JPH01160488A - ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 - Google Patents
ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、1)ウシ成長ホルモン(bGH)の生物活性
誘導体をコードしている遺伝子の解読フレーム内にある
転写および翻訳活性化ヌクレオチド配列、および 2)誘導条件下で、コピー数の制御能を喪失するレプリ
コン を含有する、選択可能な、自律的に複製する新規な組換
えDNA発現ベクターに関する。本発明は、さらに、こ
のベクターの新規な形質転換体、ウシ成長ホルモン誘導
体およびこれらの使用方法に関する。
誘導体をコードしている遺伝子の解読フレーム内にある
転写および翻訳活性化ヌクレオチド配列、および 2)誘導条件下で、コピー数の制御能を喪失するレプリ
コン を含有する、選択可能な、自律的に複製する新規な組換
えDNA発現ベクターに関する。本発明は、さらに、こ
のベクターの新規な形質転換体、ウシ成長ホルモン誘導
体およびこれらの使用方法に関する。
bGHを生産するための組換えDNA技術は、遺伝子の
発現性に問題があり、それ故にその開発および利用は妨
げられていた。これらの問題のうち、欧州特許出願公開
第0075444号に記載されている幾つかの問題は、
機能的に最善でない(functionally su
boptimal)m RN Aの転写に関するもので
ある。
発現性に問題があり、それ故にその開発および利用は妨
げられていた。これらの問題のうち、欧州特許出願公開
第0075444号に記載されている幾つかの問題は、
機能的に最善でない(functionally su
boptimal)m RN Aの転写に関するもので
ある。
組換えDNA技術の開発および利用は、遺伝子発現が高
レベルで得られるベクターが一般に不足していることか
ら、制限を受けている。lac [ロバート(Robe
rts)ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス、ニー・ニス・ニー(Pr
oc、 Nat、 Acad、 Sci、 USA 7
6:5596゜197.9)およびガウシテ(Guar
ante)ら、セル(Cell 20:543.198
0)] 、trp [ホールウェル(Hallewel
1)およびエムテージ(Emtage)のジーン(G
ene 9:27.1980)] 、バクテリオファー
ジλPL[レマウト(Remaut)ら、Gene 1
5(1):81.1981.パーナート(Bernar
d)ら、Gene 5:59.1979およびブロム(
Derom)ら、Gene 17:45.1982コお
よびlpp [ジーベル(Ziebel)ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジ−(J、 Bacterio
l、 145:654.1981)、シー(Lee)
ら、J、 Bacteriol、 146:861.1
981およびナカムラ(Nakamura)およびイノ
ウニ(Inouye)のCe1l 18:1109,1
979]プロモーターシステムが、それらに適合する組
換えDNAベクター類に組み込まれているが、他の使用
し得る発現システムは殆どなく、たとえあるとしてもわ
ずかである。実際、これらの既知の発現ベクターを用い
ても、多(の異種遺伝子は発現されないが、または、せ
いぜい若干量しか発現されない。このような発現の不良
は、mRNAの転写、即ちリボゾームに対する最善でな
い結合または結合不能に関係していることが多い。これ
は、リボゾームと結合する部位を封鎖する不適当なステ
ム(stem)およびループ(loop)構造の形成、
mRNA転写物の一般的な不安定性、またはりボゾーム
の結合性もしくは翻訳の開始を阻害する配列の存在に由
来するのかもしれない。これらの問題の幾つかは、欧州
特許出願公開第0075444号に記載されている。
レベルで得られるベクターが一般に不足していることか
ら、制限を受けている。lac [ロバート(Robe
rts)ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス、ニー・ニス・ニー(Pr
oc、 Nat、 Acad、 Sci、 USA 7
6:5596゜197.9)およびガウシテ(Guar
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1)およびエムテージ(Emtage)のジーン(G
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Derom)ら、Gene 17:45.1982コお
よびlpp [ジーベル(Ziebel)ら、ジャーナ
ル・オブ・バクテリオロジ−(J、 Bacterio
l、 145:654.1981)、シー(Lee)
ら、J、 Bacteriol、 146:861.1
981およびナカムラ(Nakamura)およびイノ
ウニ(Inouye)のCe1l 18:1109,1
979]プロモーターシステムが、それらに適合する組
換えDNAベクター類に組み込まれているが、他の使用
し得る発現システムは殆どなく、たとえあるとしてもわ
ずかである。実際、これらの既知の発現ベクターを用い
ても、多(の異種遺伝子は発現されないが、または、せ
いぜい若干量しか発現されない。このような発現の不良
は、mRNAの転写、即ちリボゾームに対する最善でな
い結合または結合不能に関係していることが多い。これ
は、リボゾームと結合する部位を封鎖する不適当なステ
ム(stem)およびループ(loop)構造の形成、
mRNA転写物の一般的な不安定性、またはりボゾーム
の結合性もしくは翻訳の開始を阻害する配列の存在に由
来するのかもしれない。これらの問題の幾つかは、欧州
特許出願公開第0075444号に記載されている。
本発明は、遺伝子の合成による修飾を要することなく、
発現に関する問題を解決するものである。
発現に関する問題を解決するものである。
この合成による修飾は、時間および費用がかかるばかり
でな(、偶発的にせよ、DNA配列に誤りを生じさせか
ねない危険性が実質的に増大する。
でな(、偶発的にせよ、DNA配列に誤りを生じさせか
ねない危険性が実質的に増大する。
本発明は、注目の遺伝子独自の配列を修飾または変化さ
せることなく、mRNA転写物の5°末端部を改変する
ことによって、この問題を回避するものである。
せることなく、mRNA転写物の5°末端部を改変する
ことによって、この問題を回避するものである。
本明細書中に記載の用語を以下に定義する。
組換えDNAクローニングベクター:1つまたはそれ以
上の付加的なりNA上セグメント追加することができる
が、またはこのようなセグメントが既に追加されたDN
A分子を含有している自律的に複製する物質であり、こ
れにはプラスミドがあるが、これに限定されるものでは
ない。
上の付加的なりNA上セグメント追加することができる
が、またはこのようなセグメントが既に追加されたDN
A分子を含有している自律的に複製する物質であり、こ
れにはプラスミドがあるが、これに限定されるものでは
ない。
組換えDNA発現ベクター:1つまたはそれ以上の転写
および翻訳活性化配列(群)が組み込まれた組換えDN
Aクローニングベクター。
および翻訳活性化配列(群)が組み込まれた組換えDN
Aクローニングベクター。
転写活性化配列: DNAの、RNA転写物への転写を
指令するDNA配列であるが、またはその転写のための
DNA配列。
指令するDNA配列であるが、またはその転写のための
DNA配列。
翻訳活性化配列:mRNA転写物の、ペプチド、ポリペ
プチドまたはタンパク質への翻訳を指令するDNA配列
であるが、またはその翻訳のためのDNA配列。
プチドまたはタンパク質への翻訳を指令するDNA配列
であるが、またはその翻訳のためのDNA配列。
翻訳開始シグナル:翻訳開始コドンをコードしているD
NA l−リプレット。
NA l−リプレット。
翻訳終止シグナル:翻訳終止コドンをコードしているD
NAトリプレット。
NAトリプレット。
形質転換: DNAを受容宿主細胞に導入すること。
形質転換体:形質転換を既に受けている受容宿主細胞。
制限フラグメント:1つまたはそれ以上の制限酵素の作
用によって生成された線状DNA配列。
用によって生成された線状DNA配列。
生物活性ポリペプチド:回収可能な生物学的に活性な同
種(ホモローガス)または異種(ヘテロローガス)ポリ
ペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチドおよび一部
もしくは全部の同種ポリペプチドを含有する回収可能な
ポリペプチド、または、異種ポリペプチドおよび特異的
に開裂することができる生物活性を不活化するポリペプ
チドを含有する回収可能な生物不活性な融合ポリペプチ
ド。
種(ホモローガス)または異種(ヘテロローガス)ポリ
ペプチドもしくは前駆体、異種ポリペプチドおよび一部
もしくは全部の同種ポリペプチドを含有する回収可能な
ポリペプチド、または、異種ポリペプチドおよび特異的
に開裂することができる生物活性を不活化するポリペプ
チドを含有する回収可能な生物不活性な融合ポリペプチ
ド。
融合憤伝子産物:同種ポリペプチドの一部または全部を
含有する回収可能な異種ポリペプチド。
含有する回収可能な異種ポリペプチド。
レプリコン:組換えDNAクローニングおよび発現ベク
ターの復製を制御するDNA配列。
ターの復製を制御するDNA配列。
ウシナウェー・レプリコン°コピー数の制御能が欠如し
ているが、または喪失するよう誘導され得るレプリコン
である。このような喪失の結果、複製が非制御下に置か
れ、このようなレプリコンが組み込まれたDNAはコピ
ー数が大幅に増大する。
ているが、または喪失するよう誘導され得るレプリコン
である。このような喪失の結果、複製が非制御下に置か
れ、このようなレプリコンが組み込まれたDNAはコピ
ー数が大幅に増大する。
本発明は、a)転写活性化配列、
b)以下の配列群の中から選ばれるいずれかのDTff
rTTCCTCCTTATA″ITAT−’)’および [式中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニル
、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルである]
、および C)生物活性ポリペプチドをコードしているDNA配列 を連続的に含有している新規な組換えDNA発現ベクタ
ーを提供するものである(ただし、配列aおよび配列す
は配列Cか微生物学的に発現される様位置している)。
rTTCCTCCTTATA″ITAT−’)’および [式中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニル
、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルである]
、および C)生物活性ポリペプチドをコードしているDNA配列 を連続的に含有している新規な組換えDNA発現ベクタ
ーを提供するものである(ただし、配列aおよび配列す
は配列Cか微生物学的に発現される様位置している)。
本発明は、さらに、このベクターを構築するのに使用さ
れるDNA配列、ならびにこのような配列およびベクタ
ーを含有する形質転換された宿主細胞を提供するもので
ある。
れるDNA配列、ならびにこのような配列およびベクタ
ーを含有する形質転換された宿主細胞を提供するもので
ある。
本発明のベクターは、Xbal−Ndel DNAリン
カ−配列a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7ま
たはa8のいずれかをpCZ 145の〜92kb X
bal−Ndelフラグメントにライゲートすることに
よって溝築される。得られるプラスミドはそれぞれpC
Z149、pCZ183、pCZ184、pCZ149
川、pCZ149.2、pCZ149.3、pCZ 1
83.lおよびpCZ 183.2と命名され、これら
は、 1・)大腸菌(E.Coli)リポプロテイン遺伝子転
写活性化配列(ナカムラ(Nakamura)およびイ
ノウニ(Inouye)、 1979)、 2)合成翻訳活性化配列、 3)メチオニル−ウシ成長ホルモン(net −b G
H)をコードしているヌクレオチド配列の解読フレー
ム内に存在する翻訳開始シグナル、および4)met−
bGHコード配列の解読フレーム内に於いて適切に配置
された翻訳終止シグナルを連続的に含有している。
カ−配列a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7ま
たはa8のいずれかをpCZ 145の〜92kb X
bal−Ndelフラグメントにライゲートすることに
よって溝築される。得られるプラスミドはそれぞれpC
Z149、pCZ183、pCZ184、pCZ149
川、pCZ149.2、pCZ149.3、pCZ 1
83.lおよびpCZ 183.2と命名され、これら
は、 1・)大腸菌(E.Coli)リポプロテイン遺伝子転
写活性化配列(ナカムラ(Nakamura)およびイ
ノウニ(Inouye)、 1979)、 2)合成翻訳活性化配列、 3)メチオニル−ウシ成長ホルモン(net −b G
H)をコードしているヌクレオチド配列の解読フレー
ム内に存在する翻訳開始シグナル、および4)met−
bGHコード配列の解読フレーム内に於いて適切に配置
された翻訳終止シグナルを連続的に含有している。
プラスミドpCZ145出発物質は〜9.2kbであり
、Xbal−HgiAI DNAリンカ−配列:を、プ
ラスミドpc2118の0.6kb BamH1−Hg
iAlおよび8.6kb BamHI −Xbalフラ
グメントとライゲートすることによって構築される。
、Xbal−HgiAI DNAリンカ−配列:を、プ
ラスミドpc2118の0.6kb BamH1−Hg
iAlおよび8.6kb BamHI −Xbalフラ
グメントとライゲートすることによって構築される。
このプラスミドpCZ118は〜9゜2kbであり、〜
1.6kb EcoRI−Ndelフラグメントをプラ
スミドpCZlolから削除することによって構築され
る。このプラスミドpCZ101は〜10.8kbであ
り、プラスミドpNM789Bの0、6 kb Xba
l −B amHIフラグメントを、同様に消化したプ
ラスミドpTM−1°−A3にライゲートすることによ
って構築される。
1.6kb EcoRI−Ndelフラグメントをプラ
スミドpCZlolから削除することによって構築され
る。このプラスミドpCZ101は〜10.8kbであ
り、プラスミドpNM789Bの0、6 kb Xba
l −B amHIフラグメントを、同様に消化したプ
ラスミドpTM−1°−A3にライゲートすることによ
って構築される。
E.Coliリポプロテイン遺伝子の転写および翻訳活
性化配列ならびに温度誘発性ウシナウェイ・レプリコン
を含有するこの後者のプラスミドは、ノーザン・シージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−(Northern
Regional Re5earch Laborat
ory、ペオリア、イリノイ)に寄託され、そのパーマ
ネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部を
構成している菌株であるE.Coli K 12 R
V308/p1M lo−A3から得ることができる
。この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源および
ストック保有宿主として受託番号NRRL B−15
733の下で入手可能である。上記プラスミドpN、M
789B出発物質は、以下の第1図から第8図および実
施例1に於いて開示し、説明している工程に従い、プラ
スミドpKEN111から得られる。プラスミドpKE
N111は、ノーザン・シージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−(Northern Regional Re
5earch Laboratory、ベオリア、イリ
ノイ)に寄託され、そのパーマネント・ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している菌株である
E.Coli K 12 CC620/pKENl 1
1から得ることができる。
性化配列ならびに温度誘発性ウシナウェイ・レプリコン
を含有するこの後者のプラスミドは、ノーザン・シージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリ−(Northern
Regional Re5earch Laborat
ory、ペオリア、イリノイ)に寄託され、そのパーマ
ネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部を
構成している菌株であるE.Coli K 12 R
V308/p1M lo−A3から得ることができる
。この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源および
ストック保有宿主として受託番号NRRL B−15
733の下で入手可能である。上記プラスミドpN、M
789B出発物質は、以下の第1図から第8図および実
施例1に於いて開示し、説明している工程に従い、プラ
スミドpKEN111から得られる。プラスミドpKE
N111は、ノーザン・シージョナル・リサーチ・ラボ
ラトリ−(Northern Regional Re
5earch Laboratory、ベオリア、イリ
ノイ)に寄託され、そのパーマネント・ストック・カル
チャー・コレクションの一部を構成している菌株である
E.Coli K 12 CC620/pKENl 1
1から得ることができる。
この菌株は、上記プラスミドの好ましい供給源およびス
トック保有宿主として受託番号NRRLB−15011
の下で入手可能である。プラスミドpNM789Bも、
E.Coli リポプロティン遺伝子の転写および翻
訳活性化配列を含有しており、さらに、bGHおよびこ
のbGHのN−末端に位置する9員ポリペプチドからな
る融合タンパク質のコード配列を、適切に配置されてい
る翻訳終止シグナルと共に含有している。Xbal−B
amHIフラグメント内に含有されている前述の転写活
性化配列および融合タンパク質コード配列を、適切に開
裂したプラスミドpIM−1°−A3にライゲートする
ことにより、上記のプラスミドpCZ101出発物質が
得られる。
トック保有宿主として受託番号NRRLB−15011
の下で入手可能である。プラスミドpNM789Bも、
E.Coli リポプロティン遺伝子の転写および翻
訳活性化配列を含有しており、さらに、bGHおよびこ
のbGHのN−末端に位置する9員ポリペプチドからな
る融合タンパク質のコード配列を、適切に配置されてい
る翻訳終止シグナルと共に含有している。Xbal−B
amHIフラグメント内に含有されている前述の転写活
性化配列および融合タンパク質コード配列を、適切に開
裂したプラスミドpIM−1°−A3にライゲートする
ことにより、上記のプラスミドpCZ101出発物質が
得られる。
関連する多くのその他のbGH発現プラスミドを構築す
ることもでき、これらも本発明を例示する。例えば、個
々のDNAリンカ−配列は、mRNA転写物をポリペプ
チドに発現させるものでなければならないが、このよう
な構築に使用できるリンカ−D N A配列の数は、実
際上無限である。
ることもでき、これらも本発明を例示する。例えば、個
々のDNAリンカ−配列は、mRNA転写物をポリペプ
チドに発現させるものでなければならないが、このよう
な構築に使用できるリンカ−D N A配列の数は、実
際上無限である。
これらの配列は、完全保護ジデオキシリボヌクレオチド
・ビルディングブロックを使用した改良ホスホトリエス
テル法によって、常法により合成することができる。こ
のような合成法は当業界では周知であり、イタクラら[
Itakura、サイエンス(Science)、19
8:1056.1977]およびフレアらEProcN
ak、 Acad、 Sci、 LISA 75:57
65.1978]の操作法に実質的に従うことで行うこ
とができる。
・ビルディングブロックを使用した改良ホスホトリエス
テル法によって、常法により合成することができる。こ
のような合成法は当業界では周知であり、イタクラら[
Itakura、サイエンス(Science)、19
8:1056.1977]およびフレアらEProcN
ak、 Acad、 Sci、 LISA 75:57
65.1978]の操作法に実質的に従うことで行うこ
とができる。
本発明を実施する場合、特定の転写活性化配列を選択す
ることは重要でないので、本発明は、特定の転写活性化
配列を使用することに限定されない。既に例示したリポ
プロテインの転写活性化配列と置換することのできる転
写活性化配列としては、E.Coli トリプトファ
ン(trp)、E 、 col iラクトース(lac
)、バタテリオファージλPLOL。
ることは重要でないので、本発明は、特定の転写活性化
配列を使用することに限定されない。既に例示したリポ
プロテインの転写活性化配列と置換することのできる転
写活性化配列としては、E.Coli トリプトファ
ン(trp)、E 、 col iラクトース(lac
)、バタテリオファージλPLOL。
バクテリオファージλPROR,バシラス・サブチリス
(Bacillus 5ubLilis、枯草菌)増殖
(veg)およびストレプトマイセス・アズレウス(S
treptomyces azureus)チオストレ
プトン耐性(tsr)遺伝子転写活性化配列などが挙げ
られるが(これらに限定されるものではない。さらに、
1つまたはそれ以上の転写活性化配列、例えばtrpお
よびIac転写活性化配列を直列して使用することがで
きる。
(Bacillus 5ubLilis、枯草菌)増殖
(veg)およびストレプトマイセス・アズレウス(S
treptomyces azureus)チオストレ
プトン耐性(tsr)遺伝子転写活性化配列などが挙げ
られるが(これらに限定されるものではない。さらに、
1つまたはそれ以上の転写活性化配列、例えばtrpお
よびIac転写活性化配列を直列して使用することがで
きる。
既述した遺伝子の配列はすべて、既に特性化されており
、これらは合成によって、または既知のプラスミドから
構築することができる。
、これらは合成によって、または既知のプラスミドから
構築することができる。
本発明は、非常に応用性が広く、既述のmet −bG
Hコード配列を、生物活性ポリペプチドをコードしてい
る、実際上ありとあらゆるヌクレオチド配列で置き換え
ることができる。このようなコート配列としては、ヒト
成長ホルモン(hGH)、ヒト・プレ成長ホルモン(p
re −h G H) 、ブタ成長ホルモン(pGH)
、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン放出因子、ウシまたはブタ成長ホルモン放出因
子、ヒト・インシュリンA鎖、ヒト・インシュリンBm
、ヒト・プロインシュリン、ヒトおよび非−ヒト・イン
ターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活
性化因子、インターロイキンIおよびインターロイキン
11.あらゆるポリペプチドホルモン、研究または商業
的に価値のあるあらゆる酵素およびあらゆる生物活性ポ
リペプチドをコードしている配列が挙げられるが、これ
らに限定されない。
Hコード配列を、生物活性ポリペプチドをコードしてい
る、実際上ありとあらゆるヌクレオチド配列で置き換え
ることができる。このようなコート配列としては、ヒト
成長ホルモン(hGH)、ヒト・プレ成長ホルモン(p
re −h G H) 、ブタ成長ホルモン(pGH)
、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン放出因子、ウシまたはブタ成長ホルモン放出因
子、ヒト・インシュリンA鎖、ヒト・インシュリンBm
、ヒト・プロインシュリン、ヒトおよび非−ヒト・イン
ターフェロン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活
性化因子、インターロイキンIおよびインターロイキン
11.あらゆるポリペプチドホルモン、研究または商業
的に価値のあるあらゆる酵素およびあらゆる生物活性ポ
リペプチドをコードしている配列が挙げられるが、これ
らに限定されない。
より具体的には、例えば生物活性ポリペプチドがhGH
の場合のベクターは、例えば、プラスミドpCZ101
の〜l 0.2kb BamHI−Xbalフラグメン
トおよびプラスミドp NM575の〜05kb Ba
mH[−FnuD ffフラグメントの両者を、既述の
リンカ−配列1.2.3.4.5.6.7または8のい
ずれかにライゲートすることによって構築することがで
きる。
の場合のベクターは、例えば、プラスミドpCZ101
の〜l 0.2kb BamHI−Xbalフラグメン
トおよびプラスミドp NM575の〜05kb Ba
mH[−FnuD ffフラグメントの両者を、既述の
リンカ−配列1.2.3.4.5.6.7または8のい
ずれかにライゲートすることによって構築することがで
きる。
本明細書に開示した具体例では、プラスミドの複製は、
英国(GB)特許公開番号第1,557,774号およ
びウーリン(Uhlin)らのGene 6:91.1
979の両者に開示されている温度誘発性ウシチウェイ
・レプリコンによって決定される。30°C以下の温度
、特に25℃では、このレプリコンは1個の細胞当たり
約10−15コピーと比較的少ないコピー数を維持して
いる。温度を37°Cにした場合には、コピーの制御能
が喪失し、このレプリコンを含有するプラスミドDNA
が1細胞当たり1000−2000のコピー数にまで増
幅する。本明細書に於いて例示している特定のウシナウ
ェイ・レプリコンは、既述のプラスミドp1Mi’−A
3出発物質に含有されている。
英国(GB)特許公開番号第1,557,774号およ
びウーリン(Uhlin)らのGene 6:91.1
979の両者に開示されている温度誘発性ウシチウェイ
・レプリコンによって決定される。30°C以下の温度
、特に25℃では、このレプリコンは1個の細胞当たり
約10−15コピーと比較的少ないコピー数を維持して
いる。温度を37°Cにした場合には、コピーの制御能
が喪失し、このレプリコンを含有するプラスミドDNA
が1細胞当たり1000−2000のコピー数にまで増
幅する。本明細書に於いて例示している特定のウシナウ
ェイ・レプリコンは、既述のプラスミドp1Mi’−A
3出発物質に含有されている。
本発明が特定のウシナウェイ・レプリコン、即ちコピー
数突然変異物を使用することに限定されるものでないこ
とは、理解されるであろう。他の誘発性ウシナウェイ、
即ち高いコピー数のレプリコンは、適当な選択によって
得ることができ、また、国際公開番号WO321029
01およびピットナー(Bittner)およびヴアブ
ネック(vapnek)のGene 15:319.1
981に記載されている操作法に従えば構築することが
できる。さらに、非−ウシナウェイ・レプリコンも、そ
れがE.Coli、 BacillusSS trep
tomycesまたは他の適当な細菌宿主細胞に於いて
機能的である限り、使用することができる。このような
レプリコンには、限定されるものではないが、例えばE
、 col i内で複製するバクテリオファージなど
の、pMB l、Co1E1、NR1、RK2、RK6
、psc l Ol、RPI、RP4、Fなど由来のレ
プリコン、またストレプ]・マイセス内で復)ソするバ
クテリオファージなどの、pEL7、pEL103.5
cp2.5CP2*など由来のレプリコン、さらにバシ
ラス内で復製するバクテリオファージなどの、pcI9
4、pBsl、pEI94、p[JB l 10. p
T I 27など由来のレプリコンが挙げられる。当業
者であれば、これらのレプリコン、さらにはウシナウェ
イ・レプリコンの変異物も置換可能であり、これらを使
用して構築される発現ベクターも本発明の範囲内に属す
ることは理解できるであろう。
数突然変異物を使用することに限定されるものでないこ
とは、理解されるであろう。他の誘発性ウシナウェイ、
即ち高いコピー数のレプリコンは、適当な選択によって
得ることができ、また、国際公開番号WO321029
01およびピットナー(Bittner)およびヴアブ
ネック(vapnek)のGene 15:319.1
981に記載されている操作法に従えば構築することが
できる。さらに、非−ウシナウェイ・レプリコンも、そ
れがE.Coli、 BacillusSS trep
tomycesまたは他の適当な細菌宿主細胞に於いて
機能的である限り、使用することができる。このような
レプリコンには、限定されるものではないが、例えばE
、 col i内で複製するバクテリオファージなど
の、pMB l、Co1E1、NR1、RK2、RK6
、psc l Ol、RPI、RP4、Fなど由来のレ
プリコン、またストレプ]・マイセス内で復)ソするバ
クテリオファージなどの、pEL7、pEL103.5
cp2.5CP2*など由来のレプリコン、さらにバシ
ラス内で復製するバクテリオファージなどの、pcI9
4、pBsl、pEI94、p[JB l 10. p
T I 27など由来のレプリコンが挙げられる。当業
者であれば、これらのレプリコン、さらにはウシナウェ
イ・レプリコンの変異物も置換可能であり、これらを使
用して構築される発現ベクターも本発明の範囲内に属す
ることは理解できるであろう。
本発明の発現ベクターおよび本発明の方法は、広い範囲
の宿主生物に使用することができ、これらには、エシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli。
の宿主生物に使用することができ、これらには、エシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli。
大腸菌)、例えばE.Coli K l 2、E.Co
li K 12 RV308、E.Coli K 1’
2 HB I O1、E。
li K 12 RV308、E.Coli K 1’
2 HB I O1、E。
coli K12 C600、E.Coli K12
C600RK−MK−1E.Coli K 12 RR
1およびE.Coli K 12 MM294など、セ
ラチア(Serratia)、シュードモナス(P s
eudomonas)などのダラム陰性原核生物、パシ
ラス、例えばB、サブチリス(Bacillus 5u
btilis)、B、スリンギエンシス(B。
C600RK−MK−1E.Coli K 12 RR
1およびE.Coli K 12 MM294など、セ
ラチア(Serratia)、シュードモナス(P s
eudomonas)などのダラム陰性原核生物、パシ
ラス、例えばB、サブチリス(Bacillus 5u
btilis)、B、スリンギエンシス(B。
thringiensis)およびB、スリンギエンシ
スvar。
スvar。
イスラエレンシス(B、 thringiensis
var、 1sraelensis)、ならびにストレ
プトマイセス、例えばS。
var、 1sraelensis)、ならびにストレ
プトマイセス、例えばS。
フラジアエ(S、 fradiae)、S、アンボア
7 ’、i Z 7ス(S、 aibofaciens
)、S、リヴイダンス(S、 1ividans)およ
びS、グリセオファスカス(S、 griseofus
cus)などのグラム陽性原核生物などがある。本発明
のすべての態様は有用であるが、ウシ成長ホルモンをコ
ードしているDNAを含有するベクターおよび形質転換
体が好ましい。
7 ’、i Z 7ス(S、 aibofaciens
)、S、リヴイダンス(S、 1ividans)およ
びS、グリセオファスカス(S、 griseofus
cus)などのグラム陽性原核生物などがある。本発明
のすべての態様は有用であるが、ウシ成長ホルモンをコ
ードしているDNAを含有するベクターおよび形質転換
体が好ましい。
好ましいベクターには、pCZ149、pCZ183、
pCZ184、pCZ149.1、pCZ149,2、
pCZ149.3、pCZ183゜1およびpCZ18
3.2があり、好ましい形質転換体には、E、col、
i K 12 RV308/pCZ149、E.Col
i K12 RV308/pCZ183、E.Col
i K12 R,V308/pCZ184、E.Co
li K 12 RV308/pCZ 149.1、
E.Coli K 12 RV308/pCZ 14
9.2、E.Coli K12 RV308/pCZ
149.3、E.Coli K 12 RV308/
pCZ 183.1およびE.Coli K12 RV
308/pCZ183.2がある。
pCZ184、pCZ149.1、pCZ149,2、
pCZ149.3、pCZ183゜1およびpCZ18
3.2があり、好ましい形質転換体には、E、col、
i K 12 RV308/pCZ149、E.Col
i K12 RV308/pCZ183、E.Col
i K12 R,V308/pCZ184、E.Co
li K 12 RV308/pCZ 149.1、
E.Coli K 12 RV308/pCZ 14
9.2、E.Coli K12 RV308/pCZ
149.3、E.Coli K 12 RV308/
pCZ 183.1およびE.Coli K12 RV
308/pCZ183.2がある。
当業者であれば、理解されるであろうが、本発明の発現
ベクターおよび方法を使用して適当な宿主生物を形質転
換すれば、標準的な発酵条件下で外来性タンパク生産物
が発現される。次いで、得られた発酵ブロスから常法に
よって外来性タンパク生産物を単離する。以下の実施例
によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらには
、本発明のベクターの構築の説明およびその実際の操作
法の両方を適宜記載している。
ベクターおよび方法を使用して適当な宿主生物を形質転
換すれば、標準的な発酵条件下で外来性タンパク生産物
が発現される。次いで、得られた発酵ブロスから常法に
よって外来性タンパク生産物を単離する。以下の実施例
によって、本発明をさらに詳細に説明する。これらには
、本発明のベクターの構築の説明およびその実際の操作
法の両方を適宜記載している。
実施例1
プラスミドpKENO21(第3図、106)のXba
l−Ban+Hr開裂によって調製した〜5、lkbフ
ラグメントを出発物質として使用した。プラスミドpK
ENO21はpKENlll(第1図、101、これは
さらにり−(Lee)らのジャーナル・オブ・バクテリ
オロジ−(J、Bact、) 146461−866゜
1981およびライ−ベル(’Zwiebel)らのJ
、 Bact、 145:654−656.1981に
記載されている)の誘導体であり、このpKENl 1
1はE.Coli CC620(NRRL受託番号15
011)として寄託されており、またE.Coliのリ
ポプロティン遺伝子を含有している〜2.8kbフラグ
メントを有している。
l−Ban+Hr開裂によって調製した〜5、lkbフ
ラグメントを出発物質として使用した。プラスミドpK
ENO21はpKENlll(第1図、101、これは
さらにり−(Lee)らのジャーナル・オブ・バクテリ
オロジ−(J、Bact、) 146461−866゜
1981およびライ−ベル(’Zwiebel)らのJ
、 Bact、 145:654−656.1981に
記載されている)の誘導体であり、このpKENl 1
1はE.Coli CC620(NRRL受託番号15
011)として寄託されており、またE.Coliのリ
ポプロティン遺伝子を含有している〜2.8kbフラグ
メントを有している。
このフラグメントに関する記述は、ナカムラおよびイノ
ウニのCell 18:1109−1117.1979
にある。
ウニのCell 18:1109−1117.1979
にある。
pKENO21中、pBR322の唯一のBamH■お
よび5ail制限部位間に於ける6 50 bp(塩基
対)配列を、E 、 cot iのリポプロティン遺伝
子から取った配列と置換した。このリポプロティン遺伝
子配列(ナカムラおよびイノウニ、1979)は、リポ
プロティン遺伝子の最初のトリプレット(メチオニン)
の上流にある、プロモーター、5′−非翻訳領域および
リボゾーム結合部位を含有する462bpのAlulフ
ラグメントを含んでいる。
よび5ail制限部位間に於ける6 50 bp(塩基
対)配列を、E 、 cot iのリポプロティン遺伝
子から取った配列と置換した。このリポプロティン遺伝
子配列(ナカムラおよびイノウニ、1979)は、リポ
プロティン遺伝子の最初のトリプレット(メチオニン)
の上流にある、プロモーター、5′−非翻訳領域および
リボゾーム結合部位を含有する462bpのAlulフ
ラグメントを含んでいる。
唯一のXbaI制限部位が、翻訳開始メチオニンシグナ
ルから16bp前のりボゾーム結合部位内に位置してい
る。構造遺伝子の翻訳終止コドンから105bp上流に
位置しているPvun制限部位を、合成りNAリンカ−
(5’CCGGATCCGG3′、コラボレイティブ・
リサーチ(Col 1aborat ive Re5e
arch)から入手)を付加することによりBamHI
制限部位に変換した。リポプロティンの最後の35アミ
ノ酸に対応するコード配列、翻訳終止シグナルおよびメ
ツセンジャーRNAの3”−非翻訳領域に対応する配列
がこのBamHI部位の後ろに続いている。プラスミド
pKENO21はまた、リポプロティン遺伝子と関連の
ない、E、co1i染色体内に於けるその下流に位置す
る約850bpの外来性配列をも含有している。これら
の配列は、リポプロティン遺伝子を最初に単離する時に
使用した方法および制限酵素部位の結果、含まれたもの
である。
ルから16bp前のりボゾーム結合部位内に位置してい
る。構造遺伝子の翻訳終止コドンから105bp上流に
位置しているPvun制限部位を、合成りNAリンカ−
(5’CCGGATCCGG3′、コラボレイティブ・
リサーチ(Col 1aborat ive Re5e
arch)から入手)を付加することによりBamHI
制限部位に変換した。リポプロティンの最後の35アミ
ノ酸に対応するコード配列、翻訳終止シグナルおよびメ
ツセンジャーRNAの3”−非翻訳領域に対応する配列
がこのBamHI部位の後ろに続いている。プラスミド
pKENO21はまた、リポプロティン遺伝子と関連の
ない、E、co1i染色体内に於けるその下流に位置す
る約850bpの外来性配列をも含有している。これら
の配列は、リポプロティン遺伝子を最初に単離する時に
使用した方法および制限酵素部位の結果、含まれたもの
である。
プラスミドpKENO21は、以下の方法によってpK
ENl 11から誘導される(第1図、第2図および第
3図を参照):pKENlll (第1図、101)の
約50ugを、20mMトリス・HCQ(pH=7.4
) 、10mM MgC(!−おヨヒ6n+M β−メ
ルカプトエタノールを含有する緩衝i&300μρ中に
於いて、37°Cで2時間、制限酵素Hpa1125単
位を用いて消化した。得られた混合物を、フェノールお
よびクロロホルム50:50の混液300μgで2回抽
出し、次いでエタ/−ル2.5容量および3M酢酸ナト
リウムO1■容量を用い、回収した水層を沈澱させた。
ENl 11から誘導される(第1図、第2図および第
3図を参照):pKENlll (第1図、101)の
約50ugを、20mMトリス・HCQ(pH=7.4
) 、10mM MgC(!−おヨヒ6n+M β−メ
ルカプトエタノールを含有する緩衝i&300μρ中に
於いて、37°Cで2時間、制限酵素Hpa1125単
位を用いて消化した。得られた混合物を、フェノールお
よびクロロホルム50:50の混液300μgで2回抽
出し、次いでエタ/−ル2.5容量および3M酢酸ナト
リウムO1■容量を用い、回収した水層を沈澱させた。
得られたDNAペレットを電気泳動用緩衝液100μe
に溶解し、5%ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミ
ド:ビス(N、N’−メチレンビスアクリルアミド)の
比率29;1である。以下、特に明記しない限りすべて
のゲルもこれと同様である。)上で分画した。このゲル
を0.5μg/xσ臭化エチジウムを含有する溶液中で
染色し、バンドを長波長紫外光下で観察した。950b
pバンドを単離し、透析バッグへの電気溶出(elec
troelution)によってゲルから回収した。フ
ェノール/クロロホルム抽出し、エタ/−ル沈澱した後
、回収したDNA (約2.5 u g)をTEN (
10mM NaCQ、10mM )リス−HCf2(
pH=7.4)および″ 1mMエチレンジニトリロ
テトラ酢酸ナトリウム(EDTA) 、pH=8.0)
25μQに溶解した。
に溶解し、5%ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミ
ド:ビス(N、N’−メチレンビスアクリルアミド)の
比率29;1である。以下、特に明記しない限りすべて
のゲルもこれと同様である。)上で分画した。このゲル
を0.5μg/xσ臭化エチジウムを含有する溶液中で
染色し、バンドを長波長紫外光下で観察した。950b
pバンドを単離し、透析バッグへの電気溶出(elec
troelution)によってゲルから回収した。フ
ェノール/クロロホルム抽出し、エタ/−ル沈澱した後
、回収したDNA (約2.5 u g)をTEN (
10mM NaCQ、10mM )リス−HCf2(
pH=7.4)および″ 1mMエチレンジニトリロ
テトラ酢酸ナトリウム(EDTA) 、pH=8.0)
25μQに溶解した。
得られた9 50bp Hpanルミnフラグメントg
を、50mM NaCQ、6n+M トリス−HCQ(
pH−7,6) 、6mM MgC12,および6mM
β−メルカブトエタノールを含有する緩衝液200″μ
σ中に於いて、37°Cで2時間、制限酵素Alu■で
消化した。得られたDNAを6%ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、生成した462bpA1u■フラグメン
トを既述の方法によって回収し、精製した。この462
bpA1ulフラグメント(約1μg)を、リン酸化し
たEcoRIリンカ−(5”GGAATTCC3°、C
o11aborative Re5earchから入手
)150ピコモルおよびT4 DNAリガーゼ2単位
を含有するT4 DNAリガーゼ緩衝液(66mM3
リス・HCff(pH=7.6)、 10mM MgC
Qt−,10mM ジチオトレイトール、0.4mM
ATP)LOltQに溶解した。4°Cで16時間イン
キュベートした後、得られた混合物を65°Cで10分
間暖め、EcoRI緩衝液(100mM)リス・HCQ
(pH=7.2) 、50mMNaCQ、10mM
MgCQ、、6mM β−メルカプトエタノール)およ
びEcoRI酵素40単位を加えて希釈した。37°C
で2時間経過した後、得られた試料を常法によりフェノ
ール/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。次い
で、得られたDNAを、T4 DNAリガーゼ0.1
単位、および前もってE、coRIで線状化した後、ア
ルカリホスファターセで処理しておいたpBR3220
゜1μg(第1図、102)を含有するT4 DNA
l)ガーゼ緩衝液20μσに溶解した。4°Cで16
時間ライゲートした後、得られたDNAを使用して常法
により、E.Coli菌株に12 HBIOIを形質転
換した。12μg/rttQテトラサイクリンを含有す
る寒天平板上で形質転換体を選別し、バーンポイム(B
irnboim)およびドーリ−(Doly)のヌクレ
イツク・アンノズ・リサーチ(Nucleic Ac1
ds Re5earch)、 7:1513−1523
.1979に記載されている迅速アルカリ性抽出法(r
apid alkaline extract 1on
)によって耐性コロニーからプラスミドを単離した。4
66bp EcoRIフラグメントを含有するプラスミ
ド(第1図、103)を選別し、これを、以下に記載の
次工程に於ける出発物質として使用した。
を、50mM NaCQ、6n+M トリス−HCQ(
pH−7,6) 、6mM MgC12,および6mM
β−メルカブトエタノールを含有する緩衝液200″μ
σ中に於いて、37°Cで2時間、制限酵素Alu■で
消化した。得られたDNAを6%ポリアクリルアミドゲ
ル上で分画し、生成した462bpA1u■フラグメン
トを既述の方法によって回収し、精製した。この462
bpA1ulフラグメント(約1μg)を、リン酸化し
たEcoRIリンカ−(5”GGAATTCC3°、C
o11aborative Re5earchから入手
)150ピコモルおよびT4 DNAリガーゼ2単位
を含有するT4 DNAリガーゼ緩衝液(66mM3
リス・HCff(pH=7.6)、 10mM MgC
Qt−,10mM ジチオトレイトール、0.4mM
ATP)LOltQに溶解した。4°Cで16時間イン
キュベートした後、得られた混合物を65°Cで10分
間暖め、EcoRI緩衝液(100mM)リス・HCQ
(pH=7.2) 、50mMNaCQ、10mM
MgCQ、、6mM β−メルカプトエタノール)およ
びEcoRI酵素40単位を加えて希釈した。37°C
で2時間経過した後、得られた試料を常法によりフェノ
ール/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した。次い
で、得られたDNAを、T4 DNAリガーゼ0.1
単位、および前もってE、coRIで線状化した後、ア
ルカリホスファターセで処理しておいたpBR3220
゜1μg(第1図、102)を含有するT4 DNA
l)ガーゼ緩衝液20μσに溶解した。4°Cで16
時間ライゲートした後、得られたDNAを使用して常法
により、E.Coli菌株に12 HBIOIを形質転
換した。12μg/rttQテトラサイクリンを含有す
る寒天平板上で形質転換体を選別し、バーンポイム(B
irnboim)およびドーリ−(Doly)のヌクレ
イツク・アンノズ・リサーチ(Nucleic Ac1
ds Re5earch)、 7:1513−1523
.1979に記載されている迅速アルカリ性抽出法(r
apid alkaline extract 1on
)によって耐性コロニーからプラスミドを単離した。4
66bp EcoRIフラグメントを含有するプラスミ
ド(第1図、103)を選別し、これを、以下に記載の
次工程に於ける出発物質として使用した。
この得られたプラスミド(第2図、103)の約2ug
を、Hindu緩衝液(60mM NaCQ、10mM
)リス・HCQ (pH=7.4) 、] 00mMM
g CQ 2および6mM β−メルカプトエタノール
)50μσ中に於いて、37°Cで1時間、酵素)(i
ndI[[21位で消化した。フェノール/クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱させた後、得られたDNjA
を、300mM −NaC(!、 30mM酢酸ナトリ
ウム(pH=4.25)、1 mM Z nCQ2およ
びSlヌクレアーゼ(マイルス(Miles)・ラボラ
トリ−)200単位を含有する緩衝液200μQに溶解
した。15℃で1時間経過した後、フェノール/クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱によって反応を停止さ
せた。得られたDNAを、リン酸化BamHIリンカ−
(5″CCG G A T CCGG3’、Co11a
borative Re5earchから入手)20ピ
コモルおよびT4 DNAリガーゼ2単位を含有する
T4 DNAリガーゼ緩衝液10μeに溶解した。4
°Cで16時間経過した後、得られた反応混合物を65
°Cに10分間暖め、リガーゼを不活性にし、次いでB
amH1酵素20単位を含有するBaIIIHr緩衝液
(150mM NaCl2.20mM トリス−HC
Q(pH=8.0)、10mMMgcL、6mM β−
メルカプトエタノール)100μCを加えて希釈した。
を、Hindu緩衝液(60mM NaCQ、10mM
)リス・HCQ (pH=7.4) 、] 00mMM
g CQ 2および6mM β−メルカプトエタノール
)50μσ中に於いて、37°Cで1時間、酵素)(i
ndI[[21位で消化した。フェノール/クロロホル
ム抽出し、エタノール沈澱させた後、得られたDNjA
を、300mM −NaC(!、 30mM酢酸ナトリ
ウム(pH=4.25)、1 mM Z nCQ2およ
びSlヌクレアーゼ(マイルス(Miles)・ラボラ
トリ−)200単位を含有する緩衝液200μQに溶解
した。15℃で1時間経過した後、フェノール/クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱によって反応を停止さ
せた。得られたDNAを、リン酸化BamHIリンカ−
(5″CCG G A T CCGG3’、Co11a
borative Re5earchから入手)20ピ
コモルおよびT4 DNAリガーゼ2単位を含有する
T4 DNAリガーゼ緩衝液10μeに溶解した。4
°Cで16時間経過した後、得られた反応混合物を65
°Cに10分間暖め、リガーゼを不活性にし、次いでB
amH1酵素20単位を含有するBaIIIHr緩衝液
(150mM NaCl2.20mM トリス−HC
Q(pH=8.0)、10mMMgcL、6mM β−
メルカプトエタノール)100μCを加えて希釈した。
37°Cで2時間経過した後、得られた混合物を1%ア
ガロースゲル上で精製した。このゲルを染色し、凍結後
に、溶出によって比較的大きいフラグメント(〜4 、
5 kb)を回収し、次いでフェノール/クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱して精製した。BamHI粘着
末端を有する回収したフラグメントを、T4 DNA
リガーゼ0.1単位を含有するT4 DNAリガーゼ
緩衝液20μQに溶解した。4°Cで16時間経過した
後、得られたDNAを使用してE.ColiHBlol
を形質転換した。100μg/村のアンピシリンの耐性
能(Apつによって形質転換体を選別し、10ug/x
Qテトラサイクリンに対する感受性(Tc’)について
スクリーニングした。既述したバーンボイム(Birn
boim)の操作によって、Ap’Tc”であるコロニ
ーから幾つかのプラスミドを調製し、これらをHind
l11部位の不存在および単一のBamH1部位の存在
について検査した。EcoRI、5ailで連続的に消
化し、466bpおよび305bpフラグメントを得た
。
ガロースゲル上で精製した。このゲルを染色し、凍結後
に、溶出によって比較的大きいフラグメント(〜4 、
5 kb)を回収し、次いでフェノール/クロロホルム
抽出し、エタノール沈澱して精製した。BamHI粘着
末端を有する回収したフラグメントを、T4 DNA
リガーゼ0.1単位を含有するT4 DNAリガーゼ
緩衝液20μQに溶解した。4°Cで16時間経過した
後、得られたDNAを使用してE.ColiHBlol
を形質転換した。100μg/村のアンピシリンの耐性
能(Apつによって形質転換体を選別し、10ug/x
Qテトラサイクリンに対する感受性(Tc’)について
スクリーニングした。既述したバーンボイム(Birn
boim)の操作によって、Ap’Tc”であるコロニ
ーから幾つかのプラスミドを調製し、これらをHind
l11部位の不存在および単一のBamH1部位の存在
について検査した。EcoRI、5ailで連続的に消
化し、466bpおよび305bpフラグメントを得た
。
これらの特徴を有するプラスミド(第2図、104)を
選別し、次いでlppプロモーターの上流に位置するE
coR1部位をHindI[r制限部位に変換するよう
修飾した。
選別し、次いでlppプロモーターの上流に位置するE
coR1部位をHindI[r制限部位に変換するよう
修飾した。
プラスミド(第2図、104)2μgを、Ec。
RIo、2単位を含有するEcoRI緩衝液100μQ
中に於いて、37°Cで10分間消化した。65℃に1
0分間暖めることで、反応を停止させ、次いでフェノー
ル/クロロホルム抽出した後、DNAをエタノール沈澱
させ、1000単位/mQのSlヌクレアーゼを含有す
るs1ヌクレアーゼ緩衝液200μQに溶解し、12°
Cで1時間反応させた。この反応をフェノール/クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱することで停止させた
。
中に於いて、37°Cで10分間消化した。65℃に1
0分間暖めることで、反応を停止させ、次いでフェノー
ル/クロロホルム抽出した後、DNAをエタノール沈澱
させ、1000単位/mQのSlヌクレアーゼを含有す
るs1ヌクレアーゼ緩衝液200μQに溶解し、12°
Cで1時間反応させた。この反応をフェノール/クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱することで停止させた
。
得られたDNAを、リン酸化HindI[[リンカ−(
5″CCAAGCTTGG3’、Co11aborat
ive Re5earchから入手)20ピコモルおよ
びT4 DNAリガーゼ2単位を含有するT4 D
NAリガーゼ緩衝液10μQに再懸濁した。4°Cで1
6時間経過した後、得られた混合物を65°Cに10分
間暖め、HindI[I酵素10単位を含有するHin
dI[[緩衝液150μQに希釈し、37°Cで2時間
インキュベートした後、1%アガロースゲル上で分画し
た。
5″CCAAGCTTGG3’、Co11aborat
ive Re5earchから入手)20ピコモルおよ
びT4 DNAリガーゼ2単位を含有するT4 D
NAリガーゼ緩衝液10μQに再懸濁した。4°Cで1
6時間経過した後、得られた混合物を65°Cに10分
間暖め、HindI[I酵素10単位を含有するHin
dI[[緩衝液150μQに希釈し、37°Cで2時間
インキュベートした後、1%アガロースゲル上で分画し
た。
最も大きなバンド(1回切断のプラスミドに相当)を常
法により回収して精製し、T4 リガーゼ0゜2単位を
含有するT4 リガーゼ緩衝液20aQに溶解し、4℃
で16時間インキュベートした。
法により回収して精製し、T4 リガーゼ0゜2単位を
含有するT4 リガーゼ緩衝液20aQに溶解し、4℃
で16時間インキュベートした。
次いで、得られたDNAを使用してE.Coli HB
10]を形質転換した。アンピシリン耐性によって形質
転換体を選別し、常法によりプラスミドを単離し、制限
酵素分析により分析した。EcoRI−HindIII
フラグメント500bpを有するプラスミド(第2図、
105)を選別し、これをIpp遺伝子の3゛領域を付
加するためのクローニングベクターとして使用した。
10]を形質転換した。アンピシリン耐性によって形質
転換体を選別し、常法によりプラスミドを単離し、制限
酵素分析により分析した。EcoRI−HindIII
フラグメント500bpを有するプラスミド(第2図、
105)を選別し、これをIpp遺伝子の3゛領域を付
加するためのクローニングベクターとして使用した。
プラスミド(第3図、105)約2μgを、5ail2
単位を含有する5alT制限緩衝液(150mMNac
f2.6mMトリス−HCffl (pH=7.9)、
6mM MgCl22および6mMβ−メルカプトエタ
ノール)中に於いて、37℃で1時間消化し、次いで2
単位のBamHIを含有するBamHI緩衝液15c)
I&で希釈した。37°Cで1時間経過した後、アルカ
リホスファターゼ2.5単位を加え、次いで65°Cで
1時間インキュベートした。得られた物質をフェノール
/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してTENに溶
解し、これをlpp 3′フラグメントのためのクロー
ニングベクターとして使用した。
単位を含有する5alT制限緩衝液(150mMNac
f2.6mMトリス−HCffl (pH=7.9)、
6mM MgCl22および6mMβ−メルカプトエタ
ノール)中に於いて、37℃で1時間消化し、次いで2
単位のBamHIを含有するBamHI緩衝液15c)
I&で希釈した。37°Cで1時間経過した後、アルカ
リホスファターゼ2.5単位を加え、次いで65°Cで
1時間インキュベートした。得られた物質をフェノール
/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱してTENに溶
解し、これをlpp 3′フラグメントのためのクロー
ニングベクターとして使用した。
1pp3“領域を含有するフラグメントを得るために、
pKENlll(第3図、+01)10μgを、Hpa
rlO単位を含有するHpar緩衝液(20mM KC
Q、10mM トリス・HCl2(pH−74) 、1
0mM MgCQv および6mM β−メルカプトエ
タ/−ル)中に於いて、37℃で2時間消化した。フェ
ノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した後、
得られたDNAを、リン酸化5allリンカ−(5’G
GTCGACC3°、Co11aborative R
e5earchから入手)20ピコモルおよびT4
DNAリガーゼ2単位を含有するT4D N A ll
ガーゼ緩衝液10μQに溶解し、次いで4°Cで16時
間インキュベートした。このリガーゼを、65°Cに1
0分間暖めて不活性化した。得られた物質を、5all
酵素10単位含有する5alI緩衝液100μQに加え
て希釈し、37°Cで10Mインキュベートし、次いで
PvuII制限酵素10単位を含有するPvulI緩衝
液(60mM NaCQ、6mM)リス・HCQ (p
H=7.5) 、6mM MgCQ、および6mMβ−
メルカプトエタノール)300μQで希釈した。37°
Cで1時間経過した後、得られたDNAを5%ポリアク
リルアミドゲル上で分画した。950bpフラグメント
約0.5μgを回収し、精製し、TENに溶解した。こ
のフラグメント0.2μgを、リン酸化BamHIリン
カ−(5’CCGGATCCGG3’、Co11ab。
pKENlll(第3図、+01)10μgを、Hpa
rlO単位を含有するHpar緩衝液(20mM KC
Q、10mM トリス・HCl2(pH−74) 、1
0mM MgCQv および6mM β−メルカプトエ
タ/−ル)中に於いて、37℃で2時間消化した。フェ
ノール/クロロホルム抽出し、エタノール沈澱した後、
得られたDNAを、リン酸化5allリンカ−(5’G
GTCGACC3°、Co11aborative R
e5earchから入手)20ピコモルおよびT4
DNAリガーゼ2単位を含有するT4D N A ll
ガーゼ緩衝液10μQに溶解し、次いで4°Cで16時
間インキュベートした。このリガーゼを、65°Cに1
0分間暖めて不活性化した。得られた物質を、5all
酵素10単位含有する5alI緩衝液100μQに加え
て希釈し、37°Cで10Mインキュベートし、次いで
PvuII制限酵素10単位を含有するPvulI緩衝
液(60mM NaCQ、6mM)リス・HCQ (p
H=7.5) 、6mM MgCQ、および6mMβ−
メルカプトエタノール)300μQで希釈した。37°
Cで1時間経過した後、得られたDNAを5%ポリアク
リルアミドゲル上で分画した。950bpフラグメント
約0.5μgを回収し、精製し、TENに溶解した。こ
のフラグメント0.2μgを、リン酸化BamHIリン
カ−(5’CCGGATCCGG3’、Co11ab。
rative Re5earchから入手)20ピコモ
ルおよびT4.DNAリガーゼ2単位を含有するT4
DNAリガーゼ緩衝液20μaに希釈し、次いで4°
Cで16時間インキュベートした。次いで、得られたD
NAを65°Cに10分間暖め、BamHI2Q単位を
含有するBamHI緩衝液100μgに希釈し、37°
Cで2時間インキュベートした後、5%ポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカ−分子を除去した。
ルおよびT4.DNAリガーゼ2単位を含有するT4
DNAリガーゼ緩衝液20μaに希釈し、次いで4°
Cで16時間インキュベートした。次いで、得られたD
NAを65°Cに10分間暖め、BamHI2Q単位を
含有するBamHI緩衝液100μgに希釈し、37°
Cで2時間インキュベートした後、5%ポリアクリルア
ミドゲル上で分画し、過剰のリンカ−分子を除去した。
得られたBamHIおよび5all粘着末端を有する9
50bl)フラグメントを常法により精製し、既述した
クローニングベクター〇、2μgおよびT4 DNA
リガーゼ0.2単位をともに含有するT4 DNAリ
ガーゼ緩衝液20μaに溶解した。4℃で16時間イン
キュベートした後、得られたD N Aを使用してE.
ColiK12 HBIOIを形質転換した。アンピシ
リン耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、常法に
よりSal I −BamHIフラグメントに関して分
析した。所望のプラスミド(〜5.2 kb)をpKE
NO21と命名したく第3図、106)。
50bl)フラグメントを常法により精製し、既述した
クローニングベクター〇、2μgおよびT4 DNA
リガーゼ0.2単位をともに含有するT4 DNAリ
ガーゼ緩衝液20μaに溶解した。4℃で16時間イン
キュベートした後、得られたD N Aを使用してE.
ColiK12 HBIOIを形質転換した。アンピシ
リン耐性の形質転換体からプラスミドを調製し、常法に
よりSal I −BamHIフラグメントに関して分
析した。所望のプラスミド(〜5.2 kb)をpKE
NO21と命名したく第3図、106)。
pKENO21の10μgを、X ba I / B
amHI緩衝液(150mM NaCQ、l OmM
ト’) ス−HCQ、(1)H=8)、10mM Mg
CQlおよび6mMβ−メルカプトエタノール>200
μρ中に於いて、10単位のBamHIを用いて37°
Cで1時間、次いでXbaIIQ単位を用いてさらに1
時間消化した。次いで、アルカリホスファターゼ2゜5
単位で15時間65°Cに於いて処理し、フェノール/
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱によって所望のX
bal−BamHI消化DNAを捕集し、これをTEN
50μQに溶解して以後の使用に備えた(第3図、10
7)。
amHI緩衝液(150mM NaCQ、l OmM
ト’) ス−HCQ、(1)H=8)、10mM Mg
CQlおよび6mMβ−メルカプトエタノール>200
μρ中に於いて、10単位のBamHIを用いて37°
Cで1時間、次いでXbaIIQ単位を用いてさらに1
時間消化した。次いで、アルカリホスファターゼ2゜5
単位で15時間65°Cに於いて処理し、フェノール/
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱によって所望のX
bal−BamHI消化DNAを捕集し、これをTEN
50μQに溶解して以後の使用に備えた(第3図、10
7)。
B、プラスミドpNM575の構築
マーンヤル(Martial)らサイエンス205:6
02−607゜1979に記載されているプラスミドp
trpE D 50 chGH800(第4図、108
)を、ヒト成長ホルモン遺伝子の一部をフードしている
コード配列を含有するDNAフラグメントの供給源とし
て使用した。このフラグメントは、合成によっても構築
することができ「イタクラら(1977)およびフレア
(Crea)ら(1978)] 、あるいはヒトの下垂
体からヒト成長ホルモンをコードしているmRNAを単
離することによって、グツドマン(Goodman)ら
のメソッズ・イン・エンザイモロギー(Methods
in Enzymology)、 68ニア5−90
.1979に記載された容認されている方法により得る
ことができる。プラスミドptrpE D 50 ch
G、H800のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、その遺
伝子の翻訳終止コドンから6bp下流に1つのSmal
制限部位を有している。
02−607゜1979に記載されているプラスミドp
trpE D 50 chGH800(第4図、108
)を、ヒト成長ホルモン遺伝子の一部をフードしている
コード配列を含有するDNAフラグメントの供給源とし
て使用した。このフラグメントは、合成によっても構築
することができ「イタクラら(1977)およびフレア
(Crea)ら(1978)] 、あるいはヒトの下垂
体からヒト成長ホルモンをコードしているmRNAを単
離することによって、グツドマン(Goodman)ら
のメソッズ・イン・エンザイモロギー(Methods
in Enzymology)、 68ニア5−90
.1979に記載された容認されている方法により得る
ことができる。プラスミドptrpE D 50 ch
G、H800のヒト成長ホルモン遺伝子部分は、その遺
伝子の翻訳終止コドンから6bp下流に1つのSmal
制限部位を有している。
この部位を以下の操作によってBamHI部位に変換し
た。このプラスミド6μgを、S ma I制限緩衝液
(15mMトリス−HC(! (pH=8.0)、6m
M M g CQ 2.15mMKCgおよび6mM
β−メルカプトエタノール)200μσ中に於いて、3
7°Cで1.5時間、Sma16単位で消化した。消化
が完全に終了した後、フェノール/クロロホルム抽出を
行い、エタノール沈澱によって、得られたDNAを回収
し、次いでTEN24μρに溶解した。リン酸化Bam
HIアダプターフラグメント(Collaborati
ve Re5earch) 40ピコモルを、T4
DNAリガーゼ2単位を含有する上記の消化プラスミド
0.511 g (0,2picomole end
s)のりガーゼ緩衝液16μρに加えた。得られた混合
物を22℃で2時間、4°Cで16時間、次いで65°
Cで10分間インキュベートした。BamHI制限酵素
で通常の消化を行いBamHI粘着末端を生成させた。
た。このプラスミド6μgを、S ma I制限緩衝液
(15mMトリス−HC(! (pH=8.0)、6m
M M g CQ 2.15mMKCgおよび6mM
β−メルカプトエタノール)200μσ中に於いて、3
7°Cで1.5時間、Sma16単位で消化した。消化
が完全に終了した後、フェノール/クロロホルム抽出を
行い、エタノール沈澱によって、得られたDNAを回収
し、次いでTEN24μρに溶解した。リン酸化Bam
HIアダプターフラグメント(Collaborati
ve Re5earch) 40ピコモルを、T4
DNAリガーゼ2単位を含有する上記の消化プラスミド
0.511 g (0,2picomole end
s)のりガーゼ緩衝液16μρに加えた。得られた混合
物を22℃で2時間、4°Cで16時間、次いで65°
Cで10分間インキュベートした。BamHI制限酵素
で通常の消化を行いBamHI粘着末端を生成させた。
この酵素は、得られたリンカ−配列を開裂させ、またク
ローンされたヒト成長ホルモンcDNA配列の始めに位
置するBamH1部分をも開裂させた。6%ポリアクリ
ルアミドゲルで分離し、次いで常法により回収すること
で、粘着BamHI末端を有する691bpのフラグメ
ントを得た。回収したDNAフラグメントを、BamH
I消化し、かつアルカリホスファターゼ処理したpBR
322(第4図、102)とライゲートした[これには
、既述の条件下で20μe緩衝液中、T4 DNAリ
ガーゼ0.2単位を使用した]。4°Cで16時間経過
した後、得られた物質を使用してE.Coli菌株JA
221 (NRRL番号B−15014)を形質転換し
た[ウェンシカ(Wensink)らのCell、 3
:315−325.1974の形質転換法に実質的に従
った]。形質転換体を100μg/zσアンピシリンを
含有した寒天平板上で選別し、次いでプラスミドを常法
により単離し、制限酵素分析および電気泳動分析によっ
て同定した。所望のプラスミド[pNM575と命名(
第4図、109)]は、大きさが約700bpのBam
HIフラグメントを含有しており、これを以後の使用の
ために増幅させた。
ローンされたヒト成長ホルモンcDNA配列の始めに位
置するBamH1部分をも開裂させた。6%ポリアクリ
ルアミドゲルで分離し、次いで常法により回収すること
で、粘着BamHI末端を有する691bpのフラグメ
ントを得た。回収したDNAフラグメントを、BamH
I消化し、かつアルカリホスファターゼ処理したpBR
322(第4図、102)とライゲートした[これには
、既述の条件下で20μe緩衝液中、T4 DNAリ
ガーゼ0.2単位を使用した]。4°Cで16時間経過
した後、得られた物質を使用してE.Coli菌株JA
221 (NRRL番号B−15014)を形質転換し
た[ウェンシカ(Wensink)らのCell、 3
:315−325.1974の形質転換法に実質的に従
った]。形質転換体を100μg/zσアンピシリンを
含有した寒天平板上で選別し、次いでプラスミドを常法
により単離し、制限酵素分析および電気泳動分析によっ
て同定した。所望のプラスミド[pNM575と命名(
第4図、109)]は、大きさが約700bpのBam
HIフラグメントを含有しており、これを以後の使用の
ために増幅させた。
C,プラスミドp NM645の構築
成熟ヒト成長ホルモンのDNA配列は、最初のヌクレオ
チドから47bpにある1つのFnuDI[部位を含有
している。25μgのpNM575を、25単位のBa
mHIを含有するBamHI緩衝液250μσ中に於い
て37°Cて1時間消化した。BamHI粘着末端を有
する691bpフラグメントを常法により6%ポリアク
リルアミドゲルから単離し、精製した。このフラグメン
トを精製した後、そのl/3(プラスミド8μgに相当
)を、25単位F nuD 11を含有したFnuDI
T緩衝液(6mMNaC12,6mM)リス−HC(1
(pH=7.4)、6mM MgCQ*、および6mM
β−メルカブトエ9/−ル) 100tt(l テ、
37°Cに於イテ1.5時間消化した。6%ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行い、標準的な方法で回収し
、その遺伝子の後部175アミノ酸およびその後の翻訳
終止シグナルをコードしているコード配列を含有する5
38bpDNAフラグメントを単離した。
チドから47bpにある1つのFnuDI[部位を含有
している。25μgのpNM575を、25単位のBa
mHIを含有するBamHI緩衝液250μσ中に於い
て37°Cて1時間消化した。BamHI粘着末端を有
する691bpフラグメントを常法により6%ポリアク
リルアミドゲルから単離し、精製した。このフラグメン
トを精製した後、そのl/3(プラスミド8μgに相当
)を、25単位F nuD 11を含有したFnuDI
T緩衝液(6mMNaC12,6mM)リス−HC(1
(pH=7.4)、6mM MgCQ*、および6mM
β−メルカブトエ9/−ル) 100tt(l テ、
37°Cに於イテ1.5時間消化した。6%ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動を行い、標準的な方法で回収し
、その遺伝子の後部175アミノ酸およびその後の翻訳
終止シグナルをコードしているコード配列を含有する5
38bpDNAフラグメントを単離した。
このヒト成長ホルモンコード領域にlppプロモーター
領域を結合させるために、二重鎖のDNAフラグメント
(第5図、1lO)をホスホトリエステル法によって合
成した。この二重鎖のDNAフラグメントは、下記の配
列を有している:祖阻工 このフラグメントは、以下のセグメントを調製すること
によって、容認されているホスホトリエステル方法論に
基づいて調製した: 1)CTAGAGGGTAT 2)TAATAATGTTCC 3)CATTGGATGAT 4)GATGATAAGTTCC 5)CAACCATTCCC 5)TTATCCAGGC 7)TTTTTGACAACG 8)CTATGCTCCG 9)CATTATTAATACCCT to)ATGGGAA 11)CTTATCATCATCCA 12)GGTTGGGAA 13)C,GATAAGGGAAT 14)GTCAAAAAGCCT 15)CGGAGCATAGCGTT 調製した上記セグメントを使用し、T4リガーセにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った: a)5°−非リン酸化セグメント1を、5゛−リン酸化
セグメント9の存在下にT4リガーゼを使用して5゛−
リン酸化セグメント2に結合し、二本鎖DNA分子lを
調製した[ブラウン(Brown)ら、Methods
in Enzymology 68:109−151
.1979]。
領域を結合させるために、二重鎖のDNAフラグメント
(第5図、1lO)をホスホトリエステル法によって合
成した。この二重鎖のDNAフラグメントは、下記の配
列を有している:祖阻工 このフラグメントは、以下のセグメントを調製すること
によって、容認されているホスホトリエステル方法論に
基づいて調製した: 1)CTAGAGGGTAT 2)TAATAATGTTCC 3)CATTGGATGAT 4)GATGATAAGTTCC 5)CAACCATTCCC 5)TTATCCAGGC 7)TTTTTGACAACG 8)CTATGCTCCG 9)CATTATTAATACCCT to)ATGGGAA 11)CTTATCATCATCCA 12)GGTTGGGAA 13)C,GATAAGGGAAT 14)GTCAAAAAGCCT 15)CGGAGCATAGCGTT 調製した上記セグメントを使用し、T4リガーセにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った: a)5°−非リン酸化セグメント1を、5゛−リン酸化
セグメント9の存在下にT4リガーゼを使用して5゛−
リン酸化セグメント2に結合し、二本鎖DNA分子lを
調製した[ブラウン(Brown)ら、Methods
in Enzymology 68:109−151
.1979]。
この二本鎖分子を15%ポリアクリルアミドの調製用ゲ
ル電気泳動によって単離した。
ル電気泳動によって単離した。
b)5′−リン酸化セグメント3を、5′−リン酸化セ
グメント11の存在下にT4リガーゼを使用して5”−
リン酸化セグメント4に結合し、二本鎖DNA分子2を
調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。
グメント11の存在下にT4リガーゼを使用して5”−
リン酸化セグメント4に結合し、二本鎖DNA分子2を
調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製した。
C)5″−リン酸化セグメント5を、5゛−リン酸化セ
グメント12および13の存在下にT41/ガーゼを使
用して5′−リン酸化セグメント6に結合し、二本鎖D
NA分子3を調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
グメント12および13の存在下にT41/ガーゼを使
用して5′−リン酸化セグメント6に結合し、二本鎖D
NA分子3を調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
d)5゛−リン酸化セグメント7を、5°−リン酸化セ
グメント14および5゛−非リン酸セグメント15の存
在下にT4リガーゼを使用して5“−リン酸化セグメン
ト8に結合し、二本鎖DNA分子4を調製し、次いでこ
の二本鎖分子を15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。
グメント14および5゛−非リン酸セグメント15の存
在下にT4リガーゼを使用して5“−リン酸化セグメン
ト8に結合し、二本鎖DNA分子4を調製し、次いでこ
の二本鎖分子を15%ポリアクリルアミドゲル電気泳動
によって精製した。
e)次いで、得られた二本鎖DNA分子2.3および4
を、T4リガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖DN
A分子5を調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
を、T4リガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖DN
A分子5を調製し、次いでこの二本鎖分子を15%ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
f)5°−リン酸化セグメント10および二本lDNA
分子5を、T4リガーゼの存在下に二本鎖DNA分子l
に加えた。得られた二本鎖DNA分子(第5図、110
)を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精
製した。次いで、この二本鎖DNA分子を、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび[γ−P”] ATPを使用
して酵素学的にリン酸化し、次いで確立された操作に付
した。
分子5を、T4リガーゼの存在下に二本鎖DNA分子l
に加えた。得られた二本鎖DNA分子(第5図、110
)を10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精
製した。次いで、この二本鎖DNA分子を、T4ポリヌ
クレオチドキナーゼおよび[γ−P”] ATPを使用
して酵素学的にリン酸化し、次いで確立された操作に付
した。
プラスミドpKENO21のXbal −BamHTフ
ラグメント(第5図、107)0.’1ピコモル(0,
4μgL合成りNAフラグメント(第5図、110)0
.025ピコモルおよび538bpフラグメント(第5
図に於ける109由来)0゜3ピコモル(0,08μg
)を、T4 DNAリガーセ1.5単位を使用したラ
イゲート緩衝液24μσ中で酵素学的に結合させ、発現
プラスミドpNM645を構築した。4°Cで16時間
インキュベートした後、得られた混合物を使用して、既
述のようにE.Coli J A221を形質転換した
。lOOμg/x(lアンピシリンを含有した寒天平板
を用いて形質転換体を選別し、これを、所望の発現プラ
スミドの好ましい供給源として常法、により培養した。
ラグメント(第5図、107)0.’1ピコモル(0,
4μgL合成りNAフラグメント(第5図、110)0
.025ピコモルおよび538bpフラグメント(第5
図に於ける109由来)0゜3ピコモル(0,08μg
)を、T4 DNAリガーセ1.5単位を使用したラ
イゲート緩衝液24μσ中で酵素学的に結合させ、発現
プラスミドpNM645を構築した。4°Cで16時間
インキュベートした後、得られた混合物を使用して、既
述のようにE.Coli J A221を形質転換した
。lOOμg/x(lアンピシリンを含有した寒天平板
を用いて形質転換体を選別し、これを、所望の発現プラ
スミドの好ましい供給源として常法、により培養した。
ヒト成長ホルモンの発現を、標準的な放射免疫検定法(
ラジオイムノア、ライ)[ツォーメイ(Twomey)
ら、クリニカル・ケミストリー(CI in、 Che
m、 )20:389−391. f974]によって
検出し、細胞1個当たりに少なくとも200万個の分子
があることを確認した。
ラジオイムノア、ライ)[ツォーメイ(Twomey)
ら、クリニカル・ケミストリー(CI in、 Che
m、 )20:389−391. f974]によって
検出し、細胞1個当たりに少なくとも200万個の分子
があることを確認した。
D、プラスミドpNM789の構築
プラスミドpNM645(第6図、111)、ヒト成長
ホルモンの発現プラスミドを、Met−Phe −P
ro −L eu −A sp −A sp −A s
p −A sp −L ys−bGHを発現するプラス
ミドを構築するための出発物質として使用した。
ホルモンの発現プラスミドを、Met−Phe −P
ro −L eu −A sp −A sp −A s
p −A sp −L ys−bGHを発現するプラス
ミドを構築するための出発物質として使用した。
ウシ成長ホルモン遺伝子の一部をコードしているコード
配列を含有する2つのDNAフラグメントの供給源とし
て、ミラー(liller)らのジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J、 Bi。
配列を含有する2つのDNAフラグメントの供給源とし
て、ミラー(liller)らのジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J、 Bi。
1、 Chem、255ニア521−7524.198
0)に開示されたプラスミドpBP348 (第6図、
112)を使用した。このプラスミドは、pBR322
のPstl制限部位にクローンされている831bpウ
シ成長ホルモンコ一ド配列を含有している。ミラーら[
1980]に開示されている方法の替わりとして、ウシ
成長ホルモンのこの配列は合成により構築することがで
き[イタクラら、1977およびフレアら、1978]
、あるいはグツドマンら(1979)に開示された今
では常套手段である手法によってウシ下垂体から単離し
たメツセンジャーRNAから得ることもできる。
0)に開示されたプラスミドpBP348 (第6図、
112)を使用した。このプラスミドは、pBR322
のPstl制限部位にクローンされている831bpウ
シ成長ホルモンコ一ド配列を含有している。ミラーら[
1980]に開示されている方法の替わりとして、ウシ
成長ホルモンのこの配列は合成により構築することがで
き[イタクラら、1977およびフレアら、1978]
、あるいはグツドマンら(1979)に開示された今
では常套手段である手法によってウシ下垂体から単離し
たメツセンジャーRNAから得ることもできる。
ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンのコード配列
は非常に似ており、これらは高い相同性(homo I
ogy)を示す。ウシ成長ホルモンの発現プラスミドを
構築する上で特に有用なものは、制限酵素PvuIIの
消化によって生成されるフラグメントである。この生成
フラグメントの大きさは、ヒト成長ホルモンでは497
bpであり、ウシ成長ホルモンでは494 bpであり
、両配列ともに、対応する制限部位が同じ解読フレーム
内に生じる。
は非常に似ており、これらは高い相同性(homo I
ogy)を示す。ウシ成長ホルモンの発現プラスミドを
構築する上で特に有用なものは、制限酵素PvuIIの
消化によって生成されるフラグメントである。この生成
フラグメントの大きさは、ヒト成長ホルモンでは497
bpであり、ウシ成長ホルモンでは494 bpであり
、両配列ともに、対応する制限部位が同じ解読フレーム
内に生じる。
1)NM645(第6図、111)10μgを、Pvu
II制限緩衝液(60mM NaCf2,6mM )
リス・HCf! (pH=7.5) 、6n+M Mg
C12t、 6mMβ−メルカプトエタノール’)20
0μe中に於いて37°Cで10分間、PvuIIl単
位を用いて部分消化した。65°Cに10分間暖めて反
応を停止させた後、得られたDNAをアルカリホスファ
ターゼで処理し、1%アガロースゲルによって、得られ
たフラグメントを分離した。494bpPvuIIフラ
グメントか欠けたDNA (1カ所切断プラスミドより
も若干速く行う)に対応する大きさの、得られた線状D
NAフラグメント(第6図、113)を常法により取り
出し、精製し、次いで中間プラスミド(第6図、114
)の構築に使用した。
II制限緩衝液(60mM NaCf2,6mM )
リス・HCf! (pH=7.5) 、6n+M Mg
C12t、 6mMβ−メルカプトエタノール’)20
0μe中に於いて37°Cで10分間、PvuIIl単
位を用いて部分消化した。65°Cに10分間暖めて反
応を停止させた後、得られたDNAをアルカリホスファ
ターゼで処理し、1%アガロースゲルによって、得られ
たフラグメントを分離した。494bpPvuIIフラ
グメントか欠けたDNA (1カ所切断プラスミドより
も若干速く行う)に対応する大きさの、得られた線状D
NAフラグメント(第6図、113)を常法により取り
出し、精製し、次いで中間プラスミド(第6図、114
)の構築に使用した。
プラスミドpBP348の1011gを、Pvul11
0単位を含有するPvuII緩衝液200μρ中に於い
て37°Cで1時間消化し、プラスミドpBP348の
494 bp Pvu[Iフラグメントを調製した。こ
のフラグメントを6%ポリアクリルアミドゲル上で分難
し、所望の494 bpフラグメント(第6図、112
由来)を常法によって明視化し、精製した。
0単位を含有するPvuII緩衝液200μρ中に於い
て37°Cで1時間消化し、プラスミドpBP348の
494 bp Pvu[Iフラグメントを調製した。こ
のフラグメントを6%ポリアクリルアミドゲル上で分難
し、所望の494 bpフラグメント(第6図、112
由来)を常法によって明視化し、精製した。
中間プラスミド(第6図、114)は、T4DNAリガ
ーゼ2単位を含有するT4 DNAリガーゼ緩衝液2
0μg中、プラスミドpNM702のPvulIフラグ
メント0.2 tt gを494bpフラグメント0.
05μgと4°Cで16時間反応させることによって構
築した。形質転換し、アンピシリン耐性による選択を行
った後、プラスミドを常法により、494bp Pvu
IIフラグメントの存在および適正な方向に関して検定
した。494 bpPvuIIフラグメントおよび44
0bp Xbal −3malフラグメントを有するプ
ラスミドを選択し、その後の構築に使用した。
ーゼ2単位を含有するT4 DNAリガーゼ緩衝液2
0μg中、プラスミドpNM702のPvulIフラグ
メント0.2 tt gを494bpフラグメント0.
05μgと4°Cで16時間反応させることによって構
築した。形質転換し、アンピシリン耐性による選択を行
った後、プラスミドを常法により、494bp Pvu
IIフラグメントの存在および適正な方向に関して検定
した。494 bpPvuIIフラグメントおよび44
0bp Xbal −3malフラグメントを有するプ
ラスミドを選択し、その後の構築に使用した。
中間プラスミド(第7図、114)10μgを、Pvu
II緩衝液20 OttQ中、37℃で5分間Pvu■
1単位で消化した。65°Cで10分間暖めた後、得ら
れた混合物を1%アガロースゲル上に展開し、1分子当
たり唯一のPvuII切断しかされていない線状DNA
を回収し、精製した。この回収した物質(約3μg)を
Xbal 5単位で完全に消化し、アルカリホスファ
ターゼで処理した。得られたフラグメントを1%アガロ
ースゲル上に展開し、最も大きなフラグメント(ヒトお
よびウシ成長ホルモンに於けるXbalおよび初めのP
vu11部位間の109bpフラグメントを欠いている
)を常法により回収した(第7図、115)。
II緩衝液20 OttQ中、37℃で5分間Pvu■
1単位で消化した。65°Cで10分間暖めた後、得ら
れた混合物を1%アガロースゲル上に展開し、1分子当
たり唯一のPvuII切断しかされていない線状DNA
を回収し、精製した。この回収した物質(約3μg)を
Xbal 5単位で完全に消化し、アルカリホスファ
ターゼで処理した。得られたフラグメントを1%アガロ
ースゲル上に展開し、最も大きなフラグメント(ヒトお
よびウシ成長ホルモンに於けるXbalおよび初めのP
vu11部位間の109bpフラグメントを欠いている
)を常法により回収した(第7図、115)。
つ/成長ホルモンに於ける、初めのPVLI11部位マ
でノ最)/L7)237ミ/酸(69bp) のDNA
配列は、2つ(1) Hpa l]制限部位を含有して
おり、この最初の部分はコード配列の最明のヌクレオチ
ドから23bpにある。63bpフラグメント(第7図
、+16)をホスホトリエステルl去によって合成した
。このフラグメントは、lppリポゾーム結合部位内の
Xha[部位からATG翻訳開始/グナルまでの19b
p配列、その陵のP be −P ro −L cu
−A sp −A sp −A sp −A sp −
L ysのコード配列(24bp)およびウシ成長ホル
モンのコード配列の20ヌクレオチド(Pheから初め
のI−1pa 11部位まで)に対応している。このフ
ラグメントは以下の配列を有する 砧徂工 この63bpフラグメントの調・シソに際して、以下の
9個のセグメントを調製した: 1)CTAGAGGGTAT 2)TAATAATGTTCC 3)CATTGGATGAT 4)GATGATAAGTTCC 5)CAGCCATGTCCTTGTC6)ATGGG
AACATTATTAATACCT 7)TTATCATCATCATCCA8)ATGGC
TGGGAAC 9)CGGACAAGGAC 調製した上記セグメントを使用し、T4リガーゼにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った: a)5゛−非リン酸化セグメント1を、5゛−リン酸化
セグメント6の存在下にT4リガーゼを使用して5゛−
リン酸化セグメント2に結合し、二本鎖DNA分子lを
調製し、これを15%ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動によって精製した。
でノ最)/L7)237ミ/酸(69bp) のDNA
配列は、2つ(1) Hpa l]制限部位を含有して
おり、この最初の部分はコード配列の最明のヌクレオチ
ドから23bpにある。63bpフラグメント(第7図
、+16)をホスホトリエステルl去によって合成した
。このフラグメントは、lppリポゾーム結合部位内の
Xha[部位からATG翻訳開始/グナルまでの19b
p配列、その陵のP be −P ro −L cu
−A sp −A sp −A sp −A sp −
L ysのコード配列(24bp)およびウシ成長ホル
モンのコード配列の20ヌクレオチド(Pheから初め
のI−1pa 11部位まで)に対応している。このフ
ラグメントは以下の配列を有する 砧徂工 この63bpフラグメントの調・シソに際して、以下の
9個のセグメントを調製した: 1)CTAGAGGGTAT 2)TAATAATGTTCC 3)CATTGGATGAT 4)GATGATAAGTTCC 5)CAGCCATGTCCTTGTC6)ATGGG
AACATTATTAATACCT 7)TTATCATCATCATCCA8)ATGGC
TGGGAAC 9)CGGACAAGGAC 調製した上記セグメントを使用し、T4リガーゼにより
触媒される結合反応を以下の工程によって行った: a)5゛−非リン酸化セグメント1を、5゛−リン酸化
セグメント6の存在下にT4リガーゼを使用して5゛−
リン酸化セグメント2に結合し、二本鎖DNA分子lを
調製し、これを15%ポリアクリルアミドゲルの電気泳
動によって精製した。
b)5”−リン酸化セグメント3.4および5を、5°
−リン酸化セグメント7および8の存在下に、T4リガ
ーセを使用して5″−非リン酸化セグメント9に結合し
、二本鎖D N A分子2を調製し、次いでこれを15
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
−リン酸化セグメント7および8の存在下に、T4リガ
ーセを使用して5″−非リン酸化セグメント9に結合し
、二本鎖D N A分子2を調製し、次いでこれを15
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
C)次に、得られた二本鎖分子1および2を、T41J
ガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖DNA分子(第
7図、116)を調製し、次いでこの二本鎖分子を15
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
ガーゼを使用して相互に結合し、二本鎖DNA分子(第
7図、116)を調製し、次いでこの二本鎖分子を15
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。
次いで、この二本鎖DNA分子を、確立された方法に従
って、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ−P”
]ATPを使用して酵素学的にリン酸化した。
って、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび[γ−P”
]ATPを使用して酵素学的にリン酸化した。
前述のHpaI[部位からPvuII部位までの46b
pDNAフラグメントは、合成によって構築することが
でき、またあるいは原型のpBP348プラスミドから
得ることができる。従って、プラスミドpBP348の
100μgを、Pvu[50単位を含有するPvuU緩
衝液400μρ中に於いて、37°Cで2時間消化した
。フェノール抽出し、エタノール沈澱させた後、得られ
たDNAを、50単位のPstlを含有するPstI緩
衝i&(50mMNaCQ、6mM)リス−HC& (
pH=7.4)、6 m M M g CQ tおよび
6mM β−メルカプトエタノール)中に、37°Cで
2時間溶解した。得られたDNAフラグメントを6%ポ
リアクリルアミドゲル上で展開し、所望の46bp配列
を含有する135bpフラグメントを回収し、標準的な
方法で精製した。回収したDNAの1/3量(33μg
に相当)を、HpaII緩衝液(20LIIMトリス・
HCQ (pH=7.4) 、7mM MgC+b、(
3mMβ−メルカプトエタノール)lo’oμg中に於
けるHpaI[制限酵素1単位の限定消化反応(37°
C140分間)に付した。65°Cに10分間暖めた後
、DNAフラグメントを、適当なサイズマーカーと共に
5%アクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビス比率−
191)で展開した。135hpフラグメント(第7図
、112由来)のHpa11部分消化によって得られた
所望の46bpフラグメントを標準的な方法によって精
製した。
pDNAフラグメントは、合成によって構築することが
でき、またあるいは原型のpBP348プラスミドから
得ることができる。従って、プラスミドpBP348の
100μgを、Pvu[50単位を含有するPvuU緩
衝液400μρ中に於いて、37°Cで2時間消化した
。フェノール抽出し、エタノール沈澱させた後、得られ
たDNAを、50単位のPstlを含有するPstI緩
衝i&(50mMNaCQ、6mM)リス−HC& (
pH=7.4)、6 m M M g CQ tおよび
6mM β−メルカプトエタノール)中に、37°Cで
2時間溶解した。得られたDNAフラグメントを6%ポ
リアクリルアミドゲル上で展開し、所望の46bp配列
を含有する135bpフラグメントを回収し、標準的な
方法で精製した。回収したDNAの1/3量(33μg
に相当)を、HpaII緩衝液(20LIIMトリス・
HCQ (pH=7.4) 、7mM MgC+b、(
3mMβ−メルカプトエタノール)lo’oμg中に於
けるHpaI[制限酵素1単位の限定消化反応(37°
C140分間)に付した。65°Cに10分間暖めた後
、DNAフラグメントを、適当なサイズマーカーと共に
5%アクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビス比率−
191)で展開した。135hpフラグメント(第7図
、112由来)のHpa11部分消化によって得られた
所望の46bpフラグメントを標準的な方法によって精
製した。
プラスミドベクター(第7図、115)のXbaI−P
vu[lフラグメント2/10μg、63bp合成フラ
グメント(第7図、116由来)3.2ピコモルおよび
46bpフラグメント(第7図、112由来)0.5ピ
コモルを、T4 DNAリガーゼ2単位を含有するラ
イゲート緩衝液lOμρ中で4°Cで16時間インキユ
ヘートした。このライゲート混合物を使用してE.Co
li J A221を形質転換し、アンピシリン(A
p ’)の耐性能によって形質転換体(従って、これは
所望のプラスミドp NM789を含有している)を選
別した。
vu[lフラグメント2/10μg、63bp合成フラ
グメント(第7図、116由来)3.2ピコモルおよび
46bpフラグメント(第7図、112由来)0.5ピ
コモルを、T4 DNAリガーゼ2単位を含有するラ
イゲート緩衝液lOμρ中で4°Cで16時間インキユ
ヘートした。このライゲート混合物を使用してE.Co
li J A221を形質転換し、アンピシリン(A
p ’)の耐性能によって形質転換体(従って、これは
所望のプラスミドp NM789を含有している)を選
別した。
プラスミドpNM789 (第7図、117)について
、常法により、Pvull 494bpフラグメントお
よびXbaI −PvulI 109bpフラグメント
の両者の存在に関してスクリーニングすることによって
その同定を行った。
、常法により、Pvull 494bpフラグメントお
よびXbaI −PvulI 109bpフラグメント
の両者の存在に関してスクリーニングすることによって
その同定を行った。
E、プラスミドp N M 789 Bの最終的構築ウ
シ成長ホルモンの完全な転換を図るには、プラスミドp
NM789 (第8図、117)に1つのアミノ酸コド
ンを変換する必要である。これは、p NM789のP
vuI[からBamHIまでの28bpフラグメントを
除去し、以下の配列を有する合成二重鎖フラグメントで
置換すれば行える(第8図、118): 3”−GACACG GAA GAT CCTAG−5
“p NM789の10μgをPvuII緩衝液200
μρ中、Pvu111単位を用いて消化した。65°C
に10分間暖めた後、得られた混合物にBamHI緩衝
液を加えて300μeに希釈し、10単位のBamHI
を用いて37°Cで1時間完全に消化し、アルカリホス
ファターゼ5単位で処理し、65°Cで1時間インキュ
ベートした。得られたDNAフラグメントを1%アガロ
ースゲルで分離し、1カ所切断された大きさのプラスミ
ドp NM789のDNAフラグメント(第8図、11
9)を常法により精製した。このフラグメント2/10
μgを、リガーゼ緩衝液20μρ中、T4リガーゼ2単
位を使用して合成フラグメント5ピコモルにライゲート
した。このライゲート反応は4°Cで一晩行った。形質
転換した後、幾つかのプラスミドを単離し、適当なPv
uIlフラグメント(494bp)およびXbal −
BamHIフラグメント(628bp)に関してスクリ
ーニングした。上記のフラグメントを含有するプラスミ
ドは、所望のプラスミドpNM789(第8図、120
)を構成していた。
シ成長ホルモンの完全な転換を図るには、プラスミドp
NM789 (第8図、117)に1つのアミノ酸コド
ンを変換する必要である。これは、p NM789のP
vuI[からBamHIまでの28bpフラグメントを
除去し、以下の配列を有する合成二重鎖フラグメントで
置換すれば行える(第8図、118): 3”−GACACG GAA GAT CCTAG−5
“p NM789の10μgをPvuII緩衝液200
μρ中、Pvu111単位を用いて消化した。65°C
に10分間暖めた後、得られた混合物にBamHI緩衝
液を加えて300μeに希釈し、10単位のBamHI
を用いて37°Cで1時間完全に消化し、アルカリホス
ファターゼ5単位で処理し、65°Cで1時間インキュ
ベートした。得られたDNAフラグメントを1%アガロ
ースゲルで分離し、1カ所切断された大きさのプラスミ
ドp NM789のDNAフラグメント(第8図、11
9)を常法により精製した。このフラグメント2/10
μgを、リガーゼ緩衝液20μρ中、T4リガーゼ2単
位を使用して合成フラグメント5ピコモルにライゲート
した。このライゲート反応は4°Cで一晩行った。形質
転換した後、幾つかのプラスミドを単離し、適当なPv
uIlフラグメント(494bp)およびXbal −
BamHIフラグメント(628bp)に関してスクリ
ーニングした。上記のフラグメントを含有するプラスミ
ドは、所望のプラスミドpNM789(第8図、120
)を構成していた。
実施例2
通常の微生物学的操作法に従い、細菌E 、 col
1K12/p1M−1−A3 (NRRL B−157
33)を、50μg/m(lカナマイシンを含有するT
Yブロス[1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.
5%塩化ナトリウム、pH=7.4]中、25°Cで培
養した。得られた培養物を新鮮なブロスでl:10に希
釈し、37°Cで3時間インキュベートした後、培養物
約0.5x&を1.5次σ容量エッペンドルフ試験管に
移し、約15秒間遠心分離した。特に明記しない限り、
すべての手法は、環境温度で行った。得られた上清を、
微小先端のアスピレータ−を用いて注意深く除去し、得
られた細胞ペレットを、2μg/mQ リゾチーム、5
0mM グルコース、10mM EDTA (ジアミン
テトラアセテート)および25m1VIトリス・HCQ
(pH=8)を含有する調製したばかりのりVチーム
溶液(2tt g/xc )約100 ttQに再懸濁
した。アルカリ性SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)
溶液約200μQ(0,2N NaOH11%5DS)
を加え、試験管を穏やかに逆さにし、次いで細胞溶解が
完了するまで(〜5分間)、0°Cを維持した。次ぎに
、3M酢酸ナトリウム約150μgを加え、数秒間穏や
かに逆さにするごて試験管の内容物を混合した。
1K12/p1M−1−A3 (NRRL B−157
33)を、50μg/m(lカナマイシンを含有するT
Yブロス[1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.
5%塩化ナトリウム、pH=7.4]中、25°Cで培
養した。得られた培養物を新鮮なブロスでl:10に希
釈し、37°Cで3時間インキュベートした後、培養物
約0.5x&を1.5次σ容量エッペンドルフ試験管に
移し、約15秒間遠心分離した。特に明記しない限り、
すべての手法は、環境温度で行った。得られた上清を、
微小先端のアスピレータ−を用いて注意深く除去し、得
られた細胞ペレットを、2μg/mQ リゾチーム、5
0mM グルコース、10mM EDTA (ジアミン
テトラアセテート)および25m1VIトリス・HCQ
(pH=8)を含有する調製したばかりのりVチーム
溶液(2tt g/xc )約100 ttQに再懸濁
した。アルカリ性SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)
溶液約200μQ(0,2N NaOH11%5DS)
を加え、試験管を穏やかに逆さにし、次いで細胞溶解が
完了するまで(〜5分間)、0°Cを維持した。次ぎに
、3M酢酸ナトリウム約150μgを加え、数秒間穏や
かに逆さにするごて試験管の内容物を混合した。
この試験管を少なくとも60分間O℃に維持し、次いで
15分間遠心分離にかけ、殆ど清澄な上清を得た。この
上清を別の遠心管に移し、これに100%冷エタノール
3容量を加えた。この遠心管をドライアイス−エタノー
ル上に5分間放置した後、得られた沈澱物を遠心分離(
5分間)によって集め、アスピレータ−法によって上清
を除去した。捕集したベレットをTE(10mM ト
リス・HC((pH=8.0)、1mM EDTA)1
00μeに溶解し、これを所望のpIM−1’−A3プ
ラスミドDN、Aと選定した。
15分間遠心分離にかけ、殆ど清澄な上清を得た。この
上清を別の遠心管に移し、これに100%冷エタノール
3容量を加えた。この遠心管をドライアイス−エタノー
ル上に5分間放置した後、得られた沈澱物を遠心分離(
5分間)によって集め、アスピレータ−法によって上清
を除去した。捕集したベレットをTE(10mM ト
リス・HC((pH=8.0)、1mM EDTA)1
00μeに溶解し、これを所望のpIM−1’−A3プ
ラスミドDN、Aと選定した。
グメントの生成
以下の組成を有するHi塩緩衝液5olle中、プラス
ミドpNM789B DNA約5μgを制限酵素Ba
mHIおよびXbaI各々10単位とともに37℃で約
1時間インキュベートした。3M酢酸ナトリウム(pH
=7.0)5μσを加えた後、100%エタノール3容
量を用いてDNAを沈澱させた。所望のDNA消化物を
TE緩衝液100μgに溶解し、今後の使用に備えてo
′cで保存した。
ミドpNM789B DNA約5μgを制限酵素Ba
mHIおよびXbaI各々10単位とともに37℃で約
1時間インキュベートした。3M酢酸ナトリウム(pH
=7.0)5μσを加えた後、100%エタノール3容
量を用いてDNAを沈澱させた。所望のDNA消化物を
TE緩衝液100μgに溶解し、今後の使用に備えてo
′cで保存した。
*Hi塩緩衝液は以下の成分を用いて常法により調製し
た。
た。
100mM NaCQ
20mM トリス−HCQ(pH=8.0)10mM
MgCb 5mM β−メルカプトエタノール。
MgCb 5mM β−メルカプトエタノール。
C,プラスミドp1M−ビーA3のXbal −Bam
HI消化 プラスミドpNM789Bではなくプラスミドp1M−
ビーA3を用い、実施例2Bの操作法に実質的に従い、
所望の消化反応を行った。得られた所望のDNAをTE
緩衝液約100μQに溶解し、以後の使用に備えてO′
Cで保存した。
HI消化 プラスミドpNM789Bではなくプラスミドp1M−
ビーA3を用い、実施例2Bの操作法に実質的に従い、
所望の消化反応を行った。得られた所望のDNAをTE
緩衝液約100μQに溶解し、以後の使用に備えてO′
Cで保存した。
D ライゲートおよび形質転換
プラスミドp IM−1’−A3消化物約1μg、プラ
スミドpNM789 B Xbal −BamHI消
化物Jμg、水40μg、(5mM) AT P 5
μe、ライゲート用ミックス2)5μgおよびT4DN
A リガーゼ5単位を、20’Cで2時間インキュベ
ートした。65°Cで2分間インキュベートした後、水
上で冷却し、次いて得られたライゲート混合物を使用し
、ウェンシンク(Wensink)、 Cell 3:
315.1974に開示されている形質転換法に実質的
に従って、E.Coli K 12 RV308を、
50μg/rRQのカナマイシンを含有するTY平板(
1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナ
トリウム、1.5%寒天、pH=7.4)上で形質転換
した。菌株E.Coli K12 RV308は、ノ
ーイン・レギオナル・リサーチ・ラボラトリ−(ペオリ
ア、イリノイ)のパーマネント・ストック・カルチャー
・コレクションの一部ヲ構成し、そこに寄託され、受託
番号NRRL B−15624のもとて一般に入手可能
である。
スミドpNM789 B Xbal −BamHI消
化物Jμg、水40μg、(5mM) AT P 5
μe、ライゲート用ミックス2)5μgおよびT4DN
A リガーゼ5単位を、20’Cで2時間インキュベ
ートした。65°Cで2分間インキュベートした後、水
上で冷却し、次いて得られたライゲート混合物を使用し
、ウェンシンク(Wensink)、 Cell 3:
315.1974に開示されている形質転換法に実質的
に従って、E.Coli K 12 RV308を、
50μg/rRQのカナマイシンを含有するTY平板(
1%トリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナ
トリウム、1.5%寒天、pH=7.4)上で形質転換
した。菌株E.Coli K12 RV308は、ノ
ーイン・レギオナル・リサーチ・ラボラトリ−(ペオリ
ア、イリノイ)のパーマネント・ストック・カルチャー
・コレクションの一部ヲ構成し、そこに寄託され、受託
番号NRRL B−15624のもとて一般に入手可能
である。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電気泳
動法[マニアチス(Maniatis)ら、1982]
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜10
.8kbプラスミド(第9図)のみを含有していた。本
明細書に於いてはE.Coli K l 2 RV30
8/pCZ 101と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するTY寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。実
施例IAの操作法に実質的に従い、得られた細胞を使用
してプラスミドpCZIOIを単離した。
動法[マニアチス(Maniatis)ら、1982]
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜10
.8kbプラスミド(第9図)のみを含有していた。本
明細書に於いてはE.Coli K l 2 RV30
8/pCZ 101と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するTY寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。実
施例IAの操作法に実質的に従い、得られた細胞を使用
してプラスミドpCZIOIを単離した。
a)ライゲート用ミックス(緩衝液)は、以下の成分か
ら調製できる: 500mM トリス−HC4(pH=7.8)20C
)mM ジチオトレイトール l QQmM MgCL 実施例3 E.Coli K 12 [) IM −1’−A3
の代わりにE.Coli K 12 RV308/p
CZ 101を使用し、実施例2Aて説明した操作法に
実質的に従い、プラスミドpCZ101 DNAを得
た。所望のフラグメントは、プラスミドpNM789B
iよび制限酵素BamHIおよびXbalの代わりにそ
れぞれプラスミドpCZ101および制限酵素EcoR
IおよびNdelを使用し、実施例2Bで説明した操作
法に実質的に従って溝築した。所望の8.6kb Ec
oRI−Ndel制限フラグメントを常法により分離し
、アガロースゲル電気泳動法(Maniatis(マニ
アチス)ら、1982)で単離し、次いでTE緩衝液約
100μσに溶解し、以後の使用に備えてO′Cに保存
17た。
ら調製できる: 500mM トリス−HC4(pH=7.8)20C
)mM ジチオトレイトール l QQmM MgCL 実施例3 E.Coli K 12 [) IM −1’−A3
の代わりにE.Coli K 12 RV308/p
CZ 101を使用し、実施例2Aて説明した操作法に
実質的に従い、プラスミドpCZ101 DNAを得
た。所望のフラグメントは、プラスミドpNM789B
iよび制限酵素BamHIおよびXbalの代わりにそ
れぞれプラスミドpCZ101および制限酵素EcoR
IおよびNdelを使用し、実施例2Bで説明した操作
法に実質的に従って溝築した。所望の8.6kb Ec
oRI−Ndel制限フラグメントを常法により分離し
、アガロースゲル電気泳動法(Maniatis(マニ
アチス)ら、1982)で単離し、次いでTE緩衝液約
100μσに溶解し、以後の使用に備えてO′Cに保存
17た。
A、ライゲートおよび形′転換
プラスミドpCZ101の〜8.6kb EcoRI−
Ndelフラグメント約1μgをクレノー・ポリメラー
ゼ(Klenow Polymerase) Iおよび
4つのデオキシリボヌクレオチドとともにインキュベー
トし、−本鎖部分を充填した。クレノー・ポリメラーゼ
[[ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(B
oehringer−Mannheim Bioche
micals)、7941カストロウニー・ドライブ、
P、○ボックス50816、インデイアナポリス、IN
4.6250から市販されているコは、DNAポリメラ
ーゼ■のタンパク質加水分解の開裂によって得られるフ
ラグメントである。それは、粗酵素[コーンベルブ(K
ornberg)、 1974. W、 H、F r
eemen andCo、 、 SFo、 98]の5
′→3′ポリマー化活性、3”→5°エキソヌクレアー
ゼ活性を有しているが、5”→3°エキソヌクレアーゼ
活性を存していない。
Ndelフラグメント約1μgをクレノー・ポリメラー
ゼ(Klenow Polymerase) Iおよび
4つのデオキシリボヌクレオチドとともにインキュベー
トし、−本鎖部分を充填した。クレノー・ポリメラーゼ
[[ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ(B
oehringer−Mannheim Bioche
micals)、7941カストロウニー・ドライブ、
P、○ボックス50816、インデイアナポリス、IN
4.6250から市販されているコは、DNAポリメラ
ーゼ■のタンパク質加水分解の開裂によって得られるフ
ラグメントである。それは、粗酵素[コーンベルブ(K
ornberg)、 1974. W、 H、F r
eemen andCo、 、 SFo、 98]の5
′→3′ポリマー化活性、3”→5°エキソヌクレアー
ゼ活性を有しているが、5”→3°エキソヌクレアーゼ
活性を存していない。
反応混合物を50°Cに暖め、10’Cまでゆっくりと
冷却させ、次いでクレノー酵素4μgを加えた。室温で
15分間インキュベートし、次いで37°Cで30分間
インキュベートした後、0.25MEDTA5μσを加
え、反応を停止させた。
冷却させ、次いでクレノー酵素4μgを加えた。室温で
15分間インキュベートし、次いで37°Cで30分間
インキュベートした後、0.25MEDTA5μσを加
え、反応を停止させた。
得られた反応混合物をフェノールで抽出し、クロロホル
ムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。得られた
DNAをライゲートl衝液に再懸濁してライゲートし、
次いで実施例2Dの操作法に実質的に従って、得られた
プラスミドを使用してE.Coli K12 RV30
8を形質転換した。
ムで抽出し、次いでエタノールで沈澱させた。得られた
DNAをライゲートl衝液に再懸濁してライゲートし、
次いで実施例2Dの操作法に実質的に従って、得られた
プラスミドを使用してE.Coli K12 RV30
8を形質転換した。
得られた耐性形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電
気泳動法[マニアチス(Maniatis)ら、198
2]および他の検定法から通常分かるように、所望の〜
9.2kbプラスミド(第1O図)のみを含有していた
。本明細書に於いてはE.Coli K 12RV30
8/pCZ 118と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するTY寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。
気泳動法[マニアチス(Maniatis)ら、198
2]および他の検定法から通常分かるように、所望の〜
9.2kbプラスミド(第1O図)のみを含有していた
。本明細書に於いてはE.Coli K 12RV30
8/pCZ 118と命名したこのような形質転換体を
選択し、適当な抗生物質を含有するTY寒天にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法によって培養した。
実施例4
プラスミドpNM7−89Bの代わりにプラスミドpc
2118を用い、実施例2Bの操作法に実質的に従って
、所望のフラグメントを構築した。
2118を用い、実施例2Bの操作法に実質的に従って
、所望のフラグメントを構築した。
所望の〜8.6kb BamHI−Xbal制限フラグ
メントを常法により分離し、アガロースゲル電気泳動法
「マニアチス(Maniatis)ら、1982]によ
って単離し、次いでTE緩衝液約100μgに溶解し、
以後の使用に備えてO′Cで保存した。
メントを常法により分離し、アガロースゲル電気泳動法
「マニアチス(Maniatis)ら、1982]によ
って単離し、次いでTE緩衝液約100μgに溶解し、
以後の使用に備えてO′Cで保存した。
プラスミドpNM789Bおよび制限酵素XbaIを使
用する代わりにそれぞれプラスミドpCZ101および
制限酵素Hg1A Iを用い、実施例2Bの操作法に実
質的に従って、所望のフラグメントを構築した。所望の
〜0.6kb BamHI −HgiAT制限フラグメ
ントを常法により分離し、アガロースケル電気泳動法[
マニアチス(Maniatis) ラ、1982]によ
って単離し、次いでTE緩iIi液約100μgに溶解
し、以後の使用に備えてo′cで保存した。
用する代わりにそれぞれプラスミドpCZ101および
制限酵素Hg1A Iを用い、実施例2Bの操作法に実
質的に従って、所望のフラグメントを構築した。所望の
〜0.6kb BamHI −HgiAT制限フラグメ
ントを常法により分離し、アガロースケル電気泳動法[
マニアチス(Maniatis) ラ、1982]によ
って単離し、次いでTE緩iIi液約100μgに溶解
し、以後の使用に備えてo′cで保存した。
所望のリンカ−配列を、イタクラら、1977およびフ
レアら、1978に開示された方法に実質的に従い、改
良ホスホトリエステル法によって常法とおりに合成した
。この合成法は、実施例1にら詳細に説明されている。
レアら、1978に開示された方法に実質的に従い、改
良ホスホトリエステル法によって常法とおりに合成した
。この合成法は、実施例1にら詳細に説明されている。
D ライケートおよび形質転換
実施例/ICのDNAリンカ−約20ピコモル、プラス
ミドpCZl]8の〜l 0.2kb Bam)−11
Xbalフラグメント1μgおよびプラスミドpCZ1
01の〜0.6kb BamHr −HgiA I 7
ラグメント05μgをライゲートし、得られたプラスミ
ドを使用し、実施例2Dの操作法に実質的に従い、E.
Coli K12 RV308を形質転換した。
ミドpCZl]8の〜l 0.2kb Bam)−11
Xbalフラグメント1μgおよびプラスミドpCZ1
01の〜0.6kb BamHr −HgiA I 7
ラグメント05μgをライゲートし、得られたプラスミ
ドを使用し、実施例2Dの操作法に実質的に従い、E.
Coli K12 RV308を形質転換した。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースゲル電気泳
動法[マニアチス(Man ia t i s)ら、1
982]および他の検定法から通常分かるように、所望
の〜9.2kbプラスミド(第11図)のみを含有して
いた。このような形質転換体を選択しく本明細書に於い
てE.Coli K 12 RV308/pCZ145
と命名する)、適当な抗生物質を含有するTY寒天上に
プレートし、次いて通常の微生物学的手法に従って培養
した。SDSゲル電気泳動法、tAおよび他の検定法に
より、得られた細胞では、met−bGHが高いレベル
で発現されていることが証明された。プラスミドpCZ
145は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約37°Cの時にmet −b
G Hの最高発現が認められた。
動法[マニアチス(Man ia t i s)ら、1
982]および他の検定法から通常分かるように、所望
の〜9.2kbプラスミド(第11図)のみを含有して
いた。このような形質転換体を選択しく本明細書に於い
てE.Coli K 12 RV308/pCZ145
と命名する)、適当な抗生物質を含有するTY寒天上に
プレートし、次いて通常の微生物学的手法に従って培養
した。SDSゲル電気泳動法、tAおよび他の検定法に
より、得られた細胞では、met−bGHが高いレベル
で発現されていることが証明された。プラスミドpCZ
145は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約37°Cの時にmet −b
G Hの最高発現が認められた。
実施例5
プラスミドpc]45DNA約5 tt gを、1−1
1塩k lr液50μ(!中でXbalおよびNdel
制限酵素各々10単位とともに、37°Cで約1時間イ
ンキュベートした。3M酢酸ナトリウム(pr−r=7
.0)5μ(を加えた後、100%エタ/−ル3容量を
用いてl) N Aを沈澱させた。このDNAを゛rE
緩函液100μaに溶解し、以後の使用に6fifえて
O′Cで保存した。
1塩k lr液50μ(!中でXbalおよびNdel
制限酵素各々10単位とともに、37°Cで約1時間イ
ンキュベートした。3M酢酸ナトリウム(pr−r=7
.0)5μ(を加えた後、100%エタ/−ル3容量を
用いてl) N Aを沈澱させた。このDNAを゛rE
緩函液100μaに溶解し、以後の使用に6fifえて
O′Cで保存した。
所望のリンカ−配列を、イタクラら(1977)および
フレアら(197g)に開示された方法に実質的に従い
、改良ホスホトリエステル法によって、常法どおり合成
した。この合成法は、実施例1にも詳細に説明されてい
る。
フレアら(197g)に開示された方法に実質的に従い
、改良ホスホトリエステル法によって、常法どおり合成
した。この合成法は、実施例1にも詳細に説明されてい
る。
C,ライゲートおよび形質転換
実施例5Bのリンカ−約20ピコモルおよび実施例5A
のpCZ145消化物111gをライゲートし、実施例
2Dの操作法に実質的に従い、得られたプラスミドを使
用してE.Coli K 12 RV308を形質転
換した。
のpCZ145消化物111gをライゲートし、実施例
2Dの操作法に実質的に従い、得られたプラスミドを使
用してE.Coli K 12 RV308を形質転
換した。
得られた形質転換体の幾つかは、アガロースケル電気泳
動法[マニアチス(Maniatis)ら、1982]
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜9.
2kbプラスミドのみを含有していた。
動法[マニアチス(Maniatis)ら、1982]
および他の検定法から通常分かるように、所望の〜9.
2kbプラスミドのみを含有していた。
このような形質転換体を選択しく本明細書に於いてE.
Coli K12 RV308/pCZ149と命名す
る)、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法に従って培養した。S
DSゲル電気泳動法、RI 、Aおよび他の検定法によ
り、得られた細胞はmet −b G Hが高いレベル
で発現されていることが分かつた。プラスミドpCZI
49は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約37°Cの時にmet −b G
Hの最高発現が認められた。
Coli K12 RV308/pCZ149と命名す
る)、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレート
し、次いで通常の微生物学的手法に従って培養した。S
DSゲル電気泳動法、RI 、Aおよび他の検定法によ
り、得られた細胞はmet −b G Hが高いレベル
で発現されていることが分かつた。プラスミドpCZI
49は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約37°Cの時にmet −b G
Hの最高発現が認められた。
実施例6
DNAリンカ−配列:
を、実施IZ15のリンカ−配列の代わりにfψ用する
以外は、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構
築物を構築した。イタクラら(1977)およびフレア
ら(1978)に開示された常法に実質的にウェイ、上
記のリンカ−配列を溝築した。この合成法は、実施例1
にも詳細に説明されている。
以外は、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構
築物を構築した。イタクラら(1977)およびフレア
ら(1978)に開示された常法に実質的にウェイ、上
記のリンカ−配列を溝築した。この合成法は、実施例1
にも詳細に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE.ColiK1
2 RV308/pCZ183と命名する)を、適当
な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートし、次いで
常法により以後のプラスミドpCZ183の生産および
単離のために培養した。SDSケル電気泳動法、RI
Aおよび池の検定法により、得られた形質転換体はmc
L −b G I−Iが高いレベルで発現することが分
かった。プラスミドpCZ I 83はj!+!+ I
U +ji%発性ウシナウェイ・レプリコンを含イfし
ているので、培地l晶度約37°Cの時に5et−b
G Hの最高発現が認められた。
2 RV308/pCZ183と命名する)を、適当
な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートし、次いで
常法により以後のプラスミドpCZ183の生産および
単離のために培養した。SDSケル電気泳動法、RI
Aおよび池の検定法により、得られた形質転換体はmc
L −b G I−Iが高いレベルで発現することが分
かった。プラスミドpCZ I 83はj!+!+ I
U +ji%発性ウシナウェイ・レプリコンを含イfし
ているので、培地l晶度約37°Cの時に5et−b
G Hの最高発現が認められた。
実施例7
DNAリンカ−配列:
を、実施例5のリンカ−配列の代わりに1史用する以外
は、実施例5の操作法に実質的に1ノでって、所望の構
築物を構築した。イタクラら(+977)およびフレア
ら(1978)に開示された常法に実fl的に従い、上
記のリンカ−配列を114築した。この合成法は、実施
例Iにも詳細に説明されている。
は、実施例5の操作法に実質的に1ノでって、所望の構
築物を構築した。イタクラら(+977)およびフレア
ら(1978)に開示された常法に実fl的に従い、上
記のリンカ−配列を114築した。この合成法は、実施
例Iにも詳細に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE.ColiKI
2 1ンV308/pCZ184と命名する)を、適当
な抗生物質を含有する′FY寒天上にプレートし、次い
で常法により以後のプラスミドpCZ184の生産およ
び単離のために培養した。SDSゲル電気泳動法、RI
Aおよび他の検定法により、得られた形質転換体はme
t −b G tlが高いレベルで発現することが分か
った。プラスミドpCZI8/lは温度誘発性ウシナウ
ーイ・レプリコンを含有しているので、培地温度約37
°Cの時にmeL−b G Hの最高発現が認められた
。
2 1ンV308/pCZ184と命名する)を、適当
な抗生物質を含有する′FY寒天上にプレートし、次い
で常法により以後のプラスミドpCZ184の生産およ
び単離のために培養した。SDSゲル電気泳動法、RI
Aおよび他の検定法により、得られた形質転換体はme
t −b G tlが高いレベルで発現することが分か
った。プラスミドpCZI8/lは温度誘発性ウシナウ
ーイ・レプリコンを含有しているので、培地温度約37
°Cの時にmeL−b G Hの最高発現が認められた
。
実施例8
DNAリンカ−配列:
を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE.ColiK1
2 RV308/pCZ149.1と命名する)を、
適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートし、次
いで常法により以後のプラスミドpCZ149,1の生
産および単離のために培養した。
2 RV308/pCZ149.1と命名する)を、
適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートし、次
いで常法により以後のプラスミドpCZ149,1の生
産および単離のために培養した。
SDSゲル電気泳動法、RIAおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はmet−bGHが高いレベルで
発現することが分かった。プラスミドpc2149.1
は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有している
のて、培地を晶度約37°Cの時にnet −b G
Hの最高発現が認められた。
、得られた形質転換体はmet−bGHが高いレベルで
発現することが分かった。プラスミドpc2149.1
は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有している
のて、培地を晶度約37°Cの時にnet −b G
Hの最高発現が認められた。
実施例9
DNAリンカ−配列:
を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(+977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実1r=例1にも
詳細に説明されている。
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(+977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実1r=例1にも
詳細に説明されている。
所望の形質転換体く本明細書に於いてl’:.Coli
!(12RV308/pCZ]49.2と命名する)を
、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートシ、
次いて常法により以後のプラスミドpCZ149,2の
生産および単離のために培養した。
!(12RV308/pCZ]49.2と命名する)を
、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレートシ、
次いて常法により以後のプラスミドpCZ149,2の
生産および単離のために培養した。
SDSケル電気泳動法、RI Aおよび池の検定法によ
り、1すられた形質転換体はmat −b G Hか高
いレベルで発現することか分かった。プラスミドpCZ
l 49.2はt温度誘発性ウシナウェイ・レプリコ
ンを含有しているので、培地温度約37°Cの時にne
t −b G Hの最高発現が認められた。
り、1すられた形質転換体はmat −b G Hか高
いレベルで発現することか分かった。プラスミドpCZ
l 49.2はt温度誘発性ウシナウェイ・レプリコ
ンを含有しているので、培地温度約37°Cの時にne
t −b G Hの最高発現が認められた。
実施例10
DNAリンカ−配列:
を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE 、 cot
1KI2 RV308/pCZ149.3と命名する
)を、適当な抗生物質を含をするTY寒天上にプレート
シ、次いて常法により以後のプラスミドpCZ149,
3の生産および単離のために培養した。
1KI2 RV308/pCZ149.3と命名する
)を、適当な抗生物質を含をするTY寒天上にプレート
シ、次いて常法により以後のプラスミドpCZ149,
3の生産および単離のために培養した。
SDSゲル電気泳動法、RIAおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はmcL−、bGHが高いレベル
で発現することが分かった。プラスミドpCZ149,
3は温度誘発性ウシチウェイ・レプリコンを含有してい
るので、培地1品度約37℃の時にmeL−bGHの最
高発現が認められた。
、得られた形質転換体はmcL−、bGHが高いレベル
で発現することが分かった。プラスミドpCZ149,
3は温度誘発性ウシチウェイ・レプリコンを含有してい
るので、培地1品度約37℃の時にmeL−bGHの最
高発現が認められた。
DNAリンカ−配列:
を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(+977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、l記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(+977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、l記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE.ColiK1
2 RV308/、pCZ183川と命名する)を、
適当な抗生物質を含有するTY寒天上にブレートし、次
いで常法により以後のプラスミドpC7183川の生産
および単離のために培養した。
2 RV308/、pCZ183川と命名する)を、
適当な抗生物質を含有するTY寒天上にブレートし、次
いで常法により以後のプラスミドpC7183川の生産
および単離のために培養した。
SDSゲル電気泳動法、尺rAおよび曲の検定法により
、得られた形質転換体はmat bG)Iが高いレベ
ルで発現することが分かった。プラスミドpCZ183
.lは温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約37°Cの時にset −b G
Hの最高発現が認められた。 ′実施例12 DNAリンカ−配列: を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
、得られた形質転換体はmat bG)Iが高いレベ
ルで発現することが分かった。プラスミドpCZ183
.lは温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有して
いるので、培地温度約37°Cの時にset −b G
Hの最高発現が認められた。 ′実施例12 DNAリンカ−配列: を、実施例5のリンカ−配列の代わりに使用する以外は
、実施例5の操作法に実質的に従って、所望の構築物を
構築した。イタクラら(1977)およびフレアら(1
978)に開示された常法に実質的に従い、上記のリン
カ−配列を構築した。この合成法は、実施例1にも詳細
に説明されている。
所望の形質転換体(本明細書に於いてE 、 col
1K12 RV308/pCZ183.2と命名する
)を、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレート
シ、次いで常法により以後のプラスミドpCZ183,
1の生産および単離のために培養した。
1K12 RV308/pCZ183.2と命名する
)を、適当な抗生物質を含有するTY寒天上にプレート
シ、次いで常法により以後のプラスミドpCZ183,
1の生産および単離のために培養した。
SDSゲル電気泳動法、RIAおよび他の検定法により
、得られた形質転換体はmet −b G Hが高いレ
ベルで発現することが分かった。プラスミドpc218
3.2は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約37°Cの時にmet−bGH
の最高発現が認められた。
、得られた形質転換体はmet −b G Hが高いレ
ベルで発現することが分かった。プラスミドpc218
3.2は温度誘発性ウシナウェイ・レプリコンを含有し
ているので、培地温度約37°Cの時にmet−bGH
の最高発現が認められた。
第1図から第4図は、プラスミドpNM575の構築の
プロトコールを表した模式図、第5図から第8図は、プ
ラスミドpNM789Bの構築のプロトコールを表した
模式図、ならひに第9図はプラスミドpCZ to l
の制限部位地図、第10図はプラスミドpCZ118の
制限部位地図および第11図はプラスミドpCZ145
の制限部位地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リシー・アンド・カンパ代 理
人 弁理士 前出 葆 (外1名)第1図 pKENlll pBR322第
2図 デ2p白03(第1の /S1 λ2し1−にり 第3図 t5.tjF’105 @ 2 n第4図 第5図 第6図 al l 第7図 第8図 ピVLI II 掘取Pv’ II Bam +t1
BamHI
4功保フンクヌンヒ第9図 第10図
プロトコールを表した模式図、第5図から第8図は、プ
ラスミドpNM789Bの構築のプロトコールを表した
模式図、ならひに第9図はプラスミドpCZ to l
の制限部位地図、第10図はプラスミドpCZ118の
制限部位地図および第11図はプラスミドpCZ145
の制限部位地図をそれぞれ表す模式図である。 特許出願人 イーライ・リシー・アンド・カンパ代 理
人 弁理士 前出 葆 (外1名)第1図 pKENlll pBR322第
2図 デ2p白03(第1の /S1 λ2し1−にり 第3図 t5.tjF’105 @ 2 n第4図 第5図 第6図 al l 第7図 第8図 ピVLI II 掘取Pv’ II Bam +t1
BamHI
4功保フンクヌンヒ第9図 第10図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、a)転写活性化配列、 b)以下の配列群の中から選ばれるいずれかのDNA配
列:1)【遺伝子配列があります。】2)【遺伝子配列
があります。】 3)【遺伝子配列があります。】 4)【遺伝子配列があります。】 5)【遺伝子配列があります。】 6)【遺伝子配列があります。】 7)【遺伝子配列があります。】 および 8)【遺伝子配列があります。】 [式中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニル
、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルである]
、および c)生物活性ポリペプチドをコードしているDNA配列 を連続的に含有している組換えDNA発現ベクター。 2、プラスミドである請求項1に記載の組換えDNA発
現ベクター。 3、転写活性化配列が、E.Coliトリプトファン、
E.coliリポプロテイン、E.coliラクトース
、バクテリオファージλP_LO_L、バクテリオファ
ージλP_RO_R、バシラス・サブチリス増殖または
ストレプトマイセス・アズレウスチオストレプトン耐性
転写活性化配列である請求項1または請求項2に記載の
組換えDNA発現ベクター。 4、プラスミドpCZ149、pCZ183、pCZ1
84、pCZ149.1、pCZ149.2、pCZ1
48.3、pCZ183.1またはpCZ183.2で
ある請求項1から請求項3までのいずれかに記載のベク
ター。 5、請求項1から請求項3までのいずれかに記載の組換
えDNA発現ベクターを含有する宿主細胞。 6、E.coliである請求項5に記載の宿主細胞。 7、E.coliK12RV308である請求項6に記
載の宿主細胞。 8、機能的なポリペプチドを生産するための方法であっ
て、 1)a)転写活性化配列、 b)以下の配列群の中から選ばれるいずれかのDNA配
列; 1)【遺伝子配列があります。】 2)【遺伝子配列があります。】 3)【遺伝子配列があります。】 4)【遺伝子配列があります。】 5)【遺伝子配列があります。】 6)【遺伝子配列があります。】 7)【遺伝子配列があります。】 および 8)【遺伝子配列があります。】 [式中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニル
、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルである]
、および c)生物活性ポリペプチドをコードしているDNA配列 を連続的に含有している組換えDNA発現ベクターで原
核生物細胞を形質転換し、 2)適当な遺伝子発現の条件下に、この形質転換した細
胞を培養すること を特徴とする生産方法。 9、転写活性化配列が、E.coliトリプトファン、
E.coliリポプロテイン、E.coliラクトース
、バクテリオファージλP_LO_L、バクテリオファ
ージλP_RO_R、バシラス・サブチリス増殖または
ストレプトマイセス・アズレウスチオストレプトン耐性
転写活性化配列である請求項8に記載の方法。 10、転写活性化配列が、直列に1つまたはそれ以上の
E.coli転写活性化配列を含有している請求項8に
記載の方法。 11、転写活性化配列がE.coliトリプトファンま
たはE.coliラクトース転写活性化配列である請求
項9に記載の方法。 12、組換えDNA発現ベクターがプラスミドである請
求項8から請求項10までのいずれかに記載の方法。 13、生物活性ポリペプチドのコード配列が、ウシ成長
ホルモン、ヒト成長ホルモン、ヒト・プレ成長ホルモン
、ブタ成長ホルモン、哺乳類成長ホルモン、鳥類成長ホ
ルモン、ヒト成長ホルモン放出因子、ウシ成長ホルモン
放出因子、ブタ成長ホルモン放出因子、ヒト・インシュ
リンA鎖、ヒト・インシュリンB鎖、ヒト・プロインシ
ュリン、ヒトおよび非−ヒト・インターフェロン、ウロ
キナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インター
ロイキン I またはインターロイキンIIをコードしてい
る配列である請求項8から請求項11のいずれかに記載
の方法。 14、プラスミドが、pCZ183、pCZ184、p
CZ149.1、pCZ149.2、pCZ149.3
、pCZ183.1またはpCZ183.2である請求
項12に記載の方法。 15、形質転換される細胞が原核生物細胞である請求項
8から請求項13までのいずれかに記載の方法。 16、形質転換される原核生物細胞がE.coliであ
る請求項15に記載の方法。 17、形質転換される原核生物細胞がE.coliK1
2RV308である請求項16に記載の方法。 18、配列が、 1)【遺伝子配列があります。】 2)【遺伝子配列があります。】 3)【遺伝子配列があります。】 4)【遺伝子配列があります。】 5)【遺伝子配列があります。】 6)【遺伝子配列があります。】 7)【遺伝子配列があります。】 および 8)【遺伝子配列があります。】 [式中、Aはデオキシアデニル、Gはデオキシグアニル
、Cはデオキシシチジル、およびTはチミジルを示す] であるDNAリンカー配列を含有する組換えDNA発現
ベクター。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US11867887A | 1987-11-09 | 1987-11-09 | |
US118678 | 1987-11-09 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01160488A true JPH01160488A (ja) | 1989-06-23 |
Family
ID=22380086
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63283528A Pending JPH01160488A (ja) | 1987-11-09 | 1988-11-09 | ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0316115A3 (ja) |
JP (1) | JPH01160488A (ja) |
CA (1) | CA1307482C (ja) |
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IL (1) | IL88279A0 (ja) |
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---|---|---|---|---|
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US5990091A (en) * | 1997-03-12 | 1999-11-23 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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