JP2608870B2 - 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造 - Google Patents

組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆの製造

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の目的 本発明は組換えDNA技術による、種々の形のヒトIGF
（インシユリン様成長因子）の製造法に関する。特に本
発明は、組換えDNA変換宿主生物中での発現、プロセシ
ング（加工、または加工処理）および分泌による、成熟
蛋白質生成物としてのヒトIGFの製造法を提供するもの
である。即ち本発明は、種々の形のヒトIGFの生産、分
離および用途、およびそれを製造するための、関連する
組換えDNA技術を提供するものである。更に、本発明は
関連する蛋白質、ヒトEGF（外皮成長因子）の類似の製
造法に関するものでもある。
本発明は、一部には、組換え宿主生物によつて、個別
に、成熟蛋白質の形で、ヒトIGFを製造することができ
る新規な系を発見したことに基づいている。これは、少
なくとも一部の酵母α因子信号（シグナル）配列と融合
したヒトIGFのアミノ酸配列を発現し、その信号配列を
プロセシングし、成熟ヒトIGF蛋白質を、宿主生物を扶
養している培地中に分泌することができる発現系（これ
は本発明の１態様である）によつて達成された。即ち、
この本発明の新規な態様は、初めて、ヒトIGFを個別
の、成熟蛋白質として製造、分離および利用を可能なら
しめるものと考えられる。しかし本発明は、その広い範
囲の意味に於いて、細菌と細胞培養を含む他の組換え系
でヒトIGFのアミノ酸配列を調製することを含み、従つ
て、成熟ヒトIGFのみならず、必須成分としてIGFのアミ
ノ酸配列を含有している融合生産物誘導体を提供するヒ
トIGF DNA配列の発現を含んでいる。この様な生産物
は、生物学的に活性であることがわかり、従つて、所期
の目的に有用である。
本発明の背景を説明し、またある場合には、より詳細
な内容を紹介するために各種の文献を引用したが、それ
らは、それぞれアルフアベツトまたは数字で表わし、そ
れらの記号を添えて本明細書の末尾にまとめた。
本発明の背景 A.ヒトIGF（インシユリン様成長因子） 過去の研究者達にとつて、ヒトIGFは熱心な研究対象
であつた。この蛋白質または一連の蛋白質を種々の面か
ら研究した多数の文献が発表されている（文献Ａ〜Ｌ参
照）。
インシユリン様成長因子ＩおよびIIは、ヒト血清から
単離された（文献Ａ）。「インシユリン様成長因子」と
いう用語またはIGFは、インシユリン様作用および多く
の細胞に対して有糸分裂促進剤として作用するこれらの
ポリペプチド類のインシユリン様構造を表わすのに選ば
れた。IGF−ＩおよびIGF−IIの安全なアミノ酸配列は決
定されている（文献Ｄ、Ｅ）。これらは共に１本鎖ポリ
ペプチドで、３つのジスルフイド橋を持つており、それ
ぞれヒトインシユリンＡ鎖およびＢ鎖に49および47％の
配列同一性を有している。連結ペプチドまたはＣ領域
は、プロインシユリンのそれよりも極めて短かく、それ
と有意な相同性を持つていない（IGFの生物学的作用に
関する初期の研究についての総論は文献Ｆ参照のこ
と）。
IGF−ＩおよびIGF−IIは、ヒト血清およびヒト脳背髄
液に存在する成長促進ポリペプチドである。その構造は
プロインシユリンとホモローガス（相同）である。IGF
−Ｉは、特異なIGF結合蛋白質とともに肝臓で生産され
る様であり、この両者は、成長ホルモンの支配下にあ
る。即ち、ヒトIGFは、ヒト成長ホルモンの作用を媒介
する活性な成長促進分子であると考えられている。
成長因子として人類に適用される高品質のヒトIGF
は、必要なだけ多量に提供するには、組換えDNAおよび
関連技術を応用するのが最も効果的であることがわかつ
た。目標とする所は、宿主生物から、組換えDNA技術の
産物として、生物学的に活性な融合蛋白質として、ある
いは、より重要なことであるが成熟蛋白質として、ヒト
IGFを生産することであつた。この様な物質は、生物活
性を示し、各種の成長に影響のある症状の治療に臨床応
用が可能であろう。
B.組換えDNA技術 組換えDNA技術は、一応成熟期に達したと言える。分
子生物学者は、各種のDNA配列をある程度容易に組換
え、形質転換された微生物および細胞培養株中で多量の
外来性蛋白質産物を生産し得る新しいDNA体をつくるこ
とができる。一般的な手技手法は、各種のDNAの平滑末
端あるいは粘着末端フラグメントをインビトロで結合さ
せ、特定の生物に形質転換するのに有用な強力な発現媒
体（ビヒクル）を調製し、所望の外来性産物を効率的に
合成させることである。しかし、産物によつては、それ
を生産する方法は依然として回りくどいものであり、常
に成功を予見し得る程には、この科学は進歩していな
い。事実、基礎的な実験に基づくことなく、成功すると
予想する者は、著しい実施不能の危険をおかしてそうす
るのである。
主要な要素、即ち複製起源、１種またはそれ以上の表
現型選択特性、発現プロモーター、外来性遺伝子の挿入
および残留ベクターのDNA組換えは、通常宿主細胞の外
で行なう。得られた組換え複製可能発現ビヒクルまたは
プラスミドを形質転換によつて細胞に導入し、その形質
転換体を増殖させることによつて多量の組換えビヒクル
を得る。暗号化されているDNA情報の転写および翻訳を
支配している部分に関して適切な位置にこの遺伝子が挿
入された場合は、この得られた発現ビヒクルは、挿入さ
れた遺伝子が暗号化しているポリペプチド配列を生産す
るのに有用である。この過程は発現と呼ばれる。要すれ
ば宿主細胞を溶解させ、他の蛋白質から分離精製して生
産物を回収することができる。
実際には、組換えDNA技術を使つて全て外来性のペプ
チドを発現させることができ（いわゆる直接発現）、あ
るいはまた、ホモローガス（同種の）ポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス（異種の）
のポリペプチドを発現させることもできる。後者の場
合、目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂され
るまで、融合したホモローガス／ヘテロローガスポリペ
プチド内で不活性化されていることがある（文献Ｍおよ
びＮ参照）。
同様に、遺伝および細胞生理を研究するための細胞培
養または組換培養の技術も非常に進歩している。単離し
た正常細胞から、続々と継代（移植）して調製した耐久
セルラインを保持する手技手法を使用することができ
る。研究に使用するには、この様なセルラインは液体培
地中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄養物を
含んでいる懸濁液中で発育させて保持する。大量生産の
ためのスケールアツプには機械的な問題があるだけであ
る。その他の背景については文献ＯおよびＰ参照。
同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は有用
な、実は必要な補助学問である。所望の蛋白質を生産す
る細胞は、何百という他の蛋白質、細胞代謝の内性産物
をも生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の蛋白質か
ら分離しておかないと、他の化合物と同様、所望の蛋白
質による治療過程でヒトや動物に投与されると毒性を現
わすことがある。従つて、当面の特定の系に適した分離
法を計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生産
物を得るのに蛋白質生化学の技術が必要となつてくる。
蛋白質生化学はまた、所望の生産物の同定に、そしてそ
れを特性化して、細胞が確実に、変化したり変異するこ
となく、忠実にそれを生産したことを確めるのにも必要
である。この科学分野は更に、バイオアツセイや安定性
試験を計画したり、臨床試験やマーケテイングを行なう
前にやらなければならないその他の手続きにも関係して
いる。
本発明の要約 本発明は、組換えDNA技術により、市場に出すまでに
必要な動物実験および臨床実験を行なうのに十分な量の
ヒトIGF、関連する蛋白質、ヒトEGFを、好ましくは直接
の形で生産することができることを発見したことに基づ
いている。この生産物、ヒトIGFおよびEGFは、本発明に
よつて生産されるあらゆる形に於いて、ヒトの成長に関
連する種々の症状または疾患の予防または治療に使用す
ることができる。従つて、本発明の目的の１つは、本発
明の方法および手段によつて製造されるヒトIGFまたは
ヒトEGF、またはそれらの適当な医薬組成物を使つて、
ヒトの患者の成長状態を処置する方法を提供するもので
ある。
更に本発明の目的は、組換え宿主生物内に於ける発
現、加工、および分泌の生産物としての実質的に純粋
な、成熟ヒトIGFを提供することである。このヒトIGF
は、この物質を製造するのに使用され得る発現系由来の
Ｎ−末端アミノ酸配列を伴なつていない。即ち、本発明
はIGFのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造に関す
るものであるが、その特徴とする所は、成熟ヒトIGFを
直接、使用した組換え宿主生物の培地内に生産させるこ
とである。本発明はまた、ヒトIGFおよびヒトEGFを暗号
化している遺伝子配列を発現可能な形で担持している複
製可能なDNA発現ビヒクル、この様なビヒクルで形質転
換された微生物株または細胞培養、およびヒトIGFおよ
びヒトEGFのアミノ酸配列を生産し得るその様な形質転
換体の微生物あるいは細胞培養を提供するものである。
更に本発明は、この様な遺伝子配列、DNA発現ビヒク
ル、微生物および細胞培養、並びにそれらの特定の態様
を調製するのに有用な各種の方法を提供するものであ
る。更に本発明は、その様な微生物および細胞培養の醗
酵培養の製造法を提供するものである。
以下に図面について説明する。
第１図はヒトIGF−１のための発現ベクターの組み立
てに使用される化学的に合成されたDNA鎖を表わしてい
る。1L、2L、3Lおよび4Lはそれぞれ43、46、43および46
量体、1R、2R、3Rおよび4Rはそれぞれ46、54、46および
46量体である。
第２図は第１図のDNAから完成された２本鎖DNAを表わ
している（DNAポリメラーゼＩ合成２本鎖DNA）。
第３図は、EcoR IおよびPst IおよびBamH Iで制限酵
素切断（restriction）した後の第２図のDNAのフラグメ
ントを示している。
第４図は、左半分のIGF−Ｉ組み立てにおける、第３
図のパーツ１およびパーツ２のpBR322へのライゲーシヨ
ンを示している（EcoR I−BamH I pBR322＋パーツ１＋
パーツ２のスリー．パーツ・ライゲーシヨン）。
第５図は、IGF−Ｉの右半分のパーツ３および４を示
している。
第６図は、IGF−Ｉ組み立てに於ける、第５図のパー
ツ３および４の、第４図のベクターへのライゲーシヨン
を表わしている（IGF−I LH322＋パーツ３＋パーツ４の
スリー・パーツ・ライゲーシヨン）。
第７図は、DNA配列およびIGF−Ｉを含有している推定
の融合蛋白質の配列を示している。翻訳分子量＝28671.
51、下線部分＝成熟ヒトIGF−１、箱で囲つた部分＝コ
ラゲナーゼ認識部位。
第８図は、DNA配列およびIGF−Ｉを含有している推定
の短い融合蛋白質の配列を示している（SLE−IGF−１融
合蛋白質）。下線部分＝成熟ヒトIGF−１、箱で囲つた
部分＝コラゲナーゼ認識部位。
第９図は本発明の組み立てに使用されるプラスミドで
ある。
第10図は、α因子プレ−プロ配列と融合したIGF−Ｉ
の、DNAおよび蛋白質配列を示している（酵母プレプロ
α因子−IGF−Ｉ）。下線部分＝成熟ヒトIGF−１、箱で
囲つた部分＝コラゲナーゼ認識部位。
第11図は、IGF−Ｉと融合した、α因子プロモーター
およびプレ−プロ配列を含有しているベクターである。
第12図は、IGF−Ｉと融合した酵母インベルターゼ信
号（シグナル）を示している（酵母インベルターゼ信号
−IGF−１蛋白質）。下線部分＝成熟ヒトIGF−１。
第13図は酵母PGKプロモーターを含有している親プラ
スミドである（YEp1PT Small）。
第14図は、PGKプロモーター、インベルターゼ信号お
よびヒトIGF−Ｉ遺伝子を含んでいる酵母発現ベクター
である（YEp1PT Small P.I.PGKプロモーター）。
第15図は成熟ヒトEGFの暗号配列を組み立てるのに使
用される合成DNAである。
第16図は、ヒトEGF暗号配列と融合した酵母α因子
「プレ−プロ」配列を示している。
第17図は、ヒトEGF暗号配列と融合した酵母インベル
ターゼ信号配列を示している。
第18図はヒトIGF−IIの暗号配列である。
詳細な説明 A.定義 「ヒトIGF」および「ヒトEGF」は、微生物または細胞
培養系によつて生産されるヒトのインシユリン様成長因
子およびヒトの表皮性成長因子であり、生物活性形は、
ヒトの組織由来のヒトのIGFおよびヒトのEGFに相当する
アミノ酸配列を含んでいる。本発明に於いて生産された
ヒトIGFおよびEGF蛋白質は、DNA、遺伝子および推論的
なアミノ酸配列決定によつて明らかにされた。全配列に
おけるアミノ酸の違い、あるいはその様な配列の１若し
くはそれ以上のアミノ酸の欠落、置換、挿入、逆位、ま
たは付加によつて例示される様に、天然に対立遺伝子変
異が存在し、かつ個体から個体へと起るので、本発明は
これらの２つの分子の対立遺伝子変異体の全てを含むも
のと解釈されるべきである。更に、グリコシル化の位置
およびその程度は、用いた組換え宿主生物の種類によつ
て異なるので、その様にして起こり得る変異体も本発明
の範囲に含まれる。最後に、DNA技術を使つて、この様
な分子の基本的な遺伝子配列を簡単に修飾することによ
つてヒトIGFおよびヒトEGFの各種の誘導体を製造する可
能性もある。この様な修飾は、実施例の様に、基本的DN
Aの部位指向性突然変異誘発によつて達成することがで
きた。ヒトIGFおよびヒトEGFの誘導体を生成させるこの
様な修飾は全て、必須の特徴的なヒトIGFおよびヒトEGF
活性が影響を受けずに残つている限り、本発明の範囲に
含まれる。
本発明によつて生産されたヒトIGFまたはヒトEGFの状
態を表わすのに使用される「実質的に純粋な形」という
用語は、非組換え細胞によつて、即ち、その天然の環境
で生産されるヒトIGFまたはヒトEGFに通常随伴している
蛋白質またはその他の物質を含んでいないことをいう。
「発現ベクター」とは、DNA配列が、その発現に影響
を与え得るベクター内の他の配列、即ちプロモーター／
オペレーター配列に作働可能な様に結合された場合、そ
のベクターに含まれるそのDNA配列を発現することがで
きるベクターを意味する。結局、「発現ベクター」と
は、機能的な定義である：特定のDNA暗号を発現するこ
とができるDNA配列は全てここに配置される。通常、組
み換えDNA技術に使用される発現ベクターはプラスミド
の形であることが多い。このプラスミドは、ベクターの
形に於いては染色体に結合していない環状の２本鎖DNA
ループのことをいう。プラスミドは、ベクターの最も普
通に用いられる形であるので、本明細書に於いては、プ
ラスミドとベクターを交換可能な用語として用いる。し
かし本発明に於いては、同じ機能を有す、当技術分野で
知られている、あるいは今後知られ得る他の形の発現ベ
クターも含まれると解釈すべきである。
本明細書に於いて「組換え宿主細胞」とは、この様な
ベクターで形質転換された細胞を意味する。従つて、こ
の様な細胞によつて生産されるヒトIGFおよびヒトEGF分
子は、「組換えヒトIGF」および「組換えヒトEGF」と呼
ぶことができる。
B.宿主細胞培養およびベクター 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の
真核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することが
できる。
勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み立て
るに際し、DNA配列をクローニングするのに原核生物が
好ましい。特にE.coli K12株294（ATCC No.31446）が特
に好ましい。使用し得るその他の微生物株として、E.co
li B、E.coli X1776（ATCC No.31537）などのE.coli株
が含まれる。上記の株、E.coli W3110（F-,λ-,原栄養
体、ATCC No.27325）、Bacillus subtilisの様な桿菌、
Salmonella typhimuriumまたはSerratia marcesanの様
なその他の腸内細菌、および各種のシユードモナスも使
用することができる。これらは限定する意味で挙げたの
ではなく、単なる例示に過ぎないことは言うまでもな
い。
一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細胞と適
合し得る種由来のレプリコンおよび調節配列を含んでい
るプラスミドベクターが使用される。このベクターはも
ともと、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を
付与することのできる標識化配列と共に複製部位を持つ
ている。例えば、E.coliは、E.coli種由来のpBR322を使
つて形質転換される（Bolivarら、Gene2:95（197
7））。pBR322はアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性のための遺伝子を含んでおり、従つて、これは形質
転換細胞を同定するための簡単な手段となる。このpBR3
22プラスミドやその他の微生物プラスミドは、その微生
物がそれ自身の蛋白質を発現するのに使用することので
きるプロモーターを含んでいなければならず、あるいは
含む様に改良されなくてはならない。組換えDNAの組み
立てに通常用いられるプロモーターにはβ−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系
（Changら、Nature275:615（1978）;Itakuraら、Scienc
e198:1056（1977）;Goeddelら、Nature281:544（1979）
およびトリプトフアン（trp）プロモーター系（Goeddel
ら、Nucleic Acids Res.8:4057（1980）;EPO Appl Publ
No.0036776）がある。これらが最も普通に用いられて
いるが、その他の微生物プロモーターも発見され、使用
されており、それらのヌクレオチド配列は詳細に発表さ
れているので、当業者であれば、それらをプラスミドベ
クターに機能的に結合させることができる（Siebenlist
ら、Cell 20:269（1980））。
原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物も使用
することができる。Saccharomyces cerevisiae、普通の
パン酵母は、真核微生物中最もよく使用されるものであ
るが、その他の多くの株も使用される。Saccharomyces
中で発現させるには、例えばプラスミドYRp7（Stinchco
mbら、Nature 282:39（1979）;Kingsmanら、Gene ７:14
1（1979）;Tschemperら、Gene 10:157（1980）がよく用
いられる。このプラスミドは、トリプトフアンを生産す
る能力を欠いている酵母の突然変異株、例えばATCC No.
44076またはPEP4−１（Jones,Genetics 85:12（197
7））にとつて選択マーカーとなるtrp 1遺伝子をもとも
と含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのtrp
1損傷が存在することは、トリプトフアンの非存在下に
発育させることによつて形質転換体を検出する有効な環
境を提供することになる。
酵母ベクター中の適切な促進（promoting）配列に
は、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら、J.
Biol.Chem.255:2073（1980））または他の解糖酵素（He
ssら、J.Adv.Enzyme Reg.7:149（1968）;Hollandら、Bi
ochemistry 17:4900（1978））、例えばエノラーゼ、グ
リセルアルデヒド−３−ホスフエートデヒドロゲナー
ゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、
ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフエー
トイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピ
ルベートキナーゼ、トリオースホスフエートイソメラー
ゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナー
ゼなどのプロモーターが含まれる。好適な発現プラスミ
ドを組み立てるに際し、これらの遺伝子の終了（termin
ation）配列もまた、発現ベクターに、発現しようとす
る配列の３′に結合させてmRNAのポリアデニル化および
終了を提供する。発育条件によつてコントロールされ
る、もう１つの転写における有利性を持つた他のプロモ
ーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトク
ロームＣ、酸性ホスフアターゼ、窒素の代謝に関与する
分解酵素、上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフエー
トデヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクト
ース利用に関与する酵素（Holland、前記）などのプロ
モーター領域である。酵母に適合するプロモーター、複
製起源および終了配列を含んでいる全てのプラスミドベ
クターが適している。
微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として
使用することができる。原則として、脊椎動物および無
脊椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。しかし、脊
椎動物細胞が最も興味があり、脊椎動物細胞の培養増殖
（組織培養）が最近では常套手段となつて来た（Tissue
Culture,Academic Press,KruseおよびPatteron,editor
s（1973））。この様な有用な宿主細胞系の例は、VERO
およびHeLa細胞、チヤイニーズ・ハムスター卵巣（CH
O）細胞系、W138、BHK、COS−７およびMDCK細胞系など
である。この様な細胞の発現ベクターは、通常、（要す
れば）複製起源、発現しようとする遺伝子の前に位置す
るプロモーター、必要なリボソーム結合部位、RNA組み
継ぎ（スプライス）部位、ポリアデニル化部位、転写終
了配列などを含んでいる。
哺乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上の調節
機能はウイルスから提供されることが多い。例えば、通
常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイ
ルス２から誘導され、シミアンウイルス40（SV40）から
導かれることが最も多い。古い、そして新しいSV40ウイ
ルスのプロモーターは、共にこのウイルスから、SV40ウ
イルスの複製起源を含んでいるフラグメントとして簡単
に得られるという理由で特に有用である（Fiersら、Nat
ure 273:113（1978））。Hind IIIサイト（部位）から
ウイルスの複製起源内に存在しているBgl Iサイトに至
る約250bp配列を含んでいるならば、それより小さいあ
るいは大きいSV40フラグメントも使用することができ
る。更に、所望の遺伝子配列と正常通り結合しているプ
ロモーターまたは調節配列を、この様な調節配列が宿主
細胞に適合する限り、使用することができ、またそれが
好ましいことが多い。
複製起源は、SV40または他のウイルス（例えばポリオ
ーマ、アデノ、VSV、BPVなど）が誘導される様に、外来
性の起源を含む様にベクターを組み立てることにより、
あるいは宿主細胞の染色体の複製機構により提供するこ
とができる。このベクターが宿主細胞染色体に組み込ま
れたら、後者は十分であることが多い。
C.方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞として使
用する場合は、Grahamらの燐酸カルシウム沈澱法（Grah
amおよびVan der Eb,Virology 52:546（1978））によつ
てトランスフエクシヨンを行なう。しかし、核注入また
はプロトプラスト融合などの、DNAを細胞に導入する他
の方法も使用することができる。
原核細胞または実質的な細胞壁構造を持つた細胞を使
用する場合、好ましいトランスフエクシヨンの方法は、
Cohenらの塩化カルシウムを用いたカルシウム処理であ
る（Cohen,F.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,69:21
10（1972））。
所望の暗号配列および調節配列（control sequence）
を含んでいる好適なベクターを組み立てるには標準的な
結合技術を用いる。分離したプラスミドまたはDNAフラ
グメントを開裂し、修復（テイラー）し、所望のプラス
ミドを形成する様に、希望の形に再結合する。
開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理することに
より行なう。通常、約１μｇのプラスミドまたはDNAフ
ラグメント、約20μの緩衝液、約１単位の酵素を使用
する（特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および基質
の量は製造業者が指定している）。37℃で約１時間イン
キユベートする。インキユベートした後、フエノールお
よびクロロホルムで抽出した蛋白質を除き、水性分画か
らエタノールで沈澱させて核酸を回収する。
平滑末端が必要な場合は、ポリメラーゼＩ（Klenow）
10単位で、15℃で15分間処理し、フエノール−クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈澱に付す。
開裂したフラグメントの大きさによる分離は、Goeddl
eらの方法（Goeddel,Dら、Nucleic Acids Res.8:4057
（1980））に従い、６％ポリアクリルアミドゲルを使つ
て行なう。
結合（ライゲーシヨン）には、正しく符号する様に末
端を適当に修復したほぼ等モル量の所望の成分を、DNA
0.5μｇ当たり約10単位のT4DNAリガーゼを用いて処理す
る（開裂したベクターを成分として用いる場合は、細菌
性アルカリ性ホスフアターゼで予め処理して開裂したベ
クターの再結合を防ぐのがよい）。
組み立てたプラスミド中の正しい配列を確認するため
の分析には、ライゲーシヨン混合物を使つてE.coli K12
株294（ATCC31446）を形質転換し、適切な場合はアンピ
シリン耐性によつて、成功した形質転換体を選択する。
形質転換体からプラスミドを調製し、Messingらの方法
（Nucleic Acids Res.,9:309（1981））またはMaxamら
の方法（Methods in Enzymology,65:499（1980））によ
つて制限および／または配列化によつて分析する。
実施例 以下に本発明の実施例を示すが、これは本発明を例示
するためのものであつて、これによつて本発明を限定す
るものと解釈してはならない。
ヒトIGF−１の合成および発現 酵素は以下の供給源から入手した。
New England Biolabs:制限酵素、T4DNAリガーゼ。
Bethesda Research Labs:制限酵素、細菌性アルカリホ
スフアターゼ。
Boehringer−Mannheim:E.coli DNAポリメラーゼＩ（Kle
now）。
Ｐ＋L Biochemicals:ポリヌクレオチドキナーゼ、ター
ミナルヌクレオチジルトランスフエラーゼ。
New England Nuclear:pBR322〔オリゴ（dG）−尾部化〕
DNA 試薬 BioRad:ビス・アクリルアミド、アクリルアミド、TME
D。
Sigma:アンモニウムパーサルフエート。
Amersham:10218γ32P ATP＞5000Ci/ミリモル;10165γ32
P dCTP＞400Ci/ミリモル。
Solution and Media:1×TBE:.54Mトリス塩基、0.54Mホ
ウ酸、.017M Na2EDTA。
Difco:酵母含窒素塩基（YNB）；トリプトン、酵母抽出
物;Bacto−Agar;カザミノ酸。
オートラジオグラフイー:Kodak X−Omat AR XAR−２フ
イルム。
ガラスビーズ:0.45−0.50mM B.Braun Melsungen AG。
LB培地（１当たり）:NaCl10g、酵母エキス5g、トリプ
トン10g、NaOH（50％）.17ml。
LB寒天（１当たり）：トリプトン10g、酵母エキス5
g、NaCl.5g、Bacto−Agar15g、NaOHでpH7.5に調節。
抗生物質：全ての培地にテトラサイクリン（５μg/m
l）；全ての培地にアンピシリン（20μg/ml）（平板ま
たは液体）。
Mg培地（１当たり）:Na2HPO4（無水）6g;NH4Cl1g;KH2
PO43g;NaCl.5g;MgSO41mM;0.5％（w/v）グルコース;0.5
％（w/v）カザミノ酸;.0001％チアミン−HCl。
YNB−CAA（１当たり）：酵母含窒素塩基（アミノ酸な
し）6.7g;アデニン10mg;ウラシル10mg;カザミノ酸5g;グ
ルコース20g。
YNB−CAA寒天平板（１当たり）:YNB−CAA＋寒天30g。
標準的ライゲーシヨン条件：ベクターに対し10倍モル過
剰の挿入体（またはリンカー）。１×T4DNAリカーゼ緩
衝液および400−800UT4DNAリガーゼ;14゜−12−16時
間。
標準的キネーシヨン（Kination）条件:1×ポリヌクレオ
チドキナーゼ緩衝液;15Uポリヌクレオチドキナーゼ;37
゜、60分；次いで65゜で10分間加熱して反応終結。
１×キナーゼ緩衝液:70mMトリス−HCl（pH7.6）;10mM M
gCl2;5mM DTT。
１×T4DNAリガーゼ緩衝液:50mMトリス−HCl（pH7.8）;1
0mM MgCl2;20mM DTT;1mM rATP。
DNA配列の組み立て、方法（Strategy）および選択 ヒトIGF−１分子の１゜蛋白質構造は決定されている
（１）。この蛋白質の配列および遺伝暗号に基いて、成
熟ヒトIGF−１蛋白質を暗号化しているDNA配列（全ての
塩基位置に於ける全ての可能な塩基置換体を含む）をコ
ンピユーター分析（Genetech Untrans Program）によつ
て決定した。制限部位分析プログラム（Genemtech Asea
rch Program）を使用して、同じ蛋白質を一貫して暗号
化している全ての可能なDNA配列内に存在している。可
能性のある全ゆる制限部位が見つけられた。この暗号配
列内の３つの部位、即ちPst I、BamH IおよびAva IIを
選んだ。更に２つの部位が、両末端、成熟蛋白質の暗号
配列の丁度外側に置かれた:1つは開始コドン、AUGの前
のEcoR I部位、もう１つは暗号配列の終止コドン、TAG
に続くSal I部位である、これらの部位の選択により、
暗号配列を別々のパーツ（一部分）にしてクローニング
することができ、次いでそれらをそれぞれ切り取つて集
め、完全なIGF−１遺伝子を作成することができた。こ
の組み立ては、左半分を形成している２つのパーツ、右
半分を形成している２つのパーツ、の４つのパーツを集
めて組み立てることであつた。各パーツは、化学的に合
成したDNAの２本鎖で構成されている（第１図）。提案
された合成フラグメントはまた、内部相補性について分
析された。
これらの４つのパーツを生成させるのに使用した組み
立てには、その３′末端に９−10bpの長さの相補配列を
持つた合成オリゴヌクレオチド基質のDNAポリメラーゼ
Ｉ修復合成を用いた。DNAポリメラーゼＩ（Klenow）お
よび４つのデオキシヌクレオシド・トリホスフエートの
存在下で、これらのプライマー−鋳型は伸長されて全長
２本鎖DNAとなつた。所望の部分以外の場所でのプライ
ミング、および自己−ハイブリダイゼーシヨンを避ける
ために、各セツトの１本鎖DNA群をコンピユータープロ
グラム（Genentech Homology Pragram）によつて分析
し、可能な限り、ヘアピンループ、自己−プライミング
またはミス−プライミングを起す可能性のある配列を除
去して別のコドンで置き換えた。これらの４つの２本鎖
DNAのそれぞれは、IGF−１を暗号化していないDNAの９
−12bpを、さらに、各末端に含んでいる（第２図参
照）。この追加のDNAは、制限酵素消化によつて粘着末
端を生成できるようにする為に含ませた。この様にして
生成した粘着末端により、その２本鎖片を、合成遺伝子
の隣接する暗号断片あるいはクローニングビヒクルにラ
イゲーシヨンすることができる。
各部分の末端の制限部位の先にある２本鎖DNAの追加
の９−12bp（第２図）により、TdT媒介によって、各２
本鎖DNA断片の３′末端に１本鎖のオリゴデオキシシチ
ジン鎖を形成させることができた。これらのオリゴデオ
キシシチジンを尾部とする２本鎖DNAを相補的なオリゴ
デオキシグアノシンを尾部とする、クローニングビヒク
ルのPst I部位にアニーリングすることができた。クロ
ーンし、配列を決定して正しい塩基配列を確認したら、
その部分を、その４つのパーツのそれぞれの末端で選択
された制限部位を制限酵素で開裂した後、容易に単離
し、結合させることができ、完全な合成IGF−１遺伝子
を形成させることができた。
本発明に於いて使用し、成功した方法は、Rossiらの
方法（文献28）に類似している。しかし、制限酵素認識
部位の先の僅か２つの過剰DNAの塩基対を使用するRossi
らの方法でIGF−１暗号配列を組み立て、クローニング
する試みは、繰返し失敗に終つた。本発明に於いて採用
した方法は、また、次の点でRossiらの方法と異なつて
いる：即ち、２本鎖DNAの両末端に置いた制限部位によ
り、スリー・パート・ライゲーシヨンより２本鎖DNAの
要求量が少ない方法、（dc）−尾部化および（dG）−尾
部化ベクターへのアニーリングにより、各２本鎖DNAフ
ラグメントをそれぞれクローニングするのに便利であ
る。
化学合成 CreaおよびHornの方法（文献２）により、長さが43、
43、46、46、46、46、54および46塩基の８つのフラグメ
ントを化学合成した。ただし、縮合剤として、2,4,6−
トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド・テトラ
ゾールの代りにメシチレンニトロトリアゾールを使用し
た。
フラグメントの合成は、適当な固形担体（セルロー
ス）に、適当な完全に保護されたダイマーまたはトリマ
ーブロツクを順次添加していくことにより行なつた。サ
イクルは、オリゴチミジン酸の合成について記載された
もの（Creaら、上記）と同じ条件で行なつた。最終的な
ポリマーを塩基（濃アンモニア水）および酸（80％HOA
c）で処理し、ポリマーをペレツト化し、上清を蒸発乾
固した。残渣を４％アンモニア水に溶かし、エチルエス
テルで３回洗い、完全に脱保護されたフラグメントの分
類に使用した。
20％ポリアクリルアミドゲルを使つて電気泳動法によ
り精製した。純化したオリゴヌクレオチドはゲル溶出の
後エタノール沈澱にかけた。
dCTPは例外であるが、最終濃度200μＭのデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフエートの存在下、225−285ピ
コモルの各化学合成フラグメントを当量の相補性１本鎖
DNAフラグメントと混合した（即ち、1L＋3L;2L＋4L;1R
＋3R;2R＋4R）。dCTPは、比活性1000−2000Ci/ミリモル
のα32P−標識アイソトープとして５μＭの濃度で加
え、修復合成反応生成物のモニターが容易に行なえる様
にした。この反応は、最終濃度50mMのトリスHCl（pH7.
5）、20mMのMgCl2、20mMのDTTおよび154DNAポリメラー
ゼＩ（Klenow）を含む緩衝液中、反応容量200μで行
なつた。反応は４℃で12−18時間行なつた。
反応終了後、EDTAを25mMの濃度で加えた。混合物を含
む試料緩衝液をフエノール抽出、クロロホルムで２回抽
出し、生成物をエタノール沈澱に付した。ペレツトを.3
M NaOAcにとり、DNAをエタノールで沈澱させた。このペ
レツトを水に溶解した後、1L＋3Lおよび2L＋4L生成物を
別々に、１×Pst I緩衝液（50mM（NH4）2SO4、20mMトリ
スHCl（pH7.5）、10mM MgCl2）および70U Pst Iを含ん
でいる反応ミツクス100μ中、Pst Iで消化した。４時
間後、EDTAを10mMの濃度になる様に加え、エタノール沈
澱にかけた。ペレツトを.3M NaOAcにとつて再沈澱さ
せ、次いで水に入れた。Pst I−消化した1L＋3L生成物
を100μの反応ミツクス１×EcoR I緩衝液（150mM NaC
l、6mMトリスHCl（pH7.5）、6mM MgCl2）および70U Eco
R I中、37℃でEcoR I消化した。Pst I消化2L＋4L生成物
は、１×BamH I緩衝液（150mM NaCl、6mMトリスHCl（pH
7.9）、6mM MgCl2）および70U BamH Iの反応ミツクス10
0μ中、37℃でBamH I消化した。４時間後、EDTAを両
混合物に加え、試料緩衝液を加えた。それらを６％ポリ
アクリルアミド平板ゲル電気泳動にかけた。６％平板ゲ
ルは６％（w/v）アクリルアミド（アクリルアミド対ビ
スアクリルアミドが20対１）１×TBE、１％APSおよび0.
1％TEMEDを含む混合物に流し込んで調製した。反応生成
物をオートラジオグラフイーにより、ゲル上で位置づ
け、45bp EcoR I−Pst I消化1L＋3L生成物（パーツ１）
（第３図参照）に相当する帯（バンド）および50bp Pst
I−BamH I消化2L＋4L生成物（パーツ２）（第３図参
照）をゲルから切り取り、物質を0.2×TBEに電気溶出
し、フエノール抽出し、クロロホルム抽出した後エタノ
ール沈澱にかけた。次いでパーツ１および２を水に溶解
した。
クローニングベクターの調製 クローニングベクターは、１×RI緩衝液中、pBR322
（文献15）20μｇを50U EcoR Iおよび50U BamH Iで、37
℃で６時間消化することにより調製した。EDTAを10mMの
濃度になる様添加した後、試料緩衝液を加え、この混合
物を５％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。５μ
g/mlのEt.ブロミドを含有する水中で10′染色して着色
し、水で２回洗浄し、UV徹照装置（302nM）の上に置い
た。約3712bpのEcoR I−BamH I消化pBR322分子に相当す
る帯をゲルから切り取つた。このゲル片からDNAを電気
溶出し、フエノール抽出し、クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈澱にかけた。ペレツトを水に溶かし、
ライゲーシヨンに備えた。
ライゲーシヨン ライゲーシヨン反応において挿入体とベクターのモル
比がほぼ10対１であるスリー・パート・ライゲーシヨン
（第４図参照）において、パーツ１および２を、１×T4
DNAリガーゼ緩衝液（50mMトリスHCl（pH7.8）、10mM Mg
Cl2、20mM DTT、1mM rATP）および〜800U T4DNAリガー
ゼ（NEB）中、EcoR I−BamH I消化322ベクターに結合さ
せた。この反応は14゜で12−16時間行なつた。
形質転換 形質転換宿主としてE.coli株294を使用し、M.Dagert
およびS.D.Ehrlich（文献３）の方法を用いて行なつ
た。形質転換細胞をアンピシリン（20μg/ml）含有LB−
寒天プレート（LB−Amp−プレート）に置き、形質転換
体をスクリーニングし、20μg/mlのアンピシリンを含む
LB培地で増殖させた。BirnboimおよびDoly（文献４）の
迅速ミニスクリーニング法の改良法を用いて形質転換体
をスクリーニングした。この様にして調製した少量の
（miniprep）DNAをEcoR IおよびBamH Iで消化し、ポリ
アクリルアミド平板ゲル上で泳動させた。約218bp EcoR
I−BamH I挿入体を示した数個の形質転換体を多量に増
殖させ、それぞれからプラスミドを分離し、Maxamおよ
びGilbertの方法（文献５）によつて配列を決め、正し
い化学合成および組み立てを確認した。IGF−１の完全
な正しい左半分の配列を含有しているpBR322ベクター
は、IGF−1 LH322と命名された（第５図参照）。
IGF−１の右半分のフラグメントのクローニング DNAポリメラーゼＩ−媒介修復合成の同じ条件で、合
成IGF−１の右半分を含む２個のフラグメント対を２本
鎖DNAに変換した。DNAポリメラーゼＩ反応の後、酵素消
化を行なうことなく、IR＋3R（パーツIII）および2R＋4
R（パーツIV）反応物を６％ポリアクリルアミド平板ゲ
ル上で泳動させた。オートラジオグラフイーにより83bp
（パーツIII）および91bp（パーツIV）帯を位置づけ、
ゲルから切り取つた。電気溶出の後、エタノール沈澱さ
せた２本鎖DNAを、Villa−Komaroffら（文献６）および
RowenKampおよびFirtel（文献７）の方法を使つてdC−
尾部形成した（第６図参照）。この反応は、50μ容量
の１×テイリングミツクス（.2Mカコジル酸カリウム、2
5mMトリスHCl（pH6.9）、2mM DTT、.5mM CoCl2）および
22μm dCTPを用いて行なつた。37゜で10分間予備加温し
た後、10−20単位のターミナルヌクレオチジルトランス
フエラーゼを加えて150秒反応を行ない、EDTAを加えて
反応を終結し、フエノール抽出、クロロホルム抽出し
（２回）、エタノール沈澱にかけた。
これらのオリゴ（dC）尾部化パーツIIIおよびIVを、
別々に、50μの１×アニーリング緩衝液（.1M NaCl、
10mMトリスHCl（pH7.8）、1mM EDTA）中、最終DNA濃度
１−２μg/mlで、当モル量のオリゴ（dG）−尾部化Pst
I切断pBR322ベクターと混合した。75℃に加熱した後、
混合物を16時間で徐々に４℃まで冷却し、この混合物
を、DegertおよびEhrlichの方法（文献３）に従つて、
コンピテントE.coli294細胞に導入した。形質転換細胞
をLB−テトラサイクリン−寒天平板に置き、５μg/mlの
テトラサイクリン濃度のLB−テトラサイクリン培地で増
殖させた。テトラサイクリン耐性の形質転換体をひろい
上げ、LB−アンピシリン−寒天平板にうえつけ、Pst I
部位で挿入されたかどうかを調べた。パーツ３および４
のそれぞれについて数個のテトラサイクリン耐性、アン
ピシリン感受性のコロニーをミニスクリーニングし、Ps
t I部位に於ける挿入を示すものを大規模に増殖させ、M
axamおよびGilbertの技術（文献５）によつて配列を決
定し、パーツ３および４の正しい配列を確認した。
完全な合成HuIGF−１暗号配列の組み立て 調製：パーツ３および４ １×Ava II緩衝液（60mM NaCl、6mMトリス−HCl（pH
8.0）、10mM MgCl2、6mM2−メルカプトエタノール）
中、30UのAva IIを用いて各ベクター20μｇを消化し、
パーツ３および４をそれぞれそのベクターから分離し
た。37℃で６時間後、150μの反応物にEDTAを15mMの
濃度になる様に添加し、フエノール抽出し、クロロホル
ムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。次いでパーツ
３のペレツトを１×BamH I緩衝液にとり、150μの容
量中、30UのBamH Iを用いて37℃で４時間消化した。パ
ーツ４を含んでいるペレツトは、150μの１×Sal I緩
衝液中、30U Sal Iにより37℃で４時間消化した。
両消化物を６％ポリアクリルアミド平板（スラブ）ゲ
ル上で泳動させて染色した。パーツ３に相当する51bp帯
およびパーツ４に相当する62bp帯をゲルから取り出し、
DNAを電気溶出し、フエノール抽出し、クロロホルム抽
出を２回行ない、エタノール沈澱させた。次いでペレツ
トを水に取り、ライゲーシヨン（結合）に備えた。
ベクター調製 20μｇのIGF−1LH322ベクターを、１×BamH I緩衝液
を含む200μの反応系中、50UのBamH Iと50UのSal Iに
より37゜で６時間消化した。EDTAを15mMの濃度に添加し
た後、消化混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上
で泳動し、エチジウムブロミド染色し、3814bp帯をゲル
から切り取つた。
電気溶出、フエノール抽出、クロロホルム抽出および
エタノール沈澱の後、DNAペレツトを水に取り、スリー
・パート・ライゲーシヨンでパーツ３および４と結合さ
せた。この結合は、既述したスリー・パート・ライゲー
シヨンの場合と同じ条件で行なつた（第７図参照）。パ
ーツ３および４は、ライゲーシヨンミツクス中、ベクタ
ーに対して10倍モル過剰量の挿入体の形で存在してい
た。この混合物を、DagertおよびEhrlichの方法（文献
３）によつて調製したコンピテントE.coli294細胞に導
入し、LB−アンピシリン平板上に植えつけた。数個の形
質転換体をミニスクリーニングし、約115bp BamH I−Sa
l Iフラグメントを示す２つのクローンを大量に増殖さ
せ、それらのプラスミドを調製した。完全な合成遺伝子
の両方の鎖の配列をMaxam−Gilberの方法（５）で決定
し、その正しい配列を確認した。ヒトIGF−１を暗号化
している完全な正しい配列を含んでいるこのpBR322プラ
スミドをpBR322HuIGF−１と命名した。
ヒトIGF−１の発現 細菌内でのIGF−１融合発現 初期の試みは融合蛋白質としてIGF−１を発現するこ
とであつた。これを達成する為、pNCV（文献９）および
pNCVsLE（文献10）発現ベクターを使用した。pNCVsLE発
現ベクターはpNCVベクターの誘導体であり、以下の如く
して調製した：即ち、pNCVを.LE融合の13コドンを開裂
するBgl Iで処理した。この部位を合成DNAを使つてEcoR
I開裂部位に変換し、発現ベクターpNCVsLEを得た。こ
のプラスミドに導入した合成DNAは次の配列を持つてお
り、 ５′−GATCCAGAATTC ５′−GATCGAATTCTG この配列をプラスミド： GATCCAGAATTC GTCTTAAGCTAG に導入した。
trp融合蛋白質からヒトIGF−１蛋白質を遊離させる方
法として、Wunschらの酵素的蛋白質分解法（文献８）を
この発現系に適用し得る様に、リンカーを設計した。こ
れを達成する為、以下のDNAリンカー： を標準的方法（文献２）により化学合成した。これは、
trp融合蛋白質およびIGF−１遺伝子に結合されると、IG
F−１の最初の２つのアミノ酸残基であり、プロリンお
よびアラニンが前につくことによつて、一緒になつてCl
ostridium histolyticum（文献11および12）から分離さ
れたコラゲナーゼの認識部位を形成するグリシンおよび
プロリンの前に、アミノ酸残基プロリンおよびアラニン
を暗号化する。この酵素は、この様な部位に作用してア
ラニン−グリシンペプチド結合を開裂するといわれてい
る。
コラゲナーゼ開裂部位を持つた融合蛋白質を暗号化し
ているDNA配列を組み立てる為に、30μｇのpBR322HuIGF
−１プラスミドを、200μの１×BamH I緩衝液中、50U
BamH Iおよび50U Pvu I酵素によつて、37℃で６時間開
裂させた。EDTAを15mMの濃度に加えた後、反応混合物を
６％ポリアクリルアミド平板ゲル上でクロマトグラフイ
ーした。小さい方のPvu I−BamH Iフラグメント（〜725
bp）を分離し、150μの１×Sau96I緩衝液（60mM NaC
l、6mMトリス−HCl（pH7.4）、15mM MgCl2、6mM2−メル
カプトエタノール）中、40UのAva IIで消化した。EDTA
を15mMの濃度で添加した後、得られた混合物を６％ポリ
アクリルアミド平板ゲル上でクロマトグラフイーした。
小さい方のSau96I−BamH Iフラグメント（〜86bp）をゲ
ルから抽出し、フエノール抽出し、クロロホルムで２回
抽出し、エタノール沈澱させた。このフラグメントをラ
イゲーシヨンに用いた。
リンカーフラグメント200ピコモルを、20μの１×
ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（70mMトリス−HCl（p
H7.6）、10mM MgCl2、5mM DTT、1mM rATP）中、37℃で
１時間、100Uのポリヌクレオチドキナーゼで処理した。
65℃で５分間加熱して反応を終結させた。キナーゼ処理
したリンカーフラグメント100ピコモルを、30μの１
×T4DNAリガーゼ緩衝液中、14゜で12−16時間、86bp Sa
u96I−BamH Iフラグメントに結合させた。このライゲー
シヨン反応を、EDTAを15mMの濃度になる様に加えて終了
させ、フエノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、
エタノール沈澱させた。ペレツトを１×BamH I緩衝液に
とり、50UのEcoR Iおよび50UのBamH Iを含む反応液100
μ中、37゜で６時間消化した。EDTAを加えて消化を終
結させ、この混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル
上でクロマトグラフイーし、新たに生成した（〜97bp）
EcoR I−BamH Iフラグメントをゲルから抽出し、ライゲ
ーシヨンに備えた。この新しいフラグメントを受け入れ
るベクターは、200μの１×BamH I緩衝液中、30μｇ
のpBR322HuIGF−１を、それぞれ100UのEcoR IおよびBam
H Iによつて、37゜で８時間消化することによつて調製
した。反応を終了させ、６％ポリアクリルアミド平板ゲ
ル上でクロマトグラフイーし、EcoR I−BamH I消化プラ
スミドに相当する大きい方の帯（〜3830bp）を分離し、
このプラスミドDNAを抽出し、ライゲーシヨンに備え
た。ベクターに対して挿入フラグメント10倍モル過剰量
を含む30μのライゲーシヨン反応物中、EcoR I−BamH
Iフラグメントを、上記の標準的なライゲーシヨン条件
下で、EcoR I−BamH I消化プラスミドpBR322HuIGF−１
に結合させた。既述した様にして（文献３）調製したコ
ンピテントE.coli 294を形質転換用宿主として使用し、
形質転換した細胞をLB−アンピシリン寒天平板上に植え
た。数個の形質転換体を拾い上げ、既述した如く（文献
４）ミニスクリーニングし、EcoR I−BamH I挿入を示す
２個を多量に増殖させ、それらのプラスミドを精製し
た。Maxam−Gilbert法（文献５）を使つて構成物の配列
を決定し、EcoR I−Sau96Iコラーゲナーゼリンカーの合
成および挿入を証明した。このプラスミドはpBR322HuSy
nIGF−１−Ｍと命名した。
pNCVおよびpNCVsLEに挿入するためのこのEcoR I−Sal
I IGF−１暗号配列を調製するために、30μｇのpBR322
HuSynIGF−１−Ｍを200μの１×Sal I緩衝液（150mM
NaCl、6mMトリス−HCl（pH7.9）、6mM MgCl2、6mM2−メ
ルカプトエタノール）中、70UのSal Iを用いて、37゜で
６時間消化した。EDTAを15mMになる様に添加した後、こ
の混合物をフエノール抽出し、クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈澱させた。
標準的な化学合成法（文献２）により、Sal I−EcoR
Iリンカー： ５′ TCGACGTACATG ３′ ３′ GCATGTACTTAA ５′ を合成し、400ピコモルを既述した様にキナーゼ処理し
た。200ピコモルのキナーゼ処理リンカーを、30μの
１×ライゲーシヨン緩衝液中、800UのT4DNAリガーゼを
用いて、Sal I消化pBR322HuSynIGF−１−Ｍ（既述した
様に調製）に、14℃で12−16時間反応させて結合した。
EDTAで反応を終結した後、混合物をフエノール抽出
し、クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させ
た。ペレツトを１×EcoR I緩衝液にとり、容量200μ
中の100U EcoR Iで、37゜で８時間消化した。EDTAを15m
Mの濃度で加えた後、この混合物を６％ポリアクリルア
ミド平板ゲル上でクロマトグラフイーした。このゲルを
染色し、EcoR I−EcoR I HuIGF−１フラグメントに相当
する〜230bp帯をゲルから抽出し、フエノール抽出し、
クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。こ
のフラグメントはpNCVおよびpNCVsLEにライゲーシヨン
し得るものであつた。pNCVおよびpNCVsLEは、200μの
１×EcoR I緩衝液中、それぞれ20μｇを、100UのEcoR I
を用いて、37゜で８時間消化してライゲーシヨンに備え
た。消化後、細菌性アルカリホスフアターゼ200Uを各反
応物に加え、その混合物を65℃で２時間加温した。EDTA
を15mMの濃度となる様に添加し、混合物を３回フエノー
ル抽出し、クロロホルムで２回抽出、次いでエタノール
沈澱させた。これらの発現ベクターをライゲーシヨン用
に調製した。
EcoR I−EcoR IヒトIGF−１フラグメントのこの２つ
の発現ベクターへの結合（ライゲーシヨン）は、１×T4
DNAリガーゼ緩衝液と800UのT4DNAリガーゼの30μ反応
液中、14゜で12〜16時間行なつた。EcoR I−EcoR Iフラ
グメントは、ベクターに対して10倍モル過剰量存在せし
めた。
コンピテントE.coli294を調製し（文献３）（ATCC314
46）、ライゲーシヨンのための形質転換宿主として用い
た。形質転換細胞をテトラサイクリン含有LB−寒天平板
（５μg/ml、LB−Tet−平板）上に植え、形質転換体を
ミニスクリーニングした（文献４）。pNCV−IGF−１構
成物の形質転換体からのミニスクリーンプラスミドDNA
を、Pst IおよびBgl IIの両者で消化し、EcoR Iフラグ
メント挿入の配向性を調べた。そのプラスミドが〜570b
p Bgl II−Pst Iフラグメント（〜690bpフラグメントと
対照的に）を含んでいる２つのクローンを多量に増殖さ
せ、それらのプラズミドを調製した。この構成物の配列
をMaxam−Gilbert法（文献５）により測定し、trp融合
とIGF−１蛋白質暗号配列の接合部での正しい挿入およ
び所望の読み取り枠の保持を確認した。正しく挿入され
たIGF−１フラグメントを持つたプラスミドはpNCVLE−I
GF−１と命名された。pNCV−sLE−IGF−１構成物の形質
転換体も同じ方法（文献５）でミニスクリーニングし、
このプラスミドDNAをHinc IIおよびPst Iで消化した。
〜150bp Hinc II−Pst Iフラグメント（〜105bp Hinc I
I−Hinc IIフラグメントと対照的に）を示す２つのクロ
ーンを多量に増殖させ、それらのプラスミドを調製し
た。Maxam−Gilbert技術（文献５）を使つて、trp融合
およびIGF−１蛋白質暗号配列の機能を配列化し、適切
な配向性および適当な読み取り枠の保持を確認した。こ
の正しい挿入および適切な読み取り枠を持つたプラスミ
ドは、pNCV−sLE−IGF−１と命名した。
これらの構成物のそれぞれを発現させるために、２つ
のクローン、即ち、一方はpNCV−IGF−１、他方はpNCV
−sLE−IGF−１を持つもの、を0.5mg/mlのトリプトフア
ンを補充した10mlのM9−テトラサイクリン培養培地に接
種した。IGF−１遺伝子挿入物を持たないpNCV−LE含有
クローンも、アツセイに於けるネガテイブ対照とするた
めに、培養培地に接種した。
かきまぜながら37゜で12−16時間増殖させた後、これ
らの培地0.5mlを使つてM9−テトラサイクリン培養培地2
50mlに接種した。かきまぜ下に37゜で12〜16時間増殖さ
せた後、Sorvall GSAローターを用い、5000rpmで10分間
遠心分離して細胞を収穫した。屈折体（refractile bod
ies）を、ａ）宿主蛋白質のほとんどを溶解するのに適
したイオン強度の緩衝溶液に宿主細胞を懸濁させ、ｂ）
この懸濁液を細胞壁／膜分裂にかけ、ｃ）この分裂懸濁
液を低速で遠心分離してペレツトを形成させ、所望によ
り、先の工程を繰り返し、そしてｄ）ペレツトに屈折体
としてヘテロローガス（異種）蛋白質を回収する（文献
13）。３つの標品のそれぞれの屈折性粒子少量を、SDS
および２−メルカプトエタノール含有試料緩衝液中で煮
沸し、Laemmliの方法（文献14）に従つてSDS−ポリアク
リルアミド平板ゲル上で泳動させた。pNCV−IGF−１（L
E−IGF−１）によつて発現された蛋白質のサイズは〜2
8,670ダルトン（第７図）であり、pNCV−sLE−IGF−１
蛋白質（sLE−IGF−１）については〜9770ダルトンであ
つた（第８図）。これらの２つの発現された蛋白質を6M
グアニジン−HClに溶解させ、希釈緩衝液で50倍に希釈
した。希釈後のpNCV−IGF−１のための最終緩衝液は0.1
2Mグアニジン−HCl、.0.5Mトリス−HCl（pH8）、20％グ
リセリン、0.1mg/ml BSA、.15M NaCl、0.1mM EDTAであ
り、pNCV−sLE−IGF−１屈折体の希釈後の最終緩衝液は
0.14Mグアニジン−HCl、25mMトリス−HCl（pH7.6）、10
mM CaCl2であつた。個々の粒子物質を引き延ばした後、
溶解したtrp−IGF−１融合蛋白質を含む２つの溶液を、
Hintzらにより改良された（文献24）Furlanettoらの放
射免疫アツセイ法（文献23）により分析した。融合蛋白
質は両者共、この分析で活性を示した。ネガテイブ対照
標品もこの分析にかけたが、測定可能な活性は示さなか
つた。
酵母で発現および分泌 細菌細胞溶解物（Iysates）から、屈折体の精製およ
び溶解の必要性を避けるために、その代りとして酵母の
発現−分泌系を研究した。細胞溶解物からの蛋白質純化
が避けられる利点の他に、カツプリングした発現−分泌
系は、融合蛋白質を除去するための、その後のインビト
ロに於ける加工工程を避けることができる。３種の酵母
発現−分泌系を利用することができる：即ち１）酵母α
因子（文献22）、これは酵母のα−因子プロモーターお
よびプレプロ配列を使う、２）インベルターゼプロモー
ターおよび信号配列からなる酵母インベルターゼ（文献
16）、および３）PGKプロモーター（文献25）およびイ
ンベルターゼ信号（文献16）からなるハイブリツド。
酵母α−因子プロモータープレ−α因子IGF−１プラス
ミドの組み立て α−因子プロモーターおよびプレプロ配列を使つてIG
F−１を発現させる為に、Singh（文献22）によつて組み
立てられたプラスミドを使用した。プラスミドP65（第
９図参照）は、α−因子プロモーターの配列、α−因子
プレプロ配列、酵母２ミクロンターミネーター、酵母Tr
p1遺伝子およびpBR322プラスミドの部分を持つている。
α−因子プレプロ配列中の、IGF−１暗号配列を挿入す
るのに好都合な制限部位が死んでいるので、pNCVおよび
pNCVsLEに結合させた（細菌での組みたてについて既述
した様に）同一の〜230bp EcoR I−EcoR I HuSynIGF−
１−Ｍフラグメントを使用した。このEcoR I−EcoR Iフ
ラグメントは、コラゲナーゼ認識部位プロリン−アラニ
ン−グリシン−プロリンを含んでおり、もしIGF−１が
融合蛋白質として分泌されたら、コラゲナーゼで消化す
ることができる。この組み立て（第10図参照）で発現さ
れる蛋白質は、IGF−１に融合したプレプロα−因子蛋
白質からなる。
〜230bp EcoR I−EcoR Iフラグメントを挿入するため
に、プラスミドP65を、１×EcoR I緩衝液中EcoR Iで部
分消化し、0.7％水平アガロースゲル上でサイズ化し
た。直線状の単独の制限プラスミドに相当する帯を切り
取り、ゲルから溶出させ、フエノール抽出し、クロロホ
ルムで２回抽出し、エタノール沈澱させた。このDNAペ
レツトを50mMのトリス−HCl（pH8）にとり、５′突出末
端の100％脱燐酸化を確実にするための条件下で、細菌
性アルカリホスフアターゼで処理した。この処理の後、
ホスフアターゼ活性を、先づEDTAを15mMの濃度になる様
に加えて除去し、次いでDNAをフエノールで３回抽出
し、クロロホルムで２回抽出し、ベクターをエタノール
沈澱させた。この物質は線状化P65ベクターを含んでお
り、２つの部位のいずれかで、EcoR Iにより消化した：
即ち、１つは、α−因子プロモーターおよびプレプロ配
列の上流のEcoR I部位、もう１つは、α−因子プロモー
ターおよびプレプロ配列のすぐ下流のEcoR I部位であ
る。この〜230bp EcoR I−EcoR I IGF−１フラグメント
をこのベクターに結合させた。所望の挿入場所は、α−
因子プロモーターおよびプレプロ配列からすぐ下流のEc
oR I部位であつた。
結合は、標準的なライゲーシヨン条件下で行なわれ、
形質転換宿主はDagertおよびEhrlich（文献３）の方法
に従つて調製されたコンピテントE.coli294であつた。
形質転換細胞をLB−Amp−寒天平板に植えた。Birnboim
およびDoly（文献４）の方法に従つて数個の形質転換体
をミニスクリーニングし、この様にして調製されたプラ
スミドDNAを適当な緩衝液中、Sal IおよびHind IIIの両
者で消化した。〜110bp EcoR I−Hind IIIフラグメント
を持つたプラスミドを含んでいる数個のクローンの１つ
を多量に増殖させ、そのプラスミドを精製した。このプ
ラスミド、YEp9Tα−因子EcoR I−EcoR I IGF−１（第1
1図）を使つて、Hinnenら（文献17）およびBeggsら（文
献18）の方法のHitzemanの改良法（文献19）に従い、コ
ンピテント酵母株20B−12（αtrp pep4）細胞を形質転
換した。
この様な２つの形質転換体、およびネガテイブ対照形
質転換体（プラスミド中にIGF−１挿入体を持たない）
を、酵母プレ−インベルターゼ−IGF−１プラスミド形
質転換のそれらの様に、懸濁液中で増殖させた。上清
を、分泌されたIGF−１活性について試験し、Hintzらに
より改良（文献24）されたFurlanettoら（文献23）の放
射免疫アツセイ法により測定した。IGF−１挿入物を持
つたプラスミドを含んでいる形質転換体の両上清はIGF
−１活性を示し、ネガテイブ対照の上清は活性を示さな
かつた。これらの形質転換体の１つを10の発酵器中で
多量に増殖させた。この上清は、最高レベル〜３μg/ml
の分泌されたIGF−１活性を含んでいた。発酵上清のIGF
−１活性はまた、Hornerら（文献26）によつて開発され
た胎盤膜放射受容体測定法によつても明らかにされた。
酵母インベルターゼプロモーター信号IGF−１プラスミ
ドの組み立て 酵母中でヘテロローガス信号配列を持つた蛋白質が正
しく加工（プロセシング）および分泌されるという証拠
（文献16）に基づき、酵母インベルターゼ発現−分泌系
が重要となつて来た。最初の試みは、転写の開始点とし
てインベルターゼプロモーターを使用し、IGF−１の加
工および分泌を含む。IGF−１に融合した酵母インベル
ターゼ信号蛋白質の発現であつた。
開始ATGコドンおよび信号DNA配列の５′末端を含んで
いるNco I−Hing III（〜400bp）フラグメントおよび標
準的手法により合成した４つのDNAフラグメントを使つ
て、酵母インベルターゼ信号暗号配列をIGF−１遺伝子
に結合させた： ５′AGCTTTCCTTTTCCTTTTGGC 3′ ３′ AAGGAAAAGGAAAACCGACCAA5′ ５′TGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG 3′ ３′ AACGTCGGTTTTATAGACGTCCAG5′ この組み立ては、Pvu−BamH I消化pBR322−HuSynIGF
−１から分離した〜730bp Pvu I−BamH Iフラグメント
のAva II消化による90bp Ava II−BamH I IGF−１左半
分フラグメントの分離から開始した。
標準的なキネーシヨン（Kination）条件で、４つの合
成DNAフラグメントの全てを燐酸化した後、この４つの
合成フラグメントをAva II−BamH I IGF−１左半分フラ
グメントと混合し、標準的なライゲーシヨン条件下で結
合させた。リガーゼをフエノールおよびクロロホルム抽
出（２回）によつて不活性化した後、エタノール沈澱さ
せたDNAペレツトを溶解し、適当な緩衝液中、Hind III
およびBamH Iで消化した。新たに組み立てられたHind I
II−BamH I（約140bp）フラグメントを分離し、６％ポ
リアクリルアミドゲルから抽出した。この物質をHind I
II−BamH I消化pBR322ベクターに結合させた（これは、
先づ、適当な緩衝液中、Hind IIIで消化し、次いでBamH
Iで消化し、６％ゲルから4014bpベクターフラグメント
を精製したものである）。
形質転換宿主は、標準的手法（文献３）により調製し
たコンピテントE.coli294であり、形質転換細胞はLB−
アンピシリン寒天プレート上に植えつけた。Birnboim−
Doly法（文献４）により数個の形質転換体をミニスクリ
ーニングし、それらのプラスミドDNAをEcoR IおよびBam
H Iで消化した。〜167bp EcoR I−BamH Iフラグメント
を含んでいる２つのプラスミド（Hind IIIおよびBamH I
部位への140bpフラグメントの挿入を示している）を多
量に増殖させ、それらのプラスミドを調製した。Maxam
−Gilbertの配列決定法（文献５）を使つて、DNAの全43
bp Hind III−Ava II部分の配列を決定し、化学合成の
正しいこと、および組み立ての正しいことを確認した。
この正しく組み立てられたプラスミドは、pBR322−Ｐ−
１−HuSynIGF Hind III−BamH I（〜4154bp）と命名さ
れた。
IGF−１遺伝子の右半分を挿入するために、この新た
に調製したプラスミドを適当な緩衝液中、BamH I−Sal
Iで消化し、大きい方のフラグメント（〜3879bp）をゲ
ル分画により精製した。pBR322HuSynIGFを適当な緩衝液
中BamH I−Sal Iで消化し、IGF−１の右半分に相当する
115bp BamH I−Sal Iフラグメントをゲル分画により分
離した。この115bp BamH I−Sal I IGF−１右半分フラ
グメントを、標準的なライゲーシヨン条件下でBamH I−
Sal I消化pBR322−Ｐ−Ｉ−IGF−1LH Hind III−BamH I
ベクターに結合させた。DagertおよびEhrlichの方法
（文献３）に従つて調製したコンピテントE.coli株294
を形質転換宿主として使用し、形質転換した細胞をLB−
Amp−寒天平板に植えつけた。標準的手法（文献４）に
よつて数個の形質転換体をミニスクリーニングし、この
様にして調製したプラスミドDNAを適当な緩衝液中EcoR
IおよびSal Iで消化した。IGF−１の右半分に相当するB
amH I−Sal Iフラグメントの挿入を示すプラスミドを、
pBR322P−Ｉ−HuSynIGF−1 Hind III−Sal Iプラスミド
と命名した。pBR322P−Ｉ−IGF−1 Hind III−Sal Iプ
ラスミドを含有しているクローンの１つを多量に増殖さ
せ、そのプラスミドを分離した。このプラスミドを適当
な緩衝液中、Hind IIIおよびSal Iで消化し、IGF−１遺
伝子の全てと酵母インベルターゼ信号暗号配列の３′部
分を含んでいる255bp Hind III−Sal Iフラグメントを
調製した。このDNAフラグメントをポリアクリルアミド
ゲル分画によつて分離し、標準的手法によるライゲーシ
ヨンに備えた。
酵母インベルターゼプロモーターと共に、インベルタ
ーゼ信号を暗号化しているDNA配列の５′末端を含有し
ている（〜400bp）Nco I−Hind IIIフラグメントを、適
当な緩衝液中、プラスミドYIpsp−LeIFA（文献16）のNc
o IおよびHind III消化により調製した。先づ、このYIp
sp−LeIFAプラスミドをNco Iで完全に消化し、次いでフ
エノール抽出、クロロホルム抽出（２回）し、エタノー
ル沈澱させた。この直線化した分子を１×Hind III緩衝
液にとり、部分的に消化して、内部Hind III制限部位を
含んでいる必要なNco I−Hind III（〜400bp）フラグメ
ントを生成させた。このNco I−Hind IIIフラグメント
をゲル分画により分離し、標準的手法によるライゲーシ
ヨンに備えた。
ベクターを得るために、プラスミドpUC12−YI（EcoR
I−BamH I）（文献16）を、Nco IおよびSal Iを用い、
適当な緩衝液中で消化した。ゲル分画による精製後、ゲ
ルから〜2.6kbpのベクターを分離し、標準的手法による
ライゲーシヨンに備えた。最後の組み当てを行なうため
に、標準的なライゲーシヨン技術を使つてスリー・パー
ト・ライゲーシンを行なつた。この結合に使用したDNA
は、Nco I−Sal I−消化pUC12−YI（EcoR I−BamH I）
（文献16）、〜400bp Nco I−Hind IIIおよび〜255bp H
ind III〜Sal Iフラグメントである。ライゲーシヨンの
後、その物質をDagertら（文献３）の方法に従つて調製
したコンピテントE.coli294細胞に導入した。形質転換
細胞をLB−Amp−寒天平板上に置き、BirnboimおよびDol
yの方法（文献４）を使つて数個の形質転換体をミニス
クリーニングした。この様にして調製したプラスミドDN
Aを、適当な緩衝液中、Nco IおよびSal Iで消化し、〜6
25bp Nco I−Sal I DNAフラグメントの挿入を示すプラ
スミドを含有している数個のクローンの１つを多量に増
殖させ、そのプラスミドを精製した。
最終工程として、このプラズミドを、適当な緩衝液
中、Sal Iで消化して線状化した。既述した様にして調
製し、標準的なキネーシヨン条件化でキナーゼ処理した
Sal I−EcoR Iリンカーを、標準的なライゲーシヨン条
件を使つて、この線状化したベクターに結合させ、Sal
I末端をEcoR I末端に変換した。EDTA15mMを加えてライ
ゲーシヨン反応を終結させ、フエノール抽出し、クロロ
ホルム抽出し（２回）、エタノール沈澱させ、DNAペレ
ツトを１×EcoR I緩衝液に溶解し、EcoR Iで消化した。
このEcoR I消化により、酵母インベルターゼプロモータ
ー、酵母インベルターゼ信号暗号配列およびIGF−１暗
号配列を１つの連続した配列として含んでいる〜1150bp
EcoR Iフラグメントが遊離した。この物質を分画後６
％ポリアクリルアミド平板ゲルから〜1150bp帯として分
離し、標準的手法により、ライゲーシヨン用に調製し
た。
このEcoR Iフラグメントを受け入れるための酵母−E.
coliシヤトルベクターを、プラスミドYEp9T（文献16）
をEcoR I消化してベクターを線状化し、そのEcoR I末端
を、製造業者によつて指示されている条件下で細菌性ア
ルカリホスフアターゼで処理して５′突出末端を100％
脱燐酸化することにより調製した。このホスフアターゼ
反応を、EDTA15mMを添加して終了させ、この混合物をフ
エノール抽出し（３回）、クロロホルム抽出し（２
回）、次いでDNAをエタノール沈澱させた。このDNAペレ
ツトを１×ライゲーシヨン緩衝液に再溶解し、ベクター
をEcoR I〜1150bpフラグメントと混合し、標準的なライ
ゲーシヨン条件下で結合させた。Dagerらの方法（文献
３）で調製したコンピテントE.coli294細胞を形質転換
宿主として使用し、この形質転換体をLB−Amp−寒天平
板上に植えつけた。挿入の配向を決めるために、Birnbo
imおよびDoly（文献４）の方法を使つて数個の形質転換
体をミニスクリーニングし、この様にして精製したプラ
スミドDNAを適当な緩衝液中BamH Iで消化した。BamH I
消化によつて1.3kb BamH I−BamH Iフラグメント（〜47
5bpフラグメントとは反対）を生成するプラスミドを含
有している数個の形質転換体の１つを多量に増殖させ、
そのプラスミドを精製した。このプラスミドをP.I.IGF
−1 EcoR I−EcoR I P.I.プロモーターと命名し、これ
を使つて、Hitzeman（文献19）により改良されたHinne
n,A.ら（文献17）およびBeggs,J.D.（文献18）の方法に
従つて調製したコンピテント酵母細胞を形質転換した。
酵母株20B−12（α trp1 pep4）を使用したが、これ
はYeast Genetics Stock Centerから入手した。この組
み立てに於いて、IGF−１の発現は、インベルターゼプ
ロモーターに於ける転写で開始し、酵母２ミクロン配列
で終了する。この組み立てによつて発現される融合蛋白
質は、IGF−１蛋白質と融合した酵母インベルターゼ信
号からなつており、この合計の分子量は9964ダルトンで
あつた。逆配向に挿入されたEcoR Iフラグメントを持つ
たもう１つのプラスミドも、コンピテント酵母細胞の形
質転換に使用した。この組み立てでは、IGF−１は酵母
ターミネーター（終了暗号）と共に供給されなかつた。
数個の形質転換体を選択し、YNB−CAA寒天平板に塗抹
した。これらの内、３つの形質転換体を選び、振盪フラ
スコ中のYNB−CAA増殖培地10mlに接種した。同じベクタ
ーであるが、EcoR Iフラグメントが逆配向で挿入されて
いるベクターで形質転換されたコロニーを使つて４つ目
の培養も行なつた。30゜で16−20時間増殖させた後、培
養液をサンプリングし（1ml）、エツペンドルフ・マイ
クロフユージ内で５分間回転させて細胞を除いた。上清
を、Furlanettoら（文献23）の方法であつてHintzら
（文献24）により改良された放射免疫分析法により、分
泌された活性について測定した。３つの形質転換体の上
清は、1.7〜3.3mg/mlのIGF−１活性を示したが、ネガテ
イブ対照は活性を示さなかつた。細胞内活性を調べるた
めに、培養液1mlからのペレツトを25mMトリス−HCl（pH
7.6）中、1mM EDTAで洗浄し、0.4mlのガラスビーズを含
む上記のトリス−EDTA溶液0.5ml中で３〜４分、激しく
うず巻き回転させて溶菌させた。
この細胞溶解物を分析した結果、３つのIGF−１分泌
形質転換体では1.5〜2.8ng/mlの活性を示したが、ネガ
テイブ対照の形質転換体は活性を示さなかつた。この３
つの形質転換体の最も分泌能の高いものを５の発酵容
器内で増殖させた。分泌されたIGF−１活性は、最高74n
g/ml（上清）に達した。
酵母PGKプロモータープレーインベルターゼIGF−１プラ
スミドの組み立て インベルターゼプロモーターを使用する上での１つの
問題点は、それがグルコースの存在下で抑制されるとい
うことであつた。インベルターゼプロモーターでの高レ
ベルの転写開始にグルコースが不適合であるため、グル
コースは発酵過程の主要な炭素源であるので、それに代
るプロモーターとしてPGKプロモーターがさがし求めら
れた。
PGKプロモーターP.I.IGF−１組立て物を組み立てるた
め、全インベルターゼ信号暗号配列を含んでいるフラグ
メントをクローンすることが必要であつた。これを行な
うため、プラスミドpLeIF−Ａ−インベルターゼ信号
（文献16）を適当な緩衝液中、Bgl II、次いでBamH Iで
消化した。この消化によつて数個のフラグメントが遊離
したが、その内の１個は〜625bp Bgl II−BamH Iフラグ
メントであり、これを６％ポリアクリルアミド平板ゲル
から分離し、常法に従つてライゲーシヨンに備えた。こ
のフラグメントをクローンするため、pUC8ベクター（文
献20）をクローニングビヒクルとして選んだ。pUC8プラ
スミドを１×BamH I緩衝液中、BamH Iで消化し、細菌性
アルカリホスフアターゼで処理して５′末端を脱燐酸化
し、５％ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動させて分
離した。
ライゲーシヨンのための標準的な調製を行なつた後、
BamH I消化ベクターを上記の〜625bp Bgl II−BamH Iフ
ラグメントと混合し、通常のライゲーシヨン条件下で結
合させた。この混合物を、Dagertらの方法（文献３）に
よつて調製したコンピテントE.coli294に導入し、この
形質転換培養をLB−Amp−寒天平板上に植えた。数個の
形質転換体を選択し、BirnboimおよびDolyの方法（文献
４）を使つてミニスクリーニングした。ミニスクリーン
プラスミドDNAをEcoR Iで消化し、消化物をゲル上で分
析した所、長さ〜260bpまたは〜385bpのEcoR Iフラグメ
ントを持つた２つのタイプのプラスミドが生成してい
た。〜260bp EcoR Iフラグメントを含んでいる１つのク
ローンを多量に増殖させ、そのプラズミドを精製した。
このプラズミドをpUC8P.I.プロモーターシグナルBgl II
−BamH Iと命名した。
このタイプのクローンは、挿入されたBgl II−BamH I
フラグメントが所望の配向を有するが故に選択した。こ
のプラスミドから必要なものは、ATG開始コドンおよび
インベルターゼ信号暗号配列の５′末端を含んでいる〜
20bp EcoR I−Hind IIIフラグメントであつた。
完全なインベルターゼ信号暗号化DNA配列を組み立て
る為に、IGF−１遺伝子の左半分に融合した信号配列の
３′末端を含有している〜150bp Hind III−BamH Iフラ
グメントを、プラスミドpBR322P.I.IGF−LH Hind III−
BamH I（〜4154bp）のHind III−BamH I消化物から分離
した。ポリアクリルアミド平板ゲル分画によつて分離を
行ない、〜150bpフラグメントに相当するDNA帯を切り取
り、標準的手法に従つてライゲーシヨン用に調製した。
短かい（〜20bp）EcoR I−Hind IIIフラグメントを得
るために、プラスミドpUC8P.I.プロモーターシグナル−
Bgl II−BamH Iを１×EcoR I緩衝液中、EcoR Iで消化し
た。この消化により〜260bp EcoR I−EcoR Iフラグメン
トが遊離した。これは、消化混合物を分画した後、６％
ポリアクリルアミド平板ゲルから分離した。この〜260b
pフラグメントを適当な緩衝液中、Hind IIIで消化し、
２つのHind III−EcoR Iフラグメント、即ち、１つは長
さ〜20bpのもの、他方は〜240bpのものを調製した。完
全に消化した後、EDTAを15mM加えて消化を終結させ、混
合物全体をフエノール抽出し、クロロホルム抽出し（２
回）、エタノール沈澱させた。
pBR322（文献15）を適当な緩衝液中、EcoR I−BamH I
で消化し、このEcoR I−BamH I消化ベクターを５％ポリ
アクリルアミド平板ゲルから精製してベクターを得た。
標準的な方法でライゲーシヨン用に調製した後、このベ
クターを〜150bp Hind III−BamH Iフラグメント（イン
ベルターゼ信号の３′末端＋左半分IGF−１）、および
２つのHind III−EcoR Iフラグメント（インベルターゼ
信号暗号配列の５′末端を含んでいる〜20bpフラグメン
ト）と混合し、この混合物全体を標準的なライゲーシヨ
ン条件下で結合させた。ライゲーシヨンのための形質転
換宿主として、DagertおよびEhrlichの方法（文献３）
に従つて調製したコンピテントE.coli294を使用し、こ
の形質転換細胞をLB−Amp−寒天平板に植えつけた。Bir
nboimおよびDoly（文献４）の方法で数個の形質転換体
をミニスクリーニングし、精製したミニスクリーンDNA
をEcoR IおよびBamH Iで消化した。〜170bp EcoR I−Ba
mH Iフラグメントを持つた数個のクローンの１つを多量
に増殖させ、そのプラスミドを精製した。このプラスミ
ドはIGF−１の左半分に融合した完全な酵母インベルタ
ーゼ信号暗号配列を含んでいた。このプラスミドはP.I.
IGF−1 L.H.RI−BamH Iと命名された。
所望の〜170bp EcoR I−BamH Iフラグメントを、この
プラスミドを適当な緩衝液中EcoR IとBamH Iで消化し、
反応混合物を平板ゲル分画することにより分離した。標
準的手法を使つて〜170bp帯のDNAをライゲーシヨン用に
調整した。組み立てを完成させる為に、IGF−１の右半
分を、プラスミドP.I.IGF−1 EcoR I−EcoR I−P.I.プ
ロモーターを適当な緩衝液中でEcoR IおよびBamH Iで消
化し、消化混合物をポリアクリルアミド平板ゲル分画し
た後ゲル切片から溶出させることにより、〜120bp BamH
I−EcoR Iフラグメントとして分離した。これらの２つ
のフラグメント、〜170bp EcoR I−BamH Iおよび〜120b
p BamH I−EcoR Iを、インビトロで、標準的なライゲー
シヨン条件下、両フラグメントをほぼ等モル濃度存在せ
しめて結合させた。このライゲーシヨン混合物にEDTAを
〜15mMに加えて反応を終結させ、フエノール抽出し、ク
ロロホルム抽出し（２回）、エタノール沈澱させた。DN
Aペレツトを１×EcoR I緩衝液にとり、EcoR Iで消化し
た。消化物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動
させ、〜290bp（〜340bpおよび240bpと対照的に）で染
色するDNA帯を切り取り、標準的手法でライゲーシヨン
用に調製した。この〜290bp EcoR I−EcoR Iフラグメン
トは、完全なIGF−１暗号配列に融合した全酵母インベ
ルターゼ信号暗号配列を含んでいた。
この蛋白質を発現する為には、プロモーターを持つた
酵母ベクターを選択する必要があつた。プラスミドYEp1
PT Small（第13図参照）のPGKプロモーターを使用し
た。YEp1PT Smallは、適当な緩衝液中、YEp1PTのCla I
およびPvu II消化により、YEp1PT（文献21）の誘導体と
して組み立てた。Cla I5′突出末端を、製造業者のすす
める条件下で、DNAポリメラーゼＩ（Klenow）を使つて
平滑末端に変えた。Cla I突出末端を平滑にした後、こ
の線状化ベクターの平滑末端Cla IおよびPvu IIを、標
準的なライゲーシヨン条件下、T4DNAリガーゼを使つて
融合させた。得られたYEp1PT Smallベクターは、長さ〜
5.9kbp（即ち、YEp1PTより〜2.7kbp小さい）であつた。
YEp1PTと同様、YEp1PT Smallは２ミクロン起源およびタ
ーミネーター、PGKプロモーター、TRP1遺伝子、および
β−ラクタマーゼ遺伝子を含むpBR322からの配列を持つ
ている。
YEp1PT Smallは、〜290bp EcoR Iフラグメントをその
プラスミドの唯一のEcoR I部位に挿入することにより、
ベクターとして使用した。EcoR I線状化YEp1PT Smallベ
クターは、YEp1PT SmallをEcoR I消化し、細菌性アルカ
リホスフアターゼ（BAP）で処理（相補末端の再結合を
防ぐため）することにより調製した。BAPをフエノール
抽出（３回）、クロロホルム抽出（２回）により除去
し、エタノール沈澱させた。標準的なライゲーシヨン条
件下、〜290bp EcoR Iフラグメントをベクターに結合さ
せた。
DagertおよびEhrlich（文献３）の方法によつて調製
したコンピテントE.coli294を形質転換宿主として使用
し、この形質転換した培養をLB−Amp−寒天平板に植え
た。BirnboimおよびDolyの方法（文献４）で数個の形質
転換体をミニスクリーニングし、ミニスクリーンプラス
ミドDNAを適当な緩衝液中Hind IIIで消化して挿入の配
向性を調べた。〜400bp Hind IIIフラグメントを含むプ
ラスミドを持つた数個の形質転換体の１つを多量に増殖
させ、そのプラスミドを精製した。このプラスミドをYE
p1PT Small P.I.IGF−1PGKプロモーター（第14図参照）
と命名し、Hitzemanの改良（文献19）に係るHinnenら
（文献17）およびBeggsら（文献18）の方法により、コ
ンピテント酵母株20B−12（ATCC20626）（α trp pep
4）細胞を形質転換するのに使用した。
P.I.IGF−1 EcoR I−EcoR I P.I.プロモータープラス
ミド形質転換の場合と同様にして、数個の酵母形質転換
体を懸濁液中で増殖させ、上清の活性を、Hintzら（文
献24）の改良に係るFurlanettoらの放射免疫分析法（文
献23）によつて測定した。３つの形質転換体の振盪フラ
スコ上清は、上清1ml当たり38〜53ngの活性を含んでい
た。同様にして、これらの形質転換体の１つを選び、10
の発酵容器中で多量に増殖させた。上清中に分泌させ
たIGF−１活性は、最高〜780ng/mlに達した。また、こ
の発酵上清を放射受容体測定法（文献26）にもかけた
所、IGF−１活性を有することがわかつた。
成熟ヒトIGF生産 成熟IGF−１を暗号化しているDNA配列に融合したα−
因子プレプロ蛋白質を暗号化しているDNA配列を組み立
てるために、Ｍ−13インビトロ突然変異誘発技術を用い
た（Reginら、Proc.Acad.Science（USA）75,4268;Hutch
insonら、Journal Biological Chem.253,6551;Gilliam
ら、Gene ８,81および99;Gillamら、Nucleic Acids Res
earch ６,2973;Adelmanら、DNA（June,1983）参照）。
Ｍ−13プラスミドを組み立てるために、プラスミドYE
p9Tα−因子EcoR I−EcoR I IGF−１（第16図）をBgl I
IおよびSal Iで消化し、IGF−１と融合したα−因子プ
ロモーター信号を含有している約1.5Kpbフラグメントを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離した。こ
のフラグメントを、標準的なライゲーシヨン条件下、Ba
mH IおよびSal Iで消化し、細菌性アルカリホスフアタ
ーゼで処理したMP−８（BRL）ベクターに結合させた。
このライゲーシヨン混合物をDagertおよびEhrlichの方
法（文献３）に従つて調製したコンピテントJM101細胞
に導入した。これらの形質転換体を対数期まで増殖させ
たコンピテントでないJM101細胞と混合し、トツプ寒天
と混合してLB寒天平板上に置いた。数個の明確なプラー
クを選び、Ｍ−13ジデオキシ配列化法を使つて配列決定
し、ベクターのSal I−BamH I部位に挿入体が存在する
ことを確認した。
上記の方法で欠失を行なうため、 ５′AGAGTTTCCGGACCT CTT TTATCCAAAG3′ で示される配列の１本鎖を常法（文献２）に従つて化学
合成し、α−因子プロモーター／信号IGF−１融合配列
のIGF−１暗号配列の直前の ５′GAGGCTGAAGCTCTAGAATTCCCTGCC3′ ３′CTCCGACTTCGAGATCTTAAGGGACGG5′ で示されるDNA配列を欠失させるのに使用した。この欠
失を含むプラスミドで接種したJM101細胞培養から、多
量プラスミド調製によつて、この組み立て物を複製型と
して分離した。
分離した複製型（10mg）をSal Iで消化した。次いで
フエノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱さ
せ、ライゲーシヨンに備えた。この複製型にSal I−Eco
R Iリンカーを結合させた。ライゲーシヨンを行ない、
フエノール、クロロホルム抽出、次いでエタノール沈澱
させてリガーゼを不活性化した後、この物質を標準的な
条件下で〜50U EcoR I酵素で消化し、６％ポリアクリル
アミドゲル上で泳動させた。放出された約1.5KbpのRI−
EcoR Iフラグメントをゲルから分離し、標準的な方法で
ライゲーシヨンに備えた。
YEp9Tプラスミド10mgをEcoR I50単位で消化し、細菌
性アルカリホスフアターゼで処理することにより酵母ベ
クターを調製した。この消化物を数回フエノール−クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱させ、ライゲーシヨン
に備えた。
欠失を含む約1.5Kbp EcoR I−EcoR IフラグメントをE
coR I−EcoR I YEp9Tベクターと結合させ、このライゲ
ーシヨン混合物をDagertおよびErhlich（文献３）の方
法に従つて調製したコンピテント294細胞に導入し、Bir
nboimおよびDoly（文献４）の方法でミニスクリーニン
グした。調製したDNAをEcoR Iで消化してスクリーニン
グし、約1.5Kbpフラグメントの挿入を示すDNAを使つ
て、Hitzermanの改良に係る（文献19）Beggsらの方法
（文献18）により、コンピテント酵母株20B−12（ATCC2
0626）を形質転換した。
形質転換体を振盪フラスコ内で増殖させ、上清に５′
末端で結合させた。この融合蛋白質はメチオニンの位置
でCNBrにより開発され、バリン置換ヒトEGF分子を放出
する。
酵母から成熟型のEGFを分泌させるために、成熟蛋白
質を暗号化している上記の配列をα−因子プロモーター
／プレプロ配列に結合させ、残基数21のバリンを暗号化
しているコドンをATGで置き換え、適当な欠失を行なつ
て、成熟EGFの暗号配列をα−因子信号暗号配列に隣接
させた。この組み立て物を酵母ベクターYep9Tに挿入
し、酵母に導入した。この様に調製した形質転換体は成
熟ヒトEGFを発現し、分泌した。更に、成熟EGFを暗号化
している配列をプレインベルターゼ信号配列（第17図）
に結合させた。この組み立て物をPGKプロモーター含有
酵母ベクターYep1PT smallに挿入し、酵母に導入する
と、ヒトEGFが発現、分泌された。
ヒトIGF−IIの組み立て、発現および分泌 合成DNA配列および天然のDNA配列を組み合せて、成熟
IGF−IIを暗号化している２本鎖を分析すると、Hintzら
の改良にかかる（文献24）Furlanettoらの放射免疫測定
法によつてIGF−Ｉ活性の存在することがわかつた。
これらのクローンの１つを10の発酵容器内で多量に
増殖させ、この発酵の上清からIGF−１を精製した。こ
の物質をアミノ末端蛋白質配列決定法にかけ、成熟IGF
−Ｉ蛋白質であることを確認した。
以上述べた方法と類似の方法を用い、本発明に従つて
ヒトEGFを調製することができる。
ヒトEGFの組み立て、発現および分泌 IGF−１と同様にして、化学的にあるいは重合反応に
よつて合成した２本鎖DNA（第15図）を組み合せて、成
熟蛋白質のアミノ末端アスパラギンの直前のメチオニン
（ATG）を暗号化しているコドン、アミノ末端アスパラ
ギンから21残基のメチオニンに代つてバリンと置き換え
るコドン（GTC）を含んでいる成熟EGF暗号配列を形成さ
せた。この組み立て物を、酵母または細菌内で発現させ
ると融合蛋白質を生産する暗号配列DNA配列を組み立て
た（第18図）。内部メチオニンを含んでいないこの暗号
配列をTrpEリーダー蛋白質暗号配列に結合させ、融合蛋
白質として発現させた。精製したこの融合生成物から、
この成熟蛋白質の最初の残基（アラニン）の前のメチオ
ニン残基にCNBrを作用させることにより、成熟IGF−II
を化学的に開裂させた。
このIGF−II暗号配列をα−因子プロモーター／プレ
プロ配列に結合させ、適当な欠失を行なつてα−因子信
号暗号配列の３′末端を成熟IGF−II暗号配列の５′末
端に隣接させた後、この組み立て物をYep9Tベクターに
挿入し、酵母に導入した。得られた形失転換体は成熟ヒ
トIGF−IIを発現し、分泌した。同様にして、成熟IGF−
IIを暗号化している配列をプレインベルターゼ暗号配列
に結合させた。得られた組み立て物をYep1PT smallに挿
入し、酵母に導入した。この様にして調製した形質転換
体は成熟ヒトIGF−IIを発現し、分泌した。
医薬製剤 ヒトIGFおよびヒトEGFまたは本発明の生産物は、薬学
的に許容し得る担体と混合し、既知の方法で薬学的に有
用な組成物に製剤化することができる。ヒトの他の蛋白
質、例えばヒトの血清アルブミンを包含する、好適な担
体や製剤化については、例えばW.MartinのRemingtons P
harma−centical Sciencesを参照することができる。
本明細書に於いては、好ましい態様についてのみ記載
したが、本発明がこれらに限定されるものと解釈しては
ならない。
以下に明細書中で引用し、記号化した文献を列挙す
る。
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【図面の簡単な説明】
第１図はヒトIGF−１のための発現ベクターの組み立て
に使用される化学反応されたDNAの模式図、第２図は第
１図のDNAから完成された２本鎖DNAの模式図、第３図は
制限酵素で切断した第２図のDNAのフラグメントの模式
図、第４図は第３図のパーツ１およびパーツ２のpBR322
への結合を示す模式図、第５図はIGF−Ｉの右半分のパ
ーツ３および４の模式図、第６図は第５図のパーツ３お
よび４の、第４図のベクターへ結合を示す模式図、第７
図は、DNA配列および推定融合蛋白質配列を示す模式
図、第８図はDNA配列および推定の短い融合蛋白質の配
列を示す模式図、第９図は本発明の組み立てに使用する
プラスミドの模式図、第10図はα因子プレプロ配列と融
合したIGF−ＩのDNAおよび蛋白質配列を示す模式図、第
11図はIGF−Ｉと融合した、α因子プロモーターおよび
プレ−プロ配列を含有しているベクターの模式図、第12
図はIGF−Ｉと融合した酵母インベルターゼ信号を示す
模式図、第13図は酵母PGKプロモーターを含有している
親プラスミド（YEp1PT Small）の模式図、第14図はPGK
プロモーター、インベルターゼ信号およびヒトIGF−Ｉ
遺伝子を含んでいる酵母発現ベクターの模式図、第15図
は成熟ヒトEGFの暗号配列の組み立てに使用される合成D
NAの模式図、第16図はヒトEGF暗号配列と融合した酵母
α因子「プレ−プロ」配列を示す模式図、第17図はヒト
EGF暗号配列と融合した酵母インベルターゼ信号配列を
示す模式図、第18図はヒトIGF−IIの暗号配列を示す模
式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/26 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アクセル・ウールリツヒ アメリカ合衆国カリフオルニア94117、 サン・フランシスコ、アツパー・テラス 433番 (56)参考文献 特開 昭56−95199（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−122096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−200343（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−163352（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 253 Ｎｏ．８（1978）Ｐ．2769−2776 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ. 247 Ｎｏ．18（1972）Ｐ．5928−5934

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトIGF−ＩまたはヒトIGF−IIから選択さ
    れるヒトIGFを暗号化している下記DNA配列を適当な細菌
    宿主細胞中で発現することができる複製可能な発現ベク
    ターを調製し、このベクターで細菌宿主細胞培養を形質
    転換し、得られた組換え細菌宿主細胞培養を、ヒトIGF
    暗号化DNA配列を発現できる条件下で培養してヒトIGFを
    生産せしめ、これを回収することからなるヒトIGFの製
    造法：
  2. 【請求項２】細菌宿主細胞が大腸菌である第１項の製造
    法。
  3. 【請求項３】ヒトIGF暗号化DNA配列がヒトIGF−Ｉを暗
    号化している第１項の製造法。
  4. 【請求項４】ヒトIGF暗号化DNA配列がヒトIGF−IIを暗
    号化している第１項の製造法。
  5. 【請求項５】IGFが屈折体の形態で回収される第１項の
    製造法。
  6. 【請求項６】回収したヒトIGFを医薬的に許容される担
    体と混合する工程を含む第１項の製造法。
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