JP5634971B2 - 培地へのペプチドの直接発現 - Google Patents
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Description
コード化領域は、シグナルペプチドをコードしている核酸から下流の読み枠に結合した重要なペプチド生産物をコードしている核酸を含み、それによって該コード化領域は、シグナル及びペプチド生産物のN末端からC末端までに、それぞれ含んでいるペプチドをコードする。理論に結び付けるべき意図無しに、そのシグナルは、ペリプラズムへのそれの分泌に酸化することに加え、蛋白分解的な分解からペプチド生産物のいずれかの保護を提供し得ると確信する。
少なくとも1の分泌促進ペプチドをコードしている核酸は、本発明のベクター中に任意に存在する。代替的に、該分泌促進ペプチドをコードしているペプチドは、ペプチド生産物をコードしているベクターとして同じ宿主細胞中で発現した分離ベクター上に存在し得る。好ましくは、分泌促進ペプチドは、SecY(prlA)又はprlA-4からなる群から選択される。SecYとprlAは同一であり、その2つの用語は当該分野において別称として使用されていることが指摘される。prlA-4は、prlAの周知の変形であり且つ同様の機能を有する。別の好適な分泌促進ペプチドは、"prlG"としても知られるSecEである。最も好ましくは、複数の分泌促進ペプチドは、SecEと、SecY(prlA)及びprlA-4からなる群から選択されるその他の少なくとも1つとがコードされる。その2つは、細胞質からペリプラズムまでのペプチド生産物のトランスロケーションを助力するように相互作用すると確信される。
本発明はまた、本発明の何れかのベクターによって形質転換され又は形質移入された宿主細胞をも提供する。好ましくは、宿主細胞は細菌の細胞である。より好ましくは、該宿主細胞はグラム陰性細菌である。更により好ましくは、該宿主細胞は大腸菌(E.coli)である。より好ましくは、その大腸菌は、BLR,BL21又はWA837株である。また最も好ましくは、該宿主細胞は、少なくとも1の分泌促進ペプチドを発現する。
新規の発酵条件が、高い収率で培地中にペプチド生産物の放散又は排出を与える培養条件下に非常に高い細胞密度で宿主細胞を増殖するために提供される。
[1又は細菌細胞の除去後に実行され得る]
本発明は、培地から宿主細胞を除去すること、及びその後に、ゲル濾過、イオン交換(好ましくはそのペプチドがカルシトニンである場合にはカチオン交換)、逆相、アフィニティー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーからなる群から選択されるクロマトグラフィーの少なくとも1のタイプに該培地をかけることを含むペプチド生産物を回収するための方法を更に提供する。システイン残基を含むペプチドにおいて、S-スルホン化は、ペプチドの集団化を防ぎ且つモノメリックペプチドの収量を増加するために精製工程の前にまたはその間に実行され得る。
pSCT-037とpSCT-038クローン化方法 pSCT-037とpSCT-038の構築は、最終的に望む発現プラスミドを構築するのに必要な中間のベクターを創製するために収束した8つのパートよりなる。このプロジェクト用の記載テキストの外に使用した又は構築した全ての遺伝子とフラグメントを表1中にリスト化した。
pSCT-018Dの構築 TACプロモーターカートリッジ(表1)は、pGEM11ZF+TACを創製するHind III-Bam HIフラグメントとしてpGEM11ZF+(表1)内にサブクローンした。pelB-sCTgly cas2遺伝子(表1)は、発現ベクターpSCT-013Bを創製するためのBam HIサイト内のtacプロモーターの下流に結紮した。そのtac-pelBsCTglyオペロンは、Hind IIIとEco RIを用いてpSCT-013Bから切断した。このフラグメントは、pSCT-015Bを創製するpSP72(表1)内に、Hind III-Pst Iアダプターと一緒に結紮した。
pSCT-019の構築 pSCT-013B(tac-pelBsCTglyを含んでいる)からのサイトPst IとHind IIIとHind III-Eco RIフラグメントを持ったlac P/O(表1)は、pSCT-015Aを創製するpSP72のPst IとEco RIサイトの中に、3つの結紮手法で挿入した。pSCT-017Bの構築において記載した通り、Kan-R遺伝子を挿入し且つβ-ラクタマーゼ遺伝子を、pSCT-016AとpSCT-017Aを創製するためにpSCT-015Aから取り外した。lpp-lac-ompAsCTgly(表1)Pst I-Acc Iフラグメント(sCTglyの5’コード化配列の17塩基対もまたある)は、pSP72-OMPAから切断し、pSCT-019を創製するためにpSCT-017A中の両立性サイト内に結紮した(図2を参照)。
pSCT-025の構築 PCR増幅したオペロンlac-ompAsCTgly(表1)のBam HIフラグメントは、pSCT-023(-)を創製するpelBsCTgly遺伝子を置換している、pSCT-018DのBam HIサイト内に結紮した。その(-)は、挿入物がtacプロモーターとの関係において逆方向に挿入されたことを表す。lac-ompAsCTglyオペロンは、pSCT-023(-)からBam HIとSal Iを用いて切断し、pSCT-017 DELTAを創製するpSCT-017Bの両立サイト内に結紮した。カナマイシン耐性遺伝子、tac-lacプロモーター及びompAsCTglyを含む、より大きなBgl I-Bgl IIフラグメントを、pSCT-017 DELTAから切断し、pSCT-025を創製するためpSCT-018DのBgl I-Bam HIサイト内に結紮した(図3参照)。
pSCT-029Aの構築 Xho IとEco RIサイトを含むRRNB T1-T2-02(表1)のPCR生産物は、pSCT-025Aを創製するpSCT-025のSal I-Eco RIサイト内に結紮した。tac-lac-ompAsCTgly RRNB T1-T2ターミネーター遺伝子カートリッジを含んでいるpSCT-025から切り出したHind III-Sac Iフラグメントは、pCPM-01を創製するpSP72の両立サイト内に結紮した。pCPM-01Aベクターは、pSCT-025Aについて記載したと同じ方法を用いて構築した。pSCT-025AとpCPM-01Aプラスミドは、RRNB T1-T2転写ターミネーターの上流と下流にある制限サイトのタイプにおいてpSCT-025とpCPM-01プラスミドと異なる。tac-lac-ompAsCTgly RRNB T1-T2ターミネーター遺伝子カートリッジを含んでいるXho I-Eco RIフラグメントは、pCPM-01Aから切断し且つジジェニック発現ベクターpSCT-029Aを創製するためpSCT-025AのSal I-Eco RIのサイト内に結紮した(図4)。pSCT-029Aを創製するために用いた方法は、pSCT034の構築のために以下に示した通り、補足のポリジェニック発現ベクターを創製するために繰り返すことができる。
pSEC-Eの構築 ベクターpCPM-01は、次いでpSP72の両立サイト内に結紮される、lac P/Oを削るためにPst IとXba Iによって消化した。Xba IとBam HIクローン化サイトを含んでいるPCR増幅したsecE遺伝子(表1)は、pCM-SECEを創製するompAsCTgly T1-T2シストロンクローン化ベクター(表1)の両立サイト内に結紮した。secE及びT1-T2ターミネーターは、Xho I-Eco RIフラグメントのようにpCM-SECEから切断し、pSEC-Eを創製するためpSP72のSal I-Eco RIサイト内に、lac P/O(pSP72-lacから切断した)を含むXba I-Sal Iフラグメントと一緒に結紮した(図5参照)。
pPRLA-4の構築(prlA-4はprlA又はcexY遺伝子の変異体対立遺伝子である) ompAsCTgly T1-T2シストロンベクターのT1-T2ターミネーター領域は、BamHIとSma Iを用いて削り、PRLA4-INT中間体クローン化ベクターを創製するpSP72のPvu IIとBam HIサイト内に結紮された。そのlacP/Oは、Xba IとSac IによりpSP72-LACから切断し、pPRLA-4を創製するためPRLA4-INTのSac I-Bam HIサイト内に、Xba IとBam HI制限サイトを含む、pr1A-4 PCRフラグメント(表1)と一緒に結紮した(図6参照)。
pSEC-EYの構築 trpE P/O配列を含む合成オリゴヌクレオチド(表1)は、pCPM-08を創製するためpCPM-01AのXho I-Xba Iサイト内にサブクローンした。prlA-4とT1-T2配列は、Xba IとXho IによりpPRLA-4から切断し、pSEC-EYを創製するためpCPM-08のXba IとEco RIサイト内に、lac-secE-T1-T2オペロンを含むpSEC-EからのSal I-Eco RIフラグメントと結紮した(図7参照)。
pSCT-037とpSCT-038の構築 secEとprlA-4コード化領域は、Xho IとBgl IIによってpSEC-EYから切断した。その残りのフラグメントは、それぞれpSCT-037とpSCT-038を創製するため、pSCT-025AとpSCT-029AのSal I-Bgl IIサイトに結紮した(図8参照)。
pSCT-034は、Tac-Lac-ompAsCTgly RRNB T1-T2転写カセットの3つのコピーを含むトリジェニック発現プラスミドである。このベクター(図9参照)は、その発現カートリッジの第3のコピーに加えpSCT-029AのSal IとEco RIサイト内にpCM-01Aからの記載したカートリッジを挿入することによって構築した。構築の方法は、pCM-01AとpSCT-025AからのpSCT-029Aの構築のための方法と同じである。その3’Sal IとEco RIサイトは、該カートリッジのより多いコピーを加えるために必要なサイトを提供するよう再創製される。
++該pRLA41ベクターは、プリンストン大学でTom Silhavyにより提供された。
1.宿主細胞の一晩飽和した培養物を調製する。
2.0.5%(v/v)までの培地の100mlに接種することによる新鮮宿主細胞 培養物の調製及び0.02-0.03のA600nmまでの増殖。
3.0.15-0.3のA600nm、ほぼ3倍化までの該培養物の増殖。
4.10分間該細胞を氷上で保管する。
5.5k rpm x 10分、遠心分離によって培地から細胞を取り除く。
6.氷冷0.1M CaCl2の0.5x容量での細胞の再懸濁と塊状化、30分 間氷上保存、次いで上記の細胞の塊状化。
7.0.1M CaCl2の0.lx容量で塊状化した細胞の再懸濁;使用の前 の1時間氷上で保管する。
1.記載の通り調製した受容細胞の100μlにプラスミドベクターDNA の2-10ngを理想的に含むであろう結紮混合物の1-2μlを加える。
2.30分間氷上で該混合物を保存する。
3.37℃で加熱ブロック又は水浴中に配することで該混合物を熱ショ ックする。
4.予備加熱した培地1mlに該混合物を加え、37℃で30-60分間該混合物 をインキュベートする。
5.必要な選択抗生物質を含む適当な固体培地上に形質転換混合物を適 量散布し、且つコロニー出現まで18-24時間その平板をインキュベート する。
形質転換体は各種の方法により同定される。幾つかのクローンは第2宿主、大腸菌B宿主BLR株への転移のために選択される。BLRは、選択又は発酵とタンパク質発現の宿主株である。
1.宿主細胞の一晩飽和培養物を調製する。
2.1.0%(v/v)に培地の100mlを接種することによって新鮮な宿主細胞 培養物を調製し、0.3-0.5のA600nmまで培養する。
3.15分間氷上で培養物を冷却した後に遠心分離によって細胞を収穫 する。
4.可能な限り多くの培地を除去するよう上清をデキャンタする。氷冷 10%グリセリン水溶液、w/v(グリセリンは特級品とすべきである)の100 mlsの全量中に該細胞を再懸濁する。再懸濁した細胞を直ちに再遠心分 離する。
5.氷冷10%グリセリン(w/v)の50mls中に細胞を再懸濁する。再遠心分 離。
6.氷冷10%グリセリン(w/v)の25mls中に細胞を再懸濁する。再遠心分 離。
7.工程6を繰り返す。
8.氷冷10%グリセリン(w/v)の2mlsの最終容量中に細胞を再懸濁する 。最終細胞濃度は1-3x1010細胞/mlとなるであろう。細胞は−80℃で1 年まで保存できる。
1.滅菌キュベットと白色チャンバースライドを氷上で10分間インキ ュベートする。また数本のポリプロピレン管もインキュベートする。
2.100pg/μlの適当な濃度でTris/EDTA中にプラスミドDNAを含む溶 液の1-2μl溶液と細胞懸濁液の40μlを混合する。(DNA混合物は装置 のアーチング(arcing)を防ぐために可能な限り塩分フリーとする必要が ある。)溶液を良く混合し0.5-1.0分氷上でインキュベートする。
3.25μFでGene-Pulser装置にセットする。200オームでパルス制御器 抵抗をセットする。0.2cmキュベットで2.5Kv又は1.0cmキュベットを用 いる場合、1.5-1.8KvにGene-Pulser装置をセットする。
冷やした電気穿孔キュベットに細胞とDNAの混合物を移し、全ての気 泡を除去するためキュベットの底までの懸濁物を振る。冷やした安全チ ャンバースライド中にキュベットを配置し、キュベットがチャンバーの 基部中の接触部の間に固定されるまで、チャンバーにスライドを押す。
4.上記セッティングでキュベットを一度パルスする。
5.キュベットにSOC(20gトリプトン、5g酵母エキス、0.5gNaCl、 1L H2O及び20mMグルコース)緩衝化培地1mlを直ちに加え、細胞を 再懸濁する。
6.滅菌17x100mmポリプロピレン管に懸濁物を移し、37℃で1時間イ ンキュベートする。
7.選択培地平板上で電気穿孔した混合物を平板培養する。
発酵バッチ培地は表2中に載せた成分を用いて調製される。発酵は接種培地(表2)中で増殖した対数期後期培養物により接種される。接種容量は、0.015と0.24の間に発酵槽内のイニシャルA600nmが達するまでに要した接種物の量(細胞の数)により決定される。発酵作動のためのpH、DO2、及び温度パラメータは、表3中にリスト化される。発酵の供給バッチ段階は、バッチ培地中のグリセリンが消耗した時に開始した。[グリセリン消耗は溶存酸素の急増及び/又はグリセリン測定により測定され得る。]供給率は、グリセリン消耗の時点で細胞量(細胞乾物重量)に基づく一定の細胞分裂速度を維持するようにセットした。供給率は以下の式に基づいている:
Mu=増殖速度(時間当たり倍化)
dcw=個々の大腸菌株のための経験的に決定した供給開始での培地のリットル当たり乾物細胞重量グラム
t=時間での経時
Yx/s=宿主用のグリセリン利用定数(大腸菌WA837で0.327;BLRで相似)
v=リットルでの培養容量
[feed]=供給培地のリットル当たりのグラムグリセリン(個々に記載し た全ての実施例でリットル当たり629グラムを用いた)。
Q=グリセリン供給率、リットル/時間
条件付けた培地は、タンジェンシャルフロー濾過(Tangential Flow Filtration)又は培地から採集するための遠心分離と該細胞の廃棄のいずれかを用いて培地から細胞を分離することで収穫される。排出されたsCTglyは、3.0の最終pHまで2.0N HClを加えることによって培地中で安定化される。グリシン-延長化サケカルシトニンは、pH3.0時点で延長した期間、安定である。細胞除去とpH安定化の後、該ペプチドはカチオン交換及び逆相クロマトグラフィー法を用いて精製される。カチオン交換クロマトグラフィーに続く逆相クロマトグラフィーは、良好な精製を提供でき、最初のカチオン交換工程もまた逆相液体クロマトグラフィーの前に含めることも好適である。大型の精製のために、これは逆相クロマトグラフィーのかける容量を減じ、かくしてアセトニトリルのような有機溶媒の高い容量を用いる必要性に起因する環境及び安全性の心配を減じる。
モノジェニックUGL 172クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニン(sCTgly)をコードしている一つの転写カセット(モノジェニック)を含むベクターpSCT-025Aを含む大腸菌BLR宿主株である。2 ジジェニックUGL 165クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニン(sCTgly)をそれぞれコードしている縦列で2つのカセットを有する(ジジェニック)ベクターpSCT-029Aを含む大腸菌BLR宿主株である。トリジェニックUGL 168クローンは、C末端グリシンを持ったサケカルシトニン(sCTgly)をそれぞれコードしている縦列で3つのカセットを有する(トリジェニック)ベクターpSCT-034を含む大腸菌BLR株である。モノジェニックUGL 702クローンは、1つのカセットと分泌因子遺伝子を含むベクターpSCT-037を含む大腸菌BLR株である。ジジェニックUGL 703クローンは、縦列に2つのカセットと、分泌因子遺伝子を含むベクターpSCT-038を含む大腸菌BLR株である。
UGL 165クローンの発酵は、実験の詳細に記載した通り実行した。表4は、発酵パラメーターと結果を要約した。概略は、UGL 165クローン細胞を、接種用培地中で培養し、0.06のイニシャルA600nmを与えるようにバッチ培地の1リットルを含む発酵槽を播種するために使用した。細胞は、該培地中のグリセリンが消耗されるまで6.25時間培養した。次いで、発酵の供給バッチ段階を開始し、25.5時間、供給培地を連続して補充した。ゼロ時点での条件は(供給と誘導の開始の)、以下の通り:酸素飽和度、94%;温度30℃;及びpH6.8。発酵の終了での条件は(25.5時間)、以下の通り:酸素飽和度40%;温度31℃;及びpH6.8。また、発酵の終了時に、600nmでの吸光度は、113.3に等しく、1リットル当たりのgでの細胞湿重量は168gであった。発酵終了時のsCTgly生産物もまた、222mg/培地のリットルとして測定された(図10と表4参照)。
組換え大腸菌UGL 703は、特許手続の目的のために微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従い、ATCC 98395としてAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託されている。UGL 703クローンの発酵は、実験の詳細に記載した通り実行した。表5は、この発酵の条件を要約した。概略は、UGL 703クローン細胞を、接種用培地中で培養し、0.06の(好ましくは0.06から0.12)イニシャルA600nmを与えるようにバッチ培地の1リットルを含む発酵槽を播種するために使用した。細胞は、該培地中のグロセリンが消耗されるまで6.25時間(好ましくは6.0から7.0時間)増殖した。次いで、発酵の供給バッチ段階を開始し、26時間、供給培地を連続して補充した。ゼロ時点での条件は(供給と誘導の開始の)、以下の通り:酸素飽和度、95%;温度30℃;及びpH6.8。発酵の終了での条件は(26時間)、以下の通り:酸素飽和度80%;温度31℃;及びpH6.8。また、発酵の終了時に、600nmでの吸光度は、80.9に等しく、1リットル当たりのgでの細胞湿重量は129.1gであった。発酵終了時のsCTgly生産物もまた、284mg/培地のリットルとして測定された(図11と表5参照)。
他の実験は、UGL 172、UGL 168及びUGL 702クローンを用い、全体的に類似の条件下で実行した。図12と13は、ジジェニックUGL 165クローンが、sCTglyの生産のために最適であることを、トリジェニックUGL 165クローンがモノジェニックUGL 173クローンを越えて二番目に良好であることと併せて示す。しかしながら、UGL 165によるsCTglyの生産は、共−発現分泌因子(UGL 703)の存在において更に改善され得る(図10と11と17に比較する)。
タンジエンシャルフロー濾過又は遠心分離のいずれか一方で収穫されている培地のほぼ1000Lは、pHを3.0に減少するために2N塩酸の十分な量で酸性化した。該培地は、≦7.5mSにまで導電率を減じるよう十分な量の水で連続希釈した。
得られたS-スルホン化反応混合物(約100L)は、2.0L/分(4.0cm/分)で、0.1%トリフルオロ酢酸によって平衡化されている逆相カラム(Toso Haas Amberchrom CG300md,25.0cm x 18.0cm)に直接ロードした。ローディングが完結した後、そのカラムは0.1%トリフルオロ酢酸により750ml/分(1.5cm/分)で安定したUVベースラインが達成されるまで洗浄した。そのカラムは、0.1%トリフルオロ酢酸、20%アセトニトリルによって750ml/分(1.5cm/分)で、主要な不純物ピークが完全に無くなるまで洗浄した。その生産物(sCTgly)は、0.1%トリフルオロ酢酸、40%アセトニトリルによって750ml/分(1.5cm/分)で溶出した。そのカラムは750ml/分(1.5cm/分)で30分間、0.1%トリフルオロ酢酸、80%アセトニトリルによって洗浄した。
得られたRP#1溶出液(ほぼ8.0L)を、25mM MES(2-[N-モルホリノ]-エタンスルホン酸)pH5.8で平衡化されているカチオン交換カラム(E.Merck Fractogel EMD SO3 650M,18.0cm x 24.0cm)に500ml/分(2.0cm/分)で直接ロードした。ローディングが完結した後、そのカラムは25mM MES(2-[N-モルホリノ]-エタンスルホン酸)pH5.8によって750ml/分(3.0cm/分)で、カラム溶出液がpH5.8(範囲5.6-5.9)に復帰するまで洗浄した。そのカラムは25mM MES(2-[N-モルホリノ]-エタンスルホン酸)pH5.8によって750ml/分(3.0cm/分)で主要なペプチド干純物を除去するために補足の30分間洗浄した。その生産物(sCTgly)は、25mM MES、100mM塩化ナトリウムpH5.8により、750ml/分(3.0cm/分)で溶出した。その生産物フラクションは直後のアミド化までに1.0M HClでpH3.0-5.0に調整される。そのカラムは0.1M水酸化ナトリウム、0.1M塩化ナトリウムによって750ml/分(3.0cm/分)で60分間洗浄し且つ衛生化した。
得られたpH調節したCEX#2溶出液は、sCTglyの真性のサケカルシトニンへのインビトロでの変換において使用するための適当な基質溶液である精製したsCTglyを含み、その反応は以下の実施例5中に示した通り、ペプチジルグリシンα-アミド化酵素(PAM)により促進される。
採集したクロマトグラフィーフラクション中のsCTglyは、分析用CEX-HPLCによって同定し且つ定量分析した。各フラクションのアリコートは、10mMリン酸ナトリウムpH5.0で平衡化したカチオン交換カラム(The Nest Group,ポリスルホエチルアスパルタミド,4.6mm x 50mm)に、1.2ml/分の流速でロードした。分離は、10mMリン酸ナトリウムpH5.0から10mMリン酸ナトリウム,250mM塩化ナトリウムpH5.0までの直線的濃度勾配を1.2ml/分で15分間にわたり実行することによって達成した。そのカラム溶出液は、220nmでUV吸収によりモニターした。sCTglyは、精製したsCTgly参照標準品のそれに対してその保持時間の比較により同定した。
アミド化サケカルシトニンの至適収量を得るために、以下の臨界パラメーターが観測される:
1)そのアミド化反応は、反応容器に対するペプチドの非特異的な吸収を防止するためにシラン化したガラス容器中で実行される。
2)溶解した酸素の高いレベルは、拡散及び/又は振混ぜにより反応混合物中に維持される。好ましくは溶解した酸素のレベルは≧75%である。
3)アミド化を通してインキュベーション温度は35℃−39℃に維持される。
4)アミド化反応のpHは6.0と6.5の間に維持される。
5)アミド化反応中のグリシン延長化サケカルシトニンの開始濃度は3.5−10.5mg/ml(0.95mMから2.9mM)の間とすべきである。
6)実質的にプロテアーゼ無しのα-アミド化酵素(ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ、ここでは"PAM"と記す)の12,000-24,000単位/mlが反応混合物に加えられ且つ基質の濃度が上記5)中に示された通りである場合、その反応は4-6時間実行される。しかしながら、その反応時間は、生産物への有害な作用無しに24時間まで更に増加できる。
7)アスコルビン酸塩制限化の精製からアミド化反応を防止するため、アスコルビン酸塩の補足の同等物が該反応のほぼ中間点で加えられる。
S-スルホン化、グリシン延長サケカルシトニンの3.5-10.5mg/ml
30mM MES緩衝液、pH6.0-6.5
0.5から1.0μM CuSO4(例えば0.5)
4-15mM KI(例えば5)
1-5%エタノール(例えば1%)
10-100μg/mlカタラーゼ(例えば35)
1.5-3.0mMアスコルビン酸塩(例えば1.5)
ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ(反応混合物のml当たり12,000-24,000単位。1単位はpH7で37℃で生産されるダンシルTyr-Val-Gly基質の変換の分当たりの1ピコモルである)。PAM酵素は、Millerら,ABB 298:380-388(1992)米国特許第4,708,934号、欧州公開0 308 067と0 382 403、及びBiotechnology Vol.II(1993)pp.64-70中に記載された通り得ることができ、その開示は参考によりここに加えられる。
カチオン交換クロマトグラフィー#3(CEX#3):このカラムはα-アミド化と再生化に続きsCTを精製するために使用した。α-アミド化/再生化の後の主要な不純物はsCTGである。CEX#3クロマトグラフィーは、Toyopearl SP650S樹脂を充填したAmicon Vantage-Aカラム(18.0x16.0cm)を用いる。単位操作は注入用の水(WFI)と150mMリン酸ナトリウムpH5.5と一緒に0.5M,50mM及び175mM塩化ナトリウムを用いて達成される。その方法の工程の概略に記載は以下の通り:
1)操作流速は750ml/分にセットする。
2)クロマトグラフィーをモニターするために用いた以下のパラメーターがLC系制御装置を用いてセットされる:
UV波長230nm
範囲0.64 AUFS
導電率x1000
3)そのカラムは750ml/分の流速で少なくとも5分間、WFIによって最初に洗浄される。
4)希釈ポンプ(150mMリン酸ナトリウムpH5.0)は、50ml/分にセットし、且つそのカラムは安定なpHベースラインが観測されるまで750ml/分の流速で10mMリン酸ナトリウムで平衡化される。
5)そのカラムは、6.0以下の安定なpHベースラインが達成されるまで750ml/分の流速で10mMリン酸ナトリウムで再平衡化される。(注:もしカラムのpHが6.0以下でないなら、150mMリン酸ナトリウム洗浄が要求される。)もし150mMリン酸ナトリウム洗浄が実行されるなら、そのカラムは次の工程の操作の前に10mMリン酸ナトリウムpH5.5を用い再平衡化する必要がある。
6)再平衡化に続き、そのカラムは175mM塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH5.5により750ml/分の流速で4分間、ブランク溶出にかけられる。
7)そのカラムは安定なpHベースラインが達成されるまで750ml/分の流速で10mMリン酸ナトリウムで再平衡化される。
8)一度平衡化が達成された10-25グラムのsCTを含むアミド化/再生化処理液は、2N水酸化ナトリウムを用い3.5にpH調整され、且つ400ml/分でCEX#3カラムにロードされる。そのサンプルのロードはWFIの500mlによってロードコンテナーを濯ぐことによって続行される。
9)そのロードに続き、カラムは750ml/分の流速で10mMリン酸ナトリウムで30分間、又はそのカラムのpHが5.0以上で安定化されるまで洗浄される。
10)カラムのpHが5.0以上で安定化しているそのカラムは、750ml/分の流速で50mm塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH5.5で100分間又はsCTglyピークが出現するまで洗浄される。
11)100分間が満了し175mm塩化ナトリウムがその系に続けられる。
そのカラムは、750ml/分の流速で175mM塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH5.5で洗浄し、次いで生産物が溶出される。全体の生産物ピークが一つの容器に採集される。CEX3溶出液材料の重量が測定され、次いで1N酢酸(10%フラクション重量)がそのフラクションに加えられる。
12)そのカラムは750ml/分の流速で15分間、0.5M塩化ナトリウム;10mMリン酸ナトリウムpH5.5で脱着化した。
13)脱着されているそのカラムに1.0M塩化ナトリウム/0.25N水酸化ナトリウムが該系に接続される。希釈ポンプは0.000ml/分にセットされ、該カラムは1.0M塩化ナトリウム/0.25N水酸化ナトリウムにより600ml/分の流速で少なくとも30分洗浄される。
14)そのカラムは750ml/分の流速で5分間WFIにより洗浄される。
15)そのカラムは500ml/分の流速で10mM水酸化ナトリウムにより30分間洗浄される。そのカラムはこれらの条件下で保存される。
操作工程の概略記載は以下の通り:
1)CEX#3溶出液(ほぼ4リットル)は、リン酸によりpH2.0に酸性化し、333mM酢酸ナトリウム溶液の3等量により希釈し、少なくとも1時間放置させる。
2)流速は320ml/分にセットされ、一方希釈ポンプ(0.5%酢酸)は400ml/分の全般的な操作流速のために80ml/分にセットされる。
3)クロマトグラフィーをモニターするために用いた以下のパラメーターがLC系制御装置を用いてセットされる:
UV波長230nm
範囲2.54AUFS
導電率x1000
4)そのカラムは400ml/分の流速で安定な導電率が観測されるまで0.1%酢酸によって最初に洗浄される。
5)そのカラムは、安定したpHベースラインが観測されるまで400ml/分の流速で80%エチルアルコール、0.1%酢酸によって脱着される。
6)そのカラムは、安定したpHベースラインが観測されるまで0.1%酢酸によって洗浄される。
7)その洗浄の後、カラム試験が樹脂洗浄をたどるために実行される。
該カラムは40%エチルアルコール;0.1%酢酸によって400ml/分の流速で6分間、ブランク溶出にかけられる。そのカラム試験から採集された溶出液は分析試験のQCに従う。
8)そのカラムは400ml/分の流速で、安定した導電率ベースラインが観測されるまで0.1%酢酸によって洗浄される。
9)その洗浄の完了したなら、WFIがその入り口から外され、250mM酢酸ナトリウムが接続される。希釈ポンプは0.000ml/分にセットされる。そのカラムは、安定したpHベースラインか観測されるまで、400ml/分の流速で250mM酢酸ナトリウムにより平衡化される。
10)平衡が達成されたなら、CEX#3溶出液が、400ml/分で該RP#2カラムにロードされる。そのサンプルロードは、250mM酢酸ナトリウムの1.0リットルによってロードコンテナーを濯ぐことによって追出される。
11)そのカラムは、400ml/分の流速で60分間、250mM酢酸ナトリウムを用いて洗浄される。
12)酢酸ナトリウム洗浄に続き、その酢酸ナトリウムは入口から取り外され、WFIが接続される。希釈ポンプは80ml/分の流速に戻され、そのカラムは0.1%酢酸によって400ml/分の流速で25分間、洗浄される。
13)0.1%酢酸洗浄に続き、その生産物は、400ml/分の流速で40%エチルアルコール;0.1%酢酸によって溶出される。生産物ピークの全体を採集し、精製されたsCT粉末を得るために凍結乾燥にかけられる。
14)そのカラムは、少なくとも20分間、400ml/分の流速で80%エチルアルコール;0.1%酢酸によって脱着される。
15)脱着に続き、希釈ポンプは0.000ml/分にセットされ、そのカラムは少なくとも5分間、400ml/分の流速でWFIにより洗浄される。
16)WFI洗浄の後、WFIが入口から取り外され、0.5N水酸化ナトリウムが接続される。そのカラムは、少なくとも20分間、400ml/分の流速で0.5N水酸化ナトリウムによって洗浄される。
17)0.5N水酸化ナトリウムが該系から分離され且つWFIが接続される。そのカラムは400ml/分の流速で少なくとも20分間、50%エチルアルコールで洗浄される。そのカラムはこれらの条件下で保存される。
18)そのRP#3溶出液は、2から8℃で保存される。
Claims (11)
- 2つの転写カセットを縦列で含む発現ベクターであって、それぞれのカセットは、
(a)OmpA、pelB、OmpC、OmpF、OmpT、β−la、PhoA、PhoS、及びStaphAから選択されるシグナルペプチドをコードしている核酸の読み枠3’に結合したペプチド生産物をコードしている核酸を持ったコード化領域;及び
(b)tacプロモーターがlacプロモーターの上流に存在する2つのプロモーターを縦列で有し、且つ少なくとも1のリボソーム結合サイトを含む、該コード化領域と操作可能に結合した制御領域;
を含み、
前記発現ベクターは、SecE、SecY、及びprlA−4から選択される少なくとも1の分泌促進ペプチドをコードする核酸を更に含む、発現ベクター。 - 上記ペプチド生産物のC末端アミノ酸がグリシンである、請求項1記載の発現ベクター。
- 請求項1または2記載のベクターにより形質転換した又は形質移入した宿主細胞。
- 上記宿主細胞が大腸菌である、請求項3記載の宿主細胞。
- 上記宿主が大腸菌BLR株である、請求項4記載の宿主細胞。
- 培地中で請求項3から5のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること、次いで該宿主細胞が培養されている培地からペプチド生産物を回収することを含む、ペプチド生産物の製造方法。
- (a)炭素源の存在する培地中で請求項3から5のいずれか一項記載の宿主細胞を培養すること、及びペプチド生産物の発現を誘導すること、同時に時間当たり0.05と0.20倍化の間の増殖率で上記宿主細胞の増殖を制御すること;及び
(b)その後培地からペプチド生産物を回収すること;
の工程を含む、ペプチド生産物の製造方法。 - 膜透過量のグリシンを、上記制御した増殖の少なくとも一部の期間、培地に存在させる、請求項7記載の方法。
- 上記ペプチド生産物を回収することが:
(a)培地から宿主細胞を分離すること;及び
(b)その培地を逆相液体クロマトグラフィーにかけること及びペプチド生産物を含んでいるフラクションを回収すること;及び
(c)工程(b)の上記フラクションをカチオン交換クロマトグラフィーにかけること;及び
(d)その後にペプチド生産物を含んでいるフラクションを回収すること;
を含む、請求項6から8のいずれか一項記載の方法。 - (a)上記宿主細胞がC末端グリシンを有するペプチド生産物を発現し;且つ
(b)上記ペプチド生産物がC末端グリシンをアミノ基に換えることによってアミド化ペプチドに変換される;
請求項7記載の方法。 - 上記ペプチド生産物が、
(a)ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ、又はペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼの存在中で酸素及び還元剤と上記ペプチド生産物とを接触することによって反応混合物を形成すること;
(b)もし工程(a)でペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを使用しないなら、及びもしその反応混合物がそれまでに塩基性でないなら、それのpHが塩基性となるまで該反応混合物のpHを増加すること;及び
(c)上記反応混合物から上記アミド化ペプチドを回収すること;
によってアミド化ペプチドに変換される、請求項10記載の方法。
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