JPS6069029A - 組換えｄｎａ技術によるヒトｉｇｆおよびｅｇｆの製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の目的 本発明は組換えＤＮＡ技術による、種々の形のヒ）ＩＧ
Ｆ（インシュリン様成長因子）の製造法に関する。特に
本発明は、組換えＤＮＡ変換宿主生物中での発現〜プロ
セシング（加ニーまたは加工処理）および分泌による、
成熟蛋白質生成物としてのヒ）　Ｉ　ＣＦの製造法を提
供するものである。

即ち本発明は、種々の形のヒトｌ　ＣＦの生産、分離お
よび用途、およびそれを製造するための一関連する組換
えＤＮＡ技術を提供するものである。

更に、本発明は関連する蛋白質、ヒ）　ｌｉ　Ｇ　Ｆ　
（外皮成長因子）の類似の製造法に関するものでもある
。

本発明は、一部には、組換え宿主生物によって、個別に
、成熟蛋白質の形で、ヒｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆを製造すること
ができる新規な系を発見したことに基づいている。これ
は〜少なくとも一部の酵ＩＪα因子信号（シグナル）配
列と融合したヒ）　Ｉ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列を発現し
、その信号配列をプロセシングし、成熟ヒ）　Ｉ　Ｇ　
Ｆ蛋白質を、宿主生物を扶養している培地中に分泌する
ことができる発現系（これは本発明の１態様である）に
よって達成された。

即ち、この本発明の新規な態様は、初めて、ヒトＩＱＦ
を個別の、成熟蛋白質と、して製造、分離および利用を
可能ならしめるものと考えられる。しかし本発明は−そ
の広い範囲の意味に於いて、細菌と細胞培養を含む他の
組換え系てヒｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列を調製する
ことを含み、従って、成熟ヒトＩＣＦのみならず一必須
成分としてＩ　Ｇ　Ｆのアミノ酸配列を含有している融
合生産物誘導体を提供するヒｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆ　Ｉ）ＮΔ
配列の発現を含んでいる。この様な生産物は一生物学的
に活性であることがわかり、従って、所期の目的に有用
である。

本発明の詳細な説明し、またある場合には−より詳細な
内容を紹介するために各種の文献を引用したが−それら
は、それぞれアルファベットまたは数字で表わし−それ
らの記号を添えて本明細２１の末尾にまとめた。

本発明の背景 □ Ａ、ヒトＩＧＦ（インシュリン様成長因子）過去の研究
者達にとって、ヒトＩ　Ｇ　ｌ”は熱心な研究対象であ
った。この蛋白質または一連の蛋白質を種々の面から研
究した多数の文献が発表されている（文献Ａ、Ｌ参照）
。

インシュリン様成長因子１および■は−ヒト血清から単
離された（文献Ａ）。「インシュリン様成長因子」とい
う用語またはｌ　ＣＦは、インシュリン様作用および多
くの細胞に対して有糸分裂促進剤として作用するこれら
のポリペプチド類のインシュリン様構造を表わすのに選
ばれた。Ｉ　ＣＦ−■およびＩ　ＣＦ　−ＩＪの完全な
アミノ酸配列は決定されている（文献Ｉ）、Ｅ）。これ
らは共に１本鎖ポリペプチドで−３つのジスルフィド橋
を持っており、それぞれヒトインシュリンＡ鎖およびＢ
連結ペプチドまたはＣ領域は、プロインシュリンのそれ
よりも極めて短かく、それと有意な相同性を持っていな
い（Ｉ　Ｇ　ｌｉの生物学的作用に関する初期のω■究
についての総論は文献Ｆ参照のこと）。

ＩＧＦ−■およびＩＧＦ−■は、ヒト血清およびヒト脳
背髄液に存在する成長促進ポリペプチドである。その構
造はプロインシュリンとホモローガス（相同）である。

Ｉ　Ｇ　Ｆ　−■は一特異なｌＧＦ結合蛋白乞とともに
肝臓で生産される様であり、この両者は、成長ホルモン
の支配下にある。即ち、ヒｌ−Ｉ　ＣＦは、ヒ１−成長
ホルモンの作用を媒介する活性な成長促進分子であると
考えられている。

成長因子として人類に適用される高品質のヒトＩ　ＣＦ
を、必要なだけ多量に提供するには、組換えＤＮＡおよ
び関連技術を応用するのが最も効果的であることがわか
った。目標どする所は、宿主生物から、組換えｌ）　Ｎ
　Ａ技術の産物として、生物学的に活性な融合蛋白質と
じて−あるいは、より重要なことであるが成熟蛋白質と
して−ヒ）ＩＣＦを生産することてあった。この様な物
質は、生物活性を示し、各種の成長に影響のある症状の
治療に臨床応用が可能であろう。

」３１組換えＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ技術は、一応成熟期に達したと言える。分
子生物学者は一各種のＤＮＡ配列をある程度容易に組換
え〜形質転換された微生物および細胞培養株中で多量の
外来性蛋白質産物を生産し得る新しいＤＮＡ体をつくる
ことができる。一般的な手技手法は、各種のＤＮＡの平
割末端あるいは粘着末端フラグメントをインビトロで結
合させ一特定の生物に形質転換するのに有用な強力な発
現媒体（ビヒクル）を調製し、所望の外来性産物を効率
的に合成させることである。しかし、産物によっては、
それを生産する方法は依然として回りくどいものであり
、常に成功を予見し得る程には、この科学は進歩してい
ない。事実、基礎的な実験に基づくことなく、成・功す
ると予想する者は一部しい実施不能の危険をおかしてそ
うするのである。

主要な要素、即ち複製起源−１種またはそれ以上の表現
型選択特性、発現プロモーター、外来性遺伝子の挿入お
よび残留ベクターのＤＮＡ組換えは一通常宿主細胞の外
で行なう。得られた組換え複製可能発現ビヒクルまたは
プラスミドを形質転換によって細胞に導入し、その形質
転換体を増殖させることによって多量の組換えビヒクル
を得る。

暗号化されているＤＮＡ情報の転写および翻訳を支配し
ている部分に関して適切な位置にこの遺伝子が挿入され
た場合は−この得られた発現ビヒクルは一挿入された遺
伝子が暗号化しているポリペプチド配列を生産するのに
有用である。この過程は発現と呼ばれる。要すれば宿主
細胞を溶解させ、他の蛋白質から分離精製して生産物を
回収することができる。

実際には、組換えＤＮＡ技術を使って全て外来性のペプ
チドを発現させることができ（いわゆる直接発現）、あ
るいはまた、ホモローガス（同種の）ポリペプチドのア
ミノ酸配列の一部と融合したヘテロローガス（異種の）
ポリペプチドを発現させることもてきる。後者の場合、
目的とする生物活性産物は、細胞外環境で開裂されるま
で、融合したホモローガス／ヘテロローガスポリペプチ
ド内で不活性化されていることかある（文献ＭおよびＮ
参照）。

同様に、遺伝および細胞生理を研究するための細胞培養
または組織培養の技術も非常に進歩している。単離した
７正常細胞から一続々と継代（移植）しテ調製した耐久
セルラインを保持する手技手法を使用することができる
。研究に使用するには、この様なセルラインは液体培地
中の固形担体上に保持するか、あるいは支持栄養物を含
んでいる）Ｖ濁液中で発育させて保持する。大量生産の
ためのスケールアップには機械的な問題があるだけであ
る。その他の背景については文献ＯおよびＰ参照。

同様に、生物工学に於いて、蛋白質の生化学は有用な、
実は必要な補助字間である。所望の蛋白質を生産する細
胞は、何面という他の蛋白質、細胞代謝の内性産物をも
生産する。これらの夾雑蛋白質は、所望の蛋白質から分
離しておかないと一部の化合物と同様−所望の蛋白質に
よる治療過程でヒトや動物に投与されると毒性を現わす
ことがある。従って一当面の特定の系に適した分離法を
計画し、所望の用途に使用できる均質な安全な生産物を
得るのに蛋白質生化学の技術が必要となってくる。蛋白
質生化学はまた、所望の生産物の同定に、そしてそれを
特性化して、細胞が確実に、変化したり変異することな
くへ忠実にそれを生産したことを確めるのにも必要であ
る。この科学分野は更に−バイオアツセイや安定性試験
を計画したり、臨床試験やマーケティングを行なう前に
やらなけれはならないその他の手続きにも関係している
。

本発明は、組換えＤＮＡ技術により、市場に出すまでに
必要な動物実験および臨床実験を行なうのに十分な邦：
のヒトＩ　Ｇ　ｌ・’、関連する蛋白質、ヒトＥＧＦを
、好ましくは直接の形で生産することかできることを発
見したことに基ついている。この生産物、ヒトＩＧＦお
よびＥ　Ｇ　Ｆ’は、本発明によって生産されるあらゆ
る形に於いて、ヒトの成長に関連する種々の症状または
疾患の予防または治療に使用することができる。従って
、本発明の目的の１つは一本発明の方法および手段によ
って製造されるヒトＩＧＦまたはヒトＥ　Ｇ　Ｆ、また
はそれらの適当な医薬組成物を使って−ヒトの患者の成
長状態を処置する方法を提供するものである。

更に本発明の目的は、組換え宿主生物内に於ける発現、
加ニーおよび分泌の生産物としての実質的に純粋な、成
熟ヒ）ＩＧＦを提供することである。このヒ）　ＩＧＦ
は、この物質を製造するのに使用され得る発現系由来の
Ｎ−末端アミノ酸配列を伴なっていない。即ち、本発明
はＩＧＦのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造に関
するものであるが、その特徴とする所は、成熟ヒトＩＧ
Ｆを直接、使用した組換え宿主生物の培地内に生産させ
ることである。本発明はまた、ヒｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆおよび
ヒ）　Ｉｌ、　ＣＦを暗号化している遺伝子配列を発現
可能な形て担持している複製可能なＩ）　Ｎ　Ａ発現ビ
ヒクル、この様なビヒクルで形質転換された微生物味ま
たは細胞培養−およびヒトＩＧＦおよびヒト］！、ＧＦ
のアミノ酸配列を生産し得るその様な形質転換体の微生
物あるいは細胞培養を提供するものである。更に本発明
は、この様な遺伝子配列、ＤＮＡ発現ビヒクル、微生物
および細胞培養、並ひにそれらの特定の態様を調製する
のに有用な各種の方法を提供するものである。更に本発
明は、その様な微生物および細胞培養の醗酵培養の製造
法を提供するものである。

以下に図面について説明する。

第１図はヒトＩ　Ｇ　Ｆ　−１のための発現ベクターの
組み立てに使用される化学的に合成されたＩ）ＮＡ鎖を
表わしている。Ｉ　Ｌ−２Ｌ−３１−および４１−はそ
れぞれ４３．４６．４３および４６量体、１ｋ、２Ｉζ
−３ｉｔおよび４にはそれぞれ４６．５４．４６および
４６量体である。

第２図は第１図のＩ）　Ｎ　Ａから完成された２本鎖１
）　Ｎ　Ａを表わしている（１）ＮＡポリメラーゼ■合
成２本鎖ＤＮＡ）。

Ｈｇ　３図は、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩおよびＢａｍ
ＨＩて制限酵素切断（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　）　し
た後の第２図のＤＮＡのフラグメントを示している。

第４図は、左半分のＩ　Ｇ　ｉ”　−■組み立てにおけ
る一第３図のパーツ１およびパーツ２　（７）　ｌ）　
１３１ζ３２２へのライゲーションヲ示している（　１
！、ｃｏＲＩ　−Ｂａｍ８１　ｐＢＲ３２２＋パーツ１
＋パーツ２のスリー、パーツ・ライゲーション）。

第５図は−ＩＧＦ−Ｉの右半分のパーツ３および４を示
している。

第６図は、ＩＣＦ−工組み立てに於ける一第５図のパー
ツ３および４の、第４図のベクターへのライゲーション
を表わしている（ＩＣＦ−４ＬＩＩ３２２＋パーツ３＋
パーツ４のスリー　パーツ　ライゲーション）。

第７図は、ＤＮＡ配列およびＩ　Ｇ　ｌ：　−ｉを含有
している推定の融合蛋白質の配列を示している。

翻訳分子ｆｆｉ　＝　２８６７１．５１、下線部分＝成
熟ヒトｉ　ｃ　Ｆ−ｉ、箱で囲った部分＝コラゲナーゼ
認識部位。

第８図は、ＤＮＡ配列およびＩ　Ｇ　Ｆ　−ｉを含有し
ている推定の短い融合蛋白質の配列を示している（ＳＬ
Ｅ−ＩＣＦ−１融合蛋白質）。下線１３１５分＝成熟ヒ
トＩ　Ｇ　Ｆ−１、箱で囲った部分−コラゲナーゼ認識
部位。

第９図は本発明の組み立てに使用されるプラスミドであ
る。

第１０図は−α因子プレープロ配列と融合したＩＧＦ−
■の、ｌ）　Ｎ　Ａおよび蛋白質配列を示している（酵
母プレプロａ因子−ＩＧＦ’−４）。下線部分＝成熟ヒ
トＩＣＦ−１、箱で囲った部分−コラゲナーゼ認識部位
。

第１１図は、Ｉ　Ｇ　Ｆ−Ｉと融合した、α因子プロモ
ーターおよびプレープロ配列を含有しているベクターで
ある。

第１２図は−　Ｉ　Ｇ　ｌ゛−■と融合した酵母インベ
ルターゼ信号（シグナル）を示している（酵母インベル
ターゼ信号−Ｉ　Ｇ　ｌｉ’　−１蛋白質）。下線部分
＝成熟ヒトＩ　Ｇ　Ｆ　−１゜ 第１３図は酵母ＰＧＫプロモーターを含有している親プ
ラスミドである（Ｙｌらｐ　ｌ　ｌ’−１−Ｓｍａｌｌ
　）。

第１４図は−ＰＧＫプロモーター、インベルターゼ信号
およびヒ）　Ｉ　Ｇ　ｌ’　−ｉ　遺伝子を含んでいる
酵母１発現ベクターである（　ＹＪｉｐ　ｌ　ＰＴＳｍ
ａｌｌ　Ｐ。

１、ＰＧＫプロモーター）。

第１５図は成熟ヒトＥＧＦの暗号配列を組み立てるのに
使用される合成りＮＡである。

第１６図は、ヒ）　ｌｉ　Ｇ　Ｆ暗号配列と融合した酵
母α因子「プレープロ」配列を示している。

第１７図は、ヒ）　Ｅ　Ｇ　Ｆ暗号配列と融合した酵母
インベルターゼ信号配列を示している。

第１８図はヒ）ＩＧＦ−ｌの暗号配列である。

詳細な説明 Ａ　定義 ［ヒトＩ　Ｇ　Ｆ　Ｊおよび「ヒトＥＧＦＪは、微生物
または細胞培養系によって生産されるヒトのインシュリ
ン様成長因子およびヒトの表皮性成長因子であり、生物
活性形は、ヒトの組織由来のヒトのＩ　ＣＦおよびヒト
の−ＥＧＦに相当するアミノ酸配列を含んでいる。本発
明に於いて生産されたヒトＩ　Ｇ　Ｆおよび１礼ＧＦ蛋
白質は−１）　Ｎ　Ａ−遺伝子および推論的なアミノ酸
配列決定によって明らかにされた。全配列におけるアミ
ノ酸の違い、あるいはその様な配列の１若しくはそれ以
上のアミノ酸の欠落−置換−挿入、逆位−または付加に
よって例示される様に一天然に対立遺伝子変異が存在し
、かつ個体から個体へと起るので一本発明はこれらの２
つの分子の対立遺伝子変異体の全てを含むものと解釈さ
れるべきである。更に−グリコモル化の位置およびその
程度は、用いた組換え宿主生物の種類によって異なるの
で、その様にして起こり得る変異体も本発明の範囲に含
まれる。最後に、ＤＮＡ技術を使って、この様な分子の
基本的な遺伝子配列を簡単に修飾することによってヒト
ｌ　ＣＦおよびヒ）　ｌ！：　Ｇ　ｌｉ’の各種の誘曽
体を製造する可能性もある。この様な修飾は、実施例の
様に、基本的ＤＮＡの部位指向性突然変異誘発によって
達成することができた。ヒトＩ　Ｇ　Ｆおよびヒ１司る
ＧＦの誘等体を生成させるこの様な修飾は全て、必須の
特徴的なヒ）　Ｉ　Ｇ　Ｆおよびヒ）、　Ｅ　Ｇ　Ｆ活
性が影響を受けずに残っている限り、本発明の範囲に含
まれる。

本発明によって生産されるヒトＩＧＩ゛またはヒ１−　
Ｅ　Ｇ　Ｆの状態を表わすのに使用される「実質的に純
粋な形」という用語は、非組換え細胞によって、即ち、
その天然の環境で生産されるヒトｌＧＩ；またはヒ）Ｅ
ＧＦに通常随伴している蛋白質またはその他の物質を含
んでいないことをいう。

「発現ベクター」とは、ＤＮＡ配列が、その発現に影響
を与え得るベクター内の他の配列、即ちプロモーター／
オペレーター配列に作働可能な様に結合された場合−そ
のベクターに含まれるそのＤＮＡ配列を発現することが
できるベクターを意味する。結局、「発現ベクター」と
は、機能的な定義である：特定のＤＮＡ暗号を発現する
ことができるＤＮＡ配列は全てここに配置される。通常
、組み換えＤＮＡ技術に使用される発現ベクターはプラ
スミドの形であることが多い。このプラスミドは、ベク
ターの形に於いては染色体に結合していない環状の２本
鎖ＤＮＡループのことをいう。

プラスミドは、ベクターの最も普通に用いられる形であ
るので、本明細書に於いては、プラスミドとベクターを
交換可能な用語として用いる。しかし本発明に於いては
、同じ機能を有する、当技術分野で知られている、ある
いは今後知られ得る他の形の発現ベクターも含まれると
解釈すべきである。

本明細書に於いて「組換え宿主細胞」とは、この様なベ
クターで形質転換された細胞を意味する１従って、この
様な細胞によって生産されるヒトＩＧＦおよびヒトＥ　
Ｇ　Ｆ分子は−「組換えヒトＩＣＦ」および「組換えヒ
トＥＧＩ・」と呼ぶことかできる。

Ｂ、宿主細胞培養およびベクタ一 本明細書に記載した方法およびベクターは、広範囲の真
核性および原核性の生物の宿主細胞に使用することがで
きる。

勿論、一般的に、本発明に有用なベクターを組み立てる
に際し、ＤＮＡ配列をクローニングするのに原核生物が
好ましい。特にＥ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ　１２　株２９４　
（ＡＴＣＣｔＪｃｒ、３１４４６）　が特に好ｔ　しい
。使用し得るその他の微生物株として、Ｉ’、、　ｃｏ
ｌ　ｉ　Ｂ、Ｅ、　ＣＯ’ｌ　Ｘ１７７６　（Ａ”ｌ”
ＣＣＮｏ、３１５３７　）など゛の１−８ｃｏｌ　ｉ株
が含まれる。上記の株−Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｗ　３１１０
（Ｆ、Ａ、原栄養体、Ａ′ｒＣＣ１１１ｏ２７３２５）
、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓの様な桿菌、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたは５ｅ
ｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓａｎ　の様なその他の腸内
細菌、および各種のシュードモナスも使用することがで
きる。これらは限定する意味て挙げたのではなく、単な
る例示に過ぎないことは言うまでもない。

一般に、これらの宿主に関しては、その宿主細胞と適合
し得る種由来のレプリコンおよび調節配列を含んでいる
プラスミドベクターが使用される。

このベクターはもともと、形質転換細胞に表現形質（表
現型）の選択性を付与することのできる標識化配列と共
に複製部位を持っている。例えば−Ｅ、ｃｏｌｉは、Ｅ
、ｃｏｌｉ種由来の１）１３Ｒ３２２を使って形質転換
される（　Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ　２　：　９５
（１９７７））。ＰＢＲ３２２はアンピシリンおよびテ
トラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり一従っ
て、これは形質転換細胞を同定するための簡単な手段と
なる。このｐＢＲ３２２プラスミドやその他の微生物プ
ラスミドは、その微生物がそれ自身の蛋白質を発現する
のに使用することのできるプロモーターを含んでいなけ
ればならす、あるいは含む様に改良されなくてはならな
い。糺換えＤＮＡの組み立てに通常用いられるプロモー
ターにはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラ
クトースプＯモーター系（Ｃｂａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ
２７５：６１５　（１９７８）；　Ｉｔａｋｕｒａら−
　５ｃｉｅｎｃｅ１９８　：１０５６　（１９７７）Ｈ
Ｇｏｅｄｄｅｌら、ｉ’１ａｔｕｒｅ２８］　：５４４
　（１９７９）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモ
ーター系（Ｇｏｃｄｄｃｌら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｃ
ｌｓ　Ｒｃｓ、　８　：４０５７　（１９８０）　；　
Ｉらｌ’ＯＡｐｐｌＰｕｂｌＮ０００３６７７６）かあ
る。コレラカ最モ普通に用いられているが、その他の微
生物プロモーターも発見され、使用されており、それら
のヌクレオチド配列は詳細に発表されているので、当業
者であれは、それらをプラスミドベクターに機能的に結
合させることかできる（　５ｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃ
ｅ１ｌ　２０：２６９（１９８０））。

原核生物の他、酵母培養株の様な真核性微生物も使用す
ることがてきる。Ｓａｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓｃｃｒｃ
ｖｉｓｉａｃ、普通のパン酵ノＪは一真核微生物中最も
よく使用されるものであるか、その他の多くの株も使用
される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現させルニ
ハ、例えばプラスミドＹＲｐ　７　（Ｓｔｉｎｃｈｃｏ
ｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　２８２　：　３９　（１９７９
）　；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅヱ：　１４１　（
１９７９）　；　Ｔｓｃｌｌｅｍｐｅｒら−Ｇｅｎｅ　
１０　：１５７　（１９８０）がよく用いられる。

このプラスミドは、トリプトファンを生産する能力を欠
いている酵母の突然変異株、例えばＡ　Ｉ”　ＣＣＮｌ
３．４４０７６またはｌ’　Ｉ’、　Ｐ　４−１　（，
１ｏｎｃｓ　、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５　：１２　（１
９７７））にとって選択マーカーとなるｔｒｐｌ遺伝子
をもともと含んでいる。酵母宿主細胞ゲノムの特徴とし
てのＬｒ１）ｌ損傷か存在することは、トリプトファン
の非存在下に発育させることによって形質転換体を検出
する有効な環境を提供することになる。

酵母ベクター中の適切な促進（１）ｒｏｍｏＬｉｎｇ　
）配列には、３−ボスホグリセレートキナーゼ（１−１
ｉ　ｔ　Ｚｅｍａｎら２．１．１３ｉｏ１．　Ｃｌ１ｃ
ｍ、　２５５　：　２０７３　（１９８０））　または
他の解糖酵素（ｌ１ｃｓｓら１，１゜Ａｄｖ、Ｅｎｖｙ
ｍｅ　Ｒｅｇ、７　：１４９　（１９６８）　；−１ｌ
ｏｌ　１ａｎｄら−Ｂｉｏｃｂｃｍｉｓｔｒｙ　１７　
：　４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ−グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ−
へキンキナーゼ−ピルベートデカルボキシラーゼ、ホス
ホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイ
ソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベ
ートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、
ホスホクルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼな
どのプロモーターか含まれる。

好適な発現プラスミドを組み立てるに際し、これらの遺
伝子の終了（【ｃｒｍｉｎａｔｉｏｎ　）配列もまた、
発現ベクターに、発現しようとする配列の３′に結合さ
せてｍＲＮＡのポリアデニル化および終了を提供する。

発育条件によってコンＩ・ロールされる−もう１つの転
写における有利性を持った他のプロモーターは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ２−イソチトクロームＣ１酸性ホ
スファターゼ−窒素の代謝に関与する分解酵素、上記の
グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナー
ゼ、およびマルトースおよびガラクトース利用に関与す
る酵素（ｆｌｏｌｌａｎｄ−前記）などのプロモーター
領域である。酵母に適合するプロモーター−複製起源お
よび終了配列を含んでいる全てのプラスミドベクターが
適している。

微生物の他、多細胞生物由来の細胞培養も宿主として使
用することができる。原則として、を椎動物および無を
椎動物のいずれの細胞培養も使用できる。しかし、を椎
動物細胞が最も興味があり、を椎動物細胞の培養増殖（
組織培養）が最近では常套手段となって来た（　Ｔｉ５
ｓｕｅ　Ｃｕｌ　Ｌｕｒｅ　、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒ
ｅｓｓ、　ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、　ｅ
ｄｉｔｏｒｓ　（１９７３））。この様な有用な宿主細
胞系の例は−ＶｌｉＲＱおよびｌ−１ｅＬａ細胞、チャ
イニーズ・ハムスター卵巣（ＣＩ−１０）細胞系、Ｗ２
Ｂ５、Ｂｌ−ＩＫ−ＣＯ５−７およびＭＤＣＫ細胞系細
胞室ある。この様な細胞の発現ベクターは、通常、（要
すれば）複製起源−発現しようとする遺伝子の前に位置
するプロモーター、必要なリポソーム結合部位、ＲＮＡ
絹み継き（スプライス）部位、ポリアデニル化部位、転
写終了配列などを含んでいる。

咄乳動物細胞中で用いるには、発現ベクター上の調節機
能はウィルスから提供されることが多い。

例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、
アデノウィルス２から誘導され、シミアンウィルス４０
（ＳＶ４０）から導かれることが最も多い。古い、そし
て新しいＳＶ４０ウィルスのプロモーターは、共にこの
ウィルスから、５Ｖ４Ｑウイルスの複製起源を含んでい
るフラグメントとして簡単に得られるという理由で特に
有用である（　Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３：
１１３（１９７Ｂ））。

ｌ−１ｉｎｄ　ｌｌサイト（部位）からウィルスの複製
起源内に存在しているＢｇｌ　Ｉサイトに至る約２５０
ｂＰ配列を含んでいるならば、それより小さいあるいは
大きい５Ｖ４Ｑフラグメントも使用することができる。

更に、所望の遺伝子配列と正常通り結合しているプロモ
ーターまたは調節配列を、この様な調節配列が宿主細胞
に適合する限り一使用することがてき−またそれが好ま
しいことが多い。

複製起源は、５Ｖ４Ｑまたは他のウィルス（例えばポリ
オーマ−アデノ、ＶＳＶ、Ｂ　Ｉ）　Ｖなど）が誘導さ
れる様に、外来性の起源を含む様にベクターを組み立て
ることにより、あるいは宿主細胞の染色体の複製機構に
よ、り提供することができる。

このベクターが宿主細胞染色体に組み込まれたら、後者
は十分であることが多い。

Ｃ０方法 強力な細胞壁バリアーのない細胞を宿主細胞として使用
する場合は、Ｇｒａｈａｍらの燐酸カルシウム沈澱法（
ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｔ°
ｏｌｏｇｙ５２　：５４６（１９７８））　によってト
ランスフェクションを行なう。しかし−核注入またはプ
ロトプラスト融合などの、ＤＮＡを細胞に導入する他の
方法も使用することができる。

原核細胞または実質的な細胞壁＋、１１１造を持った細
胞を使用する場合、好ましいトランスフェクションの方
法は、Ｃｏｂｃｎらの塩化カルシウムを用いたカルシウ
ム処理である（　Ｃｏｂｅｎ　、　Ｆ、　Ｎ、ら、Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　、　６
９　：２１１０　（１９７２））。

所望の暗号配列および調節配列（ｃｏｎｔｒｏｌｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ　）を含んでいる好適なベクターを組み立て
るには標準的な結合技術を用いる。分離したプラスミド
またはＤＮＡフラグメントを開裂し、修復（ティラー）
し、所望のプラスミドを形成する様に一希望の形に再結
合する。

開裂は、適当な緩衝液中、制限酵素で処理することによ
り行なう。通常、約１μりのプラスミドまたはＤＮＡフ
ラグメント、約２０１１１の緩衝液、約１単位の酵素を
使用する（特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および
基質の和は製造業者が指定している）。３７℃で約１時
間インキュベートする。インキュベートした後、フェノ
ールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質を除き、水性
分画からエタノールで沈澱させて核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合は、ポリメラーゼエ（Ｋｌｅｎｏ
ｗ　）　１０単位で、１５℃で１５分間処理し、フェノ
ール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱に付す。

賭裂したフラグメントの大きさによる分離は、Ｇｏｅｄ
ｄｃｌらの方法（Ｇｏｃｄｄｅｌ　、　Ｄら、Ｎｕｃｌ
ｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、８：４０５７（１９８０）
）に従い、６％ポリアクリルアミドゲルを使って行なう
。

結合（ライゲーション）には、正しく符号する様に末端
を適当に修復したほぼ等モル量の所望の成分を、ＤＮＡ
０．５μノ当たり約１０単位の１゛４１）　Ｎ　Ａ　リ
ガーゼを用いて処理する（開裂したベクターを成分とし
て用いる場合は、細菌性アルカリ性ホスファターゼで予
め処理して開裂したベクターの再結合を防ぐのがよい）
。

組み立てたプラスミド中の正しい配列を確認するための
分析には、ライゲーション混合物を使ってＥ、　ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４，４６）を形
質転換し、適切な場合はアンピシリン耐性によって、成
功した形質転換体を選択する。形質転換体からプラスミ
ドを調製し−Ｍｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９：３Ｑ９（１９８１）　
）またはＭａｘａ＋ｎらの方法（Ｍｃｔｂｏｄｓ　ｉｎ
　１ｉｎｚｙ＋ｎｏｌｏｇｙ。

６５　：４９９（１９８０））　によって制限および／
または配列化によって分析する。

実施例 以下に本発明の実施例を示すが、これは本発明を例示す
るためのものであって、これによって本発明を限定する
ものと解釈してはならない。

ヒトＩ　Ｇ　Ｆ　−１の合成および発現酵素は以下の供
給源から入手した。

Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｃｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ　：制限酵
素、Ｔ４１）ＮＡリガーゼ。

Ｂｅｔｂｅｓｄａ　Ｒｃｓｅａｒｃｌｘ　Ｌａｂｓ　：
制限酵素、細菌性アルカリホスファターゼ。

Ｂｏｅｂｒｉｎｇｃｒ−Ｍａｎｎｂｃｉｍ　：　１’：
、ｃｏｌ　ｉ　Ｉ）Ｎ　Ａポリメラーゼｉ　（Ｋｌｃｎ
ｏｗ　）。

Ｐ　４−　Ｌ　１３ｉｏｃｂｃ口］１ｃａｌｓ　：ポリ
ヌクレオチドキナーゼ、ターミナルヌクレオチジルトラ
ンスフエラーセ。

Ｎｅｗ　ｌ：ｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｃａ＋　＝ｌ）Ｉ
％＋ｔ３２２〔オリゴ（ｄＧ）−尾部化〕１）ＮＡ 試薬 ＢｉｏＲａｄ　：　ヒス　アクリルアミド、アクリルア
ミ　ド、　’１’Ｍｌら■）。

Ｓ　ｉ　ｇｍａ　：アンモニウムパーサルフエート。

Ａｍｅｒｓｂａｍ　：　１０２１８１３２Ｐ　ＡＴＩ’
）５ＱＱＱ　Ｃｉ　／ミリモル；　１０１６５　ｆ３２
Ｐ　ｄＣＴＰ＞４００Ｃｉ／ミＩＪモル。

５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉａ　：　Ｉ　Ｘ　
ＴＢＥ　：　、　５４Ｍ　トリス塩基、０．５４Ｍホウ
酸１．０１７　Ｍ　Ｎａ２ＥＤＴＡ０Ｄｉｆｃｏ二酵母
含窒素塩基（ＹＮＢ）’；　）リプトン、酵母抽出物；
　Ｂａｃｔｏ−Ａｇａｒ　；カザミノ酸。

オートラジオグラフィー：　Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ
ＡＲＸＡＲ−２フィルム。

ガラスピーズ：　０．４５−０．５０　ｍＭ　Ｂ、　Ｂ
ｒａｕｎＭｅｌ　ｓｕｎｇｅｎ　ＡＧ　０ ＬＢ培地（１１当たり）＋　ＮａＣ１１０ｐ、酵母エキ
ス５り、トリプトン１０　ｆ　、　Ｎａ０ｔｌ　（５０
％）、１７ｍｅ。

ＬＢ寒天（ｌｚ当たり）ニドリプトンｌＯｙ、酵母エキ
ス５ノ、ＮａＣ４，５ｆ、ＢａｃＬｏ　−Ａｇａｒ　１
５７、Ｎ　ａ　ＯＨでｐＨ７，５に調節。

抗生物質二全ての培地にテトラサイクリン（５μ）／ｍ
ｒ）；全での培地にアンピシリン（２０μｙ／、、ｅ　
）　（平板または液体）。

Ｍ９培地（１１当たり）二Ｎａ２ＩＩＰＯ４（無水）６
　ｙ　；　Ｎｌ−１４Ｃ／　１　ｙ　；　ＫＮ２ＰＯ４
３ｙ　：　ＮａＣｚ　、５　ｙ；　Ｍｇ５０４１　ｍＭ
　；　０．５％（Ｗ／ｖ）グルコース；０．５％（Ｗ／
Ｖ）カザミノ酸；　、０００１％チアミン−Ｃｌ０ ＹＮＢ−ＣＡＡ（１１当たり）：酵母含窒素塩基（アミ
ノ酸なし）６．７グ；アデニン１０巧；ウラシル１０　
ｍｌ　；カザミノ酸５ｙ；グルコース２０り。

ＹＮＢ−ＣＡＡ寒天平板（１１当たり）：ＹＮＢ−ＣＡ
Ａ＋寒天３０ｙ、’ 標準的ライゲーション条件二ベクターに対し１０倍モル
過剰の挿入体（またはリンカ−）。１×１”４ＤＮＡリ
ガーゼ緩衝液および４００−８０　ＱｔＪ　Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ；１４°−１２−１６時間。

標準的キネ−ジョン（［１ｎａｔｉｏｎ　）条件：１×
ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液；１５Ｕポリヌクレオ
チドキナーゼ；３７°、６０分−次いて６５°で１０分
間加熱して反応終結。

１×キナ一ゼ緩衝液ニア０ｍＭ１−リス−１１ＣＩ（ｐ
Ｈ７、６）　；　１　ｇｍＭ　ＭｇＣｌ２；　５ｍＭ　
１）−ｒ　Ｔ。

ＩＸＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液；５０ｍＭ）リス−ＨＣ
ｌ（ｐ）ｆ　７．８　）　：　１０　ｒｎＭ　Ｍｇ　Ｃ
１２：　２０　ｍＭＤＴＴ　；　１　ｍＭ　ｒ　ＡＴＰ
　０ＤＮＡ　ｌ　’　５Ｌｒａｔｅ　“よ ひ選択 ヒ）　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１分子の１°蛋白質構造は決定され
ている（１）。この蛋白質の配列および遺伝暗号に基い
て、成熟ヒトＩ　ＣＦ　−１蛋白質を暗号化しているＤ
ＮＡ配列（全ての塩基位置に於ける全ての可能な塩基置
換体を含む）をコンピューター分析（Ｇｃｎｅｎｔｅｃ
ｂ　Ｕｎｔｒａｎｓ　Ｉ’ｒｏｇｒａｍ　）によッテ決
定した。制限部位分析プログラム（Ｇｅｎｅｎｔｃｃ１
１’ＡｓｃａｒｃｂＰｒｏｇｒａｍ　）を使用して、同
じ蛋白質を一貫して暗号化している全ての可能なＩ）　
Ｎ　Ａ配列内に存在している、可能性のある全ゆる制限
部位が見つけられた。この暗号配列内の３つの部位−即
ちＩ’ｓｔＪ、Ｂａｍ　Ｉｆ　ＩおよびＡ　ｖ　ａ　’
１１を選んだ。更に２つの部位が、両末端、成熟蛋白質
の暗号配列の丁度外側に置かれた：１つは開始コドン、
ＡＵＧの前のＥｃ。

Ｒ１部位、もう１つは暗号配列の終止コドン、ＴＡＣに
続（Ｓａｌ　Ｉ部位である。これらの部位の選択により
、暗号配列を別々のパーツ（一部分）にしてクローニン
グすることができ、次いでそれらをそれぞれ切り取って
集め、完全なＩＧＦ−１遺伝子を作成することができた
。この組み立ては、左半分を形成している２つのパーツ
−右半分を形成している２つのパーツ、の４つのパーツ
を集めて組み立てることであった。各パーツは、化学的
に合成したＩ）　Ｎ　Ａの２本鎖で構成されている（第
１図）。提案された合成フラグメントはまた、内部相補
性について分析された。

これらの４つのパーツを生成させるのに使用した組み立
てには−その３′末端に９−１０ｂｐの長さの相補配列
を持った合成オリゴヌクレオチド基質のＤＮＡポリメラ
ーゼ１修複合成を用いた。１）ＮＡポリメラーゼＩ　（
Ｋｌｅｎｏｗ）および４つのデオキシヌクレオシド・ト
リホスフェートの存在下で、これらのプライマー−鋳型
は伸長されて全長２本鎖ＤＮＡとなった。所望の部分以
外の場所でのプライミング−および自己−ハイフ゛リダ
イゼ、−ジョンを避けるために、各セットの１本鎖１）
　Ｎ　Ａ群をコンピュータープログラム（Ｇｅｎｅｎｔ
ｃｃｈ　ＨｏｍｏｌｏｇｙＰｒａｇｒａｍ　）　ニヨっ
て分析し、可能な限り、ヘアピンル−プ、自己−プライ
ミングまたはミス−フライミンクを起す可能性のある配
列を除去して別のコドンで置き換えた。これらの４つの
２本鎖ＤＮＡのそれぞれは、Ｉ　Ｇ　ｌ；　−１を暗号
化していないＤＮＡの９−１２ｂｌ）を、さらに、各末
端に含んでいる（第２図参照）。この追加のＤＮＡは一
制限酵素消化によって粘着末端を生成できるようにする
為に含ませた。この様にして生成した粘着末端により、
その２本鎖片を、合成遺伝子の隣接する暗号断片あるい
はクローニングビヒクルにライゲーションすることがで
きる。

各部分の末端の制限部位の先にある２本鎖１）ＮＡの追
加の９−１２ｂｌ）（第２図）により、−１’ｃｌＴ媒
介によって、各２本鎖ＤＮＡ断片の３′末端に１本鎖の
オリゴデオキシシチジン鎖を形成させることができた。

これらのオリゴデオキシシチジンを尾部とする２本鎖１
）　Ｎ　Ａを相補的なオリゴデオキシグアノシンを尾部
とするークローニングビヒクルのｌ’ｓｔ１部位にアニ
ーリングすることができた。

クローンし、配列を決定］７て正しい塩基配列を確認し
たら、その部分を、その４つのパーツのそれぞれの末端
で選択された制限部位を制限酵素で開裂した後、容易に
単離し、結合させることができ、完全な合成Ｉ　Ｇ　ｌ
”−１逍伝子を形成さぜることかできた。

本発明に於いて使用し、成功した方法は、Ｒｏｓｓｉら
の方法（文献２８）に類似している。しかし、制限酵素
認識部位の先の僅か２つの過剰ＤＮＡの塩基対を使用す
るＲｏｓｓｉらの方法でＩ　ＣＦ−１暗号配列を組み立
て−クローニングする試みは、繰返し失敗に終った。本
発明に於いて採用した方法は、また、次の点でＲｏｓｓ
ｉらの方法と異なっている：即ち、２本鎖１）　Ｎ　Ａ
の両末端に置いた制限部位により、スリー・パート・ラ
イゲーションより２本鎖ＤＮＡの要求量が少ない方法、
（ｄｃ）−尾部化および（ｄＧ）−尾部化ベクターへの
アニーリングにより御名２本鎖１）　Ｎ　Ａフラグメン
トをそれぞれクローニングするのに便利である。

化学合成 ＣｒｅａおよびＨ□ｒｎの方法（文献２）により、長さ
が４３．４，１４６．４６．４６．４６．５４および４
６塩基の８つのフラグメントを化学合成した。ただし−
縮合剤として、２．４．６−トリイソプロビルベンゼン
スルホニルクロリド　テトラゾールの代りにメシチレン
ニトロトリアゾールを使用した。

フラグメントの合成は、適当な固形担体（セルロース）
に、適当な完全に保護されたダイマーまたはトリマーブ
ロックを順次添加していくことにより行なった。ザイク
ルは、オリゴチミジン酸の合成について記載されたもの
（Ｃｒｅａら、上記）と同じ条件で行なった。最終的な
ポリマーを塩基（濃アンモニア水）および酸（８０％ｔ
ｌＯＡｃ　）て処理１．、ポリマーをペレット化し一上
清を蒸発乾固した。残渣を４％アンモニア水に溶かし、
エチルエステルで３回洗い、完全に脱保護されたフラグ
メントの分類に使用した。

２０％ポリアクリルアミドゲルを使って電気泳動法によ
り精製した。純化したオリゴヌクレオチドはゲル溶出の
後エタノール沈澱にかけた。

ｄＣＴＰは例外であるが一最終濃度２００μＭのデオキ
シリポヌクレオシドトリホスフェートの存在下、２２５
−２８５ピコモルの各化学合成フラグメントを当量の相
補性１本鎖Ｉ）　Ｎ　Ａフラグメントと混合した（即ち
、ＩＬ＋３Ｌ：２Ｌ＋４Ｌ；ｌＲ＋　３　Ｒ；　２　Ｒ
−１−４１’−）。ｄＣＴＰは、比活性１０００−２ｏ
ｏｏｃｉ／ミリモルのα３２ｐ−標識アイソトープとし
て５１℃Ｍの濃度て加え、修複合成反応生成物のモニタ
ーが容易に行なえる杵にした。この反応は、最終濃度５
０ｍＭのトリスト１ｃｌ（ｐｉｔ　７．５）、２０ｍＭ
のＭｇＣｌ２．２０ｍＭのＤ　１’　■および１５４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ■（Ｋｌｃｎｏｗ　）を含む緩衝液中
、反応容量２００１ｔｌで行なった。反応は４°Ｃで１
２−１８時間行なった。

反応終了後、Ｅｌ）ＴＡを２５ｍＭの濃度で加えた。

混合物を含む試料緩衝液をフェノール抽出−クロロホル
ムで２回抽出し一生酸物をエタノール沈澱に付した。ペ
レットを、　３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃにとり、１）ＮＡをエ
タノールで沈澱させた。このペレットヲ水に溶解した後
、ＩＬ−１−３１，、および２Ｌ＋４Ｌ生成物を別々に
、ＩＸＰｓｔＩ［衝液（５Ｑ　ｍ　Ｍ　（ＮＨ４）２Ｓ
Ｏ４，２０１１１Ｎ４トリスＨＣｔ　（ｐＨ７，５）、
ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ１２）および７ＱＵＰｓｔＪを
含んでいる反応ミックス１０Ｏ１ｌｌ中、Ｐｓｔｌ’で
消化した。４時間後、Ｉ！、１）ＴＡを１０ｍＭの濃度
になる様に加え一エタノール沈澱にかけた。ペレットを
、　３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃにとって再沈澱させ、次いて水
に入れた。ＰｓｔＩ−消化したｌＬ＋３Ｌ生成物を１０
０／７１！の反応ミックス１ｘＥｃ。

１（１緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ！、６ｍＭトリス
ｔ：ｘｃ、　（ｐＨ７，５）、６　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　
）および７　Ｑ　Ｕ　ＪｉｃｏＲＩ中−３７°ＣてＥｃ
ｏＲＩ消化した。Ｐｓｔｌ消化２Ｌ＋４Ｌ生成物は、Ｉ
　Ｘ　Ｂａｍ１月緩衝液（ｌ　５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣ１
，６ｍＭトリスＨＣｚ　（ｐＨ７１ｇ　）、５　ｍＭ　
ＭｇＣｊ’２　）および７０　Ｕ　Ｂａｍ１目の反応ミ
ックス１ｏｏｌｔｌ中、３７°Ｃテ１３ａｍｆ−１１消
化した。４時間後、Ｉｉ　Ｉ）ＴＡを両温合物に加え、
試料緩衝液を加えた。それらを６％ポリアクリルアミド
平板ゲル電気泳動にがけた。６％平板ゲルは６％（Ｗ／
Ｖ）アクリルアミド（アクリルアミド対ビスアクリルア
ミドが２０対１）ＩＸＴＢＥ、１％ＡＰＳおよび０．１
％Ｔ　Ｉ　Ｍ　Ｅ　ｌ）を含む混合物に流し込んで調製
した。反応生成物をオートラジオクラフィーによリーゲ
ル上で位置づけ−４５ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ工消
化ＩＬ＋３Ｌ生成物（パーツ１）（第３図参照）に相当
する化（バンド）および５０　ｂｐＰｓ　Ｌ　１−　Ｂ
ａｍ　ｌ−Ｉ　Ｉ消化２Ｌ−１−４Ｌ生成物（パーツ２
）（第３図参照）をゲルから切り取り、物質を０、２　
ｘ　−１’Ｂ　Ｉ；、に電気溶出し、フェノール抽出し
、クロロホルム抽出した後エタノール沈澱にかけた。

次いてパーツ１および２を水に溶解した。

クローニングベクターは、ｌ×ＲＩ緩衝液中、ｐＢＲ３
２２（文献１５）２０μりを５０ＵＥｃｏＲＩおよヒ５
　Ｑ　Ｕ　Ｂａｍ［ｌＩて、３７℃で６時間消化するこ
とにより調製した。ＥＤ　Ｔ　ＡをｌＱｍＭの濃度にな
る様添加した後、試料緩衝液を加え、この混合物を５％
ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。

５μり／ｍｅの１う【、プロミドを含有する水中で１０
′染色して着色し、水で２回洗浄し、ＵＶ徹照装置（３
０２ｎＭ）の上に置いた。約３７１２　ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ−Ｂａｍ　Ｉ−Ｉ　Ｉ消化ｐＢＲ３２２分子に相当す
る帯をゲルから切り取った。このゲル片からＤＮＡを電
気溶出し、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出
し一エタノール沈澱にかけた。ペレットを水に溶かし、
ライゲーションに備えた。

ライゲーション ライゲーション反応において挿入体とベクターのモル比
がほぼｌＯＯ１２あるスリー　パート・ライゲーション
（第４図参照）において、パーツ１および２を、ｌ、ｘ
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ）リスＨＣ１（ｐ
ｔ＋　７．８　）、１０ｎ１ＭＭ１０ｎ１．２０ｍＭ　
ＤＴＴ、ｌ　ｍＭ　ｒＡＴｌ’　）および〜８００ＵＴ
４　ＤＮＡＮカリゼ（ＮＥＢ）中、１ｉｃｏ　ＲＩ　−
ＢａｒｎＩｌｌ消化３２２ベクターに結合させた。この
反応は１４°で１２−１６時間行なった。

形質転換 形質転換宿主としてＥ、ｃｏｌｉ株２９４を使用し、Ｍ
、　ｌ：）ａｇｅｒｔおよびＳ、Ｄ、　Ｅｈｒｌ　ｉｃ
ｂ　（文献３）の方法を用いて行なった。形質転換細胞
をアンピシリン（２０μｙ／ｍｅ）含有１−Ｂ−寒天プ
レート（Ｌ１３−Ａ＋ｎｐ−プレート）に置き、形質転
換体をスクリーニングし一２０μｙ／Ｉ＋Ｉｅのアンピ
シリンを含むＬＢ培地で増殖させた。Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
およびｎｏｌｙ（文献４）の迅速ミニスクリーニング法
の改良法を用いて形質転換体をスクリーニングした。こ
の様にして調製した少量の（ｍ１ｎｉｐｒｃｐ　）　Ｄ
ＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１目で消化し−ポリアク
リルアミド平板ゲル上で泳動させた。約２１８　ｆｏｐ
　Ｉ’、ｃｏ　ＲＩ　−Ｂａｍ１１　Ｉ挿入体を示した
数個の形質転換体を多量に増殖させ、それぞれからプラ
スミドを分離し、ＭａｘａｍおよびＱｉｌｂｃｒｔの方
法（文献５）によって配列を決め一正しい化学合成およ
び組み立てを確認した。

Ｉ　ＣＦ−１の完全な正しい左半分の配列を含有してい
るＰＢＲ３２２ベクターは、Ｉ　Ｇ　Ｆ−Ｉ　ＬＨ３２
２と命名された（第５図参照）。

Ｉ　Ｇ　ｌ＝’　−１の右半分のフラグメントのクロー
ニング １）　Ｎ　Ａポリメラーゼ■−媒介修複合成の同じ条件
で、合成ＩＧＦ−１の右半分を含む２個のフラグメント
対を２本鎖ＤＮＡに変換した。ＤＮＡポリメラーゼ■反
応の後、酵素消化を行なうことなく＝　ＩＲ＋３Ｒ（パ
ーツ■）および２Ｒ＋４Ｒ（パーツ■）反応物を６％ポ
リアクリルアミド平板ゲル上で泳動させた。オートラジ
オグラフィーにより８３ｂｐ（パーツ■）およ′び９　
ｌ　ｂ＋）　（パーツ■）帯を位置づけ、ゲルから切り
取った。電気溶出の後、エタノール沈澱させた２本鎖Ｄ
ＮＡを、Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａ　ｒｏ　ｆ　ｆら（文献
６）およびＲｏｗｃｎＫａｍｐおよびＦｉｒｔｅｌ　（
文献７）の方法を使ってｄＣ−尾部形成した（第６図参
照）。この反応は、５０μｌ容量の１×テイリングミツ
クス（，２Ｍカコジル酸カリウム、２５ｍＭ）リスｔ−
Ｉｃ、　（ｐＨ６，９）、２１ｎＭＤＴＴ、、５　ｍＭ
　ＣｏＣ／２　）および２２１１ｍｄＣＴＰを用いて行
なった。３７°で１０分間予備加渦した後、１０−２０
単位のターミナルヌクレオチジルトランスフエラ丁ゼを
加えて１５０秒反応を行ない、ＥＤＴＡを加えて反応を
終結し、フェノール抽出、クロロホルム抽出しく２回）
、エタノール沈澱にかけた。

これらのオリゴ（ｄＣ）尾部化パーツ■および■を、別
々に、５０μｌの１×アニーリング緩衝液（、ＩＭ　Ｎ
ａＣ１，１０ｍＭ）リストＩＣ１（ｐｉ−１７，８）、
ｌ　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　）中、最終ＤＮＡ濃度”２μ７
／ｍｅで、当モル量のオリゴ（ｄＧ）−尾部化ＰｓｔＩ
切断ｐＢＲ３２２ベクターと混合した。７５℃に加熱し
た後−混合物を１６時間で徐々に４℃まで冷却し、この
混合物を、ＤｅｇｅｒｒおよびＪｉｌｌｒ　ｌ　ｉ　ｃ
ｈの方法（文献３）に従って、コンピテントＥ、ｃｏｌ
ｉ２９４細胞に導入した。形質転換細胞をＬＢ−テトラ
サイクリン−寒天平板に置き、５１１７／−のテトラサ
イクリン濃度のＬＢ−テトラサイクリン培地で増殖さぜ
た。テトラサイクリン耐性の形質転換体をひろい上げ、
ＬＢ−アンピシリン−寒天平板にうえつけ、ＰｓＬＪ部
位で挿入されたかどうかを調べた。

パーツ３および４のそれぞれについて数個のテトラサイ
クリン耐性、アンピシリン感受性のコロニーをミニスク
リーニングし、ｌ’ｓＬＩ部位に於ける挿入を示すもの
を大規模に増殖させ−ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｃｒｔ
の技術（文献５）によって配列を決定し、パーツ３およ
び４の正しい配列を確認した。

完全な合成１−１ｕ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１暗号配列の組み立
て調製：パーツ３および４ ｌ　Ｘ　ＡＶａ　ＩＩ　Ｒ衝液（６０ｍＭ　ＮａＣｚ、
６ｍＭ）　リス−ｔｌｃｚ　（ｐＩ−１８，０）、ｌ　
Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣ４２，６ｍ　Ｍ　２−メルカプトエタ
ノール）中、３０ＵのＡｖａ■を用いて各ベクター２０
ｔｔｙを消化し、パーツ３および４をそれぞれそのベク
ターから分間１した。３７°Ｃて６時間後、１５０１１
１の反応物にＥＤＴＡを１５ｍＭの濃度になる様に添加
し、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し一エ
タノール沈澱させた。

次いでパーツ３のペレットをｌ　Ｘ　Ｂａｍｌ−１１緩
衝液にとり、１５０μｌの容量中、３０ＵのＢａｍＨｌ
を用いて３７°Ｃて４時間消化した。パーツ４を含んで
いるペレットは−１５０μｌのｌ×５ａｌＩ緩衝液中−
３ＱＬＩＳａ１１：により３７℃で４時間消化した。

両消化物を６％ポリアクリルアミド平４１１２（スラブ
）ゲル上で泳動させて染色した。パーツ３に相当する５
　１　ｂｐ帯およびパーツ４に相当する６２ｂｐ帯をゲ
ルから取り出し、ＤＮＡを電気溶出し、フェノール抽出
し−クロロホルム抽出を２回行ない、エタノール沈澱さ
せた。次いでペレットを水に取り−ライゲーション（結
合）に備えた。

ベクター調製 ２０μりのＩＧＦ−１ＬＩ１３２２ベクターを一１×１
３ａｍ　ｔｌ　Ｔ　Ｍ衝液を含む２００１１１の反応系
中、５０Ｕ　（７）　Ｂａｍ　Ｉ−１１と５０ＵのＳａ
ｌ　ｌにより３７°で６時間消化した。ＥＩ）ＴＡを１
５ｒｎＭの濃度に添加した後、消化混合物を６％ポリア
クリルアミド平板ゲル上で泳動し、エチジウムプロミド
染色し、３８１４ｂｐ帯をゲルから切り取った。

電気溶出、フェノール抽出、クロロホルム抽出およびエ
タノール沈澱の後−ＤＮＡペレットを水に取り、スリー
　パート・ライゲーションでパーツ３および４と結合さ
せた。この結合は、既述したスリー・パート・ライゲー
ションの場合と同し条件で行なった（第７図参照）。パ
ーツ３および４は、ライゲーションミックス中、ベクタ
ーに対して１０倍モル過剰量の挿入体の形で存在してい
た。この混合物を、Ｄａｇｃｒｔおよび１；、ｈｒｌｉ
ｃｈ　（７）方法（文献３）によって調製したコンピテ
ントＥ。

ｃｏｌｉ２９４細胞に尋人し、ＬＢ−アンピシリン平板
上に植えつけた。数個の形竹転換体をミニスクリーニン
グし、約１１５　ｂｐ　Ｂａｍ１−１１−５ａｌ　Ｉ　
７ラグメントを示す２つのクローンを大量に増殖させ−
それらのプラスミドを調製した。完全な合成遺伝子の両
方の蛸の配列をＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒ　ノ方法（５
）で決定し、その正しい配列を確認した。ヒトＩＧ１・
−１を暗号化している完全な正しい配列を含んでいるこ
のｐＢＲ３２２プラスミドをｐＢＲ３２２１（ｕＩＧＦ
−１と命名した。

細菌内でのＩ　Ｇ　Ｆ　−１融合発現 初期の試みは融合蛋白質としてＩＧＦ−１を発現するこ
とであった。これを達成する為、ｐ　Ｎ　ＣＶ（文献９
）およびｐＮＣＶｓ　ＬＥ　（文献１０）発現ベクター
を使用した。ｐＮＣＶｓＬＥ発現ベクターはｐＮＣＶ　
ベクターの誘導体であり、以下の如くして調製した：即
ち一、ｐＮＣＶを、ＬＥ融合の１３コドンを開裂するＢ
ｇｌ　■で処理した。この部位を合成りＮＡを使ってＥ
ｃｏＲＩ開裂部位に変換し、発現ベクターｐＮＣＶｓＬ
Ｅを得た。このプラスミドに導入した合成りＮＡは次の
配列を持っており、５’　−Ｇ　Ａ　ＴＣＣＡ　ＧΔＡ
ＴＴＣ５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧ この配列をプラスミド： Ｇ　Ａ　ＴＣＣＡ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＧ　Ｔ　Ｃ
Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　ＣＴＡ　Ｇに導入した。

ｔｒｐ融合蛋白質からヒ１−　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１蛋白質を
遊離させる方法として、Ｗｕｎ　ｓ　ｃｈ　らの酵素的
蛋白質分解法（文献８）をこの発現系に適用し得る様に
、リンカ−を設計した。これを達成する為、以下のＤＮ
Ａリンカ−： ｒｏＡｌａ ５’−ＡＡＴＴＣＣＣＴＧＣＣＧ　−３’３’　ＧＧＧ
ＡＣＧＧＣＣＡＧ−５ を標準的方法（文献２）により化学合成した。これは、
ｔｒｐ融合蛋白質およびＩ　ＣＦ　−１遺伝子に結合さ
れると、Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１の最初の２つのアミノ酸残基
であり、プロリンおよびアラニンが前につくことによっ
て、一緒になってＣ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ＋ｎｈｉｓｔｏ
ｌｙｔｉｃｕｍ　（文献１１および１２）から分離され
たコラゲナーゼの認識部位を形成するグリシンおよびプ
ロリンの前に、アミノ酸残基プロリンおよびアラニンを
暗号化する。この酵素は、この様な部位に作用してアラ
ニン−グリシンペプチド結合を開裂するといわれている
。

コラゲナーゼ開裂部位を持った融合蛋白質を暗号化して
いるＤＮＡ配列を組み立てる為に、３゜７ｚｙ（７）ｐ
ＢＲ３２２１−１ｕｌＧｌ’−１プラスミドを、２００
ｉｌｌのＩ　Ｘ　Ｂａｍ　ｔｌ　Ｉ緩衝液中、５０　Ｕ
　Ｂａｍ　ＩＩＩおよび５０　Ｕ　Ｐｖｕ　■酵素によ
って、３７℃で６時間開裂させた。ＥＤＴＡを１５ｍＭ
の濃度に加えた後、反応混合物を６％ポリアクリルアミ
ド平板ゲル上でクロマトグラフィーした。小さい方のＰ
ｖｕｉ−Ｂａｍ　Ｉ−Ｉ　Ｉフラグメント（〜７２５ｂ
Ｐ）を分離し、１５０μｌの！Ｘ５ａｕ９６Ｉ緩衝液（
６Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｅ、６ｍＭトリス−Ｉ］Ｃ１（ｐＨ
７，４）、ｌ　５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６ｍＭ２−メルカ
プトエタノール）中、４０Ｕ　のＡｖａｌＩで消化した
。ＥＤＴＡを１５ｎ）Ｍの濃度で添加した後−得られた
混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上でクロマト
グラフィーした。小さい方（７）Ｓａｕ９６Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩフラグメント（〜８６ｂｐ）をゲルから抽出し、フ
ェノール抽出し−クロロホルムで２回抽出し、エタノー
ル沈澱させた。

このフラグメントをライゲーションに用いた。

リンカ−フラグメント２００１３モルを一２０１ｉｅの
１×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液（７０ｍＭ）リス
−ＨＣｌ（ｐｉ−１７，６）、１０ｍＭＭｇＣ１２゜５
ｍＭＤＴＴ、１ｍＭｒＡＴｌ’）中、３７°Ｃて１時間
、１００Ｕのポリヌクレオチドキナーゼで処理した。

６５℃で５分間加熱して反応を終結させた。キナーゼ処
理したリンカ−フラグメント１００ピコモルを、３０ｔ
ｔｉのＩＸＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、１４°で１２
−１６時間、８６　ｂｐ　Ｓａｕ　９５　ニー　Ｂａｍ
１１１　フラグメントに結合させた。このライゲーショ
ン反応を、ＥＤＴＡを１５ｍＭの濃度になる様に加えて
終了させ、フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出
し、エタノール沈殿させた。ペレットをＩ　Ｘ　Ｂａｍ
　Ｈ１緩衝液にとり、５０Ｕ（７）ＥｃｏＲＩおよび５
０　Ｕ（ｙ）　ＢａｍＨＩを含む反応液１００μｌ中、
３７°で６時間消化した。ＥＤＴＡを加えて消化を終結
させ、この混合物を６％ポリアクリルアミド平板ゲル上
でクロマトグラフィーし一新たに生成した（〜９７　ｂ
ｐ　）　ｌ１ｃｏ　ＲＩ　−Ｂａｍｌｉｌ　７ラグメン
トをゲルから抽出し、ライゲーションに備えた。この新
しいフラグメントを受け入れるベクターは、２００　ｐ
ｔｒのＩ　Ｘ　Ｂａｍ　ＨＩ緩衝液中、３０　ＩＩ　！
　（Ｄ　Ｉ）　ｌ５Ｒ３２２Ｈｕ　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１を
、それぞれ１００ＵのＥｃｏＲＩおよびＢａｍ　［Ｉ　
Ｉによって、３７°で８時間消化することによって調製
した。反応を終了させ、６％ポリアクリルアミド平板ゲ
ル上でクロマトグラフィーし、ＥｃｏＲＩ〜Ｂａｍ１ｌ
ｌ消化プラスミドに相当する大きい方の帯（〜３８３０
　ｂｐ　）を分離し、このプラスミドＤＮＡを抽出し、
ライゲーションに備エタ。ベクターに対して挿入フラグ
メント１０倍モル過剰量を含む３０μｌのライゲーショ
ン反応物中、Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｂａｍｌ−ＩＩ　７ラグメ
ントを、上記の標準的なライゲーション条件下で、Ｅｃ
ｏ　ＲＩ　−Ｂａｍｌｌｌ消化プラスミドＰＢＲ３２２
Ｈｕ　ＩＧＩ’−１に結合させた。既述した様にして（
文献３）調製したコンビテン）　Ｅ、　ｃｏｌｉ　２ｇ
４を形質転換用宿主として使用し、形質転換した細胞を
ＬＢ−アンピシリン寒天平板上に植えた。数個の形質転
換体を拾い上け、既述した如く（文献４）ミニスクリー
ニングし、Ｅｃ　ｏ　Ｒｌ　−Ｂａｍ　１４１挿入を示
す２個を多量に増殖させ、それらのプラスミドを精製し
た。Ｍａｘａｍ　−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（文献５）を使っ
て構成物の配列を決定し、Ｉうｃｏｌｋｌ−５ａｕ９５
■コラ−ゲナーゼリンカ−の合成および挿入を証明した
。このプラスミドはｐＢＲ３２２１−１ｕｓｙｎ　ＩＧ
Ｉ’−１−Ｍと命名した。

ｐＮＣＶおよびｐＮＣＶｓ　ＬＥ　Ｊこ挿入するための
このＥｃｏ　ＲＩ　−Ｓａｌ　ＩＩ　ＣＦ　−１暗号配
列を調製すルタめに一３０μノのＰＢＲ３２２１−１ｕ
Ｓｙｎ　ＩＣ，ｌ’−１−Ｍを２００Ｉｌｌの１ｘＳａ
ｌＩ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１！、６ｍＭトリフ、
　−ＨＣｌ（＋）Ｉ−１７，９）、５　＋ｎ　Ｍ　Ｍｇ
Ｃ１２，６１ＴＩＭ２−メルカプトエタノール）中、７
０Ｕの５ａｌｌを用いて、３７°で６時間消化シタ。Ｅ
ＤＴＡを１５ｍＭになる様に添加した後、この混合物を
フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、エタノ
ール沈澱させた。

標準的な化学合成法（文献２）により、Ｓａｌｉ−Ｅｃ
ｏＲＩリンカー： ５’　ＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＴＧ　３’３　ＧＣＡＴＧ
ＴＡＣＴＴＡＡ　５ を合成し、４００ピコモルを既述した様にキナーゼ処理
した。２００ピコモルのキナーゼ処理リンカ−を−３０
７ｚｚの１×ライゲーシヨン緩街液中、８００Ｕの１’
４ＤＮＡリガーゼを用いて、５ａｉｌ：消化ｐＢＲ３２
２１４ｕｓｙｎ　ＩＧＩ・−１−Ｍ（既述した様に調製
）に、１４℃で１２−１６時間反応させて結合した。

Ｅ　ｌ）　Ｔ　Ａで反応を終結した後−混合物をフェノ
ール抽出し、クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈
澱させた。ペレットを１　ｘ　１’、ｃｏ　ＲＩ１７街
液にとり、容量２００／ｌｌ中の１００ＵＥｃｏＲＩて
、３７゜で８時間消化した。ＥＤＴＡを１５ｍＭの濃度
で加えた後、この混合物を６％ポリアクリルアミド平板
ゲル上でクロマトグラフィーした。このゲルを染色し、
Ｅｃｏ　ＲＩ　−１ｉｃｏＲＩ　Ｎｕ　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−
１７ラグメントに相当する〜２３０　ｂｐ帯をゲルから
抽出し一フェノール抽出し、クロロホルムで２回抽出し
、エタノール沈澱させた。このフラグメントはＩ）ＮＣ
ＶおよびｐＮＣＶｓＬＥにライゲーションし得るもので
あツタ。ｐＮＣＶおよびｐＮＣＶｓＬＥは−２０（Ｈｚ
ｅのｌＸＥＣ０ＩζＩ緩衝液中−それぞれ２０　／ｌり
を、１００ＵのＥｃｏＲｌを用いて、３７°で８時間消
化してライゲーションに備えた。消化後、細菌性アルカ
リホスファターゼ２００Ｕを各反応物に加え−その混合
物を６５℃で２時間加／晶した。１ＤＴＡを１５ｍＭの
濃度となる様に添加し一混合物を３回フェノール抽、出
し、クロロホルムで２回抽出し、次いでエタノール沈澱
させた。これらの発現ベクターをライゲーション用に調
製した。

Ｅｃｏ　Ｒ１−ＥｃｏＲＩヒトＩ　Ｇ　Ｆ−１フラグメ
ントのこの２つの発現ベクターへの結合（ライゲーショ
ン）は、１×１”４ＤＮＡリガーゼ緩衝液と８００Ｕの
丁４１）ＮＡリガーゼの３０１１１反応液中、１４°で
１２〜１６時間行なった。ＥｃｏＲＩ　−１ｉｃｏＲＩ
　フラグメントは、ベクターに対して１０倍モル過剰量
存在せしめた。

コンピテントＥ、ｃｏｌｉ２９４を調製しく文献３）（
ＡＴＣＣ３１４４６）、ライゲーションのための形質転
換宿主として用いた。形質転換細胞をテトラサイクリン
含有Ｌ　Ｉｓ−ブ（大平板（５ｔｔｙ　／ｌｈｅ　−Ｌ
ｔｓ−−１’ｅ　Ｌ−平板）上に植え、形質転換体をミ
ニスクリーニングした（文部４）。ｐＮｃＶ−ＩＧＦ−
１構成物の形質転換体からのミニスクリーンプラスミド
ＤＮＡを−ＰｓｔｌおよびＢｇ目■の両者で消化し、Ｅ
ｃｏＲＩ　フラグメント挿入の配向性を調べた。そのプ
ラスミドが〜５７０　ｂｐ　Ｂｇｌ　ＩＩ−Ｐｓｔ　Ｉ
フラグメント（〜６９０　ｂｐフラグメントと対照的に
）を含んでいる２つのクローンを多量に増殖させ、それ
らのプラスミドを調製した。この構成物の配列をＭａｘ
ａｍ−Ｇｉｌｂｃｒｔ法（文献５）により測定し、ｔｒ
ｐ融合とｌ　ＣＦ　−１蛋白質暗号配列の接合部での正
しい挿入および所望の読み取り枠の保持を確認した。正
しく挿入されたＩ　ＣＦ−１フラグメントを持ったプラ
スミドはｐＮＣＶＬＥ−ＩＧ’Ｆ−１と命名された。ｐ
ＮＣＶ−ｓＬＥ−ＩＣＦ−１構成物の形質転換体も同じ
方法（文献５）でミニスクリーニングし、このプラスミ
ドＤＮＡをｔｌｉｎｃｌＩおよびＰＳｔ■で消化した。

〜１５Ｑｂｐｌ−１ｉｎｃｌ［−Ｐｓｔ■フラグメント
（〜１０５　ｂｐ　Ｈｉｎｃ　ｌｌ−１−１ｉｎｃ　Ｒ
７ラグメントと対照的に′）を示す２つのクローンを多
ＩＩ′ｌ：に増殖させ、それらのプラスミドを調製した
。

Ｍａｘａｍ−ＧｉｌｂｅｒＬ技術（文献５）を使ッテ、
ｔｒｐ融合およびＩＧＦ−１蛋白質暗号配列の機能を配
列化し、適切な配向性および適当な読み取り枠の保持を
確認した。この正しい挿入および適切な読み取り枠を持
ったプラスミドは、１）Ｎ　ＣＶ　−ｓ　Ｌ　Ｅ　−Ｉ
　Ｇ　Ｆ−１と命名した。

これらの構成物のそれぞれを発現させるために、２つの
クローン、即ち一一方はｐＮＣＶ−Ｉ　ＣＦ−１、他方
ハ１）ＮＣＶ−５ＬＥ　−Ｉ　Ｇ　ｌ’−１ヲ持）　モ
（Ｄ−ヲＱ、５ｍｙ　／　ｍｅのトリプトファンを補充
した１０−のＲ９−テトラサイクリン培養培地に接種し
た。ＩＧＦ−１遺伝子挿入物を持たないｐＮＣＶ−ＬＥ
含有クローンも、アッセイに於けるネガティブ対照とす
るために、培養培地に接種した。

かきまぜながら３７°で１２−１６時間増殖させた後、
これらの培地０．５−を使ってＲ９−テトラサイクリン
培養培地２５０　ｍｌに接種した。がきまぜ下に３７°
で１２〜１６時間増殖させた後、５ｏｒｖａｌ　ｌ　Ｇ
　Ｓ　Ａ　ｏ−ターを用い、５０００ｒｐｍ　で１０分
間遠心分離して細胞を収穫した。屈折体（ｒｃｆｒａｃ
ｔｉｌｅ　ｂｏｄｉｅｓ　）を、ａ）宿主蛋白質ノホト
んどを溶解するのに適したイオン強度の緩衝溶液に宿主
細胞を懸溺さぜ、ｂ）この懸濁液を細胞壁／膜分裂にか
け、Ｃ）この分裂懸濁液を低速で遠心分離してペレット
を形成させ、所望により、先の工程を繰り返し、そして
ｄ）ペレットに屈折体としてヘテロローガス（異種）蛋
白質を回収する（文献１３）。３つの標品のそれぞれの
屈折性粒子少量を、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノ
ール含有試料緩衝液中で煮沸し−Ｌａ　ｃ　ｎｕｎ　ｌ
　ｉ　の方法（文献１４）に従って５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミド平板ゲル上で泳動させた。Ｉ）ＮＣＶ　−Ｉ　
ＣＦ　−１（ＬＥ−ＩＣＦ−１）によって発現された蛋
白質のサイズは〜２８，６７０ダルトン（第７図）であ
り、ｐＮＣＶ−ｓＬＥ−ＩＣＦ−１蛋白質（ｓＬＥ−Ｉ
ＣＦ　−１）については〜９７７０ダルトンであった（
第８図）。これらの２つの発現された蛋白質を６Ｍグア
ニジン−Ｉ−１ｃｌに溶解させ、希釈緩衝液で５０倍に
希釈した。希釈後のｐＮＣＶ−Ｉ　ＣＦ−１のための最
終ｇ衝液はｏ、１２Ｍグアー、’）７−１−１ＣＩ−、
Ｑ５Ｍト！Ｊ　７．−１−１ｃｚ　（ｐｌ−１８）、２
０％グリセリン、０，１ｍｇ　／　ｍｅ　Ｂ　Ｓ　Ａ１
．　ｌ　５　Ｍ　ＮａＣｌ、　Ｑ、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａテあり、ｐ　ＮＣＶ　ｓ　Ｌｈ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１屈折
体ノ希釈後の最終緩衝液は０．１４　Ｍグアニジン−１
−ＩＣＩ−２５ｍＭトリス−ｔｌｃｚ　（ｐｔｌ　７．
６　）　−１０ｍＭ　ＣａＣｚ２　であった。個々の粒
子物質を引き延はした後、溶解したｔｒｐ−ＩＧＦ−１
融合蛋白質を含む２つの溶液を、Ｉ−１ｉ　ｎ　Ｌ　ｚ
らにより改良された（文献２４）Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏ
らの放射免疫アッセイ法（文献２３）により分析した。

融合蛋白質は両者共、この分析で活性を示した。ネガテ
ィブ対照標品もこの分析にかけたが、測定可能な活性は
示さなかった。

酵母で発現および分泌 細菌細胞溶解物（１ｙｓａｔｅｓ　）から、屈折体の精
製および溶解の必要性を避けるために、その代りとして
酵母の発現−分泌系を研究した。細胞溶解物からの蛋白
質純化が避けられる利点の他に、カップリングした発現
−分泌系は、融合蛋白質を除去するための、その後のイ
ンビトロに於ける加工工程を避けることができる。３種
の酵母発現−分泌系を利用することができる：即ち１）
酵母α因子（文献２２）−これは酵母のα−因子プロモ
ーターおよびプレプロ配列を使う、２）インベルターゼ
プロモーターおよび信号配列からなる酵母インベルター
ゼ（文献１６）−および３）ＰＧＩζプロモーター（文
献２５）およびインベルターゼ伯母（文献１６）からな
るノλイブリッド。

α因子プロモーターおよびプレプロ配列を使ってＩＧＦ
−１を発現させる為に一５ｉｎｇｈ　（文献２２）によ
って組み立てられたプラスミドを使用した。

プラスミドＰ６５（第９図参照）は、α−因子プロモー
ターの配列、α−因子プレプロ配列、酵母２ミクロンタ
ーミネータ−１酵’ＪＪ　”１−ｒｐ　ｌ遺伝子および
ＰＢＲ３２２プラスミドの部分を持っている。

α−因子プレプロ配列中の、ＩＧＦ−１暗号配列を挿入
するのに好都合な制限部位が死んでいるので、ｐＮＣＶ
　オヨびｐＮＣＶｓＬＥ　１ｍ結合させた（細菌での組
みたてについて既述した様に）同一の〜２３０ｂｌ）　
Ｅｃｏｌ（Ｉ−ＪｉｃｏｌＬＩ　ｌ−１ｕＳｙｎ　ＩＧ
Ｆ−１−Ｍフラグメントを使用した。この駄ｏＲＩ　−
１’：ｃｏＲＩフラクメントは、コラゲナーゼ認識部位
プロリン−アラニン−グリシン−プロリンを含んでおり
、もしｌ　ＣＦ−１が融合蛋白質として分泌されたら、
コラゲナーゼて消化することができる。この組み立て（
第１０図参照）で発現される蛋白質は、１Ｇ１・−１に
融合したプレプロα−因子蛋白質からなる。

〜２３０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏｌζＩフラグメ
ントを挿入するために、プラスミドＰ６５を、１ＸＥｃ
ｏＲＩ緩衝液中ＥｃｏＲＩ　で部分消化し、０．７％水
平アガロースゲル上でサイズ化した。直線状の単独の制
限プラスミドに相当する帯を切り取り、ゲルから溶出さ
せ一フエ／−ル抽出し−クロロホルムで２回抽出し一エ
タノール沈澱させた。このＤＮＡぺレットを５０ｍＭの
ｌ−リス−ｔｌＣｚ＋　（ｐＩ］　８　）にとり、５′
突出末端の１００％脱燐酸化を確実にするだめノ条件下
で、細菌性アルカリホスファターゼで処理した。この処
理の後、ホスファターゼ活性を一先つＩｉ　Ｄ　Ｔ　Ａ
を１５１ｎＭの濃度になる様に加えて除去し、次いでＤ
ＮＡをフェノールで３回抽出し、クロロホルムで２回抽
出し、ベクターをエタノール沈澱させた。この物質は線
状化１’　６５ベクターを含んでおり、２つの部位のい
ずれかて、ＥｃｏＲｌにより消化した：即ち、１つは、
α−因子プロモーターおよびプレプロ配列の上流のＥｃ
ｏＲｌ　部位、もう１つは、α−因子プロモーターおよ
びプレプロ配列のすぐ下流のＥｃｏＲ１部位である。こ
の〜２３０１）ｌ）　１ｉｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　Ｉ
ＧＩ’−１７ラクメントをこのベクターに結合させた。

所望の挿入場所は一α−因子プロモーターおよびプレプ
ロ配列からずく下流のｌｌＣｏＲｌ部位であった。

結合は、標準的なライケーション条件下で行なわれ一形
質転換宿主はＤａｇｅｒＬおよびＥｌｌｒｌｉｃｌｔ　
（文献３）の方法に従って調製されたコンピテントＥ、
ｃｏｌ　ｉ　２９４　てあった。形質転換細胞をＬＢ　
−Ａｍ　ｐ−寒天平板に植えた。Ｂｉｒｎｌ〕ｏｉｍお
よびＤｏｌｙ（文献４）の方法に従って数個の形質転換
体をミニスクリーニングし−この様にして調製されたプ
ラスミドＤＮＡを適当な緩衝液中、Ｓａｌ　Ｉおよび１
１ｉｎｄ　Ｉｆｆ　（Ｄ両者で消化した。〜１１０　ｂ
ｐ　ＥｃｏＲＩ　−１−１ｉ　ｎｄ　ｌｌフラグメント
を持ったプラスミドを含んでいる数個のクローンの１つ
を多量に増殖させ−そのプラスミドを精製した。このプ
ラスミド、Ｙｌｉｐ９Ｔα−因子ＥｃｏＲＩ　−４εｃ
ｏＲＩ　ＩＣＦ−１（第１１図）を使って、ｌ−１ｉｎ
ｎｃｎら（文献１７）およびＢｅｇｇｓら（文献１８）
の方法のＩｌｉｔｚｃｍａｎの改良法（文献１９）に従
い−コンピテント酵母株２０　Ｂ−１２（αｔｒｐ　１
）ｅｐ　４　）細胞を形質転換した。

この様な２つの形質転換体、およびネガティブ対照形質
転換体（プラス′ミド中にＩ　ＣＦ　−１挿入体を持た
ない）を、酵母プレーインベルターゼ−Ｉ　Ｇ　ｌ”　
−１プラスミド形質転換のそれらの様に、懸濁液中で増
殖させた。上清を一分泌されたＩ　Ｇ　Ｆ−１活性につ
いて試験し、ｌｌｉ　ｎ　ｔ　ｚらにより改良（文献２
４）されたＦｕｒｌａｎｃＬｔｏら　（文献２３）の放
射免疫アッセイ法により測定した。Ｉ　Ｇ　Ｉ”　−１
挿入物を持ったプラスミドを含んでいる形質転換体の両
上滑はＩ　Ｇ　Ｆ−１活性を示し−ネカテイブ対照の上
清は活性を示さなかった。これらの形質転換体の１つを
１０ｚの発酵器中で多Ｌ１に増殖させた。この上清は、
最高レヘル〜３ｔｉ！／／ｍｅの分泌されたＩ　Ｇ　ｌ
＝’　−１活性を含んでいた。発酵」二漬のｌ　ＣＦ　
−１活性はまた、Ｌｌｏｒｎｅｒら（文献２６）によっ
て開発された胎盤膜放射受答体測定法によっても明らか
にされた。

酵母中でヘテロローガス信号配列を持った蛋白質か正し
く加］二（プロセシング）および分泌されるという証拠
（文献１６）に基づき、酵母インベルターゼ発現−分泌
系が重要となって来た。最初の試みは、転写の開始点と
してインベルクーゼプロモーターを使用し、ＩＧＦ−１
の加工および分泌を含む、Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１に融合した
酵母インベルターゼ信号蛋白質の発現であった。

開始ＡＴＧコドンおよび信号ＤＮＡ配列の５′末端を含
んでいるＮｃｏ　■−１１ｉｎｄｌｌｌ　（〜４００１
）Ｐ　）フラグメントおよび標準的手法により合成した
４つのＩ）　Ｎ　Ａフラグメントを使って、酵母インベ
ルクーゼ信号暗号配列をＩＧＩ・−１遺伝子に結合させ
た： ５’　ＡｃｃＴ−ｒ−ｒｃｃ−ｒｒ−ｒ−ｒｃｃ′ｒ丁
ｒｒｃｃｃ　３３　ＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡΔＡＡＣＣ
ＧＡＣＣＡＡ　５’５　ＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＣＣＡ
ＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧ　３′３　ＡＡＣＧＴＣＧＧ
Ｔ］、−１丁ＡＴＡＧＡＣＧＴＣＣＡＧ５’コノ組み立
ては、Ｐ　ｖ　ｕ　−Ｂａ１ｔ　Ｉ目消化ｐＢＲ３２２
−Ｌｌｕ　Ｓｙｎ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１から分離した〜７３
０　ｂｐ　Ｐｖｕ■−Ｂａｍｔｌ　Ｉ　７ラグメントの
Δｖａ１１消化による９０ｂｐ　Ａｖａ　■−Ｂａｍ１
−Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１左半分フラグメントの分割か
ら開始した。

標準的なキネ−ショア　（Ｋｉｎａｔｉｏｎ　）条件て
、４つの合成りＮＡフラグメントの全てを燐酸化した後
、この４つの合成フラグメントをＡｖａ　［−Ｂａｍｔ
ｌｌＩＧＦ−１左半分フラグメントと混合し一標べ１的
なライゲーション条件下で結合させた。リガーセをフェ
ノールおよびクロロホルム抽出（２回）によって不活性
化した後、エタノール沈澱させた１）　Ｎ　Ａペレット
を溶解し、適当な緩衝液中、ｌ１ｉｎｄ１１［およびＢ
ａｍ　ＩＩ　Ｉ　で消化した。新たにｎｌみ立てられた
ｌ１ｉｎｄ　４１−Ｂａｍ１−ＩＴ　（約１４０ｂｌ）
）Ｖラクメ７トを分割し、６％ポリアクリルアミドゲル
から抽出した。この物質をＨｉｎｄルーＢａｍ　Ｉ−１
１消化ｐＢＩζ３２２ベクターに結合さぜた（これは、
先っ、適当な緩衝液中、Ｉｌｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　テ消化
し、次いでＢａｍＩＩＩて〆白化し、６％ケルから４０
１４１３１）ベクターフラグメントを精製したものであ
る）。

形質転換宿主は、標阜的手法（文献３）により調製した
コンピテント１ら、ｃｏｌｉ２９４てあり一形質１１を
換細胞はＬ　１３−アンピシリン寒天プレート上に植え
つけた。Ｂｉｒｎｂｏｉ＋ｎ−Ｄｏｌｙ法（文献４）に
より数個の形質転換体をミニスクリーニングし、それら
のプラスミドＩ）　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＩおよびＢａｍ１
ｌＩて消化した。−＋１６７　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｍｌ−ＩＩ　７　ラグメントを含んでいる２つのプラ
スミド（Ｉｌｉｎｄｌ［およびＢａｍｔｌＩ部位への１
４０１）Ｐフラグメントの挿入を示している）を多量に
増殖させ、それらのプラスミドを調製した。Ｍａｘａｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔの配列決定法（文献５）を使って−Ｄ
ＮＡの全４３ｂｌ）Ｈｉｎｃｌ　ｌｌ　−Ａｖａ　ｌ［
部分の配列を決定し、化学合成の正しいこと、および組
み立ての正しいことを確認した。この正しく組み立てら
れたプラスミドは、ｐＢＲ３２２−Ｐ　−１−１−１ｕ
ｓｙｎ　ＩＧＦ　）ＩＩＩｍｌｌｌ−ＢａｍＩＩＩ（〜
４１５４　ｂｐ　）と命名された。

Ｉ　ＣＦ　−１遺伝子の右半分を挿入するために、この
新たに調製したプラスミドを適当な緩衝液中、Ｂａｍ１
−１１−　Ｓａ　ｌ　Ｉで消化し、大きい方のフラグメ
ント（〜３８７９　ｂｐ　）　をゲル分画により精製し
た。

１）　ＢＲ３２２１１ｕ　Ｓｙｎ　Ｉ　Ｇ　Ｆを適当な
緩衝液中Ｂａｍ１ｌｌ−５ａｉｌて消化し−Ｉ　ＣＦ　
−１の右半分に相当す６１１５　ｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ　
−Ｓａ　Ｉ　■７ラクメン！・をケル分画により分離し
た。この１１５　ｂｐ　Ｂａ＋ｎｌ目−５ａｌｌｉ　Ｇ
　１゛’−１右半分フラクメントを、標準的なライゲー
ション条件下でＢａｍＩ（Ｉ　−Ｓａ　ｌ　Ｉ消化ｐＢ
Ｒ３２２−Ｐ−Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ　Ｌｌｌ　Ｉ−１ｌ−１
ｉｎｄｌｌｌ−Ｂａベクターに結合さぜた。Ｉ）ａｇｅ
ｒＬおよびＪ！Ｊｌｒｌｉｃｂの方法（文献３）に従っ
て調製したコンピテントＥ、　ｃｏｌｉ株２９４を形質
転換宿主として使用し、形質転換した細胞をＬ　Ｂ−Ａ
Ｉｌｌ＋）−寒天平板に植えつけた。

標阜的手法（文献４）によって数個の形質転換体をミニ
スクリーニングし、この様にして調製したプラスミドｌ
）　Ｎ　Ａを適当な緩衝液中１ｉｃｏＲＩおよび５ａｌ
Ｊで消化した。Ｉｃ　ｉ’　−１の右半分に相当するＢ
ａｍ１−ＩＩ−８ａｌ　：［フラグメントの挿入を示す
プラスミ　ドを、ｐＢＲ３２２Ｐ　−Ｉ　−１−１ｕＳ
ｙｎ　Ｉ　Ｇ　Ｆ−１由ｎｄ…ｌ−５ａｌｌプラスミド
と命名した。ｐＢＲ３２２１’−Ｉ−ＩＧＩ”−］、　
ｌ１ｉｎｄｌｌｌ−５ａｌ　Ｉプラスミドを含有してい
るクローンの１つを多量に増殖させ、そのプラスミドを
分ス１１シた。このプラスミドを適当な緩衝液中−１１
ｉ　ｎｃｌ　ＩＩＩおよび５ａｌＩて消化し、ＩＧＦ−
１遺伝子の全てと酵母インベルターゼ信号暗号配列の３
′部分を含んている２　５５　ｂｐ　ＩＩ１ｎｃｌｌｌ
ｌ’−５ａｌＩ７ラクメントを調製した。このＤＮＡフ
ラクメントをポリアクリルアミドゲル分画によって分離
し一標準的手法によるライゲーションに備えた。

酵母インベルターゼプロモーターと共に−インベルター
ゼ信号を暗は化しているＩ）　Ｎ　Ａ配列の５′末端を
含有している（〜４　Ｑ　Ｑ　ｂｐ　）　Ｎｃｏ　■−
１１ｉｎｃｌ■フラクメントを、適当な緩衝液中、プラ
スミドＹＩｐｓｐ　−Ｌｃ　Ｉ　ＦＡ　（文献１６）の
ＮｃｏＩおよび１１ｉ　ｎｄ　１１１　消化により調製
した。先つ、コ（＋）　Ｙ　ｌ’ｌ）ｓ　ｐ−Ｌｃｌｌ
’ＡプラスミドをＮ（０１て完全に７ｔＨｔＳし一次い
てフェノール抽出、クロロポルム抽出（２回）し、エタ
ノール沈澱させた。この直線化した分子をＩ　Ｘｌ−１
ｉｎｄｌｌ　ｇ衝液にとり、部分的に消化して、内部＋
１ｉｎｃｌｌｌｌ制限部位を含んでいる必要なＮｃｏｌ
−Ｉ−１ｉ　ｎｄ　ＩＩＩ　（〜４００　ｂｐ　）フラ
グメントを生成させた。

コ（７）　Ｎｃｏ　ｌ−１−１ｉｎｄ　ｉｌｌフラグメ
ントをゲル分画により分；ｔｉｌｌ：　Ｌ−標σ１１的
手法によるライゲーションに（＋ｉｉ＋えた。

ベクターを得るために、プラスミドＩ）ＵＣＩ、２−Ｙ
ｌ　（ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍｌｌＩ　）　（文献１６）
を、ＮｃｏＪおよび５ａｌｉを用い、適当な緩衝液中で
消化した。

ゲル分画による精製後−ゲルから〜２，５ｋｂｐのベク
ターを分離し、標帖的手法によるライゲーションに備え
た。最後の組み立てを行なうために、標準的なライゲー
ション技術を使ってスリー・パート・ライゲーシンを行
なった。この結合に使用しりＩ）　Ｎ　Ａは、Ｎｃｏｉ
−５ａｌｌ−消化りＵＣＩＩ−Ｙｌ（ＥｃｏＲＩ　−Ｂ
ａｍｌｌｌ　）　（文献１６）、〜４　Ｑ　Ｑ　ｂｐ　
Ｎｃ。

Ｉ　−ｔｌ　ｉ　ｎｄ　Ｉｌｌおよび〜２５５　ｂｐ　
１１ｉｎｄｌｌｌ−５ａｌ　］’　７ラクメントである
。ライゲーションの後、その物質をＤａｇｅｒｃら（文
献３）の方法に従って調製したコンビテン）　Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　２９４細胞に尋人した。形質転換細胞をＬ　Ｂ　
−Ａｒｎｐ−寒天平板上に置き、Ｂｉ　ｒｎｂｏｉ＋ｎ
およびＤｏｌγの方法（文献４）を使って数個の形質転
換体をミニスクリーニングした。この様にして調製した
プラスミドＤＮＡを、適当な緩衝液中、Ｎｃｏ■および
Ｓａｌ　１で消化し−〜６２５　Ｌ）ｌ）　ＮＣＯｉ　
−３ａｌｆｉｌ）ＮＡフラグメントの挿入を示すプラス
ミドを含有している数個のクローンの１つを多量に増殖
させ−そのプラスミドを精製した。

最終工程として、このプラスミドを一適当な緩衝液中、
５ａｌＩで消化して線状化した。既述した様にして調製
し、標準的なキネ−ジョン条件化でキナーゼ処理したＳ
ａｌ　Ｉ　−ＥｃｏｌＬＴリンカ−を、標飴的なライゲ
ーション条件を使って−この線状化したベクターに結合
さぜ−５ａｉｌ末端をＥｃｏＲＩ末端に変換した。Ｅ１
月Ａ１５ｍＭを加えてライゲーション反応を終結さぜ−
フェノール抽出し−クロロボルム抽出しく２回）、エタ
ノール沈澱させ、１）　Ｎ　Ａペレッ１−をＩ　Ｘ　］
ＥｃｏＲＩ緩衝液に溶解し、ＥｃｏＲＩで消化した。こ
のＥｃｏＲＩ消化により、酵１月インベルターゼプロモ
ーター、酵１」インベルターゼ（ｇ号暗号配列およびＩ
　Ｇ　Ｆ−１暗号配列を１つの連続した配列として含ん
でいる〜１１５０ｂｐＥｃｏＲＩ　フラグメントが遊離
した。この物質を分画後６％ポリアクリルアミド平板ゲ
ルから〜１１５０ｂ、、　；ｊ３として分離し、標Ｌｆ
１「２的手法によリーライゲーション用に調製した。

この１・、ｃｏＲＩ　フラグメントを受け入れるための
酵母−Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクターを、プラスミドＹ
）ｐ９Ｔ（文献１６）をＥｃｏＲＩ消化してベクターを
線状化し、そのＥｃｏＲＩ末端を一製造業者によって指
示されている条件下で細菌性アルカリホスファターゼで
処理して５′突出末端を１００％脱燐酸化することによ
り調製した。このホスファターゼ反応を、ＥＤ　１’　
Ａ　ｌ　５　＋ｎ　Ｍを添加して終了させ−この混合物
をフェノール抽出しく３回）−クロロポルム抽出しく２
回）−次いでｌ）　Ｎ　Ａをエタノール沈澱させた。こ
のＤＮＡペレットを１×ライゲーシヨン緩衝液に再溶解
し、ベクターをｊｉｃｏｌζｌ〜１１５０’）Ｐフラグ
メントと混合し、標準的なライゲーション条件下で結合
させた。Ｉ）ａｇｃｒらの方法（文献３）で調製したコ
ンビテンｌ−Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　２９４細胞を形質転換
宿主として使用し、この形質転換体をＬ　Ｂ　−Ａｍｐ
−寒天平板上に植えつけた。Ｉ’＋Ｔｉ人の配向を決メ
ルために、Ｂｉｒｎｂｏｉｍおよび１）ｏｌｙ（文献４
）の方法を使って数個の形質転換体をミニスクリーニン
グし、この様にして精製したプラスミドＪ）　Ｎ　Ａを
適当な緩衝液中ＢａｍＪＬｌ　て消化した。

Ｂａｍ１ｌＩ消化によって１．３　ｋｂ　１３ａｍｌｌ
ｌ　−１％ａｍｌｌｌ　フラグメント（〜４７５１３１
）フラグメントとは反対）を生成するプラスミドを含有
している数個の形質転換体の１つを多量に増殖させ、そ
のプラスミドを精製した。このプラスミドを１’、１．
ＩＧＦ−１１ｉｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　Ｐ、　Ｉ　、
プＣｌモータート命名シーコれを使って、ｔｌｉｔｚｃ
ｍａｎ　（文献１９）により改良された出Ｈｎｃｎ、　
Ａ、ら（文献１７）およびＢｅｇｇｓ。

１、Ｄ、　（文献１８）の方法に従って調製したコンピ
テント酵母細胞を形質転換した。酵母株２０１！１−１
２　（ａ　Ｌｒｐ　ｌ　ｐｅｐ　４　）を使用シタカー
コレハＹｅａｓＬＧｅｎｅｔｉｃｓ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒから人手した。

この組み立てに於いて−Ｉ　Ｇ　Ｆ’　−１の発現は、
インベルターゼプロモーターに於ける転写で開始し、酵
＋ｉＪ　２　ミクロン配列で終了する。この組み立てに
よって発現される融合蛋白質は、Ｉ　ＣＦ　−１蛋白質
と融合した酵母インベルターゼ仁壮からなっており−こ
の合計の分子量は９９６４ダルトンであった。逆配向に
挿入されたＥｃｏＲＩフラグメントを持ったもう１つの
プラスミドも−コンピテント酵１３ノ細胞の形質転換に
使用した。この組み立てでは、Ｉ　Ｇ　Ｆ−１は酵母タ
ーミネータ−（終了暗号）と共に供給されなかった。

数個の形質転換体を選択し、ＹＮＢ−ＣＡＡ寒天平板に
塗抹した。これらの内、３つの形質転換体を選び、振盪
フラスコ中のＹＮＢ−ＣＡＡ増殖培地１０　ｍｅに接種
した。同じベクターであるが、Ｅｃ。

Ｒ１フラグメントか逆配向で挿入されているベクターで
形質転換されたコロニーを使って４つ目の培養も行なっ
た。３０°で１６−２０時間増殖さぜた後−培養液をサ
ンプリングしく　１ｍｅ　）、エツペンドルフ　マイク
ロフユージ内で５分間回転させて細胞を除いた。上清を
、ＦｕｒｌａｎｃＬＬｏ　ら（文献２３）の方法であっ
てｌ−１ｉｎｔｚら（文献２４）により改良された放射
免疫分析法により、分泌された活性についてｌｌ＋＋＋
定した。３つの形質転換体の上清は−１，７〜３．３　
ｍｙ／ｍｅのＩＧＦ−１活性を示シタカ、ネガティブ対
照は外性を示さなかった。細胞内活性ヲ調へるために、
培養液１−からのペレット全２５ｍＭ１−リフ、　−ｌ
−１ｃｚ　（ｐｌ−１７，６）中＋　ｌ　ｍＭ　Ｅｌ）
ＴＡで洗浄し、０．４　ｍｅのガラスピーズを含む」−
記のトリス−ＩらＤＴＡ溶液０．５　ｍｅ中で３〜４分
−激しくうず巻き回転させて溶菌させた。

この細胞溶解物を分析した結果−３つのＩ　Ｇ　ｌ゛’
　−１分泌形質転換体では１．５〜２．８　ｎｒｔ／ｎ
Ｉｅの活性を示したが、ネガティブ対照の形質転換体は
活性を示さなかった。この３つの形質転換体の最も分泌
能の高いものを５１の発酵容器内で増殖させた。

分泌されたＩ　Ｇ　１＝−１活性は、最高７４　ｒｙｔ
／ｒｄ　（ｊＪｆ）に達した。

インベルターゼプロモーターを使用する上での１つの問
題点は、それがグルコースの存在下で抑制されるという
ことであった。インベルターゼプロモーターでの高レベ
ルの転写開始にグルコースか不適合であるため、グルコ
ースは発酵過程の主要な炭素源であるので−それに代る
プロモーター′としてＰＧＫプロモーターがさがしめら
れた。

Ｐ　Ｇ　ＫプロモーターＰ、Ｉ、ＩＧＦ−１組立て物を
組み立てるため、全インベルターゼ信号暗号配列を含ん
ているフラグメントをクローンすることが必要であった
。これを行なうため、プラスミドｐＬｅＩＦ−Ａ−イン
ベルターゼ信号（文献１６）を適当な緩衝液中、Ｂｇｌ
ｌＩ、次いてＢａｍＩ−ＩＩ　て消化した。この消化に
よって数個の７ラグメントが逆側したか、その内の１個
は〜６２５　ｂｌ）　Ｂｇｌ　Ｊｌ　−Ｂａ１ｎＩｌｌ
フラグメントであり−これを６％ポリアクリルアミド平
板ゲルから分離し一常法に従ってライゲーションに備え
た。このフラグメントをクローンするため、ｌ）　Ｕ　
Ｃ８ベクター（文献２０）をクローニングビヒクルとし
て選んだ。ｐＵＣ８プラスミドをｌ　Ｘ　Ｂａ＋ｎＨＩ
緩衝液中、１３ａｎｔＬＩＩで消化し一細菌性アルカリ
ポスファターゼで処理して５′末端ヲ脱燐酸化し、５％
ポリアクリルアミド平板ゲル上で泳動させて分離した。

ライゲーションのための標党的な調製を行なった後、Ｂ
ａ＋ｎ　Ｈｌ　消化ベクターを上記の〜６２５ｂＰＢｇ
ｌ　ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと混合し、通常のラ
イゲーション条件下で結合させた。この混合物を、Ｄａ
ｇｃｒＬらの方法（文献３）によって調製したコンビテ
ン）　Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　２９４に尊大し、この形質転
換培養をＬ　Ｂ　−Ａｎｉｐ−寒天平板上に植えた。数
個の形質転換体を選択し、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏ
ｌｙの方法（文献４）を使ってミニスクリーニングした
。ミニスクリーンプラスミドＤＮＡを１ｉｃｏＲＩで消
化し、消化物をゲル上で分析した所、長さ〜２６０ｂｐ
または〜３８５１）ｌ）０）Ｊ亡ｃｏＲＩ　フラグメン
トを持った２つのタイプのプラスミドか生成していた。

〜２６０　ｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントを含んている
１つのクローンを多量に増殖させ−そのプラスミドを精
製した。このプラスミドをｐＵｃＢｌ’、ｌ、プロモー
ターシグナルＢｇｌ　■−ＢａｔｎＬ−１１と命名した
。

このタイプのクローンは一１１１１人された”ｇｌｌｌ
−Ｂａｍｌ−１１フラグメントが所望の配向を有するが
故に選択した。このプラスミドから必要なものは、ＡＴ
Ｇ開始コドンおよびインベルターゼ信号暗号配列の５′
末端を含んでいる〜２Ｑ　ｌ）Ｐ　ｌらｃｏＲｌ　−１
１ｉｎｄＤＩフラクメントであった。

完全なインベルターゼ信号暗号化ＤＮＡ配列を組み立て
る為に、Ｉ　Ｇ　Ｆ−１遺伝子の左半分に融合した伯ケ
配列の３′末端を含有している〜１５０ｂｌ）Ｉ−１ｉ
ｎｄｌｌ−ＢａｍｔｌＩフラグメントを、プラスミドｐ
ＢＲ３２２Ｐ、Ｉ、　Ｉ　ＧＦ−ＬＨｌ（ｉｎｄｉｌ−
Ｂａｍｌ−１１（（〜４１５４１）ｐ　）　（Ｄ　Ｈｉ
ｎｄ　■−ＢａｍＨＩ消化物から分離した。ポリアクリ
ルアミド平板ゲル分画によって分離を行ない、〜１５０
　ｂｐフラグメントに相当するＩ）　Ｎ　Ａ帯を切り取
り、標阜的手法に従ってライゲーション用に調製した。

短かい（〜２０　ｂｐ　）　ＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄ
ｌｌｌ　７ラクメントを得るために、プラスミドｐＵｃ
８Ｐ、Ｉ、プロモータージグｆ　ルー　Ｂｇ　ｌ　Ｊｉ
　−Ｂａｍ　Ｉ−１１を１ＸＥｃｏＲＩで 緩衝液中、Ｉ！、ｃ　ｏ　ＲＩＡ消化した。この消化に
より〜２６０　ｂｐ　Ｅｃｏ　ＲＩ−１らｃｏＲＩフラ
グメントが遊離した。これは−消化混合物を分画した後
、６％ポリアクリルアミド平板ゲルから分離した。この
〜２６０　ｂｐフラグメントを適当な緩衝を夜中、ｌｌ
ｉ　ｎｄｌｌｌで消化し、２つのｌｌｉ　ｎｄ　ｌ１ｌ
−Ｅｃｏ　Ｒ１７ラグメント一即ち、１つは長さ〜２０
　ｂｐのもの一他方は〜２４０　ｂｐのものを調製した
。完全に消化した後−１乙１）　Ｔ’　Ａを１５ｍＭ加
えて消化を終結させ、混合物全体をフェノール抽出し、
クロロポルム抽出しく２回）、エタノール沈澱させた。

ｐＢｌ支３２２（文献１５）を適当な緩衝液中、１辻０
ＲＩ−Ｂａｍ）ＩＴ　テ消化し、コ（１：）　ＥｃｏＲ
Ｉ−Ｂａｍｌ−１１消化ベクターを５％ポリアクリルア
ミド平板ケルから精製してベクターを得た。標帖的な方
法でライゲーション用に調製した後、このベクターヲｑ
５０ｂｐｌ（ｉｎｄ’、Ｌｌｌ−ＢａｍＨＩ７−ｙグメ
７　ｌ・（イア”＜ルターゼ信号の３′采端＋左半分Ｉ
ＣＦ’−１）、および２つのｌ−１ｉｎｃｌ　］Ｉｌ　
−１ｉｃｏ　Ｒ１フラグメント（インベルターセ信号暗
号配列の５′末端を含んでいる〜２０＋）Ｐフラグメン
ト−）と混合し、この混合物全体を標べ１巨的なライゲ
ーション条件下で結合させた。ライゲーションのための
形質転換宿主として−Ｄａｇｅｒｃおよび１ｉｂｒｌ　
ｉｃｈの方法（文献３）に従って調製したコンピテント
Ｉｉ、ｃｏｌｉ　２９４を使用し、この形質転換細胞を
Ｉ−Ｂ　−Ａｍ　＋）−寒天平板に植えつけた。

１３ｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ　（文献４）の方法
で数個の形質転換体をミニスクリーニングし、精製した
ミニスクリー：／　Ｄ　Ｎ　ＡをＥｃｏＲＩおよびＢａ
ｍＨＩて消化した。〜１７０　ｂｐ　Ｅｃｏ　ＩζＩ　
−１ｓａｍ　ｌ　ｌ　Ｉ　フラグメントを持った数個の
クローンの１つを多量に増殖させ、そのプラスミドを精
製した。このプラスミドはＩＣＩ・−１の左半分に融合
した完全な酵母インベルターゼ信号暗は配列を含んでい
た。このプラスミドはｌ’、　ｌ　、　Ｉ　Ｇ　Ｆ　−
Ｉ　Ｌ、Ｉ−１，Ｒ１−１３ａｍｌｌｌ　と命名された
。

所望の−１７Ｑ　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　、−Ｂａｍ１ｌＩ
　フラグメントを、このプラスミドを適当な緩衝液中Ｅ
ｃｏＲＩとＢａ　ｍ　Ｈｌ　て消化し一反応混合物を平
板ゲル分画することにより分βｉｌｌした。標阜的手法
を使って〜１７０　ｂｌ）帯のｌ）　Ｎ　Ａをライゲー
ション用に調整した。組み立てを完成させる為に、Ｉ　
ＣＦ　−ｌの右半ｊ）を、プラスミド’　Ｐ、Ｉ、　Ｉ
ＣＩ’−１Ｉ−ｃｏＲＩ−１＞ｃ。

ＲｉＰ、Ｉ、プロモーターを適当な緩衝液中てＥｃ。

Ｒ１およびＢａｎ山Ｉて消化し、消化混合物をポリアク
リルアミド平板ゲル分画した後ケルＩＵＪ片から溶出さ
せることにより、〜ｌ　２Ｑ　ｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ　−
ＥｃｏＲＩフラクメントとして分１柚した。これらの２
つのフラグメント、〜１７０　ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１−１
３ａｍｌ−１１および〜ｌ　２Ｑ　ｂｐ　Ｂａｍ１ｌＩ
−ＥｃｏｌＬＩを−インビトロで一標べ〔的なライゲー
ション条件下−両フラグメントをほぼ等モル濃度存在せ
しめて結合させた。このサイケ−２３フ１１１１合物に
Ｉｉ　Ｉ）Ｔ　Ａを−１５Ｉｎ　Ｐｖｌに加えて反応を
終結させ、フェノール抽出し、クロロホルム抽出しく２
回）、エタノール沈澱させた。

１）　Ｎ　ＡペレットをＩ　Ｘ　Ｅｃｏ　Ｒ１緩衝液に
とり、Ｊｉｃ。

Ｒ１で消化した。消化物を６％ポリアクリルアミ１ζ平
板ゲル」−て泳動さぜ、〜２９０ｂＰ（〜３４０１〕ｐ
および２４０　ｂｐと対照的に）で染色するＤＮＡ幇を
切り取り一標べ（釣手法でライゲーション用に調製した
。この〜２　ｇ　Ｏｌ１ｌ）　ｌ５ｃｏｌ（Ｉ−１４ｃ
ｏ　Ｉζｌ　フラグメントは、完全なｌ　ＣＦ　−１暗
吋配列に融合した全酵ｆｌｌインベルクーゼ信号暗吋配
列を含んでいた。

この蛋白質を発現する為には、プロモーターを持った酵
母ベクターを選択する必要かあった。プラスミドＹＥＩ
）　ｌ　Ｉ）１−、　Ｓｍａｌｌ　（第１３図参照）　
（７）　］）ＧＫプＯモーターを使用した。ＹＥｐｌＰ
ＴＳｍａｌｌは一適当な緩衝液中、Ｙ　Ｅ　ｐ　ｌ　Ｐ
ＴのＣｌａ　Ｉ　およびＰｖｕｌｊ消化により−ＹＥｐ
　ｌ　ＰＴ（文献２１）の誘導体として糺み立てた。（
ＪａＩ５’突出末端を一製造業者のすすめる条件下で、
Ｉ）　Ｎ　Ａポリメラーゼ■（Ｋｌｅｎｏｙ）を使って
平泪末端に変えた。Ｃ１ａ　Ｉ突出末端を平滑にした後
、この線状化ベクターの平、）ｊｙｆ末端ｃＪａＩおよ
びＰｖｕｌｌヲ、標ＢＡ　的ナライＩｆ　−ジョン条件
下、Ｔ、４ＤＮＡ＋Ｊガーゼを使って融合させた。得ら
れたＹ　Ｅ　ｌ）　１１’Ｔ　Ｓｍａ　ｌ　！ベクター
は、長さ〜５．９ｋｂｐ（即ち、ＹＥｐＩＰＴより〜２
．７ｋｂＰ小さい）であった。ＹＥｐＩＰＴと同様−Ｙ
］！、ｐｌＰＴＳｍａｌ　ｌ　ハ２ミクロン起源および
ターミネータ−１Ｐ　Ｇ　Ｋプロモーター、−１”　Ｒ
Ｐ　１遺伝子、およびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むｐ
ＢＲ３２２からの配列を持っている。

ＹＥｐｌ　ＰＴ　Ｓｍａｌｌは−〜２９０ｂＰＩＬＣ０
１ζＩフラクメントをそのプラスミドの唯一のＥｃｏＲ
ｌ　部位に挿入することにより、ベクターとして使用し
た。

ＥｃｏＲＩ線状化Ｙ　Ｅ　Ｉ）　Ｉ　Ｐ　ＴＳｍａ　Ｉ
　ｌ　／＜　フタ−は−Ｙ　Ｉ！：　Ｉ）Ｉ　ＰＴＳｍ
ａｌ　ｌをｌ１ｃｏＲ１消化し一細菌性アルカリホスフ
ァターゼ（ＢＡＩ））で処理（相補末端の再結合を防ぐ
ため）することにより調製した。１３　Ａ　Ｐをフェノ
ール抽出（３回）−クロロホルム抽出（２回）により除
去し、エタ、ノール沈澱させた。標賭的なライゲーショ
ン条件下−〜２９０　＋）Ｉ）　ＥｃｏＲＩフラクメン
トをベクターに結合させた。

ＤａｇｃｒｔおよびＥｌｌｒｌｉｃｌｔ　（文献３）の
方法によって調製したコンビテン）］’：、ｃｏｌｉ２
ｇ４を形質転換宿主として使用し、この形質転換した培
養をＬＢ−Ａｍｐ−寒天平板に植えた。Ｂ　ｉ　ｒｎｂ
ｏ　ｉｍおよびＤｏｌｙの方法（文献４）で数個の形Ｉ
ｆ！′１転換体をミニスクリーニングし−　ミニスクリ
ーンプラスミドＤＮＡを適当な緩衝液中１１ｉ　１１（
Ｊ　ＩＩＩて消化してｊ電入の配向性を調べた。〜４０
０１）Ｐ　ｌ１ｉｎｄ　Ｊ’［フラグメントを含むプラ
スミドを持った数個の形質転換体の１つを多量に増殖さ
せ、そのプラスミドを精製した。このプラスミドをＹｌ
ｉｐＩ　Ｐ−１−Ｓｍａｌｌ　Ｐ、　ｌ。

ＩにＦ’−ＩＰＧＫプロモーター（第１４図参照）と命
名Ｌ　−１１ｉ　ｔ　ｚｅｍａｎの改良（文献１９）に
係る１１ｉｎｎｃｎら（文献１７）およびＢｃｇｇｓら
（文献１８）の方法によリーコンピテント酵母株２０Ｂ
−１２（ＡＴＣＣ２０６２６）（ａ　ｔｒｐ　ｐｅｐ４
）細胞を形質転換するのに使用した。

Ｐ、１．ＩＧＦ−Ｉ　ＥｃｏＲｌ　−ＥｃｏＲＩ　Ｐ、
１．プロモータープラスミド形質転換の場合と同様にし
て、数個の酵母形質転換体を（凹濁液中で増殖させ、上
清の活性を、ＩＩｉ＋ＩＬｚら（文献２４）の改良に係
るＦｕｒｌ；１ｎｅｔＬＯらの放射免疫分析法（文献２
３）によって測定した。３つの形質転換体の振帰フラス
コ上清は、上／Ｐｉ′１　ｍｅ当たり３８〜５３　ｎり
の活性を含んでいた。同様にして、これらの形質転換体
の１つを選ひ、１０１の発酵容器中で多Ｉ１１、に増殖
させた。上清中に分泌されたＩ　Ｇ　Ｆ−１活性は一最
高〜７８０ｎり／ｍｅ　に達した。また、この発酵」二
／ｉ’、ｉを放射受容体１ＪＩＩＪ定法（文献２６）に
もかけた所、Ｉ　Ｇ　Ｆ　−１活性を有することがわか
った。

成熟ヒトＩ　Ｇ　Ｆ生産 成熟Ｉ　ＣＦ　−］を暗号化しているＩ）　Ｎ　Ａ配列
に融合したα−因子プレプロ蛋白質を暗弓化し−Ｃいる
Ｉ）　Ｎ　Ａ配列を組み立てるために、Ｍ−１３インビ
トロ突然変異誘発技術を用いた（Ｒｃｇｉｎら−Ｐｒｏ
ｃ、Ａｃ；ｉｄ、５ｃｉｃｎｃｃ　（ＵＳＡ）７　謬Σ
、４２（３８；１１ｕｃｃｈｉｎｓｏｎら、ＪＯ旧′ｎ
ａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｂｃｎｔ、−２５３、
６５５１；　Ｇｉ　ＩＩ　ｉａ＋ｎら、Ｇｅｎｃ　８　
、８１および９９　；　Ｇｉｌｌａｍら、Ｎｕｃｌｃｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓｅ；％ｒｄｘ　６　。

２９７３　ＨＡｄｅｌｍａｎら、１）ＮＡ　（Ｊｕｎｅ
　、　１９８３　）　参照）。

Ｍ−１３プラスミドを組み立てるために−プラスミドＹ
　Ｅ　Ｉ）　９　Ｔσ−因子Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｅｃｏ　Ｒ
１ｌ　Ｇ　ｌ’　−１（第１６図）を１３ｇ１ｉｌおよ
びＳａｌ　Ｉテ消化シ、Ｉ　Ｇ　Ｆ−１と融合したα−
因子プロモーター信号を含有している約１．５　Ｋ　＋
）ｌ）フラグメントをポリアクリルアミドケル電気泳動
法により分ｉ’！Ｉｌシた。このフラグメントを、標糸
的なライゲーション条件下、Ｂａ＋ｎ１ｌｌおよび５ａ
ｌｌで消化し一細菌性アルカリホスファターゼで処理し
たＭｌ’−８（ＢＲＩ−）ベクターに結合させた。この
ライゲーション混合物をＩ）ａｇｃｒｔおよびＥｈ　ｒ
　Ｉ　ｉ　ｃｈの方法（文献３）に従って訊１製したコ
ンビテン＋−、Ｉ　Ｍ　］、　０１細胞に尋人した。こ
れらの形質転換体を対数期まで増殖させたコンビテンｉ
・でないＪＭ］、０１細胞と混合し、トップ基人と混合
してＬＢ″Ｘ人平板十に置いた。数個の明確なプラーク
を選ひ−Ｍ−１３ジテオキシ配列化法を使って配列決定
し−ベクターのＳａｌ　ｌ　−Ｂａｍｌ−ＩＩ部位に挿
入体か存在することを確認した。

上記の方法で欠失を行なうため、 ５’　ＡＧＡＧ”１丁ＴＣＣＧＧＡＣＣＴＣＩＴ　１Ｔ
ＡＴＣＣＡＡＡＧ３’で示される配列の１本鎖を常法（
文献２）に従って化学合成し、α−因子プロモーター／
信号ＩＧＦ−１融合配列のＩ　Ｇ　Ｆ　−１暗号配列の
直前の５’　ＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴ
ＴｃｃｃＴＧｃｃ　３’３’　ＣＴＣＣＧＡＣＴＴＣＧ
ＡＧＡＴＣＴＴＡＡＧＧＧＡＣＧＧ　５’で示されるｌ
）　Ｎ　Ａ配列を欠失させるのに使用した。

この欠失を含むプラスミドで接種したＪＭＩＯＩ細胞培
養から一多量プラスミド調製によって、この組み立て物
を複製型として分離した。

分離した複製型（１０ｍｇ）を５ａｌＩで消化した。

次いでフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈
澱させ、ライゲーションに備えた。この複製型にＳａｌ
　Ｊ−ＥｃｏＲ１リンカ−を結合させた。ライゲーショ
ンヲ行ない、フェノール、クロロボルム抽出、次いでエ
タノール沈澱させてリガーゼを不活性化した後、この物
質を標桑的な条件下て〜５　Ｑ　Ｕ　Ｅｃｏ　ＲＩ酵素
で消化し、６％ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた
。放出された約１，５ＫｂｐのＲ１−ＥｃｏＲＩフラグ
メントをゲルから分割し、標準的な方法でライゲーショ
ンに備えた。

ＹＥＩ３９丁プラスミド１０ｍｙをＥｃｏＲＩ　５０単
位て消化し、細菌性アルカリホスファターゼで処理する
ことにより酵母ベクターを調製した。この消化物を数回
フェノール−クロロポルム抽出し、エタノール沈澱させ
、ライゲーションに備えた。

欠失を含む約１．５　Ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲ
Ｉ　７ラグメントを１らｃｏ　Ｒ１−１！、ＣＯＲＩ　
Ｙ　Ｅｌ）　９　Ｔベクターと結合させ、このライゲー
ション混合物をｌ）ａｇｅｒｔおよびＥｒｈｌｉｃｂ　
（文献３）の方法に従って調製したコンピテント２９４
細胞に導入し、ＢｉｒｎｂｏｉｎｌおよびＤｏｌｙ（文
献４）の方法てミニスクリーニングした。調製したＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩで消化してスクリーニングし、約１．５
Ｋｂｐフラグメントの挿入を示すＤＮＡを使って、ｌ−
１ｉ　ｔｚｅｒｍａｎの改良に係る（文献１９　）　Ｂ
ｅｇｇｓらの方法（文献１８）により、株 コンピテント酵母Ａ２０Ｂ−１２（ＡＴＣＣ２０６２６
）を形質転換した。

形質転換体を振盪フラスコ内で増殖させ一上清を分析す
ると、Ｉ−１ｉ　ｎ　ｔ　ｚらの改良にかかる（文献２
４）　Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏ　らの放射免疫測定法によ
ってＩＧＦ−Ｉ活性の存在することがわかった。

これらのクローンの１つを１’０／の発酵容器内で多量
に増殖させ、この発酵の上清からＩ　Ｇ　Ｆ　−１を精
製した。この物質をアミン末端蛋白質配列決定法にかけ
、成熟Ｉ　Ｇ　Ｆ　−■蛋白質であることを確認した。

以上述べた方法と類似の方法を用い、本発明に従ってヒ
トＥ　Ｇ　Ｆを調製することができる。

ヒ）　Ｅ　Ｇ　Ｆの組み立て、廃現および分泌Ｉ　ＣＦ
　−１と同様にして、化学的にあるいは重合反応によっ
て合成した２木鎖１）ＮＡ（第１５図）ギンの直前のメ
チオニン（ＡＴＧ）を暗号化して、いるコドン−アミノ
末端アスパラギンがら２１残基のメチオニンに代ってバ
リンと置き換えるコドン（ＧＴＣ）を含んでいる成熟Ｅ
　Ｇ　Ｆ暗号配列を形成させた。この組み立て物を、酵
母または細菌内で発現させると融合蛋白質を生産する暗
号配列に５′末端で結合させた。この融合蛋白質はメチ
オニンの位置でＣＮＢｒにより開発され−バリン置換ヒ
トＩ！、　Ｃ，Ｆ分子を放出する。

酵母から成熟型のＥＧＩ”を分泌させるために一成熟蛋
白質を暗号化している上記の配列をα−因子プロモータ
ー／プレプロ配列に結合させ、残基数２１のバリンを暗
号化しているコドンをＡＴＣで置き換え、適当な欠失を
行なって、成熟ＥＧＦの暗号配列をα−因子信号暗号配
列に隣接させた。

この絹み立て物を酵母ベクターＹ　ｅ　ｐ　９−１−に
挿入し一酵母に導入した。この様に調製した形質転換体
は成熟ヒ１−ＥＧＦを発現し、分泌した。更に、成熟Ｅ
　Ｇ　Ｆを暗号化している配列をブレインベルターゼ信
号配列（第１７図）に結合させた。この組み立て物をＰ
　Ｇ　Ｋプロモーター含有酵母ベクターＹｅｐＩＰＴＳ
ｍａｌｌに挿入し、酵母に導入すると、１：）ＥＧＦが
発現、分泌された。

ヒトＩＣＦ−ＩＩの組み立て、発現および分泌合成りＮ
Ａ配列および天然のＤＮＡ配列を組み合せて、成熟ＩＧ
Ｆ−［を暗号化している２本鎖ＤＮＡ配列を組み立てた
（＠１８図）。内部メチオニンを含んでいないこの暗号
配列を１−、　ｒ　ｐ　Ｊｉ　’ＩＪ　−ダー蛋白質暗
号配列に結合させ、融合蛋白質として発現させた。精製
したこの融合生成物から、この成熟蛋白質の最初の残基
（アラニン）の前のメチオニン残基にＣＮＢｒを作用さ
ぜることにより、成熟ＩＧＦ−且を化学的に開裂さぜた
。

このｌ　Ｇ　Ｆ−１１暗号配列をα−因子プロモーター
／プレプロ配列に結合させ、適当な欠失を行なってα−
因子信号暗号配列の３′末端を成熟Ｉ　Ｃ１′−ｎ暗号
配列の５′末端に隣接させた後、この組み立て物をＹ　
ｅ　ｌ）　９　Ｔベクターに挿入し、酵母に導入した。

得られた形質転換体は成熟ヒＩ−Ｉ　ＣＦ−月を発現し
、分泌した。同様にして、成熟１．Ｇ１・−■を暗号化
している配列をプレインベルクーゼ暗号配列に結合させ
た。得られた組み立て物をＹｅｐｌＰＴ’ｓｍａｌｌ　
に挿入し、酵母に導入した。この様にして調製した形質
転換体は成熟し）ＩＣＦ−１１を発現し一分泌した。

医薬製剤 ヒトＩＧＦおよびヒ）　ＥＧ　Ｉ！−または本発明の生
産物は、薬学的に許容し得る担体と混合し、既知の方法
で薬学的に有用な組成物に製剤化することができる。ヒ
トの他の蛋白質、例えばヒトの血清アルブミンを包含す
る一好適な担体や製剤化については、例えばＷ、　Ｍａ
ｒｔｉｎ　（７）　ＲｅｍｉｎｇＬｏｎｓ　Ｐｈａｒｍ
ａ　−ｃｃｎｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓを参照ずル
コトがテキル。

本明細書に於いては−好ましい態様についてのみ記載し
たが、本発明がこれらに限定されるものと解釈してはな
らない。

以下に明細也・中で引用し、記号化した文献を列挙する
。

Ａ、　ｉ＜、１ｎｄｃｒｋｎｃｃｌｔｔ　、１ｉ、　’
Ａ’、ｃＬ　ａｌ　、、Ｐ　宜°ｏｃｃｃｄｉｎｇＮａ
ｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｒｎｙ　ｏ（５ｃｉｅｎｃｅ
ｓ　（ＵＳＡ）　７３　。

２３６５（１９７６）。

Ｂ、　Ｒｉｎｄｃｒｋｒｔｃｃｌｔｔ、ｃｔ　ａｌ、、
、ｌ’ｒｏｃｃｃｄｉｎｇｓ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａ
ｄｃｓｎｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（ＵＳＡ）７３
　、４３７９（１９７６）。

Ｃ０Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、　ｅＬ　ａｌ、、　１ゝｒｏｃ
ｃｃｄｉｎｇｓ　ＮａｔｉｏｎｓＨＡｃａｄｅｍｙ　ｏ
ｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（ＵＳＡ）　７５　、１９ＥＪ
。

（１９７８）。

Ｄ、Ｒｉｎｄｅｒｋｎｃｃｈｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏ　−ｇｉｃａｌ　Ｃｂ
ｃｍ１ｓｔｒｙ　２５３　、２７６９　（１９７８）　
。

２３６５（１９７６）。

Ｅ、Ｒｉｎｄｃｒｋｎｃｃｌｌｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｉ’ＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　８９゜２８３（１９７Ｂ
）。

Ｆ、Ｚａｐｈ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ　２７．１８０３（１９７８）。

Ｇ、１ｌｉｎｔｚ、　ｃｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏ［Ｃｌ１ｎｉｃａｌ’Ｅｎｃｌｏ−ｃｒｉｎｏｌｏ
ｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌ　ｉｓｍ　５０　、４０
５　（１９８０）。

Ｈ，１ｌｌｕｎｄｅｌｌ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　２８７　、　７８１（１９８０）。

１、　１ｌｉｎｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏ。

ａｎｄ　ＭｅＬａｂｏｌｉｓｎ＊　５１　、６７２（１
９８０）。

Ｊ−Ｂａｘｔｃｒ、ｃ５　ａｌ　、、Ｊｏｕｒｎａｌ　
□ｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｌｉ＋ｔｄｏ。

ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　５４．４７４（１９８
０）。

Ｋ、ｌ“１ｉｎｔｚ、　ｅＬ　ａｌ、−Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏ［Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｊｉｎｄｏ。

ａｎｄ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　５４．４４２（１９８
２）。

Ｌ、５ｃｈｏｃｎｌｅ、ｃｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　
２９６，２５２（１９８２）（Ｍ、　Ｂｒ１ｔｉｓｌｌ
　ｌ’ａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｌ”ｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎＮＤ、２００７６７６ＡＯ Ｎ、Ｗｅｔｚｅｌ　、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎ
ｔｉｓｔ　６８，６６４（１９８０）。

０、ＭｉｃｒｏＬ＋ｉｏｌｏｇｙ、　５ｅｃｏｎｄ　Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ、　１ｌａｒｐｅｒ　ａｎｄＲｏｗ　Ｐｕ
ｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、、　Ｉｌａｇｃｒｓｔ
ｏｗｎ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９７３）、・特に１１
１．２？頁以降。

１”、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａ＋ｎｃｒｉｃａｎ　２
４５．１０６　（１９８１）。

１、　Ｒｉｎｄｅｒｋｎｃｃｈｔ、１シ、ａｎｄ口ｕｍ
ｂｅｌ　、　ＩＬ、　Ｅ、　、　Ｊ　、Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈｅｍ、２５３，８．２７６９−２７７６　（１９７
８）。

２、Ｃｒｅａ、Ｒ９ａｎｄＨｏｒｎ、■、、　Ｎｕｃｌ
ｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｂ　８，２３３１−
２３４８（１９８０）。

３、ｉ）ａｇｅｒｔ、　Ｎｉ、ａｎｄ　Ｅｌｌｒｌｉｃ
ｈ、　Ｓ、Ｄ、、Ｇｅｎｅ　５゜２３−２８　（１９７
９）。

４、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、ｔｌ、Ｃ，ａｎｄＤｏｌｙ、Ｊ
、、ＮｕｃｌｃｉｃＡｃｉｄｓＲｃｓｅａｒｃｂ　７．
１５１３−１５２３　（１９７９）。

５、Ｍａｘａｍ、　Ａ、ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ
、　、　Ｍｃｔｂｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　
６５，４９９　（１９８０）。

６、Ｖｉｌｌａ　−Ｋｏｍａｒｏ［ｆ　ｅｔａｌ、、　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｃｌ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５．３７２７　（１９７９）。

７、　Ｒｏｗｅｎｋａｍｐ　ａｎｄ　Ｆｉｒｔｃｌ　、
Ｉ）ｉｃｔｙｏｓｔｃｌｉｕｍ　１Ｊｃｖ。

ｌ５ｉｏｌ　、　７９　、４０９　（１９８０）。

８、Ｗｕｎｓｃｌｉ、Ｆ、、ｅｔ　ａｌ　１１１ｏｐｐ
ｅ−５ｃｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、Ｉ’ｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｂｃｍ、Ｂｄ、３６２，５Ｌ２８５−１２８７（Ｓｃ
ｐｔ、１９８１）。

９．　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

４２６（１９８２）。

１０、　Ｋｌｅｉｄ、　Ｄ、Ｇ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
Δｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ、。

Ａｎｎａｌｓ　、（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ　）１１、　５ｅ
ｉｆｔｃｒ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｇａ１ｌｏｐ、　Ｐ、Ｍ、
、　］’ｈｃ　ｌ’ｒｏｔｃｉｎｓ。

２ｎｄ　Ｅｄ、　（Ｉ−１，Ｎｅｕｒａｔｂ、　ｃｄ、
）　Ｖｏｌ　、　Ｖ、　ｐ、　５５９（１９６６）。

１２、　Ｎｏｒｄｗｉｇ、　Ａ、、　Ｌｃｄｅｒ　１３
．１０（１９６２）。

１３、Ｌｉｎ、　Ｎ、　（Ｌｌ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、　０６／
４５２，３６３．出願日＝１２月・＋２２．１９８２）
。

１４、　Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、　Ｎａｔｕｒｅ　
（Ｌｏｎｃｌｏｎ）　２２７　。

６８０−６８５　（１９７０）。

１５、１３ｏ１ｉｖａｒ、　ｔ、　Ｃｔ　ａｌ　、、　
Ｇｃｎｃ　２　、　ｇ５　（１９７７）。

１６、　ＣＣｌ１ａｎ、Ｃ，Ｎ、（Ｌｌ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、
　０６／４８８３３７　。

出願日：・４月　２５．１９８３）。

１７、ｌ−１ｉｎｎｅｎ、　Ａ、　ｅｃ　ａｌ　、、　
ｌ’ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
　７５．１９２９−１９３３（１９７８）。

１Ｂ、　Ｂｅｇｇｓ、　、１．Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　
２７５．１０４−１０９（１９７８）。

１９、　ｌ−１１−１ｉｔｚｅ、　Ｒ，Ａ、　ｅＬ　ａ
ｌ　、　（特願昭！３８／３８１４６Ｊ：壬ｌモー二（
：１−１【］Ｉヨ；＝ピづ＝；ｊｌ−＝；：；＝＝にで
：；）　（１ｇ　Ｂ　３　）　、　；＠　“照＋　二　
”Ｊｉｘｐｒｅｓｓｉｏｎ。

Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、　ａｎｃｌ　５ｅｃｒｅｔｉｏ
ｎ　ｏ［ｌｌｅｔｅｒｏｌｏ１ｇｏｕｓ１’ｒｏｃｃｉ
ｎ　ｂｙ　ＹｃＨＩｓじ、　Ｉ）、　９−１０゜２Ｑ、
　Ｃａｐｏｎ、１）、　（＠：ｉｉｉ：イ　：　Ｂｏｖ
ｉｎｃ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｐａｔｅｎｔ　ｎｕｍｂ
ｅｒ）（１９８３）。

２１、ＨｉＬｚｅｍａｎ、ｉ＜、Δ、ｃｔａｌ、、５ｃ
ｉｅｎｃｅ　２１９゜６２０−６２５　（１９８３）。

２２、Ｓｉｎｇｂ、Ａ、（Ｕ、Ｓ、Ｓ、Ｎ、０６／４８
８３２３　、出に１０口：、４月　２５．１９８３）。

２３、Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏ、Ｒ，Ｖｖ、、Ｕｎｄｅｒ
ｗｏｏｄ、Ｌ、Ｅ、、ＶａｎＷｙＪ　、Ｉ、Ｊ、、　Ｄ
’Ｅｒｃｏｌｅ、　Ａ、ｌ、、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎ
ｖｅｓｔ。

６０．６４８（１９７７）。

２４、　ｌ−１ｉｎｔｚ　、　ＩＬ、ｌ−、、Ｌｉｕ、
　Ｆ、　、　Ｍａｒｓｈａｌｌ　、　Ｌ、Ｂ、。

Ｃｈｕｎｇ、ＩＪ、、Ｊ　、ＣＩ　ｉｎ、１−ｎｔＪｏ
ｃｒｉｎｏｌ　、ＭｃＬａｂ、５０　。

４０５　（１９８０）。

２５、　Ｉ−ｊｉｔｚｅｍａｎ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａ
ｌ　、、　ｌ’ｒｏｃｅｃｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＢ
ｅｒｋｅｌｃｙ　Ｗｏｒｋｓｌｉｏｐ　ｏｎ　Ｒｅｃｅ
ｎｔ　Ａｃ１ｖａｎｃｃｓ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　：　Ｒｃｃｏｍｂｉｎａ
ｎｔ　ＤＮＡ。

Ｕ、Ｓ　Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ｐ、１７３　
（１９８２）。

２６、ｌ−１ｏｒｎｃｒ、１．Ｍ、、Ｌｉｕ、Ｉｉ’、
、ｌ＋１ｎＬｚ、Ｒ，Ａ；、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　、　Ｍｃｔａｂ、　４７　、６
　、’ｐ−１２８７（１９７８）。

２７、Ｒｏｓｓｉ　＋’　Ｊ、Ｊ、、　Ｚｉｅｒｚｅｋ
、　Ｒ９，Ｈｕａｎｇ、　Ｔ、。

Ｗａｌｋｅｒ、　Ｐ、Ａ、、　１ｔａｋｕｒａ、　Ｋ−
、Ｊ、１３ｉｏ１．　Ｃ１１ｅｔｎ−２５７，１６，９
２２６（１９８２）。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒトＩＣＦ−１のための発現ベクターの組み立
てに使用される化学合成されたＩ）　Ｎ　Ａの模式図、
第２図は第１図のＤＮＡから完成された２本鎖ＤＮＡの
模式図、第３図は制限酵素で切断した第２図のＤＮＡの
フラグメントの模式図−第４図は第３図のパーツ１およ
びパーツ２のＩ）　Ｂ　Ｒ３２２への結合を示す模式図
、第５図はＩ　Ｇ　Ｆ−１の右半分のパーツ３および４
の模式図、第６図は第５図のパーツ３および４の一第４
図のベクターへの結合を示す模式図、第７図は、ＤＮＡ
配列および推定融合蛋白質配列を示す模式図−第８図は
Ｉ）　Ｎ　Ａ配列および推定の短い融合蛋白質の配列を
示す模式図、第９図は本発明の絹み立てに使用するプラ
スミドの模式図、第１０図はα因子プレプロ配列と融合
したＩＧＦ−ＪのＤＮＡおよび蛋白質配列を示す模式図
、第１１図はＩ　Ｇ　Ｆ−Ｔと融合した、α因子プロモ
ーターおよびプレープロ配列を含をしているベクターの
栓式図−第１２図はｉ　ｃ　Ｆ−１と融合した酵ＢＪイ
ンへルターゼ信号を示す模式図、第１３図は酵（ｉＪ　
Ｉ）　Ｇ　Ｋプロモーター　’ｃ含有Ｌし　テイル親プ
ラスミド（ＹＥｐ　ｌ　ＰＴＳｍａｌ　ｌ）の模式図−
第１４図はＩ）　Ｇ　Ｋプロモーター、インベルターゼ
信号およびヒ）　Ｉ　Ｇ　ｌ・’　−Ｉ遺伝子を含んで
いる酵母発現ベクターの模式図、第１５図は成熟ヒトｌ
ｉ　Ｇ　Ｆの暗号配列の絹み立てに使用される合成りＮ
Ａの模式図、第１６図はヒ）　１＜　ｃ　Ｆ暗号配列と
融合した酵母α因子「プレープロ」配列を示す模式図−
第１７図はヒトＥＧＦ暗号配列と融合した酵母インベル
ターゼイεｊ舅−配列を示す模式図、第１８図はヒ）Ｉ
ＣＦ−ＴＩの暗号配列を示す模式図である。 オ、１１許出ｈ：Ｉ白人　ジエネンテク、インコーボレ
イテツト゛代　１１１　人　弁理±　１°Ｊ１１１　葆
　外１名Ｆｉｇ、７゜ ｍｅｔ　Ｉｙｓ　ａｌａｌｌｅ　ｐｈｅ　ｖａｔ　Ｉｅ
ｕ　Ｉｙｓ　ｇｌｙ　ｓｅｒ　Ｉｅｕ　ａｓｐ　ａｒｇ
　ａｓｐ　ｌｅｕ　ａｓｐ　ｓｅｒ　ａｒｇ　ｊｌｅ　
ｇｌｕＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＡＣＴＧＡ
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ＣＡＧＣＣＧＴＡＴＴＧＡＡｌｅｕ　ｇｌｕ　ｍｅｔ　
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ｌａ　ｇｌｙ　ａｌａ　ｇｌｙ　ｖａｌ　ｖａｌ　ｌｅ
ｕ　ａｓｐＴＣＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　
ＡＡＣＧＧＴ　ＡＴＣＧＣＣＡＣＣＧＴＧ　ＣＡＡ　Ｇ
ＣＧ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＡ　ＧＴＣＣＴＴ
　ＧＡＴｓｅｒ　ｖａｌ　ｐｒｏ　ｇｌｎ　ｓｅｒ　ｇ
ｌｕ　ａｌａ　ａｓｐ　ｇｌｕ　ｔｈｒ　ａｒｇ　ａｓ
ｎ　ｌｙｓ　ａｌａ　ａｒｇ　ａｌａ　ｖａｌ　Ｉｅｕ
　ａｒｇ　ａｌａＴＣＴ　ＧＴＴ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　Ｔ
ＣＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＧＡＣＧＡＡ　ＡＣＣＣＧＴ　Ａ
ＡＣＭＡ　ＧＣＣＣＧＣＧＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＧ
ＣＧＣＴＴＣＴ　ＧＣＡ　ＴＡＧ　ＴＣＧＡＣＧＴＡＣ
ＡＴＧＡＡ７°汀ＯＩＩ、１１　Ｉｓ　ｒｏ　ａｈａ　
ｌ、Ｓ　Ｓｅｒ　ａ：、′Ａ：６−１９ ＭＴＣＧＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴ Ｉｔ）Ｌ）　Ｌｉハハ　ｌ　ｌＬｉ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　
ＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＡ１八ら　らＡ［しし

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組換え宿主により発現−プロセシングおよｄ分泌さ
   れる生産物としての成熟ヒ）ＩＣＦ。 ２、組換え酵母宿主により酵１；Ｊ、α因子１）Ｎ’Ａ
   山来のＮ末端プレ配列と共に発現され、該プレ配列をプ
   ロセシングされ一該組換え酵母宿主を扶養している培地
   中に成熟ヒトＩＧＦの形で分圧・される成熟ヒトＩＧＦ
   ０ ３組換え宿主によって生産されるヒトＩＧＩ・。 ４組換え宿主によって生産されるヒｌ−１ｉＧ＋・。 ５ヒトＩ　ＣＦを暗号化しているＩ）　Ｎ　Ａ配列を適
   当な宿主細胞中で発現することができる複製可能な発現
   ベクターを調製し、このベクターで宿主細胞培養を形質
   転換し、得られた組換え宿主細胞培養を、ヒ）ＩＧＦ暗
   号化ＤＮＡ配列を発現できる条件下で培養してヒ）　Ｉ
   　Ｇ　Ｆを生産せしめ、これを回収することからなるヒ
   ）　Ｉ　Ｇ　Ｆの製造法。 ６、ヒ）ＥＧＦを暗号化しているＩ）　Ｎ　Ａ配列を適
   当な宿主細胞中で発現することができる複製可能な発現
   ベクターを調製し、このベクターで宿主細胞培養を形質
   転換し、得られた組換え宿主細胞培養を、ヒｌ−１ｉ　
   Ｇ　ｌ’暗電°化１）　Ｎ　Ａ配列を発現できる条件下
   で培養してヒ）　Ｉｉ　Ｇ　Ｆを生産せしめ、これを回
   収することからなるヒｌ−１！：　Ｇ　ｌ・の製造法。 ７形質転換組換え宿主中、ヒトＩＧＩ・を暗号化してい
   るＩ）　Ｎ　Ａ配列を発現することができる発現ベクタ
   ー。 ８、形質転換組換え宿主中、ヒ）　ｌ−Ｇ　Ｖを暗号化
   しているＤＮＡ配列を発現することができる発現ベクタ
   ー。 ９、第８項または第９項のベクターで形質転換された組
   換え宿主。 １０、実質的に成熟ヒｌ−Ｉ　Ｇ　Ｆからなる医薬組成
   物。