | CA1307482C (ja) |
| DK (1) | DK612688A (ja) |
| IL (1) | IL88279A0 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5514544A (en) * | 1991-07-26 | 1996-05-07 | Eli Lilly And Company | Activator gene for macrolide biosynthesis |
| US5990091A (en) * | 1997-03-12 | 1999-11-23 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2852027A1 (de) * | 1978-12-01 | 1980-06-12 | Bayer Ag | Verfahren zum faerben von polyesterhaltigen materialien |
| NZ201918A (en) * | 1981-09-18 | 1987-04-30 | Genentech Inc | N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone |
| DK156072C (da) * | 1985-04-03 | 1989-11-06 | Nordisk Gentofte | Syntetisk dna-sekvens indeholdende et ribosombindingssted |
-
1988
- 1988-11-02 CA CA000581968A patent/CA1307482C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-11-03 IL IL88279A patent/IL88279A0/xx unknown
- 1988-11-03 EP EP88310371A patent/EP0316115A3/en not_active Ceased
- 1988-11-03 DK DK612688A patent/DK612688A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-11-09 JP JP63283528A patent/JPH01160488A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0316115A3 (en) | 1990-05-09 |
| DK612688A (da) | 1989-06-22 |
| CA1307482C (en) | 1992-09-15 |
| DK612688D0 (da) | 1988-11-03 |
| IL88279A0 (en) | 1989-06-30 |
| EP0316115A2 (en) | 1989-05-17 |
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